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    CAPITULO 1 4 Rutas metabdlicas y de transferencia de energia: panoramica del metabolismo intermediario El metabolismo intermediario puede definirse como la suma total de todas las reacciones enzimaticas que tienen lugar en la célula, Aunque la afirmacién no es inadecuada, como definicién resulta incompleta ya que no indica que el metabo- lismo es una actividad muy coordinada y Ilena de sentido, en la que participan muchos conjuntos de sistemas enzima- ticos mutuamente relacionados intercambiando materia y ener- gia entre la célula y su entorno. Las funciones especificas del metabolismo son cuatro: 1) la obtencién de energia quimica de las moléculas combustibles o de la luz solar absorbida, 2) la conversién de los principios nutritivos exégenos en silla- res de construccién 0 precursores de los componentes macro- moleculares de la célula, 3) el ensamblaje de estos materiales para formar proteinas, acidos nucleicos, lipidos y otros com- ponentes celulares, y 4) la formacién y degradacién de las biomoléculas necesarias para las funciones especializadas de las células, ‘Aunque el metabolismo intermediario comprende a centena- res de reacciones diferentes, enzimaticamente catalizadas, y con frecuencia se muestra en esquemas muy detallados o mapas metabélicos que dan la impresién de una complejidad deses- peranzadora, la forma y la funcién de las rutas metabélicas centrales no resultan de comprensién dificil. Por otra parte, Jas rutas centrales del metabolismo son notablemente semejan- tes en la mayor parte de las formas de vida. En este capitulo consideraremos la procedencia de los prin- cipios nutritivos y de la energia necesaria para la vida celu- lar, las rutas principales por las que se sintetizan y se degra- dan los componentes celulares, la ruta de transferencia de la energig celular y algunos de los enfoques experimentales uti- lizados para el estudio del metabolismo celular. Fuentes de carbono y de energia para la vida celular Las células pueden dividirse en dos grandes grupos segin la forma quimica del carbono que precisan tomar del entorno: las células autétrofas (cauto alimentadas>), pueden utilizar el diéxido de carbono como fuente unica de carbono y construir a partir de él los esqueletos carbonados de todas sus biomo- léculas organicas, y las células heterdtrofas (calimentadas de 371 PARTE 2. CATABOLISMO Y PRODUCCION DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO otros»), que no pueden emplear el diéxido de carbono, y tienen que obtener el carbono de su entorno en una forma reducida relativamente compleja, tal como la glucosa. Las células autétrofas son relativamente autosuficientes, mientras que las heterétrofas, con sus necesidades de carbono en forma més elaborada, deben subsistir a partir de los productos for- mados por otras células. Las células fotosintéticas y algunas bacterias, son autétrofas, mientras que las células de los ani- males superiores y la mayor parte de los microorganismos son heterdtrofas. El segundo criterio por el que pueden clasificarge las célu- las es Ja naturaleza de su fuente de energia. Las Células que emplean la luz como fuente energética son fotstrofas; las que emplean la que procede de las reacciones de oxidacién- reduccién son quimiétrofas. Estas tiltimas pueden subdividirse ulteriormente segtin la naturaleza de los dadores de electrones a los que oxidan para obtener energia. Recuérdese que las reacciones de oxidacién-reduccién son aquéllas en las que los electrones se transfieren desde un dador de electrones (agente reductor) hasta un aceptor de electrones (agente oxidante). Los quimiétrofos, que necesitan moléculas organicas comple- jas como dadores electrénicos, tales como la glucosa, se desig- nan como quimio-organétrofos, Los organismos que pueden emplear dadores electrénicos inorganicos sencillos, tales como el hidrégeno, el sulfuro de hidrégeno, el amoniaco o el azufre, reciben el nombre de quimio-litdtrofos (del griego lithos, «pie- dra»). La tabla 14-1 muestra la clasificacion de todos los organismos en cuatro grupos principales: quimio-organétrofos, quimo-litétrofos, foto-organétrofos y foto-litétrofos, de acuer- do con sus fuentes de energia y de carbono. La gran mayoria de los organismos son o fotolitétrofos o bien quimio-organétrofos. Aunque los otros dos grupos de organismos comprenden relativamente pocas especies no deben considerarse como curiosidades raras. Algunos de ellos desem- pefian papeles muy importantes en la biosfera, particularmente los microorganismos del suelo, que fijan el nitrégeno mole- cular u oxidan el amoniaco a nitrato. Recuérdese, también, que casi la mitad de la materia viva de la Tierra es micro- biana y que la mayor parte de la vida microbiana se desarrolla en el suelo y en los mares. ‘Tasta 14-1. Clasificacién metabélica de Jos. organismos. Tipo de organismo Fuente de carbono ‘Puente de energia Dadores electrénicos Ejemplos Fotolitétrofos co, Luz Compuestos inorga- nicos: H.0, HS, S Fotoorganétrofos Compuestos orgénicos Luz Compuestos corgénicos Quimiolitétrofos co; Reacciones de oxi- Compuestos inorgéni dacién-reduccién cos: Hi, S, HLS, Fe(II), NHs Quimiorganstrofos _ Compuestos orginicos Reacciones de oxi- Compuestos orgéni- dacién-reduccién cos: glucosa Células verdes de plantas superiores (en la luz), algas cianoficeas, bactetias foto- sintéticas Bacterias purpura no sulfuradas Hidrogeno, azufre, hierro y bacterias desnitrificantes Todos los animales superiores, Ia mayor parte de los mi: croorganismos, células vegeta- Jes no fotosintéticas, tambien Jas células fotosintéticas en la oscuridad 372 Figura 14-1 Ciclos del carbono y del la biosfera, oxigen en Glucosa Energia solar O DY Célula Cétulas fotosintéticas heterotrofas XM HO co, Capitulo 14 Panorémica del metabolismo intermediario Los heterétrofos pueden dividirse en dos clases principales, los aerobios, que emplean el oxigeno molecular como iiltimo aceptor de electrones de sus dadores electrénicos organicos, y los anaerobios, que emplean como aceptor electrénico alguna otra molécula en lugar del oxigeno. Muchas células pueden vivir o bien aerébicamente, o bien anaerdbicamente, y a estos organismos se les llama facultativos. Pueden emplear el oxi- geno cuando disponen de él, y en caso contrario pueden em- plear algunos compuestos organicos como aceptores electréni- cos. Los organismos que no pueden utilizar el oxigeno en ninguna circunstancia son los anaerobios estrictos; de hecho muchos de ellos son intoxicados por el oxigeno. La mayor parte de las células heterdtrofas, en particular las de los orga- nismos superiores, son facultativas, y si disponen de oxigeno prefieren utilizarlo porque les permite un empleo mas econé- mico de sus moléculas combustibles. Es importante observar que no todas las células de un or- ganismo determinado son de la misma clase, y que algunos tipos de células poseen gran flexibilidad metabélica. Por ejem- plo, en las plantas superiores, las células verdes que contienen clorofila en las hojas son autétrofas fotosintéticas, mientras que las células de las raices son heterétrofas. Es mas, la mayor parte de las células de las hojas verdes actéian como autétrofos fotosintéticos a la luz solar, pero como heterétrofos en la oscuridad. Ciclos del carbono y del oxigeno Los organismos vivos existentes en la naturaleza son indepen- dientes en el aspecto nutritivo de varias maneras. Las mas fundamentales son los ciclos del carbono y del oxigeno en la biosfera, en la cual las células fotosintéticas y las células heterétrofas aerobias se alimentan literalmente unas a otras en una relacién Iamada sintropia. Las células fotosintéticas producen compuestos organicos, tales como la glucosa, a par- tir del CO, atmosférico y del agua y a expensas de la ener- gia solar. Las células ‘heterotréficas utilizan compuestos or- ganicos producidos por las células fotosintéticas como com- bustibles y sillares de construccién; el diéxido de carbono for- mado como producto final de su metabolismo vuelve a la atmésfera para ser utilizado de nuevo por las células foto- sintéticas (fig. 14-1). Acompajia al ciclo del carbono el inter- cambio de oxigeno entre los organismos fotosintéticos y hete- rotr6ficos (fig. 14-1). La mayor parte de los organismos foto- sintéticos producen oxigeno, que es utilizado, a su vez, por los heterétrofos para oxidar los combustibles. La magnitud del ciclo del carbono en la atmésfera es enorme. Se ha cal- culado que anualmente se movilizan 3,5 x 10" toneladas de diéxido de carbono, La interdependencia nutritiva entre los organismos vivos de la naturaleza, ejemplarizada aqui mediante el ciclo del carbono, se produce a muchos niveles en la biosfera, desde el global hasta el microscépico y es caracteristica de todos los sistemas ecolégicos. Ciclo de nitrégeno El nitrégeno, componente elemental de las proteinas, los aci- dos mucleicos y de otras biomoléculas importantes, se cicla también a través de los organismos vivos de la biosfera. Al 373 PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUGCIN DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO aaa —\ Plantas [Animales superiors superiores| Bacterias | Nitrato ijadoras de Amoniaco, urea nitrégeno Bacterias ] ‘Nitrégeno Bacterias nitrficantes nitrificantes (Nitrobacter) (Nitrosomonas) igual que en el ciclo del carbono, encontramos en éste una interdependencia metabélica y nutritiva de los diferentes tipos de organismos. Aunque el nitrgeno molecular (Nz) se halla en gran cantidad en la atmésfera, es relativamente inerte des- de el punto de vista quimico y no puede ser utilizado por la mayor parte de las formas vivas. La gran mayoria de los orga- nismos vivos obtienen su nitrégeno de alguna forma combina- da; por ejemplo, nitrato, amoniaco o compuestos mas complejos como los aminoacidos. Sin embargo, tales formas combinadas de nitrégeno son muy escasas en las aguas superficiales yen el suelo, y experimentan un recambio continuo (fig. 14-2). La mayor parte de los vegetales obtienen su nitrégeno del suelo en forma de nitrato, al que reducen para formar amoniaco, aminoacidos y otros productos reducidos. Todos estos produc- tos son elaborados para formar los componentes nitrogenados de la célula, tales como las proteinas, Los organismos heteros tréficos utilizan, a continuacién, las proteinas de las plantas como elementos nutritivos y devuelven el nitrégeno al suelo en forma de productos finales de excrecién 0 como produc- tos de la putrefaccién después de su muerte, generalmente en forma de amoniaco, Los microorganismos del suelo, a su vez, oxidan el amoniaco para formar nitrito y nitrato, que pueden ser utilizados de nuevo por los vegetales. Solamente unas pocas formas de vida, tales como las bacterias fijadoras de nitrégeno, pueden reducir el nitrégeno atmosférico y su- plementar de este modo el suministro biolégicamente asequi- ble de nitrégeno combinado de la biosfera. Las células mas autosuficientes que se conocen son las algas cianoficeas fotosintéticas, fijadoras de nitrégeno, que son Pprocariotas que se encuentran en el suelo, en el agua corrien- te y en los océanos. Estos organismos obtienen su energia de la luz solar, su carbono del diéxido de carbono, y el ni- trégeno procede del nitrégeno atmosférico; los electrones para la reduccién del diéxido de carbono proceden del agua. Se cree que las algas cianoficeas fueron los primeros organismos que poblaron la tierra durante la evoluci6n, hipotesis que esta basada en una interesante observacién efectuada hace muchos afios. Después de que la erupcién del Monte Krakatoa, en 1883, hubo destruido completamente toda la vida en una gran 374 Ficura 14-2 Ciclo det nitrégeno, Figura 14-3 Flujo de energia en la biosfera. La energia solar es ef origen de toda Ia energia celular. La glucosa y otros productos Totosintéticos son empleados por los vegetales y por los animales en ef suministro de energia para las actividades vitales de la célula. En tiltimo término, la energia solar se disipa en formas degradadas tales como el calor. Fotosintesis | Energia quimica [ATP, NADPH, glucosal Contraccién Transporte Biosintesis Capitulo 14 Panordmica del metabolismo intermediario rea oceanica circundante, los primeros microorganismos que se restablecieron por si mismos, fueron las algas cianoficeas, fijadoras de nitrégeno. El flujo de la energia en la biosfera En la biosfera, existe un flujo masivo de energia que se halla muy emparejado con el ciclo del carbono. Los organismos fotosintéticos capturan la energia solar convirtiéndola en la energia quimica de la glucosa y de otros productos organicos. Los organismos heterotréficos utilizan estos productos como Precursores de sus biomoléculas estructurales y como combus- tibles ricos en energia para ejecutar sus actividades que pre- cisan energia (fig. 14-3). La energia solar es, por tanto, la fuente ultima de energia para casi todos los organismos, ya sean autétrofos o heterétrofos. Sin embargo, es importante observar que la energia no se cicla en la biosfera, sino que fluye en una sola direccién. El flujo comienza con la energia solar, capturada por las células fotosintéticas y convertida en la energia quimica de los productos fotosintéticos. Estos pro- ductos son empleados después por los heterétrofos pata desempefiar las diversas formas de trabajo celular. En el curso de estos procesos la energia quimica se degrada hasta formas de energia biolégicamente iniitiles, tales como el calor, que se disipa hacia el entorno. E] flujo energético en la biosfera es de proporciones enor- mes. Se emplean anualmente unas 10" kcal de energia solar para convertir el diéxido de carbono en biomasa por me- dio de los organismos fotosintéticos de la biosfera. Este flujo de energia biolégica es unas veinte veces mayor que el flujo de energia que efecttian todas las maquinas manufacturadas por el hombre sobre la faz de la tierra. Interdependencia nutritiva de los organismos y de las células Ademés de los elementos nutritivos de bulto como los gli- cidos y las grasas, muchos organismos precisan de sustan- cias organicas especificas formadas por otros organismos. Si bien la bacteria E. coli puede utilizar el amoniaco como ‘nica fuente de nitrégeno para la fabricacién de todos sus aminoacidos, nucleétidos y otros compuestos nitrogenados, la bacteria productora de acido lactico Leuconostoc mesenteroides precisa de un total de 32 elementos nutritivos nitrogenados diferentes, incluyéndose entre ellos la mayor parte de los aminoacidos corrientes asi como cierto nimero de vitaminas (tabla 14-2). Muchos vertebrados, entre ellos el hombre, carecen tam- bién de la capacidad de sintetizar cierto namero de amino- Acidos y necesitan, por tanto, a estos aminoacidos ya prefor- mados para su dieta; estos dltimos, reciben el nombre de aminoacidos esenciales (pag. 705). Ademas, muchos microor- ganismos y animales carecen de la capacidad de sintetizar una © mas vitaminas (pag. 341), que deben también obtener de fuentes exégenas. Las necesidades nuttitivas de la rata albina, que son probablemente idénticas a las del hombre, aparecen en la tabla 14-3, La sintropia como principio de organizacién de los ecosistemas se extiende asi mas alla del intercambio 375 PARTE 2. CATABOLISMO Y PRODUCCION DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO ‘Tapia 14-2. Necesidades nutritivas de la bacteria Iéctica Leuconostoc mesenteroides. Tanta 14-3, Nutrientes ‘orgénicos que necesita la rata albina, Glucosa Aminodcidos . Arginina NH¢ Histidina Aminodcidos Tsoleucina Ala Glu Lys Thr Leucina Ang Gly = Met = Trp Lisina Asn His Phe = Tyr ee ‘ap lle, ~soPre. Vdd Fenialaninn Cys Leu Ser Teiptofano Bases Valina Adenina Vitamin, ene ‘itaminas Urecilo. Hidrosolubles Lm Tiamina : Riboflavina Vitaminas Acido nicotinico Tiamina Acido pantoténico Piridoxina Piridoxina Acido pantoténico Biotina Riboflavina Vitamina Bu Acido nicotinico Acido félico Acido p-Aminobenzoico Liposolubles Biotina Vitamina A Acido félico Vitamina D Nat Vitamina E K Vitamina K Mgt Otros compuestos orgénicos HPO. Acidos grasos poliinsaturados Sor Colina ‘ Inositol masivo de carbono y nitrégeno; la asociacién metabélica entre organismos de diferentes especies puede implicar la interven- cién de trazas de moléculas organicas muy especializadas. Aun dentro de un organismo multicelular determinado, un tipo de célula depende con frecuencia de los productos del metabolismo de otro tipo de célula. De hecho, tal interdepen- dencia nutritiva constituye un principio de organizacién en la evolucién de los organismos multicelulares. En general, las células de los animales superiores precisan de muchos com- ponentes exégenos para su crecimiento; en realidad, las com- plejas necesidades nutritivas para el cultivo de algunas célu- las de mamiferos «in vitro» no se conocen todavia. Flexibilidad y economia del metabolismo intermediario Los organismos vivos poseen una flexibilidad metabélica con- siderable y pueden ajustarse al tipo y cantidad de los diversos elementos nutritivos asequibles en el entorno. Por ejemplo, todas las células de E. coli son quimio-organétrofas, pero dentro de esta categoria son metabélicamente versatiles. Pue- den utilizar como fuente tinica de carbono no solamente la glucosa, sino también otros azticares diversos, glicerina, amino- cidos, etanol y acetato. Esta flexibilidad es posible porque todas estas fuentes carbonadas son convertidas por los enzi- mas de E. coli, en componentes que pueden ser aceptados como combustibles en las rutas metabélicas centrales. 376 Capitulo 14 Panordmica del metabolismo intermediario Las células de E. coli pueden emplear también otras fuentes de nitrégeno distintas del amoniaco, como por ejemplo, los aminodcidos, las pirimidinas, la colina y otros compuestos ni- trogenados. En realidad, las células de E. coli crecen mucho més de prisa si en lugar de amoniaco el medio contiene una mezcla completa de diferentes aminoacidos, purinas y pirimi- dinas, necesarias para la sintesis de las proteinas y de los cidos nucleicos. En estas circunstancias las células se aho- rran el trabajo de producir todos estos sillares de construcci6n a partir del amoniaco. Por tanto, cuando las células de E. coli subsisten utilizando amoniaco como tinica fuente de nitrégeno y se les proporciona un amplio suministro de aminoacidos exégenos, cesan de emplear al amoniaco utilizando en su lugar los aminodcidos preformados, La asequibilidad de estos ulti- mos actia como sefial para interrumpir la biosintesis de los enzimas necesarios para catalizar las biosintesis de los amino- acidos. La célula se ahorra asi el trabajo metabélico de con- feccionar estos enzimas que ahora le son superfluos. Sin em- bargo, cuando la concentracién de los aminoacidos preforma- dos existentes en el entorno desciende por debajo de un nivel critico, se sintetizan de nuevo los enzimas necesarios y la célula comienza a producir sus propios aminodcidos utilizando al amoniaco como fuente de nitrégeno. Veremos muchos ejemplos del principio de maxima economia interviniendo en el empleo de la energia y de los principios nutritivos por las células, lo cual resulta posible gracias a la intervencién de diversos tipos de sistemas reguladores. Catabolismo y anabolismo El metabolismo se divide en dos fases principales: catabolismo y anabolismo. El catabolismo es la fase degradativa del meta- bolismo, en la cual moléculas nutritivas complejas y relativa- mente grandes (gliicidos, lipides y proteinas) que provie- nen o bien del entorno o bien de sus propios depésitos de reserva, se degradan para producir moléculas més sencillas tales como Acido lactico, Acido acético, CO;, amoniaco o urea. El catabolismo va acompafiado de la liberacién de la energia quimica inherente a la estructura de las moléculas organicas nutritivas y a su conservacién en forma de la molécula de trifosfato de adenosina (ATP), transferidora de energia. El anabolismo constituye la fase constructiva o biosintética del metabolismo, en la cual tiene lugar 1a biosintesis enzima- tica de los componentes moleculares de las células tales como los acidos nucleicos, las proteinas, los polisacaridos y los li- pidos a partir de sus precursores sencillos. La biosintesis de Jas moléculas organicas a partir de éstos, precisa del consumo de energia quimica aportada por el ATP generado durante el catabolismo, El catabolismo y el anabolismo se desarrollan simultaneamente y de modo concurrente en las células, pero son regulados independientemente, como ya veremos, Debido a que el metabolismo procede de modo escalonado a través de muchos intermediarios, se emplea con frecuencia el término de metabolismo intermediario para designar a las rutas qui- micas del metabolismo. Los productos intermedios del meta- bolismo se Ilaman también metabolitos. Cada una de las reacciones del metabolismo, catalizada enzimaticamente, va acompafiada de un cambio de energia 377 PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCION DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO caracteristico. En determinadas etapas especificas de las rutas catabélicas, se conserva la energia quimica de los metabolitos en forma de ATP, mientras que en otras etapas de las rutas de biosintesis, se emplea la energia del ATP. Por tanto, al examinar cualquier ruta metabélica, debemos considerar no solamente las sucesivas etapas de reaccién enzimaticas, me- diante las que se altera Ja estructura covalente de la molécula del precursor para formar el producto final, sino también el mecanismo quimico por el cual la energia se conserva o se emplea durante la conversién metabélica. Veremos que cada ruta catabélica y anabélica esta cons- tituida por una secuencia de reacciones consecutivas catali- zadas enzimaticamente; a veces se producen hasta 20 etapas. Cabe preguntarse si el mismo producto final no podria for- marse en menos etapas, e incluso en una sola etapa. Una res- puesta es que las etapas secuenciales mtltiples son mas ver- satiles y flexibles que una sola etapa, virtualmente irreversible, para poder proporcionar interconexiones en el entramado metabélico. Otra razén, y mas fundamental, para la existencia de multiples etapas es que se necesita una cantidad fija y especifica de energia libre para formar una molécula de ATP. a partir del ADP y del fosfato durante el catabolismo; por el contrario, hay un limite maximo para la cantidad de energia libre que puede ser liberada por una molécula de ATP en una tuta biosintética. Las rutas metabélicas poseen muchas etapas, de modo que las que proporcionan y las que consumen ener- gia quimica se adaptan a las dimensiones de los valores de intercambio energético habituales de la célula; es decir, a la cantidad 0 «quantum» de energia libre inherente al grupo fosfato terminal de una molécula de ATP (pag. 411). Sistemas multienzim4ticos Los enzimas son las unidades cataliticas del metabolismo in- termediario, Actéan, normalmente, de modo secuencial, cata~ lizando reacciones consecutivas conectadas por intermediarios comunes, de modo que el producto del primer enzima es el sustrato del siguiente, y asi sucesivamente. Los sistemas enzi- maticos pueden comprender desde 2 hasta 20 0 mas enzimas actuando en una secuencia. La mayor parte de las reacciones consecutivas del metabolismo intermediario, implican trans- ferencias enzimaticas de atomos de hidrégeno, de moléculas de agua o de unidades funcionales especificas como grupos amino, acetilo, fosfato, metilo, formilo, carboxilo 0 adenililo. En la organizacién de los sistemas multienzimaticos pode- mos distinguir tres niveles de complejidad. En los mas senci- llos, los enzimas individuales estan disueltos en el citoplasma como moléculas independientes, no asociadas unas con otras en ningtin momento durante su actuacién. Los intermediarios en un sistema enzimatico de esta naturaleza, que son, general- mente, moléculas mucho menores que las de los enzimas y poseen por tanto velocidades de difusién elevadas, se difunden muy répidamente desde una molécula enzimatica a la siguiente de la secuencia (fig. 14-4). Otros sistemas multienziméticos poseen un grado de orga- nizacién mas elevado, de modo que los enzimas estén fisica- mente asociados y funcionan conjuntamente como complejos multienzimaticos (fig. 14-4). Por ejemplo, el sistema de la 378 Ficura 14-4 Tipos de sistemas multienziméticos. Sistema multienzimético soluble o disociado con los intermediarios B, C, D y E que se difunden, Complejo multienzimatico. A menudo los intermediarios en la secuencia de reaccién catalizada por un complejo multienzimatico se hallan unidos covalentemente y no se difunden fuera det complejo. Sistema enzimético unido a la membrana. = Membrana Capitulo 14 Panorémica del metabolismo intermediario sintetasa de los acidos grasos de la levadura cataliza la bio- sintesis de los acidos grasos a partir de moléculas precursoras pequefias, proceso que requiere la cooperacién secuencial de siete enzimas diferentes. Una molécula de cada uno de estos enzimas est presente en una agrupaci6n estrechamente unida, © complejo, que no se disocia facilmente; de hecho, las molé- culas de enzima separadas son inactivas. Este tipo de orde- nacién de moléculas enzimaticas secuencialmente activas for- mando un complejo no disociable, resulta biolégicamente ven- tajoso, porque limita la distancia, por la cual deben difun- dirse las moléculas del sustrato durante el curso de la secuen- cia reaccional. En realidad, en el sistema de la sintetasa de 4cido graso de la levadura, los intermediarios de la secuencia permanecen covalentemente unidos y no abandonan nunca al complejo (pg. 671). Los sistemas multienzimaticos mas complicados y con mayor grado de organizacién, son los que se hallan asociados a grandes estructuras supramoleculares como por ejemplo las membranas 0 los ribosomas (fig. 14-4). Un ejemplo importante es la cadena de enzimas transportadores de electrones, respon-. sable de la transferencia de electrones desde los sustratos hasta el oxigeno en las células heterétrofas. Estos enzimas estén ligados a la membrana mitocondrial interna, y en reali- dad forman parte de su estructura (pags. 503 y 521). Cuando mas complicado es el sistema enzimatico, mas probable es que se halle asociado a algan organulo u otra estructura intra- celular. El comportamiento cinético de un sistema multienzimatico es, desde luego, mucho mas dificil de analizar cuantitativa- mente que la cinética de un enzima aislado, Cada miembro de una secuencia multienzimatica posee no solamente su pro- pia Ky caracteristica para cada sustrato y cofactor, sino que también tiene una Voie y una dependencia del pH caracte- risticas (pag. 195). La velocidad de cada etapa individual viene determinada por la concentracién en el estado estacio- nario de cada uno de los intermediarios de la secuencia meta- bélica, asi como por la concentracién de cada enzima. Muchas veces, la primera reaccién de una secuencia multienzimatica es la que determina la velocidad para:todo el sistema; esta reaccién es la que generalmente esta catalizada por un enzima regulador (pag. 240). La cinética de un sistema multienzima+ fico puede simularse mediante computadores electrénicos, aportindose como datos los valores conocidos de Ky y Vinix de cada enzima, las concentraciones en el estado estacionario de Jos intermediarios y las caracteristicas del enzima regula- dor que participa en la secuencia. Rutas catabélicas, anabélicas y anfibélicas La degradacién enzimatica de cada uno de los elementos nu- tritivos mayoritarios de las células, a saber, los polisacéridos, los lipidos y las proteinas, tiene lugar por medio de cierto nimero de reacciones enziméticas consecutivas organizadas en tres fases principales (fig. 14-5). (Aunque los acidos nucleicos representan una fraccién sustancial del peso seco de la célula, no son utilizados como fuente de energia por la mayor parte de los organismos, y por ello no se incluyen en esta discusién). En la fase I del catabolismo, las grandes moléculas nutritivas, 39 PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCION DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO Ficura 14.5 Las tres fases del metabolismo. Las rates catabélicas (sefialadas con flechas grises descendentes) convergen hacia productos Finales comunes y conducen a la sintesis de ATP en ta fase tit. Las rutas anabélicas (biosintéticas, fechas coloreadas ascendentes) parten de unos pocos recursores en la fase III y emplean la energia del ATP para sendie muchos componentes celulares distintos. Fase 1 Fase I NX ADP +, ATP Ciclo de los acidos N tricarboxilicos } Fase IIL % WA —, Fosforilacion oxidativa “Transporte clectrénico ADP +P, ATP or 380 NHs HO Oz Figura 14-6 Convergencia y divergencia de las rutas metabélicas. Rutas convergentes del catabolismo Rtas divergentes de Ia biosintesis Capitulo 14 Panorémica del metabolismo intermediario se degradan, liberando sus sillares de construccién principa- les. Asi los polisacaridos se degradan rindiendo hexosas o pentosas, los lipides producen acidos grasos, glicerina y otros componentes, y las proteinas se desintegran en sus componen- tes aminoacidos. En la fase II del catabolismo, todos los productos de la fase anterior se convierten en un niémero menor de intermediarios todavia mas sencillos. Asi, las hexosas, las pentosas y Ia glicerina, se degradan pasando por el Acido pirdivico, intermediario de tres carbonos, para rendir una es- pecie mas sencilla, de dos carbonos, el grupo acetilo del acetil- CoA. De modo analogo, los diversos acidos grasos y amino- Acidos se escinden para formar acetil-CoA y unos pocos pro- ductos finales diferentes. Finalmente, los grupos acetilo del acetil-CoA, asi como otros productos de la fase Il, se canali- zan hacia la fase III, ruta catabélica final comén en la que en iltimo término resultan oxidados a diéxido de carbono y agua. La biosintesis tiene lugar también en tres etapas (fig. 14-5). En la etapa III se generan pequefias moléculas precursoras que se convierten en la fase II en moléculas sillares; éstas, a su vez, se ensamblan en la fase I para constituir macromo- léculas. Por ejemplo, la biosintesis de las proteinas comienza en la fase III con la formacién de ciertos a-oxoacidos, que son los precursores de los a-aminoacidos. En la etapa II, los e-oxoacidos se aminan por los dadores de grupos amino for- mando los a-aminodcidos. Finalmente, en la fase I se ensam- blan los aminoacidos para constituir las cadenas polipeptidicas. Obsérvese que las rutas catabélicas del metabolismo, cuyos comienzos son difusos porque se inician a partir de muchos polisacaridos diferentes, lipidos y proteinas, convergen en una ruta final comin en la fase III (fig. 14-6). En contraposicién, las rutas biosintéticas son divergentes; se inician a partir de unos pocos precursores en la fase Ill, y a medida que avan- zan a través de las fases II y I, se ramifican y divergen, con- duciendo a la formacién de muchas clases diferentes de bio- moléculas (fig. 14-6). Llegamos ahora a otro punto importante. Las rutas cata~ bélicas y anabélicas entre un precursor determinado y un producto dado, no son meramente inversas una de otra. Por ejemplo, la degradacién del glucégeno hasta Acido lactico se verifica segiun una secuencia de etapas catalizadas por 12 enzimas bien caracterizados. Podria parecer légico y econé- mico que la biosintesis del glucégeno a partir del Acido lactico ocurriese por una simple inversién de estas 12 etapas enzima- ticas. Sin embargo, la biosintesis del glucégeno a partir del Acido lactico implica solamente la inversién de 9 de las 12 etapas enzimaticas que intervienen en el proceso de degrada- cién. Consideraciones energéticas excluyen la simple inversion de las 3 etapas restantes, y por ello, se utilizan para la biosin- tesis rutas que las bordean, en las que se implican diferentes enzimas e intermediarios. Las rutas catabélicas y anabélicas entre proteinas y aminoacidos son también diferentes, al igual que las existentes entre los Acidos grasos y el acetil-CoA. Aunque la existencia de dos conjuntos de rutas metabélicas, una para el catabolismo y otra para el anabolismo, pueda parecer un despilfarro, esta ordenacién posee ventajas impor- tantes. En realidad, la existencia de tales rutas paralelas de liberacién de energia frente a las que consumen energia cons- tituye una necesidad, ya que la ruta catabélica es energéti- 381 PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIGN DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO camente imposible para el anabolismo. La degradacion de una molécula organica compleja es un proceso «cuesta abajo», mientras que su sintesis es un proceso . Tal como se muestra en la figura 14-5, las rutas catabélicas de- terminan la formacién de ATP a partir de ADP y de fosfato y a expensas de la energia libre liberada durante la degrada- cién de diversas moléculas combustibles, especialmente en el proceso de fosforilacién oxidativa de la fase III. Inversamente, las rutas biosintéticas o anabélicas, que son «cuesta arriba», precisan del consumo de ATP y van acompafiadas por su escisién a ADP y fosfato. Otra ventaja de la existencia de rutas catabélicas y ana- bélicas independientes, consiste en que su regulacién es tam- bién independiente. Por ejemplo, la degradacién del glucégeno a Acido lactico esta controlada por diferentes enzimas regula- dores que la del proceso inverso, es decir, la conversién de Acido lactico en glucégeno. Por esta razén, el trafico metabé- lico entre el glucégeno y el acido lactico puede regularse muy eficazmente en ambas direcciones; si una ruta esta actuando, la otra se interrumpe. La regulacién duplicada constituye un principio general caracteristico de todas las rutas catabélicas y anabélicas patalelas o correspondientes. Las rutas catabélicas y anabélicas pueden diferir en otro aspecto importante; a menudo tienen lugar en localizaciones diferentes de las células eucaridticas. Por ejemplo, Ja oxida- cién de los acidos grasos hasta Ia fase de acetil-CoA se pro- duce por la accién de un conjunto de enzimas localizados en las mitocondrias, mientras que la biosintesis de los acidos gra- sos a partir del acetil-CoA, tiene lugar por un conjunto di- ferente de enzimas que esté localizado en el citoplasma extra~ mitocondrial. La separacién en diferentes compartimientos celulares de las rutas catabélicas y anabélicas opuestas per- mite que estos procesos tengan lugar independientemente, pero de modo simultaneo. Aunque las correspondientes rutas del catabolismo y el ana- bolismo no son idénticas, la fase III (fig. 14-5) constituye un punto de cita central o de ruta asequible a ambos. Esta ruta central comin, designada a veces como ruta anfibdlica, posee una doble funcién (del griego amphi, ), pudiendo entonces actuar como precursores de bio- moléculas mayores (fig. 14-5). El ciclo del ATP aparece en la figura 14-7 y se describe mas detalladamente en el capi- tulo 15 (pag. 417). Los electrones proporcionan otro vehiculo para la transfe- rencia de energia quimica procedente de las reacciones que liberan energia del catabolismo, a las reacciones biosintéticas que precisan de tal energia. En la biosintesis de algunas bio- moléculas ricas en hidrégeno, por ejemplo, los acidos grasos y el colesterol, se necesitan electrones 0 atomos de hidrégeno para la reduccién de los dobles enlaces a enlaces sencillos. Los electrones son transportados enzimaticamente desde las oxidaciones liberadoras de electrones del catabolismo hasta Jos grupos que requieren electrones, tales como los dobles en- laces carbono-carbono 0 carbono-oxigeno, mediante coenzimas transportadores de electrones. El mAs importante de éstos es el nicotinamida-adenin-dinuclestido-fosfato (NADP). Este coenzima NADP (pag. 347) actia por tanto como transpor- tador de electrones ricos en energia desde las reacciones ca- tabélicas hasta las reacciones anabélicas que precisan de elec- trones (fig. 14-8), igual que el ATP es un transportador de grupos fosfato y de energia desde las reacciones del catabo- lismo a las del anabolismo. Recambio metabélico: Estado din&mico de los constituyentes celulares Ha sido creencia general durante muchos afios que las pro- teinas celulares permanecian intactas y estables, a lo largo de la vida de la célula, Este punto de vista no es irrazonable, ya que para sintetizar una molécula de proteina a partir de sus aminodcidos componentes se precisa de un trabajo quimico 383 PARTE 2 CATABOLISM Y PRODUCCION DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO considerable. Sin embargo, este concepto fue superado en los afios 1930, en particular gracias a la investigacién de R. Schoenheimer y sus colaboradores. Si se administraban aini- noacidos enriquecidos con el isétopo pesado '5N (el isétopo normal y mas abundante del nitrégeno es el *N), a animales de laboratorio los aminoacidos marcados se incorporaban a las cadenas polipeptidicas de las proteinas del higado a una velo- cidad elevada, a pesar de que la cantidad total de proteina hepatica no cambiaba. Al eliminar de la dieta los aminoacidos marcados, sustituyéndolos por aminoacidos normales, con “N, las proteinas hepaticas previamente marcadas, perdian répida- mente su nitrégeno isotépico, sin que tampoco se observase variacién alguna en la cantidad total de proteina hepatica. Schoenheimer Ilegé a la conclusién de que las proteinas de Jas células del higado se hallan en un estado estacionario di- namico, en el que una velocidad relativamente elevada de sin- tesis es contrarrestada exactamente por una velocidad también relativamente elevada de degradacién. Asi, las proteinas hepa- ticas experimentan un recambio metabdlico. Se descubrié que las proteinas hepaticas de la rata poseen una vida media de unos 5 a 6 dias, mientras que la propia célula hepatica tie- ne una vida media de varios meses (tabla 14-4). Por otra parte, las proteinas del tejido muscular exhiben un recambio muy lento, lo mismo que los lipidos cerebrales. Como vemos en la tabla 14-4, los componentes moleculares principales, po- seen en cada érgano una velocidad de recambio caracteristica. El recambio metabélico es particularmente rapido en las cé- lulas 0 en los tejidos que (como el higado y Ia mucosa intes- tinal) deben autoadaptarse rapidamente a los cambios de composicién quimica de sus elementos nutritivos exégenos. Estos tejidos sintetizan rapidamente enzimas especificos a par- tir de los aminodcidos, para catalizar la utilizacién de los nuevos componentes organics presentes en el cambiante medio nutricio que entra; tales enzimas son degradados posterior- mente cuando ya no son necesarios y son substituidos por otros enzimas a medida que varia el aporte nutritivo. Métodos experimentales para estudiar el metabolismo intermediario Son dos los objetivos principales del analisis experimental de una secuencia metabélica determinada. El primero es la identificaci6n de la ruta quimica, la estequiometria y el meca- nismo de cada etapa de reaccién en la secuencia. Esta fase comprende la identificacién de cada uno de los intermediarios de la ruta asi como la extraccién de cada uno de los enzimas de la secuencia, su purificaci6n y la investigacién de su espe- cificidad, cinética, mecanismo e inhibicién. Culmina el estudio con la reconstruccién del sistema enzimatico 100 Capitulo 14 Panordmica del metabolismo intermediario Estudios metabolicos con organismos intactos El comienzo y el final de algunas rutas metabélicas principa- les ha sido identificado a partir del estudio de los balances metabélicos de entrada y salida en organismos intactos. De este modo se descubrié que el diéxido de carbono, que puede ser recuperado cuantitativamente en el aire expirado y en la orina de los animales, era el producto final de la oxidacién de los hidratos de carbono. De modo analogo se constaté que el etanol y el diéxido de carbono eran los productos prin- cipales de la fermentacién de la glucosa por la levadura, y se identificé la urea en la orina de algunos mamiferos como un producto final nitrogenado importante de la degradacién de las proteinas. Sin embargo, las etapas intermedias del cata- bolismo de los nutrientes principales no pueden reconocerse mediante tales balances. Aunque los intermediarios del metabolismo estan presentes normalmente en las células, en las bajas concentraciones del estado estacionario, a veces, pueden acumularse metabolitos especificos bajo estados de tensién o de desequilibrio, creados por disfunciones o enfermedades, y proporcionan claves im- portantes acerca de la naturaleza quimica de una ruta meta- bélica determinada o de alguna de sus etapas. Por ejemplo, se observ en seguida que durante las contracciones muscu- lares repetidas aparecian grandes cantidades de Acido lactico en la sangre a medida que desaparecia el glucégeno del miusculo, indicando con ello que la molécula de la glucosa, de seis atomos de carbono, se escinde para dar fragmentos de tres carbonos. Otros ejemplos son los proporcionados por animales en ayuno 0 diabéticos, en los que la utilizacién de la glucosa se ve impedida mientras que los 4cidos grasos llegan a constituir la fuente energética principal, Los cuerpos ceténicos (Acido B-hidroxibutirico y Acido acetoacético) apare- cen en la sangre y en la orina de estos animales en gran cantidad, lo cual permitié que fueran reconocidos como inter- mediarios en la oxidacién de los acidos grasos. Por otra parte, si se administran ciertos aminodcidos tales como alanina o Acido glutémico a animales diabéticos, aumenta la excrecién de glucosa, lo que demuestra que los esqueletos carbonados de ambos pueden desempefiar el papel de precursores meta- bélicos de la glucosa. Por otra parte, la tirosina y la fenilala- nina no producen ningiin incremento en la excrecién de glu- cosa, pero si inducen un incremento en la formacién de acido acético, probando con ello que los esqueletos carbonados de estos dos aminodcidos son convertidos metabélicamente en acetoacetato, EI tratamiento de los organismos intactos con ciertas drogas © inhibidores puede también provocar la acumulacién en la sangre o en los tejidos de un metabolito especifico. Por ejem- plo, la administracién de fluorocitrato provoca que el citrato se acumule en el higado de algunos animales debido a que inhibe competitivamente la oxidacién enzimética del citrato. La perfusién del sistema vascular de érganos aislados tales como el higado o el rifién con sangre o disolucién salina tamponada que contenga un precursor metabélico, seguida del andlisis quimico del fluido obtenido en Ja perfusion, cons- tituye otro método de abordar el problema metabélico que puede proporcionar informacién valiosa sobre las rutas meta~ 385 PaRTE 2. CATABOLISMO Y PRODUCCION DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO bélicas. Mediante este método quedé establecido que el higado es el centro principal de formacién de cuerpos ceténicos y de urea y de la conversién de ciertos aminodcidos en glucosa. Métodos de los cortes de tejidos supervivientes y métodos manométricos Otra técnica muy utilizada en los estudios iniciales del meta- bolismo intermediario tanto en'tejidos animales como vege- tales es el método de los cortes de tejidos supervivientes, in- troducido por O. Warburg en los afios 1920. Los tejidos s6lidos, vegetales o animales, se seccionan en finas lonjas, en las cuales la mayor parte de las células permanecen intactas. Pueden obtenerse cortes lo suficientemente finos (< 0,4 mm) como para asegurar que la velocidad de difusién del oxigeno y de los metabolitos hacia el interior y el exterior de aquellas células, desde el medio acuoso en que se hallan suspendidas, no sea la velocidad limitante para los cambios metabélicos que se producen en el interior de las mismas. Los cortes de tejido se incuban en un medio tamponado con un metabolito deter- minado, cuya conversién en otros productos metabélicos se estudia, y estos tiltimos se acumulan en el medio. La velocidad de muchos acontecimientos metabélicos, por ejemplo la con- version de la glucosa en Acido lactico por los tejidos animales, puede determinarse por medidas quimicas de los cambios que ocurren en el medio en el que se hallan suspendidos los cortes del tejido. También es posible determinar la velocidad de con- sumo del oxigeno por los cortes de tejidos supervivientes. La disminucién de la presién parcial del oxigeno sobre una sus- pensién de cortes de tejido, se mide mediante el dispositive manométrico llamado aparato de ;Warburg-Barcroft (fig. 14-9). Esta técnica manométrica tuvo mucha importancia, por ejem- plo, en el estudio sobre las reacciones del ciclo de los acidos tricarboxilicos (pag. 457), Defectos genéticos en el metabolismo: mutantes auxdtrofos Otro método importante para abordar el estudio del metabolis- mo intermediario en las células intactas y en los organismos es el proporcionado por los mutantes genéticos de un organismo en el que existe un defecto en la biosintesis de un enzima determinado. Tales deficiencias genéticas, si no son letales, provocan frecuentemente la acumulacién y excre- cién del sustrato del enzima en defecto. En un organismo normal, que no haya sufrido mutacién, desde luego el inter- mediario no se acumularé, ya que experimentara su ulterior conversién metabélica. La identificacién del metabolito excre- tado por tales organismos mutantes puede proporcionar im- portante informacién acerca de una ruta metabélica. La ex- creci6n anormal de acido homogentisico por la orina (pag. 582) es debida a una de tales carencias genéticas en pacientes humanos y recibe el nombre de alcaptonuria (pg. 583). Puesto que la excrecién de este acido aumenta con la administracién de fenilalanina 0 tirosina, pero no con otros aminoacidos, se lleg6 a la conclusién de que el Acido homogentisico se forma como un intermediario durante el catabolismo de la fenilalanina 386 Figura 14-9 Aparato de Warburg-Barcroft para la medida del consumo de oxigeno de suspensiones de cortes de tejidos, 0 de homogenados. La incubacion se efectiia en un recipiente de reaccién especial unido a un manémetso para medir la disminucién en la presién del oxigeno a medida que tiene lugar Ia eespiracién. Brazo lateral Disolucién de tun sustrato que debe afiadirse en el instante cero, decantando el recipiente Medio de reaccién que Pocillo central que contiene contiene papel homogenado de filtro y KOH del tejido ppara absorber el ‘© una suspension COs que se. pro- de cortes en un duce durante la medio tamponado —_respiracién El recipiente de reaccion se sacude mientras esté sumergido en un bafio a temperatura constante. El diéxido de carbono producido durante la respiracién, se absorbe de modo continuo de la fase gaseosa, por el KOH del pocillo central. De este modo, la presién parcial del CO; en la fase gaseosa se mantiene muy préxima a cero, y los cambios de presién que se observan, se deben solamente a los cambios de presion de oxigeno. El consumo 0 la produccién de metabolitos puede determinarse por medidas quimicas del medio en suspensién. Bafio de agua a temperatura constante |— Fluido manométrico Manémetro de volumen constante Capitulo 14 Panorémica del metabolismo intermediario y de la tirosina. Se conocen otros muchos defectos genéticos del metabolismo de los aminoacidos en los seres humanos que han proporcionado pruebas claras sobre la naturaleza de las etapas de reaccién intermedias en el catabolismo de los aminoacidos (pag. 582). Para el estudio del metabolismo, resultan mucho mas utiles las deficiencias genéticas especificas inducidas en microorga- nnismos por diversos agentes mutagénicos, tales como la radia- cién. Pueden producirse literalmente a voluntad, microorga- nismos mutantes carentes de una ruta especifica o de un enzima determinado, convirtiéndose asi en eficaces instrumen- tos para el estudio del metabolismo intermediario. En 1941 fue postulada por G. W. Beadle y E. L. Tatum la relacién «un gen-un enzima», basandose en sus estudios de mutantes del hongo Neurospora crassa. Los métodos que desarrollaron fueron de gran importancia no solamente para el estudio de Ja relacién gen-enzima, sino también para el analisis de las rutas del metabolismo intermediario. El tipo primitivo, es decir, la Neurospora no mutada, puede crecer en un medio sencillo que contenga glucosa como tnica fuente carbonada y amo- niaco, como tinica fuente de nitrogeno. Sin embargo, la ex- posicién de las esporas de Neurospora a la accién de los ra- yos X origina algunas células mutantes que ya no son capa- ces de desarrollarse en dicho medio sencillo. Tales células mutantes creceran normalmente si se suplementa el medio con el metabolito especifico cuya sintesis fue impedida por la mutacién. Por ejemplo, algunos mutantes de Neurospora son incapaces de crecer a menos que el medio contenga arginina, Jo cual sugiere que en estos mutantes existe un defecto gené- tico de un enzima necesario para la sintesis de arginina a partir de amoniaco. La falta de arginina determina que tales células mutantes no puedan fabricar sus proteinas. Las célu- las mutantes pueden emplear la arginina para la biosintesis de las proteinas y muestran un crecimiento normal solamente cuando este aminoacido es aportado al medio, Estudios pos- teriores han revelado que no todos los mutantes de Neuros- pora carentes de la capacidad de sintetizar arginina son idén- ticos; difieren con respecto a la etapa especifica de la ruta de la biosintesis de la arginina en la que aparece la deficiencia genética. Se descubrié asi que el mutante I arginino-defectivo (fig. 14-10) puede crecer iinicamente si se afiade arginina al medio, pero no por la adicién de cualquier precursor conocido tal como los metabolitos A, B, C o D, indicando que este mutante carece del enzima E,. Sin embargo, el mutante IT arginino-defectivo creceré si el medio es suplementado con el precursor D 0 con arginina, pero no lo hara si se afiaden los precursores A, B o C, indicando con ello que la sintesis de arginina y, por tanto, el crecimiento todo, est& bloqueado por la carencia del enzima E;. Este tipo de mutantes, bloquea- dos en diferentes puntos de una ruta metabélica, pueden em- plearse para ensayar sustancias que se sospecha puedan ser los precursores de un producto determinado, estableciendo la secuencia por la que tales precursores se convierten en el producto. Tales conjuntos de mutantes pueden utilizarse por otro lado, para identificar los intermediarios de una secuencia bioqui- mica. Por ejemplo, cuando el mutante I (fig. 14-10) se cultiva en presencia de cantidades pequefias y limitantes de arginina, 387 PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIGN DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO el precursor D bloqueado se acumularé en el medio de cultivo ya que no puede convertirse en arginina. Después de la eli- minacién de las células del mutante I por filtracién, este medio permitira la multiplicacién del mutante II en ausencia de arginina ya que aporta el precursor D. Sin embargo, el filtrado del mutante If no mantendré el crecimiento del mu- tanted. Este tipo de experimento se conoce como alimentacion crazada. El precursor producido por el mutante I, que puede alimentar al mutante II, podra entonces ser aislado e identi- ficado; la velocidad de crecimiento del mutante II puede em- plearse como un método biolégico de determinacién del pre- cursor. Los mutantes que muestran carencias en una ruta de biosintesis, pero que vuelven al crecimiento normal. cuando se les proporciona el producto normal de dicha ruta, reciben el nombre de mutantes auxétrofos. Puede utilizarse a los mutantes también para el andlisis de las rutas catabélicas, Por ejemplo, las células de E. coli, de tipo primitivo, son capaces de crecer sobre lactosa, glucosa © galactosa como fuentes carbonadas, En algunos mutantes de E. coli la capacidad de crecer sobre lactosa se ha perdido, pero las células son todavia capaces de crecer utilizando los otros azticares. El defecto genético afecta en este caso al enzima f-galactosidasa, que puede hidrolizar a la lactosa (pag. 991) en sus componentes glucosa y galactosa. Los métodos genéticos comentados de empleo de microor- ganismos mutantes, han servido para poder identificar a mu- chos intermediarios en las rutas metabélicas, Métodos de marcaje isotépico Otro método eficaz, aplicable al estudio del metabolismo en los organismos' intactos, es el empleo de un metabolito mar- cado de modo que puedan seguirse sus transformaciones me- tabélicas. Este método fue utilizado ya en el afio 1904, en que el bioquimico aleman F. Knoop encontré que un grupo fenilo, que figuraba como sustituyente en el carbono metilico terminal de un acido graso, permanecia ligado a aquel atomo a través de la degradacién oxidativa del acido graso. Los animales alimentados con Acidos grasos fenil-sustituidos de cadena larga excretaban por la orina productos de degradacién fenil-sustituidos, de cuya estructura dedujo Knoop que los Acidos grasos se oxidan por separacion sucesiva de fragmentos de dos carbonos (pag. 556). Este método primitivo de mar- caje quimico ha sido superado ahora con el empleo de is6topos estables 0 radiactivos para marcar ciertos atomos de un me- tabolito determinado, de modo que para todos los efectos practicos resulta quimica y biolégicamente indistinguible de su andlogo normal, Debido a la presencia del isétopo, tanto metabolito como productos de transformacién pueden ponerse de manifiesto y valorarse (tabla 14-5). Se ha efectuado un nimero extraordinario de observaciones importantes con la técnica de los trazadores isotépicos aplicada a animales in- tactos, a vegetales y a microorganismos, asi como a 6rganos aislados 0 extractos de tejidos. Entre ellos figura el descubri- miento de que los atomos de carbono del colesterol (pag. 692) provienen del acetato, y que la glicina es un precursor en la sintesis de las purinas (pag. 739) y de las porfirinas (pagi- na 730). El estudio de muchos aspectos del metabolismo (entre 388 Figura 14-10 Mutantes auxétrofos de Neurospora crassa con carencia de enzimas (color) en diferentes puntos de la biosintesis de la arginina @ partir del precursor A, Tipo ® primitivo 4 —&+p—=>c—2+D—> Arg Mutantel =. p—=+C—+ D> Arg 5 % Mutante I 4 + p+ CR D> Arg MutanteItl q+ p# > C+D Arg Tasta 145. Algunos is6topos empleados como trazadores: Abundancia natural Isé- relativa Tipo de topo % —radiacién Vida media HH (0.0154 Estable iH 12,1 affos ac a Estable 4c B- 5,700 afios aN 0,365 Estable 40 0,204 Estable Na Sh a 143 dias as B 87,1 dias HCl B 31108 atios aK a 15h Ca B 152 dias Fe 45: dias ‘a 8 dias + El indice superior delante del simbolo del elemento representa el nimero de masa, el subindice el nimero atémico, La radiacién B° es debida a los electrones negativos. La radiactividad se expresa en la unidad curie (Ci), que es 1a cantidad que experimenta el mismo nimero de desintegraciones por se- gundo que 1,0 g de radio (3,7 x 10" s*); el milicurie y el microcurie son unidades mas ‘tiles. Los isétopos estables se miden en porcentaje de atomos en exceso sobre le abundancia natural. Capitulo 14 Panordmica del metabolismo intermediario ellos los de las velocidades de recambio metabélico, la biosin- tesis de las proteinas y de los acidos nucleicos, y la fotosin- tesis) habrian sido completamente imposibles sin los experi- mentos Ievados a cabo con los metabolitos marcados iso- tépicamente. El método de los trazadores isotépicos puede emplearse también, para determinar cual es la velocidad de los procesos metabilicos en los organismos intactos, y si para un deter- minado metabolito una ruta metabélica es la predominante. Se ha utilizado también el mismo método para establecer si una ruta metabélica que ha sido postulada por el estudio de enzimas aislados «in vitro» sucede en la realidad en la célula intacta (véase cap. 17) Sistemas exentos de células El método experimental directo para identificar las etapas- de reaccién individuales en una secuencia metabélica deter- minada es el estudio de dispersiones de células o de tejidos, en las que la membrana se ha roto y el contenido celular se ha liberado. Tales dispersiones 0 extracts solubles, prepara- dos por centrifugacién, pueden frecuentemente llevar a cabo una secuencia metabélica completa. Asi, el conocimiento que poseemos en la actualidad de los detalles de la conversién de Ja glucosa en etanol y en diéxido de carbono, comenzé con el descubrimiento efectuado por E. Buchner en 1897 de que los extractos de levadura carentes de células catalizan la fermentacién alcohélica de la glucosa y conducen a la obten- cin de etanol y de CO;. De modo analogo se demostré pos- teriormente que la conversién de la glucosa en Acido lactico se produce en extractos de musculo libres de células. Una vez obtenidas tales preparaciones, se logré la acumulacién de los intermediarios metabélicos mediante el empleo de inhibi- dores especificos de los enzimas (pg. 429) por inactivacién de enzimas especificos 0 por separacién de coenzimas esen- ciales del extracto. La identificacién quimica de un interme- diario que se acumula después de este tratamiento permite la identificacion de la reaccién enzimatica mediante la que se forma el intermediario, y la reaccién para la cual es utilizado, En tltimo término, el enzima puede aislarse de la célula o del extracto tisular. El objetivo final es la reconstruccién de parte o de todo el sistema enzimatico mitua- mente: las células fotosintéticas emplean didxido de carbono atmosférico y energia solar para sintetizar la glucosa y desprenden oxigeno, mientras que Jas células quimiorganotroficas de los animales oxidan a la glucosa Y a otros productos de la fotosintesis, a expensas del oxigeno molecular, para asi liberar energia y diéxido de carbono. La energia solar es la fuente de energia fundamental para todas Jas formas de vida En el ciclo biolégico del nitrégeno, las plantas obtienen su nitrégeno fen forma de nitrato reduciéndolo a amoniaco y a aminodcidos; estos ulti- mos son utilizados después por los animales y devueltos at suelo en forma de urea o de amoniaco, los cuales son reoxidados a nitrato, por bacterias del suelo. Solamente las bacterias fijadoras de nitrégeno pueden emplear el nitrégeno molecular de la atmésfera. Algunos organismos precisan de aminodcidos exégenos © preformados, y de purinas o de pirimidinas como fuentes nitrogenadas. El metabolismo intermediario puede dividirse en rutas catabélicas, que son Jas responsables de la degradacién de las moléculas nutritivas de alto contenido energético, y en rutas anabélicas, por las cuales se efectia la biosintesis de los componentes celulares; la ruta anfibélica central puede desempefiar ambas capacidades. Cada ruta se halla promovida por una secuencia de enzimas especificos que cataliza reacciones consecutivas. Las Tutas catabélicas y anabélicas que se inician en un nutriente determinado © que conducen a él, como la glucosa, no son exactamente inversas una de otra, sino que son quimica y enziméticamente diferentes. Ademés, se hallan reguladas independientemente y se localizan en diferentes partes de Ia célula. El catabolismo de las moléculas de Ios compuestos nutritivos va acompafiado de la conservacién de parte de la energia de aquéllos en forma de energia de enlace fosfato del trifosfato de adenosina (ATP). Reciprocamente, la energia quimica necesaria para las rutas biosintéticas es aportada por la desfosforilacion del ATP, La energia quimica es trans- portada también desde las rutas catabdlicas a las anabélicas en forma de coenzimas reducidos, especialmente de NADPH. Las rutas metabélicas en las células intactas pueden investigarse por medio de estudios de los balances de productos de entrada y de salida, 393 PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIGN DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO en organismos normales, patolégicos, en estado de tension (stress) 0 de envenenamiento, por perfusién de érganos intactos y mediante el estudio de cortes de tejido superviviente. Los microorganismos con carencias ge- néticas, lamados auxétrofos, han ‘resultado también muy dtiles para el anilisis de las rutas metabélicas. La técnica del marcado isot6pico cons- tituye un sistema eficaz para el estudio de las rutas, de las velocidades y de diversas alteraciones del metabolismo. Una vez se ha podido demos- trar una determinada conversién metabélica en un sistema exento de eélulas, Jos enzimas individuales que catalizan las reacciones separadas pueden ser aislados ¢ identificados. El metabolismo se halla regulado por las propiedades cinéticas intrinsecas de los enzimas, mediante la accién de enzimas reguladores 0 alostéricos, por las variaciones en la velocidad de biosintesis de los enzimas y por la accién hormonal. Bibliogratia Libros BiRNEE, 6. D. (ed.): Subcellular Components: Preparation and Fractionation, 2+ ed, University Park Press, Baltimore, 1972. CHASE, G. Di, y J. L, RABINOWITZ: Principles of Radioisotope Methodology, 2+ ed., Burgess, Minneapolis, 1962. 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Problemas 1, La descomposicién o desintegracién de los radioisétopos es un proceso de primer orden (pag. 192) dado por la relacién log No = At 8 'N, ~ 2,308 394 2. Capitulo 14 Panorémica del metabolismo intermediario en la que No es el mimero de tomos del radioisctopo presentes en #=0, N, es el mimero presente en el tiempo t, y 2 la constante de desintegracién, que se expresa en unidades de ¢". La vida media, fin de un radioisétopo es el tiempo consumido para que el nimero de ‘tomos del radioisétopo se reduzca exactamente en un 50 por ciento, Obténgase una expresién para fi: en funcién de d. La determinacién directa del nimero de dtomos de un radicisétopo en una muestra determinada no resulta factible. En su lugar, la determinacién de los radioisétopos se realiza mediante medida de una cantidad proporcional, y el mimero de desintegraciones por unidad de tiempo. Tales medidas se efectian con un contador Geiger o de centelleo y se expresan, frecuentemente, en mimero de cuentas por unidad de tiempo. Si una muestra que contiene =P, da 1,5 x 10 cuentas por minuto en un sistema de contaje determinado, jcusntas cuentas por minuto daré exactamente una semana més tarde? (En este problema y en los siguientes refiérase a los datos de la tabla 14-5). Una muestra que contiene un radioisétopo hipotético dio 10000 cuen- tas por minuto, y 24 horas més tarde 6000 cuentas por minuto. ¢Cual es la vida media del radioisétopo? 4Cuénto tiempo tardaré una muestra de "S en perder el 95% de su radioactividad inicial? Una muestra que contenia "Py “S dio 3,52 x 10° cuentas por minuto inicialmente, y exactamente 30 dias més tarde, dio 2,21 x 10° cuentas por minuto, Qué fraccién de la radioactividad de la muestra original era debida al "Py cual al *S? La actividad especifica de una sustancia puede definirse como el ni- mero de cuentas por minuto por unidad de dicha sustancia. A una disolucién de p-galactosa se le aftadieron 0,1 mg de galactosa marcada con “C, con una actividad especifica de 1,00 x 10* cuentas por minuto por miligramo. La actividad especifica de la mezcla resultante se de- ferminé que era de 1,37 X 10° cuentas por minuto y por miligramo. iCual era la concentracién de galactosa en la muestra original? Pueden calcularse los volimenes de distribucion de las sustancias (tamatio del

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