Waarom zijn de bananen krom?

https://www.youtube.com/watch?v=1RyRRjl39rI
Waarom zijn bananen krom?

- Door de zwaartekracht gaat de bloemtros naar beneden hangen.

- De vruchten willen naar boven blijven groeien (negatieve geotropie).
- Als de trossteel ondersteund wordt zodat de trossteel toch recht
overeind blijft, blijven de vruchten gewoon recht.
- Er zijn diverse kleinere bananensoorten (waarvan de trossteel niet
doorbuigt onder het gewicht van de vruchten) die zo van nature recht
blijven.
- Het is dus niet genetisch bepaald en heeft ook niets met het 'groeien
naar het licht' (positieve fototropie) te maken.
Welk hormoon reguleert gravitropisme?

1. Auxine
2. Cytokinine
3. Ethyleen
4. Brassinosteroiden
5. Strigolactonen
6. Salicylzuur
7.Jasmonzuur
8. Abscisinezuur
9. Gibberellinezuur
polair auxine transport van cel naar cel
Polair auxine transport

pKz auxine = 4.7

pH cel = 7
pH apoplast = 5

Binnen de cel als ion.

Zit daar vast, want
binnenmembraan is
negatief geladen.
Transport moet dus met
een transporteiwit.

In de apoplast
ongeladen, dus diffusie
over membraan
mogelijk
 Transport gaat via z.g. PIN membraaneiwitten. Positie van de PIN
eiwitten in de cel bepaalt richting transport

PIN2 bevindt zich alleen in de buitenste

PIN1 bevindt zich alleen in
cellagen, en alleen aan de bovenkant
de stele, en alleen aan de
van de cellen. PIN3 zit alleen in de
onderkant van de cellen
columella cellen, en gelijkelijk verdeeld
over de cellen
zwaartekracht
 gravitropisme – groei oiv zwaartekracht

plant kan zwaartekracht waarnemen en orienteert zich tov de zwaartekracht

Dit doet de banaan dus ook

 Herverdeling van PIN2 oiv van zwaartekracht

0 min na 90o kantelen

PIN2

240 min na 90o kantelen

Herverdeling van PIN2 (plaatje hiervoor) en van PIN3 (hier onder) oiv
van zwaartekracht leidt tot auxine gradient (zie volgende slide)

PIN3 wordt herverdeeld aan de

onderkant van de columella
cellen na 90o kantelen
 Groen = PIN3 in de
columella cellen

Rood = PIN2 in de
buitenste cellagen

Blauw = auxine

O.i.v. zwaartekracht accumuleert PIN3 aan de onderkant in de

columella cellen. PIN2 accumuleert aan de onderkant van de wortel.
Daardoor wordt de auxine concentratie onder zo hoog dat
celstrekking geremd wordt t.o.v. boven en buigt de wortel naar
beneden
Cellen in de wortelmuts bevatten de G-kracht sensoren. Men denkt dat zware
amyloplasten gevuld met zetmeel (statolieten) onderdeel uitmaken van het
sensorsysteem
In de banaan gaat het dus waarschijnlijk zo:

- Statolieten nemen zwaartekracht waar

- Er vind herverdeling van auxine plaats
- Banaan groeit krom in de richting van de hoogste auxine concentratie

- Experimenten zijn nodig om deze hypothese te bevestigen

Auxine

Transport is erg belangrijk voor de respons

Maar hoe komt de respons tot stand ?

 Signaal perceptie en transductie

Signaal perceptie Signaal transductie Inductie genexpressie Effector eiwitten

Signalen en hormonen hebben effect op plant via:

- herkenning (receptoren)
- signaaltransductie naar effector eiwitten (bijv. transcriptiefactoren)
- genexpressie (via transcriptiefactoren)
- respons

Veranderingen in genexpressie zijn erg belangrijk in planten

Een zeer korte signaaltransductieketen:

Steroidreceptoren in dieren: receptor (R) en transcriptiefactor in één

Zonder steroidhormoon: in cytoplasma door binding aan HSP90

Binding steroidhormoon: naar kern en aanschakeling genexpressie

R R
HRE
HRE
R HSP90
HSP90

- Hormoon + Hormoon
 Een ingewikkelde signaaltransductieketen

Figure 39.4
Bij signaaltransductie spelen (onder andere) een belangrijke rol:

Eiwitfosforylatie:

- via eiwit kinases en ATP: alle organismen

- via fosfo-relay: prokaryoten en planten (overdracht van fosfaatgroep
van eiwit naar eiwit)

Selectieve eiwitafbraak:

- via herkenning door F-box eiwitten, ubiquitinering en afbraak door

het 26S proteasoom
 Regulatie van de activiteit van een bepaald eiwit

Regulatie van de hoeveelheid Regulatie van de activiteit

genexpressie

switch tussen actieve

eiwit eiwit en inactieve vorm via
covalente modificatie
of interactie met een
ander regulatoir eiwit

afbraak
Afhankelijk van het eiwit kan fosforylatie leiden tot activatie of inactivatie

K-252a
 Regulatie van eiwitten

Regulatie van de hoeveelheid Regulatie van de activiteit

genexpressie

switch tussen actieve

eiwit eiwit en inactieve vorm via
covalente modificatie
of interactie met een
regulatoir eiwit

afbraak
 Eiwitafbraak via ubiquitine/proteasoom

Ubiquitine is een klein eiwit van 76 aminozuren

MG132

Ub Ub
protein protein Ub Ub
ubiquitin
protein
ligase

Ubiquitine-eiwit ligase zorgt voor de specificiteit

SCF complexen vormen een belangrijke klasse van ubiquitine-eiwit ligases

SCF is een complex van Skp1 (= ASK1), Cullin, F-box eiwit

cullin

Skp1 E2
Ub
F-box
Ub Ub
protein Ub Ub

het F-box eiwit herkent een specifiek target eiwit

Arabidopsis heeft 700 verschillende F-box eiwitten

De mens maar 70
 zonder auxine met auxine

SCF
Ubiquitinering
F-box eiwit complex
en
TIR1 is afbraak
Auxine receptor Aux/IAA

Aux/IAA = repressor eiwit

ARF = transcriptioneel activator eiwit
Het F-box eiwit TIR1 bindt Aux/IAA repressors alleen via binding van auxine

TIR1 is dus de auxine receptor die er voor zorgt dat Aux/IAA repressors ge-
ubiquitineerd worden

cullin

Skp1 E2
Ub
F-box
Ub Ub
TIR1 Aux/IAA Ub Ub
 Auxine (= IAA) is wat anders dan Aux/IAA

- Wat voor soort molecuul is auxine? Organische metaboliet

molecuulgewicht? 175 Da

- Wat voor een soort molecuul is Aux/IAA? Eiwit

molecuulgewicht 20-35 kDa (200-300 az)
Samenvatting Auxine

Auxine-responsieve genen hebben een auxine-responsieve sequentie in hun

promoter.
Hieraan binden de ARF transcriptionele activatoren.
Aan de ARF eiwitten binden Aux/IAA eiwitten, die werken als dominante
repressors.
Auxine leidt tot ubiquitinering van de Aux/IAA eiwitten, en tot hun afbraak via
het proteasoom.
Het F-box eiwit dat de Aux/IAA eiwitten herkent heet TIR1.
TIR1 is tevens de auxine receptor. Binding van auxine aan TIR1 verhoogt
affiniteit voor Aux/IAA.

Alleen in planten is tot nu toe gevonden dat een F-box eiwit ook een receptor
kan zijn.
Practicum:

Auxine respons

Welke signaaltransductiestappen zijn erbij betrokken ?

Gebruik van inhibitors

Auxine respons:

Signaal: auxine (1-NAA)

Gemeten respons: auxine-responsieve genexpressie

Arabidopsis protoplasten

Transfectie met plasmide met 7xDR5-Gus-47 gen

DR5 is bindingsplaats voor ARF transcriptiefactoren

GUS
X-Gluc X + Gluc

GUS = -glucuronidase (gen uit E. coli)

DR5-GUS wordt gebruikt als indicator voor de auxine concentratie
Aux Aux Aux Aux Aux Aux Aux
IAA IAA IAA IAA IAA IAA IAA

ARF ARF ARF ARF ARF ARF ARF

NAA

Signaal inhibitors
transductie

ARF ARF ARF ARF ARF ARF ARF

GUS
 DR5-GUS

plasmide

- Arabidopsis celsuspensiecellen
- Verwijder celwand met cellulase en macerozym
- Houdt protoplasten altijd in media met hoge osmotische waarde (veel suiker)
- Transformatie met polyethyleenglycol (PEG) en CaCl2
 35S

35S-GUS

plasmide

Controle voor transformatie: 35S-GUS

35S
35S promoter:

Sterke promoter afkomstig van bloemkoolmozaïekvirus

Actief in vrijwel alle planten en plantenweefsels
Reageert niet op signalen
Cauliflower mosaic virus = bloemkoolmozaïekvirus

Dubbelstrengs DNA genoom

Twee transcripten

groot 35S transcript

klein19S transcript

35S
19S

35S promoter:

Sterke promoter
Actief in vrijwel alle planten en plantenweefsels
Reageert niet op signalen
 CH2-COOH
indole-3-acetic acid
IAA
N HET natuurlijke auxine
H

Niet natuurlijk voorkomende stoffen met auxine activiteit

Worden vaak gebruikt in weefselkweek van planten

O-CH2-COOH
CH2-COOH

Cl Cl

a naphthalene acetic acid 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

1-NAA 2,4-D
inhibitors

K252-a: remmer van een breed scala van eiwitkinases

MG132: een specifieke inhibitor van het 26S proteasoom
LaCl3 (lanthanumchloride): blokkeert Ca2+ kanalen
N-acetyl-L-cysteine (NAC): antioxidant, remt ROS accumulatie
 Ca2+
La3+

NAC?
K252a?

MG132
Maak signaaltransductiemodel op basis van je resultaten

-Probeer een lineaire signaaltransductie op te stellen

-D.w.z. een keten van eiwitten waarvan elk ingrijpt op de
volgende
-Je mag/moet het bestaan van eiwitten postuleren, bijv. een
(receptor-)kinase of een redox-gevoelig eiwit, of een redox-
gevoelig kinase etc.
-Lees goed de handleiding, daar staan tips in hoe inhibitors
zouden kunnen werken
-Het getoonde model is erg schematisch, er kunnen stappen
in zitten die niet zijn getoond
-Gebruik je fantasie, maar sla niet op hol
Bijv.
Je neemt waar dat de inhibitors K252-a en LaCl3 het groen worden in
respons op licht remmen. Dit zou in overeenstemming zijn met onderstaand
model, waarbij licht-geactiveerd fytochroom aanzet tot de opening van een
calcium kanaal, wat leidt tot de activatie van een calcium-afhankelijk kinase
dat een transcriptiefactor activeert door fosforylatie.