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    CAPITULO 7 Proteinas purificacién y caracterizacién Hemos visto (caps. 3 a 6) que cada tipo de célula puede con- tener millares de proteinas diferentes, que cada especie de organismo contiene un conjunto caracteristico de proteinas quimicamente diferentes de las de otros organismos, y que las proteinas son moléculas relativamente fragiles, que conservan su actividad biolégica solamente en un intervalo relativamente limitado de pH y de temperatura. El aislamiento en forma pura de una proteina determinada procedente de una célula o tejido, puede por tanto parecer que constituye una tarea dificil, es- pecialmente porque cualquier proteina determinada puede existir s6lo en una concentracién muy baja en el interior de Ja célula, acompafiada de millares de otras proteinas. A pesar de todas estas dificultades, se han conseguido aislar muchas de ellas en forma pura. Por otra parte, los métodos corrientes. para la separacién de proteinas poseen un poder de resolucién excepcionalmente elevado. En este capitulo se describen los principios fisicos en que se basan las técnicas empleadas para la separacién de proteinas, el sistema empleado en su purificacién y algunos de los mé- todos para la determinacién de sus pesos moleculares. Aunque el presente capitulo no se extiende mucho acerca de la biolo- gia de las proteinas, mucho de lo que se sabe en la actualidad acerca de su biologia depende de la posibilidad de disponer de preparaciones de proteinas de elevado grado de pureza, cuyo aislamiento ha precisado de una gran cantidad de oscuro y cuidadoso esfuerzo. Comportamiento de las proteinas en disolucién Aungue las proteinas han sido conocidas desde hace mas de un siglo, nuestro conocimiento presente de su comportamiento como solutos en los sistemas acuosos se ha conseguido en los tiltimos afios, basandose en estudios fisico-quimicos muy in- tensos. Durante muchos afios, y hasta que su estructura Ile- gase a conocerse, las proteinas fueron consideradas como sus- tancias de propiedades misteriosas, completamente diferentes en su comportamiento como solutos, a las moléculas de otras clases, Se creia que las proteinas en‘disolucién estaban cons- tituidas por micelas coloidales de peso molecular variable e indefinido, Adin en 1916, Emil Fischer, que hizo mas que cual- 161 PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS quier otro quimico para transformar el estudio de las biomo- léculas en una ciencia exacta y rigurosa, negaba enérgicamente que las proteinas tuviesen pesos moleculares superiores a 5000; creia que se asociaban para constituir unos complejos de tipo micelar. Por otra parte, se descubrié que las proteinas en disolucién experimentaban cambios extraordinarios de so- lubilidad en presencia de sales neutras, de acidos o de bases, cambios que parecian completamente diferentes a los efectos producidos por estos agentes en las moléculas organicas pe- quefias y sencillas. Han sido necesarias dos generaciones de investigacién fisico- guimica para poder afirmar nuestra teoria de que las proteinas son macromoléculas de peso molecular bien definido, que for- man verdaderas disoluciones moleculares y que son electrélitos cuyo comportamiento se rige por los mismos principios fisicos que los de los electrolitos pequefios. Merced a los esfuerzos de muchos investigadores, el estudio del comportamiento de las proteinas en disolucién y la separacién de proteinas se ha transformado en una ciencia casi exacta. En las secciones siguientes estudiaremos cémo pueden apro- vecharse las diversas propiedades caracteristicas de Jas pro- teinas globulares en disolucién para separar mezclas de protei- nas baséndose en su: 1) tamafio molecular, 2) solubilidad, 3) carga eléctrica, +) diferencias en sus caracteristicas de adsorcién y 5) afinidad biolégica para otras moléculas. Procedimientos de separacién basados en el tamafio molecular La caracteristica mas notable de las proteinas es su gran tamafio, el cual permite el uso de métodos sencillos para la separacién de las proteinas de moléculas de pequefio tamafio, asi como los métodos para la resolucién de mezclas de proteinas. Didlisis y ultrafilteacion Las proteinas globulares en disolucién pueden separarse facil- mente de los solutos de bajo peso molecular por didlisis (fi- gura 7-1), en la cual, se utiliza una membrana semipermeable para retener las moléculas de proteina, permitiendo que las moléculas pequefias de soluto y de agua las atraviesen. Otro método de separacién de proteinas de pequefio tamafio es mediante ultrafiltracién (fig. 7-2), en la que la presién o la fuerza centrifuga se emplean para separar por filtracién el medio acuoso y las moléculas de soluto de pequefio tamafio a través de una membrana semipermeable que retiene las mo- léculas de proteina. En estas operaciones se emplean corrien- temente el celofan y otros materiales sintéticos como mem- branas. Centrifugacién en gradiente de densidad (zonal) Debido a que las proteinas en disolucién tienden a sedimen- tar en campos centrifugos elevados, superando asi, la tenden- cia opuesta a la difusién (pag. 179), resulta posible separar mezclas de proteinas mediante métodos de centrifugacién. La centrifugacién zonal en gradiente de densidad constituye un 162 Fioura 7-1 Diélisis. Puesto que la membrana que contiene la disolucion de proteina es semipermeable, ef agua y los solutos tales como la glucosa 0 el sulfato aménico, atraviesan la membrana libremente, pero las proteinas no lo hacen. Sustituyendo varias veces la fase acuosa externa con nuevo volumen de agua destilada, la concentracién de las moléculas pequefias de soluto en la disolucién de proteina puede reducirse a una cantidad despreciable. ‘Tubo de celofar semipermeable Disolucién prote HO destilada Ficura 7-2 Ultrafiltracion de una disolucién de proteina. Por aplicacién de una presisn ositiva por arriba (0 haciendo el vacio Por debajo) de la membrana, puede concentrarse la proteina por filtracién del agua y de las sales disueltas. Disolucién de proteina Membrana semipermeable Rejilla para soportar la smembrana b b<— Ultrafiltrado 6 Figura 7-3 Separacién de proteinas por centrifugacin en un gradiente de densidad de sacarosa. Las proteinas se separan individualmente en bandas, segin su tamafio, forma y densidad. Capitulo 7 Proteinas: purificacién y caracterizacién Antes de la centrifugacién Después de la centrifugaci6n Sacarosa Mezcla de ee proteinas en Ja capa acuosa depositada en Ja parte superior del gradiente Gradiente de sacarosa preformado itil procedimiento ampliamente utilizado para la separacién, no solamente de proteinas y otros tipos de macromoléculas, sino también de organulos y virus. En el procedimiento mas corriente (fig. 7-3) se prepara, en primer lugar, un gradiente continuo de densidad de sacarosa en un tubo de centrifuga de material plastico, utilizando un aparato que mezcla una disolucién concentrada de sacarosa y agua en proporcién des- cendente a medida que se Ilena el tubo, de modo que la den- sidad del medio es maxima en el fondo del tubo. La mezcla de macromoléculas que hay que resolver se deposita formando un estrato en la parte superior del gradiente. La centrifugacion del tubo en posicién horizontal y colocado en un rotor que gira a velocidad elevada, provoca la sedimentacién de cada tipo de macromolécula a través del gradiente de densidad a su velocidad propia, la cual viene determinada en primer lu gar por el peso de su particula, pero también por su densidad y por su forma, provocando la aparicién de bandas o zonas separadas, Generalmente la centrifugaci6n se interrumpe antes de alcanzar el equilibrio. Las posiciones de las bandas de proteina pueden localizarse 6pticamente 0 por separacién cui- dadosa del contenido del tubo mediante una perforacién prac- ticada en el fondo, y anlisis posterior de las pequefias mues- tras obtenidas. Otra alternativa es la congelacién del tubo de plastico; una vez en estado sélido, se divide el contenido en delgadas rodajas para su correspondiente anilisis. Cromatografia de exclusién molecular Uno de los medios mas poderosos y iitiles para la separacién de proteinas entre si, basandose en el tamafio, es la croma- tografia de exclusién molecular, conocida también como fi tracién sobre gel o cromatografia de tamiz molecular. Es di rente a Ia cromatografia de intercambio iénico, que separa los solutos basandose en la carga eléctrica y en sus propie- dades acido-base. En la cromatografia de exclusién molecular, la mezcla de proteinas disueltas en un tampén apropiado, se deja fluir por gravedad, a lo largo de una columna empaque- tada con granulos, o perlas, de un material polimero inerte, de elevado grado de hidratacion, que ha sido previamente 163 PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS Figura 7-4 Separacién de dos proteinas de diferente tamaslo mediante una columna de Sephadex Mercla de | @ proteinas |@y'@? afiadidas a|*@ Ja columna| Las oo proteinas comienzan a separarse, Las parti- clas meno- res penctranl@ OS OP cn las par- edesae OO Sephadex y| O O se retardan, Las molé- culas gran- des de pro POS teina son excluidas y, por tanto, més répida- mente en sentido descen- dente, Pasticulas de Sephadex hidratadas Disco’ poroso Las dos proteinas se separan y pueden gidas en el elido 6 6 4 8 é 4 lavado y equilibrado con el tampén. Los materiales corrientes para el Ilenado de las columnas son el Sephadex, nombre co- mercial de un derivado polisacarido, el Bio-Gel, un derivado comercial de poliacrilamida, y la agarosa, otro polisacarido, todos los cuales pueden estar preparados con diferentes grados de porosidad interna. En las columnas, las proteinas de dife- rente tamafio molecular van penetrando en los poros internos de los granulos en grados diferentes de intensidad, y descen- diendo a lo largo de la columna a velocidades distintas (figu- ra 7-4), Las moléculas de proteina muy grandes no pueden penetrar en los poros de las particulas; se dice que son ex- cluidas, y permanecen por ello en el volumen de exclusién de Ja columna, definido como volumen de Ia fase acuosa en el exterior de los granulos. Por otra parte, las proteinas muy pequefias pueden penetrar libremente en el poro de las perlas (fig. 7-4). Las proteinas pequefias ven obstaculizado su paso a través de la columna, mientras que las proteinas de gran tamafio la atraviesan con rapidez, ya que no pueden penetrar en las particulas polimeras hidratadas. Las proteinas de ta- majio intermedio resultaran excluidas de las particulas en un grado que dependera de sus dimensiones; de aqui que se haya introducido el término de cromatografia de exclusion. A partir de las medidas de concentracién de proteina en pequefias frac- ciones del eluato se puede construir una curva de elucion (fig. 7-5). La cromatografia de exclusion molecular puede utilizarse también para separar mezclas de otras clases de macromolé- 164 Proceso de exclusién visto con aumento Pequefias moléculas de soluto penetran cn los intersticios del Sephadex y se retardan Particula de Sephadex @ Las moléculas grandes de soluto no pueden penetrar y son excluidas | Ficura 7-5 Blucién de proteinas de una columna de exclusién molecular y determinacién del peso molecular. Para calibrar la columna se permite que dos o més proteinas (A, B y C) de peso molecular conocido pasen a través de la columna, y se representan los picos de sus voltimenes eluidos en funcién del logaritmo de su peso molecular. A partir del volumen de elucién de una proteina desconocida puede extrapolarse su peso molecular en la grafica de calibrado. Esta relacion es cierta solamente para proteinas esféricas. En el caso de particulas no esféricas, al volumen de elucién se halla relacionado directamente con el radio de Stokes, es decir, el radio de una particula esférica de propiedades hidrodimimicas equivalentes. Fioura 7.6 Efecto del pli y de la concentracién s. sobre [a solubilidad de la f-lactoglobulina 2 25°C. Las cifeas dan In concentracién de NaCl. Solubilidad, mg de nitrégeno por mililitro Capitulo 7 Proteinas: purificacién y caracterizacién 4 i Peso molecslar e desconocido: 49.000 & ge 3 AB Desconacido rode00 67000" 2s.c00 Conc. proteina enel ‘eluido ‘Volumen eluido, en ml culas, asi como bicestructuras muy grandes, por ejemplo, los virus, los ribosomas, nicleos celulares 0 incluso bacterias, sim- plemente utilizando resinas o geles con diferentes grados de porosidad interna. La capacidad de resolucién de la croma- tografia de exclusién molecular es tan grande, que este sen- cillo método se utiliza ahora de manera muy generalizada como método de determinacién del peso molecular de las pro- teinas (fig. 7-5). Procedimientos de separacién basados en diferencias de solubilidad Las proteinas en disolucién muestran cambios profundos de su solubilidad, en funcién de 1) el pH, 2) la fuerza iénica, 3) las propiedades dieléctricas del disolvente y 4) la temperatura. Estas variables que son reflejo del hecho de que las proteinas son electrolitos de peso molecular muy grande, pueden utili- zarse para separar mezclas de proteinas, ya que cada proteina posee una composicién en aminodcidos caracteristica, la cual determina su comportamiento como electrélito. Precipitacién isoeléctrica La solubilidad de la mayor parte de las proteinas globulares se halla profundamente influida por el pH del sistema. La fi- gura 7-6 muestra que la solubilidad de la B-lactoglobulina, una proteina de la leche, es minima cuando el pH se encuentra entre 5,2 y 5,3, independientemente de la concentracién de cloruro sédico presente. A cada lado de este valor critico del pH, la solubilidad experimenta un incremento muy agudo, Casi todas las proteinas globulares muestran un minimo de solubi- lidad, aunque el pH al que ello ocurre varia de una proteina a otra, 165 PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAs CELULAS El pH al que una proteina muestra un minimo de solubili- Theta 7-1. Puntos isoeléctricos dad es su pl isoeléctrico, definido como aquel valor de pH de algunas proteinas. al que la molécula no posee carga eléctrica y es incapaz de eee desplazarse en un campo eléctrico (tabla 7-1). En estas con- pH tsoelectrico diciones no existe repulsién electrostatica entre moléculas de Pepsina ~10 proteina vecinas y tienden a coalescer y precipitar. Sin em- Ovoalbimina 46 bargo, cuando los valores de pH estan por encima o por debajo Seroalbimina #9 del punto isoeléctrico, todas las moléculas de proteina poseen Heres 52 una carga eléctrica neta del mismo signo. Por dicha raz6n, se yrGlobulina 66 repelen mutuamente, impidiendo la coalescencia de las molé- Hemoglobina 68 culas sencillas para formar agregados insolubles. Algunas Mioglobina 70 proteinas son virtualmente insolubles en sus pH isoeléctricos. Ribonucleasa 96 Quimotripsinégeno 95 Puesto que las diferentes proteinas poseen valores de pH ae fogs isoeléctrico también diferentes, debido a que difirieren en el Tusociwe 110 contenido de aminoacidos con grupos R ionizables, con fre- cuencia pueden separarse unas de otras, mediante precipitacién isoeléctrica. Cuando el pH de una mezcla de proteinas se ajus- ta al pH isoeléctrico de uno de sus componentes, la mayor parte © casi todo el componente precipitaré, quedando en la isolucién las proteinas cuyos valores de pH isoeléctrico se hallen por encima o por debajo de aquél. La proteina isoeléc- trica precipitada permanece en su conformacién nativa, y pue- de redisolverse en un medio de pH apropiado y concentracién salina adecuada. Ficura 7-7 Para una proteina determinada, el pH isoeléctrico variaré Efecto de una sal neutra (K;S0,) sobre la algo segiin la composicién iénica del medio, puesto que las solubilidad de ta carbonl-hemoglobina proteinas pueden unirse a ciertos aniones 0 cationes. Cuando St PH isoeléctrico. La fuerza ionica de oe : oe tuna disolucion x viene dada por +3023, una disolucién de proteina se dializa a fondo frente a agua hn ta'que'c cola concenteacion bo la ean destilada para eliminar todos los iones pequefios distintos de Cuando la fuerza ionica es baja, la los H* y OH, el pH de la disolucién resultante se conoce proteina se solubiliza por salado, es decir, como pH isoisnico. El pH isoiénico es constante para cual- —_attmenta en solubilidad. Cuando Ia i Saat concentracién salina es elevada, disminuye quier proteina determinada. la solubilidad y la proteina precipita. Solubilizacién y precipitacién por salado 08 de las proteinas z = og Las sales neutras ejercen efectos pronunciados sobre la solu- bilidad de las proteinas globulares, tal como muestran las fi- 3 guras 7-6 y 7-7. A baja concentracién, las sales incrementan s O| la solubilidad de muchas proteinas, fenémeno que recibe el nombre de solubilizacién por salado. Las sales de los iones > od divalentes tales como el MgCly y el (NH,)SQ,, son mucho 4 ™ : mas eficaces en la solubilizacién de las proteinas que las sales de iones monovalentes tales como el NaCl, el NH,Cl, mie 7 i y el KCl. La capacidad de las sales neutras para influir en Fuerza i6nica, p Ja solubilidad de las proteinas esta en funcién de su fuerza idnica (fig. 7-7), que constituye una medida tanto de la con. centracién como del ntimero de las cargas eléctricas existentes en los cationes y los aniones aportados por la sal. El efecto de solubilidad por salado esta’causado por cambios de la ten- dencia a la ionizacién, de los grupos R disociables de la proteina. Por otra parte, a medida que la fuerza iénica aumenta, la solubilidad de una proteina comienza a disminuir (fig. 7-7). A una fuerza iénica lo suficientemente elevada, una proteina puede ser casi completamente precipitada de su disolucién, efecto llamado insolubilizacién por salado. La base fisico-qui- mica de la insolubilizacién por salado es bastante compleja; 166, Capitulo 7 Proteinas: purificacion y caracterizacién uno de los factores que concurren en ella es que la concen- tracién elevada de la sal puede eliminar el agua de hidratacion de las moléculas de proteina, reduciendo, por tanto, su solu- bilidad; pero también estan implicados otros factores, Cual- guiera que sea su base fisica, la solubilizacién y la insolubili- zacién por salado, son procedimientos importantes para la separacién de mezclas de proteinas, ya que las diferentes proteinas varian en su respuesta frente a la concentracién de sales neutras. Las proteinas precipitadas por salado retienen su conformacién nativa y pueden disolverse de nuevo, normal- mente sin experimentar desnaturalizacién. El sulfato aménico es el preferido para precipitar las proteinas por salado, debido a su gran solubilidad en agua, lo que permite alcanzar fuerzas iénicas muy elevadas. Fraccionamiento con disolventes La adicién de disolventes organicos neutros miscibles con el agua, particularmente etanol o acetona, disminuye la solubili- dad de la mayor parte de las proteinas globulares en el agua, de tal manera que precipitan de su disolucién. El estudio cuantitativo de este efecto muestra que la solubilidad de una protéina a un pH y fuerza iénica determinados esta en fun- cién de la constante dieléctrica del medio. Puesto que el etanol posee una constante dieléctrica menor que la del agua (ta- bla 2-2, pag. 45), su adicién a una disolucién acuosa de pro- teina incrementa la fuerza de atracci6n entre las cargas opues- tas (pag. 45), disminuyendo de este modo el grado de ioniza- cién de los grupos R de la proteina. Como resultado, las moléculas de proteina tienden a agregarse y precipitan. Las mezclas de proteinas pueden separarse basandose en las dife- rencias cuantitativas de su solubilidad en mezclas frias de etanol-agua y de acetona-agua. Una desventaja de este mé- todo es que al poder estos disolventes desnaturalizar a las proteinas a temperaturas superiores, la temperatura a que se trabaja debe mantenerse muy baja. Efecto de la temperatura sobre la solubilidad de las proteinas Dentro de una fluctuacién limitada entre los 0 y los 40°C aproximadamente, la mayor parte de la solubilidad de las proteinas globulares aumenta al aumentar la temperatura, aun- que existen algunas excepciones, como ocurre con los electré- litos sencillos. Por encima de los 40 y los 50°C, la mayor parte de las proteinas aumentan en inestabilidad y comienzan a desnaturalizarse (pag. 144), generalmente con pérdida de solubilidad en la zona neutra de pH. Los procedimientos de fraccionamiento de proteinas se realizan por norma ge- neral a 0°C 0 a temperaturas de refrigerador, ya que la mayor parte de las proteinas son estables a bajas tempera- turas; sin embargo, existen excepciones. Algunas proteinas son mas estables y su solubilidad es maxima a temperatura ambiente o a la:temperatura de su entorno celular normal. Utilizando estos cuatro parametros basicos de la solubilidad de las proteinas, a saber, pH, fuerza iénica, constante die- léctrica, y temperatura, E. J. Cohn y J. T, Edsall y sus colaboradores en la Harvard Medical School durante la se- 167, PaRTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS gunda guerra mundial idearon unos procedimientos corona- dos por el éxito para el aislamiento en gran escala de diversas proteinas del plasma sanguineo humano, a saber, la sero- albimina, utilizada para restaurar el volumen sanguineo en pacientes que habian sufrido pérdida de sangre o shock, las y-globulinas séricas, 0 anticuerpos pag. 1015), de gran utili- dad para la inmunizacién contra el sarampi6n, las paperas y otras enfermedades, y el fibrindgeno, que provoca la coagu- lacién de la sangre. Estos parametros de solubilidad todavia son muy utilizados, especialmente en las etapas iniciales de la purificacién de proteinas, aunque no proporcionan el ele- vado grado de resolucién de los métodos desarrollados mas recientemente. Procedimientos de separacin basados en la carga eléctrica La separacién de proteinas sobre la base de su carga eléc- trica depende en tiltimo término de sus propiedades Acido- basicas, las cuales se hallan determinadas en gran medida por el mimero y los tipos de grupos R ionizables de sus cadenas polipeptidicas. Puesto que las proteinas difieren en composi- cién aminoacida y secuencia, cada proteina posee propiedades Acido-basicas caracteristicas. Los principios implicados en la separaci6n electroforética de las proteinas son mejor compren- didos si en primer lugar se considera la curva de valoracién Acido-basica de una proteina globular de contenido amino- Acido conocido. La figura 7-8 muestra la curva de valoracién de la ribonucleasa nativa que posee 124 aminodcidos, 34 de los cuales tienen grupos R ionizables, ademas de los grupos N-terminal y C-terminal. La curva de valoracién de la ribo- Ficura 7-8 ‘Se supone que la valoracién comienza en el punto isoeléctrico de la ribonucleasa (pH 9,6) y se efectia (hacia la izquierda) por adicién de Acido, o (hacia la derecha) por adicin de base. La adicién de H* leva a la profeina a la zona de pH donde pose carga positiva neta, y la adicién de base la lleva a la zona pH en la que tiene carga negativa. La forma de la curva de valoracién refleja el mimero y el tipo de los grupos que se ionizan (véase tabla 7-2). Punto isoeléctrico pH = 9,6 (sin carga neta) Zona de pH de carga positiva neta 0 5 10 15 20 25 30 Equivalentes deH* Bauivalentes de OH + 168 Capitulo 7 Proteinas: purificacién y caracterizacién ‘Tapta 7-2. Grupos valorables de a ribonucleasa.* Numero por molécula Deducido de pk’ pK’ del grupo Ia curva aproxi- en el aminodcido Grupo de valoracién mado libre «COOH 1 47 23 Grupo R-COOH (Glu, Asp) 10 47 40 Imidazol (His) 4 5 65 60 a-Amino 1 78 97 OH-Fendlico (Tyr) 6 } 16 9.95 109 €-Amino (Lys) 10 102 105 Guanidilo (Arg) 4 4 12 125 * La curva de valoracién aparece en la figura 7-8. nucleasa es, por tanto, una resultante compleja que refleja la ionizacién de muchos grupos. Puede también determinarse la contribucién aproximada de cada tipo de grupo R ionizable (tabla 7-2). Estos datos muestran que los valores medios de pK’ de algunos tipos de grupos R de la ribonucleasa pueden variar algo con respecto a los valores de pK’ de estos grupos en los aminodcidos libres debido a los efectos de las cargas proximas. Todos los grupos R de la ribonucleasa son accesi- bles a la valoracién dcido-base, de acuerdo con la generali- zacién obtenida a partir de los estudios por rayos X (cap. 6, pagina 140), segtin los cuales casi todos los grupos R de las proteinas globulares nativas se hallan situados sobre la su- perficie exterior de la molécula, Algunas proteinas nativas, ‘sin embargo, poseen uno 0 mas grupos ionizables que no son accesibles a la valoracién, probablemente debido a que se hallan ocultos o a que participan en enlaces de hidrégeno. Por desnaturalizacién de la proteina nativa (pag. 64) estos grupos R ocultos se hacen accesibles. Por ejemplo, en la mioglobina los grupos R de 5, de los 11 restos de histidina son inaccesibles a la valoracién hasta que la proteina se des- naturaliza. La curva de valoracién de la ribonucleasa (fig. 7-8) mues- tra también su pH isoeléctrico, al cual la molécula no porta carga eléctrica neta y es incapaz de migrar en un campo eléc- trico. El pH isoeléctrico esté determinado por el nimero y por el pK’ de los grupos R que se ionizan, Sera relativamente elevado, por encima del pH 7,0, si la proteina posee un con- tenido relativamente elevado de aminoacidos basicos {lisina, arginina) como ocurre en el caso de la ribonucleasa, que posee un pH isoeléctrico de 9,6 (fig. 7-8). El pH isoeléctrico sera relativamente bajo si la proteina posee una preponde- rancia de restos acidicos (4cidos aspartico y glutamico) como cocurre en el caso de la pepsina. La mayor parte de las pro- teinas globulares poseen puntos isoeléctricos situados entre pH 4,5 y 6,5 (tabla 7-1). La curva de valoracién de una proteina indica también el signo y magnitud de su carga eléctrica neta a cualquier valor de pH. Si el pH se halla por encima del punto isoeléctrico, la proteina posee tina carga negativa neta y se desplazara hacia el 4nodo. Su carga negativa aumenta en magnitud a medida gue el pH aumenta, en concordancia con la forma de la curva de valoracién. Anélogamente, a cualquier pH por debajo del 169 Parte 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS punto isoeléctrico, la proteina posee carga positiva neta y se desplazara hacia el catodo (fig. 7-8). El conocimiento de las propiedades acido-basicas de una proteina determinada hace posible, por tanto, predecir su comportamiento en un campo eléctrico. La forma de Ia curva de valoracién y el punto isoeléctrico de una proteina pueden variar significativamente en presen- cia de sales neutras, las cuales influyen sobre el grado de ionizacién de los diferentes tipos de grupos R. Las proteinas pueden unir también cationes tales como el Ca y el Mg*, © aniones tales como el Cl o el HPO%- (pag, 166). Por todas estas sazones, el pH isoeléctrico observado para las proteinas depende algo de la naturaleza del medio en el cual la prp- teina se halla disuelta; el punto isoiénico (pag. 166) es carac- teristicamente constante para cada proteina. Las propiedades caracteristicas Acido-basicas de las pro- teinas son utilizadas de modo directo, en dos métodos genera- les muy empleados, que permiten la separacion y el anilisis de mezclas de proteinas: la electroforesis y la cromatogra- fia de intercambio iénico. Métodos electroforéticos Hay varias formas diferentes de electroforesis, también lla- mada ionoforesis, itiles para el andlisis y la separaci6n de proteinas. El prototipo de todos los métodos modernos es la electroforesis libre o de frente mévil, desarrollada en primer lugar, por A. Tiselius, en Suecia, en los afios 1930. La mo- vilidad » expresada en cm? por Volt—s de una molécula en un campo eléctrico, viene dada por la velocidad de emigra- cién V expresada en cm/s, respecto de la fuerza del campo eléctrico E, expresada en voltios/cm. mo tals Pata iones pequefios tales como el cloruro, se halla entre 4 9X 10 cm? V+ st (25°C); para las proteinas, es de alrededor de 0,1 a 1,0 x 104 cm’ V" s". Las proteinas, por tanto, emigran mucho mas lentamente en un campo eléctrico que los iones pequefios tales como Na* o Cl, simplemente debido a que poseen una relacién mucho mas pequefia de carga a masa, En la electroforesis libre, una disolucién tam- ponada de la mezcla de proteinas se coloca en una célula de observacién de forma de U maydscula, depositando una capa de tampén puro sobre la disolucién de proteina (fig. 7-9). La célula se mantiene sumergida en un bafio a temperatura cons- tante, aislada de vibraciones, y se establece un campo eléc- trico entre los electrodos; las proteinas cargadas negativa- mente se desplazan hacia el anodo y las que poseen carga negativa hacia el cétodo. Con objeto de obtener una imagen completa de todas las proteinas existentes en una mezcla, se escoge por lo general un valor de pH en el que la mayor parte o todas las proteinas posean la misma carga, pero su movilidad sea diferente. A medida que las moléculas de pro- tena cargadas negativamente se desplazan hacia el anodo, emigran desde la disolucién de proteina a la zona de disolu- cién tampén exenta de proteina, formando un frente o Linde. 170 Figura 7-9 Electroforesis libre. Vision esquemética del aparato de Tiselius de electroforesis de frente mévil. + ' Frente descendente Tampén més proteina disuelta con carga positiva neta Diagrama electroforético de las protetnas del plasma sanguineo humano (pH 88). A= seroalbimina: $= fibrinogen a. a B yy, son diversas globulinas. [Reproducido de R. Alberty, J. Chem. Educ. 25: 619 (1948)]. Ascendente Ficura 7-10 Electroforesis de zona sobre una tira de acetato de celulosa. Después del tefiido, Ta tica se somete a un barrido en el densitémetro para obtener el trazado de los picos de proteina que se muestran abajo. Tira tefida después de la electroforesis Origen Trazado del densitémetro Se proteina Fioura 7-11 Zonas separadas de proteinas reveladas por teftido del gel después de la electroforesis de disco [Reproducido de K. Linderstrom-Lang y S. O. Nielsen en M. Bier (ed.), Electrophoresis, pag. 139, Academic Press, Inc., Nueva York, 1967. Proteinas de Proteinas de E, coli Neurospora crassa Capitulo 7 Proteinas: purificacién y caracterizacién EI indice de refraccién de la disolucién experimenta un cam- bio agudo en este frente, debido a que el indice de refraccién de las moléculas de proteina es diferente del que posee el tampén puro. Las medidas épticas de los cambios del indice de refraccién a lo largo de la célula electroforética propor- cionan los diagramas electroforéticos, llamados diagramas in- terferométricos, que muestran la direccién y la velocidad telativa de la emigracién de las proteinas principales de la mezcla. La figura 7-9 muestra un diagrama de este tipo; cada pico del diagrama corresponde a la posicién del frente mévil de una proteina especifica (no representa el pico de concen- tracién proteica). Si se determina la movilidad electroforética de una proteina cualquiera a diferentes valores de pH, se puede obtener por extrapolacién el pH isoeléctrico de la pro- teina. En realidad la curva de valoracién de una proteina (pa- gina 168) constituye una medida aproximada de su movilidad electroforética en funcién del pH. Durante muchos afios, la electroforesis de frente mévil ha constituido el método mas valioso para el analisis cuantitativo de mezclas complejas de proteinas, por ejemplo, las del plasma sanguineo. La electroforesis libre ha sido sustituida en gran medida por diversas formas de electroforesis de zona, las cuales son mucho més sencillas, poseen mayor capacidad de resolucién y tequieren muestras menores. En la electroforesis de zona, Ja disolucién acuosa de proteinas se inmoviliza en una matriz s6lida 0 soporte, un material poroso hidratado que posea ti- gidez mecanica y elimine las alteraciones debidas a la con- veccién y a la vibracién. Los soportes mas ampliamente utilizados son el papel de filtro, o las tiras de acetato de celulosa, materiales que son relativamente inertes y que no interactéan con las proteinas que emigran, ni las retardan en su movimiento. El proceso electroforético se deja proseguir hasta que los principales componentes proteicos se separan en zonas distintas; de aqui el nombre de electroforesis de zona. La posicién y la cantidad de proteina existente en cada una de las zonas separadas se determinan por aplicacién de un colorante que tifie a las proteinas; la densidad de la colora- cién retenida es proporccional a la cantidad de proteina y puede valorarse mediante un densitémetro (fig. 7-10). La elec- troforesis de zona tiene un poder de resolucién claramente superior a la electroforesis libre. El método se utiliza fre- cuentemente en los laboratorios de los hospitales para medir las cantidades de las proteinas principales en el plasma san- guineo. Se consiguen resoluciones electroforéticas mucho mas ele- vadas cuando el material que acttia como matriz o soporte puede retardar o excluir moléculas de proteina basandose en su tamafio molecular, tal como ocurre con los materiales uti- lizados en la cromatografia de exclusién molecular (pag. 163). Esta forma de electroforesis de zona puede separar una mez- cla de proteinas baséndose en la carga eléctrica y en el tamafio molecular. Con este objeto, se utilizan corrientemente geles de almidén de patata o de poliacrilamida. Mediante esta técnica los componentes proteicos del plasma sanguineo pue- den resolverse en 15 o.mas bandas, en comparacién con las 5 6 6 que pueden observarse con la electroforesis libre o la de zona, de tipo sencillo, anteriormente descritas. La electrofo- resis en gel de poliacrilamida puede efectuarse en mayor 171 PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS escala, para Ilevar a cabo el aislamiento de cantidades mas grandes de proteinas purificadas. Existe ademas otra variante de la electroforesis de zona, Hamada electroforesis de disco, La mezcla de proteinas que se va a analizar, se somete a un campo eléctrico en un gel- soporte retardador separado en dos secciones, que difieren en su porosidad y que estan tamponadas a valores de pH distintos, La mezcla de proteinas emigra desde el gel mas poroso al menos poroso, proceso que va acompafiado de un cambio de pH. Como resultado, cada especie proteica se con- centra en una banda muy estrecha y definida, produciéndose una resolucién mucho mayor que la que se consigue en un tampén continuo. Esta forma de electroforesis recibe el nom- bre de discontinua debido al tampén discontinuo que se em- plea y a la apariencia discoidal de las distintas zonas de proteinas (fig. 7-11). El método electroforético de separacién de proteinas mas ingenioso y eficaz es, quizds, el denominado de enfoque iso- eléctrico 0 electroenfoque, ideado por H. Svensson en Suecia, en el cual la mezcla de proteinas se somete a la accién de un campo eléctrico en un soporte gelificado, en el que se ha establecido con anterioridad un gtadiente de pH. Cada pro- teina migra y queda «enfocada», en aquella porcién del gra- diente de pH cuyo valor es igual al de su pH isoeléctrico, y forma alli una banda estacionaria bien definida (fig. 7-12). La capacidad del enfoque isoeléctrico es extraordinaria: pue- de resolver las proteinas del plasma sanguineo humano en 40 bandas o mas. El enfoque isoeléctrico se emplea normal- mente como instrumento analitico, pero puede utilizarse tam- bién en gran escala para la preparacién de proteinas purifi- cadas. Cromatografia de intercambio iénico Un segundo método general para utilizar el comportamiento acido-basico de las proteinas como base para su separacién, es la cromatografia de intercambio isnico, que también posee cierto nimero de variantes. Los mismos principios basicos que hacen factible la separacién y el andlisis de las mezclas de aminoacidos 0 de péptidos mediante columnas de resinas de intercambio iénico (pags. 92 y 93) fueron aplicados por vez primera a la separacién de mezclas de proteinas por H. Sober y E. Peterson en los Estados Unidos en la década de los afios 50. Los materiales utilizados mas cortientemente para la cro- matografia de proteinas son derivados sintéticos de la celu- losa, La resina denominada dietilaminoetil celulosa (abreviada- mente DEAE-celulosa) contiene grupos cargados positiva- mente a pH 7,0 y es, por tanto, un intercambiador aniénico (fig. 7-13). La carboximetilcelulosa (abreviadamente CM-ce- lulosa) contiene grupos cargados negativamente a pHs neutros y es, por tanto, un cambiador catiénico. Se consigue la reso- lucién de las mezclas de proteinas y la elucién sucesiva de Jos componentes individuales de las columnas de DEAE-celu- losa, haciendo pasar una serie de tampones de pHs decre- cientes, o una serie de disoluciones salinas de fuerza iénica creciente, las cuales provocan el efecto de disminuir las unio- nes de las proteinas aniénicas. La composicién de la disolu- cién eluyente, puede también variar poco a poco y de modo 172 Ficura 7-12 Resolucién de los isozimas (diferentes formas moleculares) de la t-amino-écido- oxidasa cristalizada procedente de veneno de serpiente de cascabel, por electro- enfoque. La electroforesis de disco (izquierda) separa los isozimas en tres bandas solamente, mientras que el electroenfoque (derecha) los resuelve en 18 formas moleculares diferentes del encima. [De M. B. Hayes y D. Wellner, J. Biol, Chem., 244: 6636 (1969)]. Ficura 7-13 Materiales de intercambio iénico para la ccomatografia de proteinas. Cada particula de celulosa contiene un gran nimero de ‘grupos intercambiadores de iones, que se hallan unidos covalentemente a los grupos hidroxilo de la celulosa. HCH NHCH,CH,—O- cH,CH, Patticula de dietilaminoetil-celulosa (intercambiador aniénico) Particula de carboximetilcelulosa (intercambiador catiGnico) Capitulo 7 Proteinas: purificacién y caracterizacion continuo durante la cromatrografia; este proceso se llama de elucién de gradiente. Los gradientes utilizados por este objeto pueden variar linealmente con el volumen de la disolucién eluyente o variar en alguna otra relacion mediante el empleo de sistemas capaces de mezclar liquidos en proporciones va- riables. La concentracién de proteina en el eluido, que se recoge en fracciones pequefias, se valora épticamente por su capacidad de absorber la luz en la regién del ultravioleta (pag. 86). Separacién de proteinas por adsorcién selectiva Las proteinas pueden ser adsorbidas, y posteriormente eluidas selectivamente, de columnas de materiales relativamente iner- tes que estén finamente divididos y con un area superficial muy grande en relacién con el tamafio de su particula. Se hallan entre ellos sustancias no polares, por ejemplo el carbén, y sustancias polares como son el gel de silice o la alimina. La naturaleza exacta de las fuerzas de unién de la proteina a tales adsorbentes no es conocida, pero es probable que pre- valezcan fuerzas de van der ‘Waals e interacciones hidrof6- bicas con los adsorbentes no polares, mientras que las atrac- ciones iénicas y los enlaces de hidrégeno sean las fuerzas principales con los adsorbentes polares. Quiz4s el adsorbente mas ampliamente utilizado y eficaz para la purificacién de las proteinas es una forma de fosfato de calcio cristalino, el hidroxiapatito, que es el mismo mineral que se halla en el hueso. Es probable, que los grupos car- gados negativamente de las moléculas de proteina se unan a los iones, calcio en la red cristalina del hidroxiapatito. Las proteinas pueden eluirse de las columnas de hidroxiapatito mediante tampones de fosfatos. Separaciones basadas en Ia especificidad de ligandos: Cromatografia de afinidad Algunas proteinas pueden aislarse a partir de mezclas muy complejas y alcanzar un grado de putificacién muy elevado, frecuentemente en una sola etapa por empleo de la croma- tografia de afinidad. Este método se basa en una propiedad biolégica de algunas proteinas: su capacidad de unién espe- cifica, no covalente con otra molécula llamada ligando, Por ejemplo, algunos enzimas se unen muy fuertemente con sus coenzimas especificos (pag. 191) mediante fuerzas no covalen- tes. A fin de separar un enzima de esta naturaleza de otras proteinas mediante la cromatografia de afinidad, su coenzima especifico se une covalentemente por medio de una reaccién quimica apropiada a un grupo funcional situado sobre la su- perficie de particulas hidratadas de gran tamafio de una co- lumna de material poroso; por ejemplo, el polisacdrido aga- rosa, el cual de otro modo, permitiria que las moléculas proteicas pasasen libremente a su través (fig. 7-14), Cuando una mezcla de proteinas que contiene el enzima que se desea aislar, se introduce en una columna de este tipo, la molécula de enzima, que es capaz de unirse intima y especificamente a la molécula del ligando inmovilizado, se adhiere a las parti- culas de agarosa que contienen dicho ligando unido, mientras que todas las demas proteinas, que carecen de centro espe- aaea PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS Molécula de ligando especifica ‘CH,—CH,—CH,~| Brazo de Proteina adsorbida basdndose en su especificidad y elevada afinidad por la molécula de ligando cifico de unién para aquella molécula concreta de ligando, pasaran a través de la columna, De modo analogo se puede utilizar un sustrato o un inhibidor competitivo (pag. 203) de un enzima como ligando especifico de la columna de material adsorbente. Este método depende, por tanto, de la afinidad biologica de la proteina por su ligando caracteristico, La pro- teina unida especificamente a las particulas de la columna puede después ser eluida, frecuentemente con una disolucién de la molécula de ligando libre. La cromatografia de afinidad se emplea no solamente para aislar enzimas (pag. 177), sino también moléculas receptoras de las membranas celulares que captan hormonas especificas. Por ejemplo, la proteina receptora de la insulina de la mem- brana plasmAtica de ciertas células animales ha sido separada y purificada en gran medida por cromatografia de afinidad utilizando una columna a la que se habian unido covalente- mente moléculas de insulina. Extraccién y purificacién de proteinas El gran nimero de proteinas que existen, su gran variedad de actividades biolégicas y las diferencias quimicas existentes entre las proteinas homélogas de los distintos organismos de- terminan que la extraccién, la purificacién y la caracterizacién de las proteinas constituyan un punto central en toda inves- tigacién bioquimica. Se han purificado ya, al menos parcial- mente, alrededor de un millar de enzimas diferentes, y algo mas de 200 se han obtenido en forma cristalina pura. Ademas, centenares de otras proteinas distintas de los enzimas se han aislado con un elevado grado de pureza. Los métodos iniciales de aislamiento de fas proteinas fueron 174 Figura 7-14 Fundamento de la cromatografia de afinidad. Capitulo 7 Proteinas: purificacién y caracterizacion empiricos, lentos y muy laboriosos; sin embargo, con los nue- vos métodos asequibles en la actualidad, algunos de los cua- les, fueron ya descritos, el aislamiento de proteinas se ha transformado en un arte depurado. No existe un procedimiento finico, 0 un conjunto de procedimientos mediante los cuales todas y cada una de las proteinas puedan aislarse, sino que normalmente se sigue una secuencia de etapas de separacién para cualquier proteina, que dara por resultado un grado de purificacién elevado y un alto rendimiento. El objetivo general consiste en aumentar la pureza o la actividad biolégica de la proteina deseada por unidad de peso mediante la eliminacién del material inactivo o de las proteinas no deseadas, mientras que al mismo tiempo se consigue un rendimiento maximo. El primer requisito es un método especifico y sensible para distinguir y medir cuantitativamente la proteina que se va a aislar. Si se trata de un enzima, se requiere un sistema de ensayo cuantitativo que permita determinar su actividad cata- litica (pag. 213). Si la proteina es una hormona, debe dispo- nerse de un ensayo biolégico adecuado. Si la proteina posee un componente quimico distintivo, por ejemplo un metal como el cobre, puede utilizarse un método analitico sensible para este componente. Tambien es necesario un procedimiento para liberar la pro- teina en forma soluble de Ja célula intacta o de la estructura del tejido sin provocar pérdidas de actividad. Normalmente se emplea la trituraci6n mecanica u homogenizacién de los te- jidos animales (por ejemplo, véase pag. 390) para romper las membranas celulares y liberar los contenidos celulares, los cuales pueden ser valorados después para determinar su con- tenido en la proteina deseada. Con las bacterias, las levadu- ras y muchas células vegetales, se necesitan procedimientos mucho més vigorosos pata romper sus gruesas paredes ce- lulares, por ejemplo Ia radiacién sénica, la trituracién con arena o la fragmentacién en una prensa de elevada presién. A veces la pared celular puede ser debilitada o lisada por tratamiento con ciertos enzimas (pag. 217). Es costumbre que la etapa siguiente consista en determinar si la proteina en cuestién se halla localizada en uno de los organulos subcelulares principales, como el nicleo, las mito- condrias o la porcién soluble del citoplasma (pags. 32 a 37). Ello puede conseguirse efectuando 1a separacién de los orga- nulos subcelulares mediante centrifugacién diferencial (véase pag. 380). Si la proteina se encuentra en una de las fracciones celulares principales, puede conseguirse un grado sustancial de purificaci6én utilizando aquella fraccién celular como punto de partida para la siguiente etapa de purificacion. Sila proteina deseada se halla por casualidad asociada a una membrana 0 aun organulo membranoso, debe ser extraida de alli en forma soluble, lo cual puede conseguirse, frecuentemente, por simple extraccién con agua o bien por ruptura mecdnica 0 sénica de Jas membranas, y también mediante el empleo de detergentes para lograr la desintegracién de la estructura membranosa (véase pag. 309). Una vez que se ha obtenido la proteina deseada en forma soluble, pueden aplicarse los métodos de fraccionamiento antes descritos en este capitulo con objeto de separarla de las pro- teinas contaminantes. Por ensayo directo puede determinarse en cual de las fracciones aparece la proteina deseada y si se 175 PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS ha enriquecido selectivamente por aumento de la actividad especifica. Puesto que las células de partida o el extracto de tejido pueden contener centenares de proteinas diferentes, la purificacién de una proteina determinada puede precisar de muchas etapas para separar muchas otras proteinas de aquélla que se va a purificar. Se utiliza una serie de procedimientos segiin secuencias que se escogen empiricamente. Entre los procedimientos de separacién utilizados como eta- pas niciales tenemos la precipitacién isoeléctrica (pag. 165), el fraccionamiento por salado (pag. 166) o la precipitaci6n con disolventes (pag. 167). En cada etapa de fraccionamiento de- ben determinarse el factor de enriquecimiento y el rendimiento en la proteina deseada. Estas etapas iniciales, en las cuales el poder de resolucién no es grande, van seguidas generalmente de procedimientos cromatograficos. Se emplean con frecuen- cia la cromatografia de exclusién molecular y la de intercam- bio iénico, en una u otra secuencia, con objeto de obtener fracciones enriquecidas en la proteina deseada, basandose en el tamajio molecular y en la carga eléctrica, respectivamente. Cuando es posible efectuar la cromatografia de afinidad, cons- tituye un método de gran poder resolutivo que puede em- plearse después o en vez de otras formas de cromatografia. A veces, y como tltima etapa de purificacién, generalmente en pequefia escala, se somete la proteina a una u otra forma de electroforesis de zona, electroforesis discontinua o enfoque isoeléctrico, con objeto de conseguir una separacion altamente resolutiva de la proteina deseada con respecto a las impurezas que todavia la acompaiian, Si el rendimiento global en proteina purificada al final de una secuencia de tales etapas de purificacién ha sido lo sufi- cientemente elevado, es a menudo posible la cristalizacién de Ja proteina. Un procedimiento a seguir para ello podria ser la adicién muy lenta de sal de modo que se aproxime a la concentracién necesaria para la precipitacién por salado, o bien que se alcance el pH préximo a la precipitacién isoeléctrica. Otro método es invertir este procedimiento; la proteina se precipita por salado, se diluye solamente lo suficiente para conseguir su redisolucién y se abandona la disolucién para que pierda agua por evaporacién. Sin embargo, la cristalizacién no constituye necesariamente un signo de pureza total, ya que los cristales de proteina contienen, con frecuencia, impurezas retenidas. En todos estos procedimientos el pH debe ser cui- dadosamente controlado mediante tampones apropiados y la temperatura ha de ser mantenida a su nivel éptimo, el cual, para la mayor parte de las proteinas, se halla préximo a los 0°C, La tabla 7-3 muestra los datos obtenidos mediante un pro- cedimiento, recientemente publicado, para el aislamiento del enzima acetilcolinesterasa del tejido eléctrico del gimnoto, Elec- trophorus electricus. Este enzima, que cataliza la reaccién Acetil-colina + H,O —=» acido acético + colina se determiné cuantitativamente midiendo el incremento de aci- dez (descenso de pH) a medida que el sustrato acetil-colina se hidrolizaba con formacién de Acido acético. La actividad especifica de cada fraccién enzimética, se expresa en micro- moles de acetil-colina hidrolizada por minuto por mg de pro- teina (véase pag. 215) para la discusién de las unidades enzi- 176 Ficura 7-15 Cromatografia de afinidad de la acetilcolinesterasa. (Arriba) Estructura de la acetilcolina, el substeato normal. (Abajo) Inhibidor de la acetilcolinesterasa, ligado covalentemente a la particula de agarosa. La porcién que se parece al substrato normal esté en color. Capitulo 7 Proteinas: purificacién y caracterizacién ‘Tata 7-3. Purificacién de la acetilcolinesterasa por procedimientos estandar}. Etapa Homogenizado de tejido fresco Extracciéa y precipitacién con sulfato aménico 520 100 DEAE-celulosa 2330 52 Concentracién y dislisis 2420 50 Sephadex G-200 4170 2 Cellex-P (intercambiador catiénico) 6830 5 DEAE-celulosa 7910 16 DEAE Sephadex 8330 12 + Datos de T. L. Rosenverry, H. W. Chang y Y. Y. Chen, "Purification of acetylcholinesterase by Affinity Chromatography and Determination of Active Site Stoichiometry”, J. Biol. Chem., 247: 1555- 1565 (1972). Los datos originales de estos autores han sido recalculados para expresarlos en Jas unidades enzimaticas estdndar descritas en la pagina 215. Taota 7-4. Putificacién de acetilcolinesterasa por cromatografia de afinidad}. Actividad especitica — Rendimi Etapa Precipitado con sulfato aménico (véase tabla 7-3) 470 (100) Cromatografia de afinidad (véase fig. 7-15) 9750 70 + Vease nota al pie de la tabla 7-3. méaticas estandar), En cada etapa de purificaci6n se incre- menta la actividad especifica desde una actividad de 16,7 umol mg” en el primer homogeneizado del tejido hasta 8330 nmol mg" en el producto final. Simultneamente se produjeron pér- didas en la actividad recuperada después de cada etapa; al final del procedimiento solamente se recuperé el 12 % de la actividad inicial. No se trata de un rendimiento demasiado bajo si tenemos en cuenta el gran nimero de etapas que intervienen. Para mostrar el gran poder de la cromatografia de afinidad, la tabla 7-4 indica la actividad especifica y el rendimiento en acetilcolinesterasa, cuando se utilizé la cromatografia de afi- nidad para purificar el enzima a partir del material inicial, En una sola etapa, este procedimiento proporciona un producto cH, cry th—ciycH,—o—c—cn, j CH ° on Nowe bx, \ Brazo que liga al inhibidor con la particula de agarosa 177 PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS con una actividad especifica significativamente mas elevada que mediante la secuencia de procedimientos de la tabla 7-3 y con mucho mayor rendimiento. La estructura del ligando especifico unido al material de la columna con objeto de captar las moléculas de acetilcolinesterasa selectivamente, puede verse en la figura 7-15. Es un inhibidor competitivo muy especifico (pag. 203) de la acetilcolinesterasa, que se parece en su es- tructura al sustrato natural, pero que no es hidrolizado por el enzima, Caracterizacién de las moléculas de proteina Después de haberse aislado una proteina determinada en for- ma muy purificada, debe establecerse su homogeneidad. A este objeto eta practica cortiente el analisis por electroforesis libre y por sedimentacion en la ultracentrifuga, pero estos métodos, telativamente poco sensibles y caros, han sido sustituidos en gran parte, por métodos mas sencillos, por ejemplo, la croma- tografia de exclusién molecular, la electroforesis sobre geles de poliacrilamida y el enfogue isceléctrico, los cuales poseen mucha mayor capacidad de resolucién y pueden detectar fa- cilmente la presencia de impurezas proteicas de menor cuantia. Una vez establecida la homogeneidad de la proteina, puede caracterizarse mediante una sucesién de métodos, con objeto de establecer 1) su peso molecular, 2) si contiene una cadena polipeptidica sencilla o miltiple, 3) el peso molecular de las cadenas polipeptidicas, 4) su composicién en aminoacidos y 5) su secuencia aminoacida. Ya hemos visto cémo pueden establecerse la composicién en aminodcidos (pag. 102) y su secuencia (pag. 101). Consideraremos ahora brevemente los principios en que se basan los diferentes métodos utilizados corrientemente para establecer el peso molecular y la compo- sicién en subunidades de las proteinas globulares. Determinacién del peso molecular minimo a partir de la composicién quimica Puesto que cada molécula de una proteina determinada debe contener por lo menos una molécula de su grupo prostético, © al menos un resto de cualquiera de sus aminodcidos compo- nentes, la masa de Ja proteina expresada en daltons que con- tenga uno de tales restos es igual al peso molecular minimo. Por ejemplo, la mioglobina contiene 0,335 % de hierro. Su peso molecular minimo puede calcularse del modo siguiente: Peso atémico del hierro % hierro 100 = 16 700 Peso molecular minimo = x 100 EI peso molecular verdadero es n veces el peso molecular mi- nimo, siendo n el niimero de Atomos de hierro por molécula. Puesto que n = 1 en la mioglobina, su peso molecular ver- dadero sera 16,700. La hemoglobina contiene también hierro, pero posee 4 atomos de hierro por molécula. Por tanto, n = 4, y el peso molecular verdadero sera 4 veces el peso molecular minimo, calculado a partir del contenido en hierro. Tales calculos son mucho mas seguros si el resto o elemento utili- zado como base para el cAlculo, tiene un valor pequefio de n. 178 Ficura 7-16 Osmosis y presisn osmética. En B, ef agua ha penetrado en la disolucin de proteina. En el equilibrio, la presion hidrostética h, de la columna de la disolucién de proteina contrarresta exactamente el flujo osmétice del agua. La presion osmética (C) es igual a la presién hidrostética de la cabeza h. A. Estado inicial Tubo Proteina’ en agua Membrana semipermeable Estado’ final C. Presion osmética Piston Capitulo 7 Proteinas: putificacién y caracterizacién Determinacién del peso molecular a partir de medidas de presién osmética Cuando una membrana semipermeable separa una disolucin de una proteina del agua pura, y el agua atraviesa la mem- brana y penetra en el compartimiento que contiene el soluto, el proceso se lama ésmosts. Ello refleja la tendencia del agua a desplazarse en cualquier direccién, lo que determina que su actividad termodinamica sea uniforme por todas las partes del sistema asequibles a ella. La presién osmética es la fuerza que debe aplicarse para contrarrestar la fuerza del flujo osmético (fig. 7-16). La presién osmética es una de las propiedades coligativas de las disoluciones; depende del numero de parti- culas de soluto por unidad de volumen, pero es independiente de la naturaleza molecular del soluto y de la forma de sus particulas, El peso molecular de una proteina se puede deter- minar a partir de medidas de la presién osmética de una diso- lucién cuya concentracién en proteina sea conocida, mediante la relacién siguiente en la que M es el peso molecular, c la concentracién en gramos por litro, R la constante de los gases (0,082 litros por atm mol! K-!), T'la temperatura absoluta, expresada en kelvins, y = la presién osmética en atmésferas. Dicho de otra manera, esta relacién establece que una disolucién 1,0 M de un soluto ideal que no se disocie, disuelto en un disolvente ideal ejerce una presién osmotica de 22,4 atm a 0°C. Sin embargo, en la practica, esta relacién sélo se cumple para disoluciones muy diluidas. Generalmente las medidas de presién osmética se realizan a diversas concentraciones de soluto, y después se extrapolan a la concentracién de proteina igual a 0. El método de la presién osmética presenta ventajas tedricas importantes; por ejemplo, no precisa del conocimiento de la forma de la proteina. Sin embargo, puesto que la presién osmética depen- de del ntimero de moléculas en disolucién, una molécula de masa pequefia pero que no atraviese la membrana ejerce el mismo efecto que una molécula de masa mucho mayor. El método resulta por ello muy susceptible a errores provocados por impurezas de bajo peso molecular y en la actualidad, se utiliza raramente. Determinacién del peso molecular por anilisis de sedimentacién La ultracentrifuga, inventada por Svedberg en 1925, puede proporcionar campos centrifugos que superan 250000 veces la fuerza de la gravedad. Un campo centrifugo tan elevado provoca la sedimentacién de las moléculas proteicas de sus disoluciones, oponiéndose a la fuerza de difusi6n (véase mas adelante) la cual normalmente tiende a mantenerlas unifor- memente dispersas en la disolucién. Para determinar el peso molecular de las proteinas se emplean tres tipos de medidas de sedimentacién: velocidad de sedimentacién, equilibrio de sedimentacién y aproximacion al equilibrio. ~“Consideraremos en primer lugar el método de velocidad de 179 PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS Modelo interferométrico de una mezcla de tres proteinas que sedimentan; cada pico indica la posicién de una zona. Spinco Division, Beckman Instroments, Inc. sedimentacién, Si la fuerza centrifuga ejercida sobre las mo- léculas de proteina existentes en una disolucién supera en gran medida a la fuerza de difusién opuesta, las moléculas se sedimentaran desde la superficie del disolvente (el meni co) dejando al disolvente puro como sobrenadante. Se forma asi un frente de separacién muy definido, La velocidad de movimiento hacia abajo de este frente de separacién en la célula de la centrifuga es observada mediante medidas épticas del indice de refracci6n en diferentes posiciones a lo largo de la célula (fig. 7-17). Las mediciones se efectian fotogra- ficamente, a intervalos de tiempo determinados durante la centrifugacién, mientras el rotor se halla girando. El sistema impulsor de la centrifuga esta ideado para producir velocida- des constantes sin vibraciones. Cuando el frente de sedimentaci6n de una proteina se mueve a velocidad constante, la fuerza centrifuga contrarres- ta exactamente la resitencia a la friccién del disolvente. El coeficiente de sedimentacién s de la proteina viene dado por Ta ecuacion dxdt ox en la que x es la distancia desde el centro de rotacién, ex- presada en centimetros, t el tiempo en segundos, y » es la velocidad angular expresada en radianes por segundo, Las proteinas poseen coeficientes de sedimentacién (expresados Sn, donde la temperatura es 20°C y el medio acuoso) que se hallan situados en el intervalo entre 1 x 10-8 y 200 x 10-8 segundos (tabla 7-5). Un coeficiente de sedimentacion de 1 X 10-8 segundos se llama unidad Svedberg o simplemente un Svedberg (S). Por tanto, un coeficiente de sedimentacién de 8 x 10-8 segundos se representa por 8S. Aunque el coeficiente de sedimentacién aumenta con el peso molecular, no es proporcional al mismo, ya que esta influido también por la resistencia a la friccién del disolvente y por la forma de la particula proteica. No obstante, con algunos datos adicionales, puede calcularse el peso molecular M de una pro- 180 Figura 7-17 Fundamento de la ultracentrifuge. Se indica cémo se realizan medidas 6pticas mientras la muestea se esté sedimentando. Fuente Juminosa Be LF impulsor | i S ! ! | Rotor, ! Cetuta para la muestra Célula i de lastre i cai 1 equilirar Cl ! + Sistema Sptico analizador | Placa fotogratica ——> Direccién de 1a sedimentacién = Representacién de la ¢ concentracién de soluto a frente a la posiciéa by en la célula. Distancia Diagrama interferométrico del frénte mostrando el gradiente de concentracién Registro de absorcién de la luz por el frente Capitulo 7 Proteinas: purificacién y caracterizacién Tanta 7-5. Constantes fisicas de algunas proteinas. Coeficiente Coeficiente de difusién de sedimen- Peso Dw X 10, tacién Proteina molecular em?" SnwX 10", Citocromo ¢ (corazén bovino) 13.370 it 171 Mioglobina (corazén equino) 16 900 113 2,04 Quimotripsinégeno (pancreas bovino) 23.240 95 254 B-Lactoglobulina (leche de cabra) 37 100. 748 2.85 Seroalbimina (humana) 68 500 61 46 Hemoglobina (humana) 64500 69, 446 Aldolasa 149 100 4.63 735 Catalasa (higado de caballo) 221 600 43 12 Ureasa (Canavalia enzyformis) 482700 346 186 Fibrindgeno (humano) 339 700 1.98 7,63 ‘Miosina (bacalao) 524 800 1.10 643 Virus mosaico del tabaco 40 590 000 0.46 198 teina a partir del coeficiente de sedimentacién por medio de la ecuacién de Svedberg, que se obtiene por igualacién de la fuerza centrifuga con la fuerza de friccién opuesta, condicién gue prevalece cuando la velocidad de sedimentacién es cons- tante. La ecuacién es la siguiente RTs M=Da= ve) en donde R es la constante de los gases (8,31 x 10” ergios mot! K-!), T la temperatura absoluta expresada en kelvins, s el coeficiente de sedimentacién v el volumen especifico par- cial de la proteina, p la densidad del disolvente y D el coefi- ciente de difusién (pag. 182). El volumen parcial especifico es el aumento de volumen cuando se afiade 1,0 g de soluto seco a un volumen infinitamente grande de disolvente; para la mayor parte de las proteinas en agua se aproxima a 0,74 cm? g’. Utilizando valores determinados experimentalmente para el coeficiente de difusién de la proteina, obtenidos como se describe mas adelante (pag. 182), puede calcularse el peso molecular de Ia proteina a partir de la ecuacién anterior. Para obtener resultados lo mas exactos posibles, los valores del coeficiente de sedimentacién s y del coeficiente de difusion D deben obtenerse a partir de medidas realizadas a diversas con- centraciones de proteina y extrapolarse a dilucién infinita. Las medidas de velocidad de sedimentacién pueden proporcionar también informacién valiosa sobre el estado de pureza de una proteina y sobre la composicién de una mezcla de proteinas, ya que las diferentes proteinas sedimentan a velocidades dis- tintas (fig. 7-17). E] método de equilibrio de sedimentacién para 1a determina- cién del peso molecular posee dos ventajas importantes sobre el método de velocidad de sedimentacién: no precisa del conocimiento del coeficiente de sedimentacién ni de la forma de la molécula de proteina. En este método, la ultracentrifuga se hace funcionar a velocidad relativamente baja, la suficiente para que el sistema alcance un estado de equilibrio en el que la velocidad de sedimentacién de Ia proteina se contrarreste exactamente con la fuerza-de difusién opuesta. En el equilibrio, no hay regién de disolvente puro en la superficie del menisco, sino que se forma un gradiente de moléculas de proteina hacia 181 PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS abajo del tubo de centrifuga, cuya capa del fondo puede tener una concentracién de proteina del doble de la existente en la capa superior. Midiendo la concentracién de la proteina en funcién de la distancia al centro de giro pueden obtenerse datos para calcular el peso molecular a partir de la ecuacion M———2RT In (es/es) @*(1 ~ Vp) (x:* — x:*) en la que R y T poseen sus significados habituales, c: y ce son las concentraciones de la proteina en dos puntos del tubo que se hallan a la distancia x, y x2 del centro de rotacién, es la velocidad angular, p es la densidad del disolvente y v es el volumen parcial especifico de la proteina, Aunque el método de equilibrio de sedimentacién es el mas seguro de los métodos de sedimentacién, pueden necesitarse varios dias de centrifugacién para alcanzar el equilibrio, dificultad que se ha resuelto, en parte, mediante el empleo de células con una columna muy corta de solucién de proteina (1 a 2 mm). Ademas, la proteina debe ser completamente pura y ho- mogénea. El método de aproximacién al equilibrio representa una transaccién en la que se sacrifica algo de la exactitud del método del equilibrio, para hacer posible una medida mas rapida del peso molecular, En el método de aproximacié6n al equilibrio, la velocidad del rotor se lleva a la de equilibrio en un periodo aproximado de una o dos horas mediante una serie de ajustes. Las medidas de la concentracién de la pro. teina se realizan siempre cerca del fondo del tubo. A partir de estas medidas puede extrapolarse el peso molecular. Difusion y coeficiente de difusion EI método de velocidad de sedimentacién para la determina- cién del peso molecular de una proteina exige el conocimiento de su coeficiente de difusién. Puesto que la difusion posee un significado biolégico muy amplio, esta justificada aqui una breve discusién sobre la difusién y el coeficiente de difusion. En una disolucién de una proteina en equilibrio, la distribu- cién del soluto es estadisticamente uniforme en toda ella, aun- que las moléculas de proteina se hallen en constante movi- miento térmico, Si se forma un gradiente de concentracién de Ja proteina, por ejemplo dejando depositar cuidadosamente una capa de agua sobre la disolucién acuosa de proteina, las moléculas de proteina tenderan a desplazarse desde la region de concentracién elevada de la capa inferior a la regién de concentracién inferior de Ia capa superior. En el equilibrio, las moléculas de proteina se hallarén uniformemente distri- buidas con libertad a través de todo el sistema. El desplaza- miento de las moléculas de soluto provocado por un gradiente de concentracién se llama difusion. La velocidad de difusién viene dada por Ia primera ley de difusién de Fick: la cantidad de soluto ds que se difunde a través del Area A en un periodo de tiempo d¢ es proporcional al gradiente de concentracién de/dx en tal punto: ds de a Ad 182 Figura 7-18 Difusion de las proteinas. Capitulo 7 Proteinas: purificacién y caracterizacion Representaciones gréficas que muestran Distribucién de la proteina en la célula de la concentracién de profeina en la célula difusién a tiempo cero y al cabo de 100 h. a diferentes intervalos de tiempo. Disolvente solo Disolucion de proteina (en color) Célula de difusion Tiempo a infinito 3 3 a Frente sg inicial 3 : g i a A las 400806 04 02 10 horas Concentracién relativa de proteina La constante de proporcionalidad D es el coeficiente de difu- sion; se define como la cantidad de soluto que se difunde por segundo a través de una superficie de 1,0 cm’, cuando existe un gradiente de concentracién de la unidad. Puesto que la difusion se realiza en la direccién de la concentracién mas baja, el signo de la expresién es negativo. El coeficiente de difusién esta en funcién del tamafio y de la forma de la molécula y de la resistencia a la friccién ofrecida por la vis- cosidad del disolvente. Para macromoléculas esféricas, el coe- ficiente de difusién es inversamente proporcional a la raiz ciibica del peso molecular. E\ coeficiente de difusién de una proteina puede determinar- se midiendo su velocidad de emigracién ascendente cuando se ha depositado una capa de disolvente puro sobre una disolucién de proteina de concentracién conocida, La variacién de la concentracién de proteina con el tiempo en un punto especifico de la célula (fig. 7-18) se sigue épticamente. El coeficiente de difusién de la proteina disminuye al aumentar el peso molecular (tabla 7-5). Sin embargo, hay que observar que la seroalbiimina, que tiene la misma forma pero cuyo peso mole- cular es dos veces superior al de la B-lactoglobulina, posee un coeficiente de difusién que es solamente un 23 % menor, de acuerdo con el hecho de que el coeficiente de difusién es inversamente proporcional a la raiz ctibica del peso molecular. A la difusién se le opone la resistencia de la friccién del disolvente, funcién que es muy sensible al radio de la parti- cula. Por esta raz6n, el coeficiente de difusién no constituye por si solo una medida titil del peso molecular de una pro- teina, aunque combinado con medidas de velocidad de sedi- mentacién puede proporcionar valores completamente correc- tos para las proteinas esféricas. La difusién es uncproceso fundamental en todas las acti- vidades de transporte celular. Se cree que la velocidad de difusién y la longitud del camino de difusién de diversos 183 PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELLULAS metabolitos y enzimas, son los causantes de establecer limites fisicos al tamafio y al volumen de la masa metabolizante de las células vivas y de sus organulos. Determinacién del peso molecular por dispersion de la luz Cuando un rayo luminoso atraviesa una disolucién de proteina en una habitacién oscura, puede verse el recorrido del rayo porque la luz se dispersa por las moléculas de proteina. Este efecto se llama efecto Tyndall. A partir de la longitud de onda de Ia radiacién incidente, de la intensidad de la luz dispersa, del indice de refraccién del disolvente y del soluto y de la concentracién del soluto, se puede calcular el peso molecular de la proteina. Puesto que las medidas pueden reali- zarse de modo instantaneo y ser registradas en funcién del tiempo, puede emplearse el método para estudiar cambios ra- pidos de peso molecular, tal como los que ocurren durante la disociacién o la polimerizacién de una proteina, Ningiin otro método de determinacién del peso molecular permite efectuar tales medidas de modo continuo; sin embargo, las particulas de polvo contaminantes producen errores muy grandes y deben eliminarse mediante filtracién cuidadosa. Determinacién del peso molecular por cromatografia de exclusién molecular Hemos visto que las mezclas de proteinas pueden separarse basandose en su peso molecular mediante la cromatografia de exclusién: molecular (pag. 163). Este método sencillo, que no requiere un equipo complejo, puede proporcionar determi- naciones sorprendentemente exactas del peso molecular de una proteina (fig. 7-5). Las columnas de exclusién molecular no miden el peso molecular verdadero de una proteina descono- cida sino su radio de Stokes, el cual se define més sencilla- mente como el radio de una esfera perfecta no hidratada que posee la misma velocidad de paso a través de la columna que Ja desconocida proteina en cuestién, Si las proteinas marca- doras y la desconocida son esféricas, el método proporciona el peso molecular directamente. La cromatografia de exclusién molecular posee otra extra- ordinaria ventaja: puede dar el radio de Stokes o el peso molecular aproximado de una proteina determinada aun en mezclas muy complejas, supuesto que la proteina posea una actividad biolégica caracteristica, o una propiedad que pueda medirse. Por ejemplo, aunque un extracto celular crudo puede contener centenares de enzimas distintos, es a menudo posible determinar el peso molecular aproximado de un solo tipo de enzima en este extracto sin proceder a su aislamiento, sim- plemente, haciendo pasar el extracto a través de una columna de Sephadex y determinando la posicién del pico de actividad catalitica del enzima en los eluidos. La presencia de otras proteinas no molesta, ya que cada una de ellas atraviesa la columna con independencia de las demas, a una velocidad que viene determinada por su radio de Stokes, Las columnas de exclusién molecular resultan ser también de gran utilidad para medir la asociacién y la disociacién de las moléculas de proteina, 184 Capitulo 7 Proteinas: purificacién y caracterizacion Determinacién del nimero y del peso molecular de las subunidades: electroforesis en gel-SDS Muchas proteinas son oligoméricas y contienen mas de una cadena polipeptidica. Mediante una variacion de la electro- foresis de zona Ilamada electroforesis en gel-SDS, puede di- sociarse una proteina oligomérica en sus subunidades y deter- minarse el peso molecular de aquéllas, El método puede ser también utilizado para determinar el peso molecular de pro- teinas de una sola cadena. La proteina purificada se trata con el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS), que disocia la proteina en subunidades y despliega por completo cada cadena polipeptidica formando un complejo polipéptido-SDS cilindrico y largo. En este complejo la cadena polipeptidica se halla recubierta por una capa de moléculas de SDS, de tal modo que sus cadenas hidrocarbonadas se hallan intimamente aso- ciadas por fuerzas hidrofobicas a la cadena polipeptidica, y los grupos sulfato cargados que posee el detergente se hallan expuestos al medio acuoso. Tales complejos contienen tina relacién constante de SDS a proteina (alrededor de 1,4:1 en peso) y difieren solamente en masa. Cuando una proteina de cadena unica tratada con SDS es sometida a electroforesis en un gel de tamiz molecular que contiene SDS, su velocidad de emigracién viene determinada, principalmente, por la masa de la particula SDS-polipéptido, segiin el principio de exclusi6n molecular. El campo eléctrico suministra, sencillamente, la fuerza impulsora para el tamizado molecular. Para calibrar un determinado sistema de gel, se hacen circular proteinas de peso molecular conocido que actiian como marcadores, con objeto de efectuar la comparacién. Se dispone también de otros procedimientos especializados para la caracterizacion de moléculas de proteina, de acuerdo con su peso molecular, su forma y su conformacién; la Biblio- grafia de final de capitulo constituye una introduccién al tema. Resumen Las proteinas pueden separarse entre si basdndose en las diferencias de (1) tamafio, (2) propiedades de solubilidad, (3) carga eléctrica, (4) com- portamiento frente a la adsorcién, y (5) afinidad biolégica de una pro- teina para un ligando especifico. La separacién de proteinas baséndose en el tamafio molecular puede realizarse mediante diferentes formas de centrifugacion en gradiente de densidad y por cromatografia de exclusién molecular. Las proteinas pueden separarse también, basdndose en la diferen- ia de solubilidades, segtin cuatro variables: el pH, Ia fuerza iénica, la cons- tante dieléctrica del medio y la temperatura. Las precipitaciones por sa- Jado y en el punto isoeléctrico son de la mayor utilidad. La separacién de las proteinas basandose en la carga eléctrica depende de sus propie- dades Acido-basicas, que constituyen un reflejo de Jos grupos R ionizables de la(s) cadena(s) polipeptidica(s). Cada proteina posee un pH isoeléc- trico caracteristico, en el cual no se desplaza en el campo eléctrico. Por encima del pH isoeléctrico pose una carga negativa y por debajo de él, una carga positiva neta, Las mezclas de proteinas pueden separarse basandose en sus velocida- des relativas de movimiento en un campo eléctrico, bien por electroforesis libre en solucién acuosa 0 por electroforesis de zona en un gel o soporte semisolido. La electroforesis discontinua y el electroenfoque isoeléctrico proporcionan una gran capacidad de resolucién. Las proteinas pueden se- pararse también mediante cromatografia de intercambio iénico. La purificacién de Jas proteinas incluye (1) la disponibilidad de un método especifico de ‘determinacién, (2) de un método para liberar la proteina de Ja célula, ya sea en forma soluble, o bien asociada con un orgénulo subcelular, (3) la extraccién de la proteina del orgénulo, en caso 185, PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS de ser necesario y (#) el empleo de una secuencia de métodos diferen- tes de fraccionamiento hasta alcanzar una actividad especifica maxima y constante de la proteina, y se ha establecido su homogeneidad por crite- ios fisicoguimices, tales como la electroforesis sobre gel o el electroenfoque isoeléctrico. EI peso molecular de una proteina puede determinarse a partir del co- nocimiento de su composicién quimica, de las medidas de presién osmética, de las de velocidad de sedimentacién © equilibrio, 0 por medio de la cromatografia en gel de exclusion. Las cadenas polipeptidicas de las subunidades pueden separarse y determinar su peso molecular por elec- troforesis en gel en presencia de un detergente tal como el dodecilsulfato sédico. Bibliografia Libros BAILEY, J. L.: Techniques in Protein Chemistry, 2° ed., Elsevier, Nueva ‘York, 1967. COHN, E. J. y EDSALL, J. T.: Proteins, Amino Acids and Peptides, Reinhold, Nueva York, 1941, reimpresién en 1958. Desarrollo de la teoria mo- derna de las proteinas como electrolitos. EDSALL, J. 7. y J. WYMAN: Biophysical Chemistry, vol. 1, Academic, Nueva York, 1958. Tratamiento detallado de las propiedades acido-basicas y lectroliticas de los amincacidos, los péptidos y las proteinas. MASCHEMEYER, R. H. y A, E. V. HASCHEMEYER: Proteins: A Guide to Study by Physical and Chemical Methods, Wiley, Nueva York, 1973. Libro breve e importante. Contiene referencias, puestas al dia, de todos los aspectos de la separacién y caracterizacién de las proteinas. JaKost, w. (ed.): Enzyme Purification and Related Techniques, vol. 22 of Methods in Enzymology, Academic, Nueva York, 1971. MORRIS, C.J. 0. Ry P. MORRIS: Separation Methods in Biochemistry, Pitman, Londres, 1963, SCHACHMAN, H. K.: Lifracentrifugation in Biochemistry, Academic, Nueva York, 1959. Tratado clisico, ‘TANFORD, C.: Physical Chemistey of Macromolecules, Wiley, Nueva York, 1961. Autorizado libro de texto en este campo. VAN HOLDE, K. E.: Physical Biochemistry, Prentice Hall, Englewood Cliffs, N. J., 1971. Breve tratado de los fundamentos bioquimicos, excelente y escrito con claridad. Work, 1. Ss. y E, WoRK: Laboratory Techniques in Biochemistey and Molecular Biology, vol. 1, North-Holland, Londres, 1969. Describe Ia electroforesis en gel y la inmunoelectroforesis. Articulos ACKERS, G. K.: «Analytical Gel Chromatography of Proteins», Adv. Protein Chem., 24: 343 (1970). ANDERSEN, N. G.: «Preparative Particle Separ: Quart. Rev. Biophys., 1: 217 (1968). (CUATRECASAS, P., YC. B. ANFINSE! 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