reo 1 9 Fosforilacién oxidativa, estructura mitocondrial y compartimentacién del-metabolismo respiratorio En el capitulo precedente se han estudiado los componentes de la cadena respiratoria, asi como el proceso de transporte electrénico desde los sustratos organicos al oxigeno. A con- tinuacién estudiaremos la fosforilacién oxidativa, mecanismo por el cual la disminucién de energia libre que acompaiia a la transferencia de electrones a lo largo de la cadena respira- toria, se acopla a la formacién de los grupos fosfato de con- tenido energético elevado del ATP. La fosforilacién oxida- tiva es fundamental para todos los aspectos de la vida celular en los organismos aerébicos, ya que es su principal fuente de energia atil, Constituye-también un importante problema de investigacin, cuya resolucién ‘final dependera de la compren- sién detallada de la organizacién’ molecular de la membrana mitocondrial interna, que es el centro de este importante sis- tema de transduccién de energia. La discusién comenzara, por tanto, con una-descripcién de la estructura de las mitocondrias. Se vera también en este capitulo que la membrana mitocon- drial contiene cierto ntimero de sistemas de transporte que promueven el movimiento de algunos metabolitos y iones mi- nerales entre la matriz mitocondrial y el citosol circundante. Estos sistemas de transporte son elementos constituyentes de Ja compartimentacién y regulacién de la energia del metabo- lismo, participando asimismo en otras actividades metabélicas importantes. Estructura de las mitocondrias El numero de mitocondrias por molécula es relativamente cons- tante y caracteristico para cada tipo determinado de célula, Una célula de higado de rata, por ejemplo, contiene cerca de 800 mitocondrias (véase fig. 1-8, pag. 34). Las mitocondrias se hallan frecuentemente localizadas en las proximidades de las estructuras que precisan ATP, producto principal de su acti- vidad bioquimica, 0 cerca de una fuente de combustible, de la cual dependen, Por ejemplo, en los mtsculos voladores de algunos insectos, las mitocondrias estan distribuidas regular- mente a lo largo de las miofibrillas (pag. 777). Asi, las mo- léculas de ATP formadas por estas mitocondrias no necesitan mas que difundirse a una corta distancia hasta los elementos contractiles que precisan ATP. Las mitocondrias estén tam- 519PARTE 2 CATAROLISMO Y PRODUCCION DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO Ficura 19-1 Figura 19-2 Estructura de las mitocondrias, Variaciones de la estructura de las crestas en las mitocondrias de diferentes Micrografia electrénica de barrido («scanning») de mitocondrias tipos de células. hepéticas intactas en estado aislado. Micrografia electiénica de una seccién delgada de una mitocondria de una célula pancredtica de murciélago. KR Porter Representacién ge una mitocondria de corazén en la que se muestra Ja ordenaci6n tridimensional de las membranas. (De Peter Raven y Helena Curtis, Biologia vegetal, Ediciones Omega, S. A., Barcelona, 1975). Membrana exterior Misculo volador de moscarda (aminillas perforadas) 520Ficura 19-3 Microgratias electronicas de las esferas de la membrana interna situadas sobre las crestas, después del tefido ‘con contraste negative. En este procedimiento las mitocondrias rots se mezclan con disolucién de fosfotungstato, se desecan ¥ se examinan por microscopia electronica. Debido a que el fosfotungstato es opaco a los electrones, rodea la estructura membranosa esbozando su perfil. Perfil de las crestas en el misculo volador de moscarda. Dt, Smith Superficie interior de la membrana interna. Capitulo 19 Fosforilacién oxidativa, estructura mitocondrial bién situadas frecuentemente junto a las gotitas citoplasma- ticas de grasa, las cuales les sirven de fuente de combustible para la oxidacién, Las mitocondrias pueden representar una fraccién relativamente grande del volumen citoplasmatico total; en la célula hepatica Megan a constituir alrededor del 20 % de la misma (pag. 35), y cerca del 50 % en las células del misculo cardiac, Las mitocondrias de las células grasas de color pardo, son esféricas o casi, tienen forma elipsoidal en las cé- lulas hepaticas, son cilindricas en las células renales y filamentosas en los, fibroblastos. Poseen, a veces, una es- tructura muy irregular y compleja, con abultadas protuberan- cias, como por ejemplo en las células de levadura. Las mito- condrias que han sido estudiadas con més detalle son las de higado de rata, cuya microscopia electrénica muestra que poseen una longitud de 2 ym y algo menos de 1 ym de an- chura en la célula intacta (fig. 19-1). Tienen, por tanto, el mismo tamafio que las bacterias (pag. 32). Las mitocondrias poseen dos membranas (fig. 19-1): una externa, que es lisa y algo elastica, y otra interna que tiene pliegues internos o invaginaciones llamados crestas, Estas varian en nimero y en estructura segtin el tipo de célula (fig. 19-2). Son recursos para aumentar el area superficial de la membrana interna en relacién con el volumen mito- condrial, En el interior del compartimiento interno se halla la matriz. Esta fase gelatinosa contiene cerca del 50 % de proteina, parte de la cual se halla organizada en un reticulo ligado, segin parece, a la superficie interna de la membrana interior. La ma- triz experimenta enormes cambios de volumen y de organiza- cién durante los cambios de la actividad respiratoria (pag. 529). La matriz.contiene tambien DNA y ribosomas; estos tltimos estan a menudo localizados cerca de la porcién de la mem- brana interna, que se halla apoyada intimamente en la membrana externa. Las membranas mitocondriales externa e interna difieren en ultraestructura, segiin revela el tefido por contraste nega- tive (fig. 19-3), Con este método, H. Fernandez Moran de- mostré que la superficie interna de la membrana interior se halla recubierta de particulas esféricas, espaciadas regular mente (didmetro 8,0 a 9,0 nm) y conectadas a la membrana Por un estrecho vastago (fig. 19-3), Estas estructuras, seme- jantes a pomos, que al principio fueron llamadas particulas elementales, pero que ahora son conocidas como esferas de la membrana interna (pag. 532), no se hallan presentes en la superficie exterior de la membrana interna ni en cualquiera de las dos superficies de la membrana externa. Localizacién de los enzimas en las mitocondrias La membrana exterior puede obtenerse de las mitocondrias hepaticas. La estructura mitocondrial remanente, que esta constituida por la membrana interna intacta y la matriz, se lama generalmente mitoplasto (fig. 19-4). El contenido de la matriz puede extraerse, a partir de estas preparaciones, con detergentes neutros, como por ejemplo Lubrol. La membrana exterior, la membrana interior y la matriz han sido analizadas para establecer su composicién molecular y su contenido en- 521PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCION DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO ‘Tapta 19-1. Localizacién de algunos enzimas en las mitocondrias de higado de rata. ‘Membrana externa Monoamino-oxidasa ‘Quinurenin-3-monoxigenasa NADHdeshidrogenasa (insensible a la antimicina) Acil-CoA-sintetasas Fosfolipasa Ay ‘Nuclessido-difosfato-quinasa Espacio intermembranoso Adenilato-quinasa ‘Membrana interna NADH-deshidrogenasa (sensible a la antimicina) Proteinas ferrosulfuradas Citocromos b, €, €1 ¥ 8a ATPasa F, Succinato-deshidrogenasa .8-hidroxibutirato-deshidrogenasa Carnitina-aciltransferasa Matiz Chtrato-sintasa Ieocitrato-deshidrogenasa Malato-deshidrogenasa Glutamato-deshidrogenasa Aspartato-transaminasa Enzimas de oxidacion de AciNgraso)-CoA (cap. 20) zimatico (tabla 19-1). La membrana interior contiene los cito- cromos b,c, cy, a y a, la ATPasa F,, asociada con el meca- nismo de la fosforilacién oxidativa (pag. 524), asi como ciertas deshidrogenasas, en particular-las del succinato (pag. 469) y las del NADH (pag. 496). La fraccién de la membrana ex-pcuen 19-4 terna no contiene ninguno de estos componentes, pero POsee — rrvocondrias de higado de cata después enzimas caracteristicos ausentes en la membrana interior, ge separar la membrana externa siendo los mas caracteristicos la monoamino-oxidasa, que es —_(mitoplastos). Las estructuras abultadas una flavoproteina que cataliza la oxidacién de diversas mono- —_son, probablemente, crestas vueltas de aminas, tales como la adrenalina (pag. 821). La monoamina —enfro afuera. oxidasa se emplea como enzima NAD* + 4H,0+3ATP (1) Esta ecuacién de reaccién puede separarse en un componente exergénico, NADH + H* + 40, —+ NAD* + H,O AG* =—52,7 kcal mol? y un componente endergénico, 3ADP + 3P; — 3ATP + 3H,0 AG” = 3 X 7,3 = +21,9 kcal mol"? La fosforilacién acoplada de tres moléculas de ATP conserva, de este modo, 21,9/52,7 x 100, 0 sea, alrededor del 42 % del descenso de la energia libre total durante el transporte de un par de electrones desde el NADH hasta el oxigeno en las condiciones estandar habituales. Se han podido poner de manifiesto, también, los tres lu- gares aproximados de la cadena respiratoria en los que se libera energia. La prediccién se ha podido efectuar a partir de los cAlculos de la variacién de energia libre que se produce durante la transferencia-de un par de equivalentes electréni- cos en cada una de las etapas sucesivas de transferencia electrénica de la cadena respiratoria. Se han efectuado este tipo de cAlculos utilizando la relacion AG =—n¥ AE, gue se ha descrito en el capitulo precedente (pag. 509), utili- zando los potenciales de oxidorreduccién estandar resefiados en las tablas 18-1 y 18-4. La figura 19-7 muestra que existen tres zonas en la cadena en las que se producen descensos relativamente grandes de energia libre, cada uno de los cuales es lo suficientemente grande como para aportar la energia {al menos te6ricamente) necesaria para la formacién de ATP a partit de ADP y fosfato. Tales calculos se basan, desde luego, en el supuesto de un equilibrio termodinémico, aunque no tiene por qué existir en ninguna de las etapas en Ia célula 525PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCION DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO +o2| +04! +0, +08! O: intacta, y también en el supuesto de que las concentraciones de todos los componentes sean la concentracién estandar 1,0 M, lo cual es también una condicién poco probable. No obstante, por métodos experimentales directos, en los que se han ensayado porciones especificas de la cadena respiratoria para determinar su capacidad de propiciar la formacién de ATP, se ha demostrado que estas zonas son, en realidad, los centros de acoplamiento de energia en la cadena respiratoria, Se designan como centro I (el trecho entre el NADH y el coenzima Q), centro II (el tramo entre el citocromo 6 y el citocromo c) y centro III (entre el citocromo a y el oxigeno). De este modo, puede considerarse a la cadena respiratoria for- mada por varios componentes, como un sistema que efectia la descomposicién en una serie de descensos menores de energia del gran decremento de energia libre que se produce cuando un par de electrones se desplaza desde el NADH (E) = —0,32 V) hasta el oxigeno molecular (Ey) = +0,82 V), proceso que rinde 52,7 kcal de energia libre por atomo de oxigeno reducido, Tres de esos tramos liberan la suficiente energia para producir una molécula de ATP a partir del ADP y del fosfato (pag. 408). La cadena respiratoria puede consi- derarse por ello como un dispositivo transformador de energia. En la figura 19-8 vemos que la oxidacién mitocondrial de muchos sustratos dependientes de NAD, y no solamente los del ciclo de los acidos tricarboxilicos, conduce a la formacién de tres moléculas de ATP por atomo de oxigeno reducido (P/O = 3,0), Sin embargo, algunos metabolitos como por ejemplo el succinato (pag. 469), los derivados acilados grasos del CoA (pag. 560), asi como el glicerol fosfato (pag. 545) son deshidrogenados por las flavoproteinas, que evitan por rodeo al centro I, y aportan electrones directamente a la ubiquinona (fig. 18-14), dando por resultado que solamente se formen dos moléculas de ATP (en los centros II y III) por tomo de oxigeno reducido (relacién P/O = 2,0). Diagrama del balance energético para la oxidacién de Ia glucosa A partir de los datos de la tabla 19-3 vemos que por cada molécula de piruvato que se oxida completamente se forman 526 Figura 19-7 Disminucion de ta energia libre a medida que los pares de electrones fluyen a lo largo de ta cadena respiratoria hasta el oxigeno. Cada uno de los tres segmentos, representado en color, rinde la energia suficiente para generar una molécula de ATP a partir de ADP y de fosfato.Figura 19-8 Centros probables de conservacién de la energia en la cadena respiratoria, NADH | Fes. Pome He oe 8 ee ADP + Py ATP + H,O ADP +P, ATP + H,O ADP +P, ATP +H, Capitulo 19 Fosforilacin oxidativa, estructura mitocondrial 12 moléculas de ATP en las cuatro etapas dependientes del NAD, es decir, la oxidacién del piruvato, del isocitrato, del a-oxoglutarato y del malato, “Se forman dos moléculas de ATP durante la oxidacién del succinato dependiente de la flavina (pag. 469), y se produce una molécula de ATP en la fosforilacién a nivel de sustrato a expensas del succinil-CoA (pag. 469), lo que constituye un total de 15 ATP formados por molécula de piruvato oxidada. Podemos escribir, por tan- to, una ecuacién de la oxidacién completa del piruvato en las mitocondrias que incluya las fosforilaciones acopladas: Piruvato + 2440; + 15P, + 15ADP —> 3CO, + 15ATP + 17H,0 Podemos presentar ahora un conjunto de ecuaciones para la oxidacién aerébica completa de la glucosa a CO; y agua, y para la conservacién de la energia libre en forma de ATP. Para la secuencia glucolitica hasta el piruvato tenemos la reaccién Glucosa + 2P, + 2ADP + 2NAD* —> 2 piruvato + 2NADH + 2H* + 2ATP + 2H,O (2) y para el ciclo de los acidos tricarboxilicos 2 piruvato + 50, + 30ADP + 30P, —> 6CO; + 30ATP + 34H,0 (3) Debemos afiadir a éstas la ecuacién para la oxidacién de las dos moléculas del NADH extramitocondrial formadas en la conversién glucolitica de la glucosa en piruvato. La oxidacién del NADH extramitocondrial puede producir dos 0 tres molé- culas de ATP por par de electrones, segin el modo como penetren en las mitocondrias los electrones del NADH extra- mitocondrial (pag. 544). Si suponemos que en este proceso se forman dos moléculas de ATP, tendremos 2NADH + 2H* + O: + 4P, + 4ADP —> 2NAD* + 4ATP + 6H;O (4) La suina de las ecuaciones (2), (3) y (4), sera, por tanto Glucosa + 60; + 36P, + 36ADP —> 6CO; + 36ATP + 42H;O (5) Disociando esta ecuacién global en sus componentes energéti- cos, tendremos: Componente exergénico: Glucosa + 60; —» 6CO, + .6H,O. AG” = —686 kcal mol Componente endergénico: 36P, + 36ADP —» 36ATP + 36H,0 AG” = +263 kcal mot La eficacia global de la recuperacién de la energia en la oxi- dacién completa de la glucosa es, por tanto, 263/686 x 100 igual 38 % en condiciones estandar. Sin embargo, en condi- aePARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCION DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO ciones intracelulares la eficacia verdadera es mucho mayor (pag. 442). Control de la velocidad del transporte electrénico por el aceptor La ecuacién global para la fosforilacién de la cadena respira- toria [ecuacién (1)] indica que el fosfato y el ADP son necesarios para el proceso del transporte electrénico desde el NADH hasta el oxigeno. De hecho, el transporte electrénico se efectiia a una velocidad maxima en las mitocondrias intac~ tas, solamente cuando hay fosfato y ADP en el medio de suspensién. Cuando sélo falta ADP la velocidad de la respi- racién es muy baja y no se produce fosforilacién debido a la inexistencia de aceptor de fosfato. Esta situacién, que se co- noce como estado 4 de la respiracién, es el estado perezoso, © de reposo, de la respiracién (fig. 19-9). Al afiadir posterior- mente una cantidad conocida de ADP a este sistema, el con- sumo de oxigeno experimenta un brusco incremento hasta un valor maximo; correlativamente, se observa que el ADP afiadido se fosforila y rinde ATP. Este estado recibe el nombre de respiracién activa, 0 estado 3. Cuando se ha fosfo- tilado todo el ADP ajfadido, la velocidad de consumo del oxigeno desciende bruscamente, y vuelve la velocidad del estado 4 0 de reposo (fig. 19-9). Este fendmeno, en el que la velocidad de transporte se halla controlada por la concentra- cién de ATP, se llama control _por el aceptor 0, con menor exactitud, control respiratorio. Las mitocondrias intactas po- seen una afinidad muy elevada para el ADP, y continuaran fosforilandolo siempre que estén presentes todos los demas componentes necesarios hasta que la concentracién de ADP sea muy baja, La relacién o indice control-aceptor, es la rela- cién entre la velocidad de respiracién de la mitocondria en presencia de abundante ADP y la velocidad de respiracién en ausencia de ADP. Esta relacion es generalmente muy ele- vada: puede ser igual a 10, 0 mayor, en las mitocondrias intactas, y atin mas elevada en la célula intacta. Sin embargo, cuando las mitocondrias se hallan lesionadas, o envejecidas, pierden su capacidad para fosforilar el ADP y la relacién des- ciende hasta 1,0. En tales mitocondrias dafiadas se produce transporte electrénico a una velocidad maxima en ausencia de ADP. La relacién control-aceptor constituye una medida util, de la integridad de las mitocondrias aisladas; cuanto mas elevada es la relacién, menos alteradas se hallan las mitocon- drias. Ademas, tal como se muestra en la figura 19-9, la can- tidad suplementaria de oxigeno consumido, inducida por una cantidad conocida de ADP, puede proporcionarnos la relacién ADP/O, que es igual a la relaci6n P/O anteriormente descrita. La ultraestructura de las mitocondrias experimenta notables alteraciones reversibles como resultado de las transiciones entre los estados respiratorios 4 (sin ADP) y 3 (con exceso de ADP) (fig. 19-10). Este efecto descrito por primera vez por C, R. Hackenbrock, y estudiado por otros muchos inves- tigadores, da por resultado una variacién de volumen y un cambio de configuracién del compartimiento de la matriz- membrana interna. En ausencia de ADP, el compartimiento interno de la mitocondria en respiracién Ilena completamente 528 Ficura 19-9 Control respiratorio por el aceptor. En ef estado 4 de la respiracion, todo el ADP disponible se ha fosforilado para dar ATP y el sistema se halla en reposo. Si se afiade ADP (SADP), la velocidad de consumo del oxigeno experimenta un brusco incremento al estado 3, 0 activo, durante el cual el ADP afadido se fosforila a ATP. Cuando se ha fosforilado casi fodo el ADP, las mitocondrias retornan a la velocidad del estado 4. La relacién de los moles de ADP aftadidos a los atomos de oxigeno adicional consumidos (relacién ADP/O) es igual a la relacion P/O. La relacién de la velocidad del estado 3 de la respiracién al estado 4 de la misma es la relacién de control por aceptor o respiratorio, Tiempo, minFigura 19-10 Capitulo 19 Fosforilacién oxidativa, estructura mitocondrial Microgratias electrénicas mostrando os cambios ulteaestructurales en las mitocondrias de higado de rata durante la transicién desde el reposo (estado 4) a la respicacién activa (estado 3). Este notable cambio en la estructura y volumen de la membrana interna y compartimiento de la matriz esta producido por la unién del ADP a las moléculas de la ADP-ATP-translocasa de la membrana mitocondrial interna, Conformacién ortodoxa a CR. Hackenbrock Tasta 19-4, Tipos de agentes que afectan a la fosforilacién oxidativa. Agentes desacoplantes 24-Dinitrofenol Dicumarol Fenilhidrazonas del cianuro de carbonilo Solicilanilidas Arseniato Inhibidores de la formacién de ATP Oligomicina Rutamicina Aurovertina ‘Trietiltina Tonéforos (transportadores de cationes) Valinomicina Gramicidinal Nonactina Nigericina Conformacién condensada CR. Hackenbrack el espacio rodeado por Ja membrana externa, lo que se llama estado ortodoxo. Al afiadir ADP para iniciar el estado 3 de Ja respiracién (activo), la matriz se condensa hasta un volumen. que es solamente de alrededor del 50% del que tiene en estado ortodoxo, y la membrana interna y las crestas se pliegan més estrechamente y se contorsionan. Este es el estado con- densado. Las configuraciones ortodoxa y condensada reflejan los estados «en suspenso» y «en marcha», respectivamente, del sistema mitocondrial productor del ATP. En las células hepaticas intactas en respiracién, las mitocondrias se hallan a mitad de camino entre los estados 4 y 3. La concentracién de ADP en las células normales intactas es relativamente baja e insuficiente para provocar las velocidades maximas de res- piracién. Al estimularse la actividad de las células, la veloci- dad de la respiracién aumenta, y las mitocondrias se hallaran, entonces, en el estado condensado, que corresponde al estado 3 de la respiracién. Desacoplamiento e inhibicién de la fosforilacién oxidativa El mecanismo molecular de la fosforilacién oxidativa ha cons- tituido, durante mucho tiempo, un interesante problema a re- solver. Se han realizado muchos intentos experimentales para aclarar las etapas intermedias. Uno de los métodos ha sido el empleo de inhibidores especificos para efectuar la diseccién del proceso global en reacciones individuales. La fosforilacién oxidativa resulta influida por cierto némero de agentes qui- micos que pueden agruparse en tres clases principales (tabla 19-4). Los agentes desacoplantes permiten la continuacién del transporte electronico, pero impiden la fosforilacién del ADP a ATP; es decir, desacoplan a las reacciones que producen energia de las que la conservan. Su caracteristica es que esti- mulan la velocidad de consumo de oxigeno de las mitocondrias eraPARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCION DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO intactas en ausencia de ADP (fig. 19-11). Ademés, provocan en aquéllas un gran aumento de actividad hidrolitica sobre el ATP, mientras que en ausencia de agentes desacoplantes, la actividad ATPasica de la mitocondria es muy débil. El primer agente desacoplante que se describié, por W. F. Loomis y F. Lipman, en 1948, es el 2,4-dinitrofenol. En la actualidad se conocen muchos agentes desacoplantes diferentes. La mayor parte de ellos son sustancias liposolubles que contienen un grupo acido y generalmente un anillo aromatico; en la figura“ 19-12 se muestran desacoplantes caracteristicos Estos agentes no desacoplan la fosforilacién glucolitica ni afectan, de modo directo, a otras reacciones celulares que no sean la fosforila- cién oxidativa. Los agentes desacoplantes acttian rompiendo © eliminando un intermediario o un estado de energia elevada generado por el transporte electrénico (pags. 503 y.536). Mas adelante veremos que los agentes desacoplantes pueden pro- mover el paso de iones H* a través de la membrana mitocon- drial, que normalmente es impermeable a dichos iones. La segunda clase de agentes, los inhibidores de la fosforila- cién oxidativa, difieren de los agentes desacoplantes; impiden tanto la estimulacién del consumo de oxigeno por el ADP, como la fosforilaci6n del ADP a ATP. Sin embargo, estos agentes no inhiben directamente a cualquiera de los trans- portadores de electrones de la cadena respiratoria, En lugar de ello impiden al mecanismo de formacién de ATP que utilice el intermediatio de energia elevada, o sea el estado producido por el transporte electronico. A consecuencia de ello, el trans- porte electrénico no puede continuar, a menos que se utilice y consuma el intermediario o el estado de energia elevada. El prototipo de esta clase es el antibidtico oligomicina, cuya accién fue descrita por vez primera por H. A. Lardy y sus colaboradores (tabla 19-4). La accién inhibidora de estos agentes sobre el consumo de oxigeno es anulada, de modo caracteristico, por el 2,4-dinitrofenol y otros agentes desaco- plantes, que pueden provocar la degradaci6n del iritermedia- tio de contenido energético elevado 0 del estado producido por el transporte electrénico (fig. 19-11). Una tercera clase de agentes, [os iondforos, provoca la de- gradacién de los estados intermediarios de energia elevada solamente si se hallan presentes ciertos cationes monovalentes. El prototipo de este grupo es el antibiético valinomicina (ta- bla 19-4) que precisa la presencia de K* para ejercer su efecto inhibidor. Otros agentes de esta clase incluyen a los antibi6- ticos nigericina y nonactina, que también precisan K* para su actuacién, y la gramicidina, que actiia tanto en presencia de K+ como de Na’. Se han descrito unos 50 antibiéticos dife- rentes con actividad semejante (pag. 813). Estos agentes son lamados ionéforos, debido a que forman complejos liposolu- bles con cationes especificos, los cuales son transportados de este modo a través de la membrana mitocondrial. El complejo de la valinomicina-K* atraviesa facilmente la membrana; en ausencia de valinomicina, el potasio pasa muy lentamente (pag. 540). Los ionéforos impiden la fosforilacién oxidativa porque obligan a las mitocondrias a utilizar la energia de la respiracién para bombear cationes, como el potasio, al interior de la matriz, en lugar de utilizar la energia para sintetizar ATP. Los cationes son expulsados con la misma rapidez con la que son bombeados hacia el interior. 530 Fioura 19-11 Efecto de los agentes desacoplantes y de la oligomicina sobre la velocidad del consumo de oxigeno de las mitocondrias. Accién de los agentes desacoplantes. La adicién de ADP a mitocondrias en respiracin en un medio tamponado que contenga sustrato, fosfato y Mg" provoca el salto habitual de la velocidad de consumo de oxigeno. Sin embargo, la adicién de un agente desacoplante, como el 2A-dinitrofenol, provoca una estimulacion indefinida de ta respiracién, generalmente ‘@ una velocidad mayor que la dada por el ADP. (O;) Estimulacion indefinida de Ja respiracién Accién de la oligomicina. La oligomicina no inhibe el estado 4 de la respiracion, pero impide la estimulacién habitual provocada por el ADP. De un modo caracteristito, los agentes desacoplantes pueden atin estimular el consumo del ‘oxigeno en presencia de oligomicina, Oligomicina (04 Curso normal —\ del salto de oxigeno inducide por el ADPFioura 19-12 Algunos agentes desacoplantes. NOt oho 24-Dinitrofenol Carbonilcianuro-p-trifluoro- metoxifenilhidrazona 5-cloro-3-t-butil-2’-cloro-4’- nitrosalicilanilida Capitulo 19 Fosforilacion oxidattva, esteustusa. mitocondeial Tasta 19-5. Reacciones parciales de 1a fosforilacién oxidativa. El componente marcado isotépicamente aparece en color; AMP~P~P representa al ATP, y AMP~P, representa al ADP Actividad ATPésica estimulada por agentes desacoplantes ATP + HO —> ADP + P, Intercambio ATP-fosfato AMP~P~P +P, = AMP~P~P + P, Intercambio fosfato-agua HPOS + HO = HPO” +H.O Intercambio ADP-ATP AMP~P + AMP~P~P = AMP~P~P + AMP~P Reacciones parciales de la fosforilacién oxidativa Cuatro de las reacciones catalizadas en la mitocondria intacta resultan influidas de un modo caracteristico por el 2,4-dinitro- fenol y la oligomicina, (tabla 19-5), creyéndose por ello que representan etapas individuales o secuencias de etapas del mecanismo mediante el cual se forma el ATP durante la fos- forilacién oxidativa, Estas reacciones, llamadas con frecuencia reacciones -parciales, parecen tener lugar en ausencia de un Tlujo neto de electrones a lo largo de la cadena. La primera de ellas es la actividad ATPasica de las mitocondrias, que es normalmente muy baja, pero que se ve muy estimulada por el 2,4-dinitrofenol y otros agentes desacoplantes. La actividad de la ATPasa es caracteristicamente inhibida por la oligomi- cina. Se cree que la actividad ATPasica de las mitocondrias representa la inversion de las reacciones de produccién del ATP a partir del ADP y del fosfato. La segunda reaccién parcial es un_intercambio isotépico, en el que el fosfato inor» ganico, marcado con ”P, se intercambia rapidamente con el grupo fosfato terminal del ATP en ausencia de transporte electrénico. Esta reaccién, llamada de intercambio ATP-fos- fato, es completamente inhibida por el 2,4-dinitrofenol o por la oligomicina. La tercera reaccién parcial es un inter- cambio de atomos de oxigeno del agua del medio con Jos del fosfato inorganico, que puede medirse por marcado del fosfa- too del agua, con "O; durante este intercambio no se produce desaparicién neta de fosfato. Esta reaccién de intercambio fosfato-agua, resulta inhibida también por 2,4-dinitrofenol y por la oligomicina. La cuarta reaccién parcial es la rapida transferencia reversible, del grupo fosfato terminal del ATP al ADP, llamada reaccién de intercambio ATP-ADP; resulta también inhibida por el 2,4-dinitrofenol y por la oligomicina. Estas propiedades de las reacciones parciales dan a enten- der claramente que la secuencia por la que se forma el ATP a partir de ADP y P, es irreversible, Ademas, constituyen un método de abordar el estudio experimental de las etapas indi- viduales en la formacién del ATP. Reversibilidad de 1a fosforilacién por transporte electrénico El hecho de que las reacciones de la fosforilacién oxidativa son realmente reversibles, ha podido demostrarse por caminos mas directos. Segiin un tipo de experimento, las mitocondrias suplementadas con succinato y con oxalacetato se incuban con 531PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCION DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO cianuro para inhibir el flujo electrénico hasta el oxigeno. Si se afiade ATP a este sistema los electrones fluyen desde el succinato hasta el oxalacetato por la via de la cadena del transporte electronico en la direccién inversa; es decir, Succinato —> succinato deshidrogenasa —» ubiquinona —> NADH deshidrogenasa —> NAD* —> oxalacetato dando por resultado la reduccién del oxalacetato a malato. De modo correlativo, el ATP experimenta su escisién a ADP y P; por inversién de las reacciones acoplantes de energia del centro I. Es necesaria por tanto la energia del ATP para invertir el transporte electrénico acoplado a la energia. Las otras dos etapas de conservacién de energia de la cadena pueden invertirse también en condiciones adecuadas. Fosforilacién oxidativa en los sistemas submitocondriales Aunque Ia fosforilacién oxidativa es un proceso muy labil y que durante mucho tiempo sélo pudo observarse en mito- condrias intactas recién obtenidas, se ha descubierto la posi- bilidad de preparar particulas submitocondriales capaces de efectuar el transporte electrénico y la fosforilacién oxidativa. Estas particulas se obtienen tratando las mitocondrias con agentes dispersantes de la membrana, por ejemplo con deter- gentes no iénicos como la digitonina o el Lubrol o por irra- diacién sénica de alta frecuencia. Las particulas estan cons- tituidas por vesiculas membranosas resultantes de los frag- mentos de membrana interna que se han «resoldado». Cata- lizan la fosforilacién oxidativa solamente en el caso de que Ja membrana se halle completamente cerrada, indicando con ello, que se necesita una estructura vesicular intacta para que se produzcan los fenémenos de conservacién de la energia. Es significativo que tales vesiculas membranosas contengan esferas de la membrana interna (pag. 521), generalmente sobre la superficie exterior de las vesiculas, lo cual sugiere que la mayoria de las vesiculas se producen por expresion de las crestas (fig. 19-13), Las particulas submitocondriales son, en gran parte, como fuera empleada para provocar la formacién de ATP a partir del ADP y del P,; simultaneamente, la proteina transportadora de energia experimentaria una reversién.a su estado de conformacién original, de bajo contenido energético. La hipétesis del aco- plamiento de conformaciénconstituye, en principio, una va- tiante de la hipétesis del acoplamiento quimico; postula que 535PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCION DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO un nimero de enlaces no covalentes y débiles de una macro- molécula acttian como intermediario o transportador de ener- gia comiin para la formacién de ATP, mientras que la hipé- tesis clasica del acoplamiento quimico pogtula que el vehiculo de la transferencia energética es un simple enlace covalente del intermediario comin, S Los cambios de conformacién que se producen en el sistema de la actomiosina del masculo esquelético cuando el ATP se une y se hidroliza, liberandose el ADP (pag. 770), se han tomado como prototipo para el acoplamiento de conformacién. Un hecho que favorece el acoplamiento de conformacién es la observacién de que la membrana mitocondrial interna experi- menta cambios fisioquimicos muy répidos a medida que los electrones circulan a través de la membrana respiratoria. Estos son detectados por medidas de fluorescencia sobre membranas unidas a moléculas marcadoras, tales como el Acido 1-anilino- naftaleno-8-sulfénico. El acoplamiento de conformacién viene sugerido también por los espectaculares cambios ultraestruc- turales que acompafian a la adicién de ADP a las mitocon- drias en respiracién (véase pag. 529). Sin embargo, hasta la fecha no tenemos mas que indicaciones atractivas para la hi- pétesis del acoplamiento por conformacién. Hipstesis del acoplamiento quimiosmético Esta hipétesis, propuesta por primera vez en 1961 y desde entonces vigorosamente sostenida por P. Mitchell, bioquimico britanico, niega la existencia de cualquier intermediario quimi- co comin que acople las reacciones productoras con las con- stmidoras de energia en la fosforilacién oxidativa. En lugar de esto propone que estas reacciones estan acopladas por un estado intermedio de energia elevada ms que por un com- puesto, Propone Mitchell que la existencia de un gradiente electroquimico (pag. 792) de iones H* a través dela mem- brana mitocondrial interna sirve como medio de acoplar el flujo de energia del transporte electrénico para la formacién del ATP. De acuerdo con la hipétesis quimiosmética, la-mem- brana constituye una parte integral del mecanismo de acopla- miento y debe hallarse intacta en forma de una vesicula con- tinua cerrada para que se verifique la fosforilacién oxidativa. Mitchell postula que la funcién de los transportadores elec- trénicos en la cadena respiratoria es 1a de actuar como un sistema de transporte activo o «bomba> (pag. 789), para transportar iones H+ desde la matriz mitocondrial a través de la membrana interna, generando de este modo un gra- diente de iones H* a través de la membrana que segin él ha postulado es impermeable a los iones H', Se ha considerado que el gradiente electroquimico que se establece de este modo, impulsa la sintesis del ATP provocando la deshidratacién del ADP y del P; (fig. 19-16). Una caracteristica especial de la hipétesis quimiosmética“es que ésta precisa de la realizacién de reacciones quimicas vec- toriales a través de la membrana mitocondrial; es decir, reac- ciones con una direccién geométrica, en contraste con las reacciones quimicas no dirigidas 0 escalares que se producen en una disolucién homogénea y libre. Se considera que el transporte electrénico produce un gradiente de iones.H* a través de la membrana, en virtud de una ordenaci6n vectorial 536Figura 19-16 Representacién simpliticada de la hipstesis del acoplamiento quimiosmético. Capitulo 19 Fosforilacion oxidativa, estructura mitocondrial EI transporte electrénico provoca que los fones H* sean bombeados hacia el exterior a través de la membrana interna de la mitocondria, para rendir un gradiente de H*. Esta fase se muestra con més detalle en la figura 19-17. El gradiente de H* es el estado rico en energia en el cual se transforma la energia del transporte electrénico, El compartimento interno se hace alcalino, y el exterior mas cido, El gradiente de H* es la fuerza impulsora inmediata para la fosforilacién del ADP, ‘que se establece con la eliminacién de agua. La relativamente elevada concentracién interna de OH" arrastra al H* (en color) del centro activo de la ATPasa Fi y la concentracién relativamente alta de H* exterior arrastra el OH" hacia fuera. Como el producto iénico del aqua (K. = [H"] [OHF]) es muy bajo (10%), los sumideros de OH" y de H’ originados por el transporte electrénico son cepos muy eficaces para los iones H* y OH’, respectivamente. La formaciéa de ATP puede verse més detalladamente en la figura 19-18. 537PARTE 2. CATABOLISM Y PRODUCCIGN DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO especifica de las proteinas transportadoras de electrones en la membrana mitocondrial- interna, de modo que las reacciones en las que se absorbe H* (tabla 18-7, pag. 505) se produzcan sobre la cara interna de la membrana interior y las reacciones productoras de H+ tengan lugar sobre su cara exterior. Se contempla asi a la cadena de transporte electrénico como un recurso para convertir la energia liberada en) el transporte electrénico en la energia de un gradiente electroquimico de iones H*, La energia libre almacenada en tal gradiente es una funciéa de Ja concentracién relativa de iones H* a través de: la membrana (pag. 790); se la ha llamado fuerza prot6n-motriz. Se cree que 2 iones H* son bombeados fuera de la mitocondria por cada par de electrones que pasan a través de cada centro conservador de energia (fig. 19-17). El gradiente rico en energia de los iones H*'es utilizado entonces para provocar la formacién de ATP a partir del ADP y de P, mediante una reaccién vectorial en la que in- terviene probablemente el complejo ATPasa F-Fo de la mem- brana interna. La eliminacién de agua del ADP y del fosfato expresada, generalmente, por la ecuacién global ADP + P,—» ATP + HO AG” = 47,3 kcal mot puede considerarse mas simplemente como la eliminacién asi- métrica 0 vectorial de Ht y de OH” del ATP sobre el centro activo de la ATPasa F,, de tal modo que el H* esta situado en el lado interior de la membrana y el OH" en el exterior: ADP + P; —» ATP + H'interice + OH exterior De este modo, el H* se vierte al «sumidero» de alcalinidad generado en la matriz por el transporte electrénico, y el OH™ se vierte al «sumidero> de acidez producido sobre la mem- brana externa (fig. 19-18). De este modo, tanto las moléculas del transportador electrénico como las del enzima formador de ATP deben hallarse adecuadamente fijas en las membra- nas, de modo que sus centros activos posean una orientacién especifica. El transporte electrénico mitocondrial genera con- tinuamente el gradiente de H* rico en energia, mientras que la fosforilaci6n del ATP utiliza continuamente la energia in- herente en tal gradiente. E] resultado es un estado estaciona- rio en el que puede observarse solamente poco o ningun gra- diente neto de H*. La mayoria de resultados obtenidos son compatibles con la hipétesis del acoplamiento quimiosmético. Se necesita una membrana mitocondrial intacta para la fosforilacién oxidativa; se ha comprobado que esta membrana es impermeable a los jones H*, Ademas, se ha demostrado que la cadena de trans- porte electrénico puede bombear H* hacia el exterior, tal como se ha postulado, y que la formacién del ATP va acompafiada por el movimiento de H* hacia el interior. Por otra parte, y en concordancia con los postulados de Mitchell, los agentes desacoplantes como el 2,4-dinitrofenol permiten a los protones atravesar la membrana mitocondrial, que de otro modo, seria impermeable, y provocaria el «colapso» del gradiente de pro- tones generado por el transporte electrénico. Las. vesiculas de membrana mitocondrial que como ya hemos visto estan evueltas del revés» (pag. 532), absorben H* del medio durante 538 Figura 19-17 Mecanismo del bombeo de protones, postulado en ta hipétesis del acoplamiento quimiosmético. Se proponen etepas alternantes de transferencia de electrones ¥ de hidrogeno (véase tabla 18-7. Ag. 505), de modo que los tres conjuntos de protones necesarios para la reduccién del FMN de la NADH-deshidrogenasa, de la ubiquinona y del oxigeno, provengan del interior 0 del lado de la matric de la membtana, descargandose tres conjuntos de protones hacia el exterior, 0 lado de la membrana en contacto con el citosol. El resultado es que el exterior se acidifica ¥ que la matriz se vuelve mas alcalina. Se observaré que la secuencia de transportadores electronicos que se postula no es la misma que aparece en el capitulo 18,, pagina 505, dado que ta ubiquinona se halla situada entre el citocromo by el citocromo c, en contra de lo que parece evidente. Este cambio se ha considerado necesario. para la inter- pretacién del sentido unilateral de las reacciones de absorcién y de produccién de Ht en la membrana. Membrana Exterior interna NADH + H+} |Ficura 19-18 Representacién esquemitica de la accin vectorial de la ATPasa F, durante la Formacién de ATP a expensas de un gradiente de H" a través de la membrana. Se supone que el centto activo posee los centros de unién para el ADP y el fosfato localizados de modo que liberen ef agua que se deriva de la deshidratacién, como H’ y OH, H* al lado de la matriz, y OH al exterior. Exterior Membrana Ficura 19-19 Papel del gradiente de H* en la formacién de ATP: dilema general. Acoplamiento quimiosmético. Se postula que el gradiente de H* a través de la membrana es el método primario de conservacién de la energia, asi como una etapa obligatoria de la fosforilacién oxidativa, ‘Transporte electrénico Acoplamiento quimico. Se postula la obligatoriedad de la existencia de un intermediario quimico de alto contenido energético A ~ para la fosforilacién oxidativa, Se considera que el estableci- miento de un gradiente de H* es resultado de una reaccién secundaria. Transporte electrénico | A-C==AHt | ATP Capitulo 19 Fosforilacién oxidativa, estructura mitocondeial el transporte electrénico hasta el oxigeno, mientras que las mitocondrias intactas H-A + C—OH como propone la hipétesis del acoplamiento quimico. Aunque los modelos del acoplamiento quimico y del aco- plamiento de conformacién, no pueden desecharse todavia, en estos momentos 1a hipétesis del acoplamiento quimiosmético parece interpretar del modo més simple y directo los resulta- dos experimentales de que se dispone, con respecto al meca- nismo de la transduccién de la energia durante el transporte electrénico en las mitocondrias y en las bacterias, asi como durante el transporte electrénico inducido por la luz en los organismos fotosintéticos (pag. 624) Sistemas de transporte de metabolitos de la membrana interna En ciertas condiciones las mitocondrias pueden emplear una fraccién significativa del total de la energia respiratoria dis- ponible para fines distintos de la fosforilacién del ADP. Una 539PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCION DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSPATO de estas actividades es el transporte de ciertos metabolitos 0 iones minerales a través de la membrana mitocondrial contra gradientes de concentracién (pag. 795), Esta actividad de las mitocondrias, que esta relacionada con la compartimentacién y regulacién del metabolismo, determina la intervencién de sistemas de transporte especificos (pag. 813) en la membrana interna. La membrana mitocondrial externa es libremente permea- ble a la mayor parte de los solutos de bajo peso molecular, pero la membrana interna no lo es: su permeabilidad es altamente selectiva. Las mitocondrias hepaticas intactas que no respiran no son permeables para los azicares sencillos, tales como la glucosa o la sacatosa, para cationes como K+ y Nat, 0 aniones como el Cl- y Br-. Ademés, la- membrana interna es también impermeable para el NAD*, NADH, NADP* y NADPH, asi como para otros nucleétidos como el AMP, CTP, GTP, CDP y GDP, y también para el CoA y el acil-CoA. El compartimiento interno, o matriz, de las mitocondrias contiene depésitos de estos coenzimas y nucled- tidos que se hallan asi, fisicamente separados de los depésitos extramitocondriales existentes en el citosol (pag. 390). Por otra parte, la membrana interna de las mitocondrias hepaticas, no permite pasar con facilidad a ciertos nucleétidos especificos y metabolitos, Tenemos entre ellos el ATP y el ADP, el fosfato inorgénico, el piruvato, el citrato, el succinato, el e-oxoglutarato y el malato, asi como los aminoacidos gluta- mato y aspartato, El paso de este grupo de solutos a través de la membrana mitocondrial tiene lugar mediante la accién de sistemas especificos de transporte de membrana (cap. 28, pag. 813). Los sistemas de transporte mitocondrial, que son probable- mente proteinas especializadas 0 grupos de proteinas, son especificos para algunos metabolitos y no transportan ni si- quiera a moléculas muy semejantes. Por ejemplo, el sistema de transporte del ATP transportara solamente ADP, ATP, dADP y dATP, pero no AMP ni otros nucleétidos estrecha- mente relacionados tales como GTP, GDP, CTP y CDP. Algunos de los sistemas de transporte mitocondrial pueden inhibirse de modo completamente especifico. Por ejemplo, el sistema de transporte del ATP y del ADP puede ser inhibido por concentraciones muy bajas de atractildsido (véase mas adelante). La figura 19-20 muestra los sistemas de transporte prin- cipales de las mitocondrias de higado de rata, asi como el tipo de procesos de transporte que promueven, Estos sistemas reciben también el nombre de transportadores, translocasas 0 porteadores. El transportador ATP-ADP, uno de los que se ha estudiado mas intensamente, promueve normalmente el intercambio equimolar reversible de una molécula de ADP externo por una molécula de ATP interno formada por fos- forilacién oxidativa en la matriz. Este transportador tiene una afinidad muy elevada por el ADP; se halla casi saturado a una concentracién de ADP menor de 10 »M. Resulta inhibido especifica y fuertemente por el atractilésido, compuesto vege- tal téxico, asi como por el Acido. bongcréquico, que es un anti- biético (fig. 19-21). El transportador de fosfato promueve un intercambio de ion H,PO~ y de ion OH- 0, lo que es equiva- lente, el cotransporte de H;PO-, y H* en la misma direccién. 540 Fioura 19-20 Sistemas de transporte importantes de la membrana interna de las mitocondrias de higado de rata (circulos coloreados). Pueden actuar en ambas direcciones como respuesta a los gradientes de concentracién de los metabolites. transportados. Membrana mitocondrial interna Fosfato ADP-ATP ATPt Dicarboxilato HPO? —+ Dicarboxilato™ @) Tricarboxilato Malato*- ‘Tricarboxilato™ @) Aspartato- glutamate Glutamato~ a-Oxoglutarato- malato e-Oxoglutarato™ _|Figura 19-21 Estructuras del atractilésido y del cido bongcréquico. Capitulo 19 Fosforilacion oxidativa, estructura mitocondcial El transportador de fosfato es inhibido por algunos reactivos de los grupos sulfhidrilo. El transportador de dicarboxilatos (fig. 19-20) promueve el intercambio equimolar de malato, succinato y fumarato entre si o con fosfato. El transportador de_tricarboxilatos puede promover el intercambio equimolar del citrato y del isocitrato entre si, asi como el intercambio equimolar de un tricarboxilato con un dicarboxilato como por ejemplo el malato. Los sistemas de transporte de la membrana mitocondrial interna son especie-especificos y se hallan determinados ge- néticamente. Aunque las mitocondrias de todos los tejidos contienen sistemas de transporte para el fosfato, el ADP y el ATP, otros sistemas de transporte varian en su distribucion en las especies. Estas observaciones y otras relacionadas Ilevadas a cabo sobre las mitocondrias procedentes de diversos tipos de célu- las, han conducido a la conclusién general de que las molé-, culas combustibles tales como el piruvato, los acidos grasos y los aminodcidos, asi como el fosfato y el ADP, deben pasar desde el citosol a través de la membrana interna mediante sistemas de transporte especificos penetrando en el com- partimiento de la matriz mitocondrial, en 1a cual tienen lugar las reacciones del ciclo de los acidos tricarboxilicos, el trans~ porte electrénico y la fosforilacién oxidativa. El ATP formado durante la fosforilacién oxidativa en el compartimiento inte- rior debe ser transportado, a través de la membrana al citosol por el transportador ADP-ATP. De este modo el «pool» mitocondrial del ATP y el del ADP se ven segregados del «pool» constituido por ambos nucleétidos en el citosol, pero los dos conjuntos se comunican por medio del transportador sensible al atractilésido. La compartimentacién y el trans- porte especifico de varios metabolitos es importante en la regulacién de las rutas glucolitica y respiratoria, asi como en Jas de biosintesis en las que participa el ciclo de los acidos tricarboxilicos (pags. 640 y 673). Atractilésido, glucésido téxico procedente del Atractylis gummifera, 0 cardo mediterraneo. Acido bongcréquico, antibistico formado por un hongo en los restos en putrefaccién del bongkrek, una clase de coco comestible utilizada como alimento en Indonesia. 541PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIGN DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSPATO Ficura 19-22 Papel central del teansportador de fosfato en el acoplamiento de energia entre el transporte electrénico y el transporte a través de la membrana. El transportador fosfato-hidroxido es el vehiculo para convertic el gradiente primario de H* en una acumulacién interna de H;PO* y crear asi un potencial de membrana negativo en el interior, que Puede emplearse para hacer posible el transporte de varios aniones y cationes tal como se muestra a continuacién. Membrana Exterior Interior Transporte hacia el interior de dicarboxilatos y tricarboxilatos acoplado al transporte electrénico Entrada de ADP” y salida de ATP por la via del transportador ADP-ATP Transporte de Ca* hacia el interior; otros eationes tales como Ma, Fe y Kt pueden penetrar también en respuesta al potencial negativo interior 542Capitulo 19 Fosforilacién oxidativa, estructura mitocondrial Acoplamiento del transporte de metabolitos y el transporte electrénico Los diversos sistemas de transporte de metabolitos mostrados en la figura 19-20 son sistemas pasivos (definidos en el capi- tulo 28, pag. 798); en ausencia de respiracién, transportan metabolitos a favor de los gradientes de concentracién, en la direccién favorable al equilibrio termodinamico a través de la membrana. Sin embargo, estos sistemas pueden transportar sus sustratos en contra de los gradientes de concentracin si se hallan acoplados al transporte de electrones como fuente de energia. Ya hemos visto que la energia que se deriva del transporte electrénico puede impulsar la formacién de un gradiente de H* a través de la membrana mitocondrial. Este gradiente, a su vez, puede utilizarse para transportar algunos metabolitos en contra de gradientes tanto hacia el interior como hacia el exterior de la-mitocondria, Por ejemplo, puede acu- mularse fosfato procedente del medio circundante por las mitocondrias que respiran, en contra de un gradiente de con- centracién, mediante la actuacién del transportador de fosfato (fig. 19-22). El gradiente de fosfato producido de este modo puede ser la causa de la acumulacién de malato en contra de su gradiente, por la via del transportador dicarboxilato. El gradiente de malato puede utilizarse, a su vez, para producir un gradiente de citrato mediante el transportador tricarboxi- lato (fig. 19-22). De este modo, gracias a especificidades de sustratos compartidas, pueden ligarse los diversos sistemas de transporte de las mitocondrias con la cadena de transporte electrénico, que actéia como fuente de energia. La figura 19-22 muestra también que el transportador fos- fato hace posible el intercambio equimolar de ADP*, externo por ATP interno al equilibrar la distribucién de la carga a través de la membrana. El transportador de fosfato es, por tanto, un lazo esencial en el acoplamiento de la energia libe- rada pot la cadena respiratoria con el transporte de varios metabolitos. ‘Transporte de calcio dependiente de Ia respiracién en las mitocondrias Las mitocondrias de los tejidos animales pueden acumular también algunos cationes, particularmente Ca®*, en contra de gradiente, en un proceso que se halla energéticamente aco+ plado con el transporte electronico, La acumulacién de Ca* va acompafiada de la incorporacién de una cantidad equiva~ lente de fosfato. Por cada par de electrones que pasan desde el NADH hasta el oxigeno, se acumulan seis iones Ca* pro- cedentes del medio, dos por cada centro de conservacién de la energia (fig. 19-23), Cuando se acumula Ca** de este modo por las mitocondrias, no se produce fosforilacién oxidativa del ADP. De. esta suerte, la energia liberada por el transporte electrénico puede emplearse para llevar a cabo la acumulacién de Ca** o la de ATP, pero no de ambas simultaneamente. Los iones Mn® y Fe* se acumulan también de un modo seme- jante por las mitocondrias hepaticas, y lo mismo ocurre con el Se2,pero no con el Mg’. El transporte de Ca* por la mito- “condria es inhibido por el complejo metalico rutenio rojo, asi como por el La* y otros cationes de los lantanidos. 543PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIGN DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO Membrana Membrana Exterior 2e” Interior Exterior 2e7 Interior Or Or Fosforilacién oxidativa del ADP Acumulacién oxidativa del Ca’ que penetra por mediacién de un transportador especifico Las mitocondrias de los tejidos animales pueden acumular cantidades muy grandes de Ca** y de fosfato, lo que da por resultado la deposicién de granulos de fosfato de calcio, elec-. trénicamente densos, en la matriz (fig. 19-24), proceso que se cree esta relacionado con la calcificacién biolégica. Esta propiedad, asi como la muy elevada afinidad que por el Ca muestran las mitocondrias, constituyen un fuerte indicio de que el transporte de Ca® mitocondrial desempefia un impor- tante papel en las células de los vertebrados (pag. 807). El transporte de Ca’ hacia el interior, en contra de un gradiente de concentracién, se halla acoplado al transporte electrénico por accién del transportador del fosfato (fig. 19-22). Sistemas de lanzadera para la entrada de electrones procedentes del NADH externo (citosol) Si se adiciona NADH a suspensiones de mitocondrias hepa- ticas y de otros tejidos animales, no se oxida, aunque sabemos que tales mitocondrias oxidan con facilidad a los sustratos NAD-dependientes que se afiadan, tales como el malato, por intervencién del NAD interno. A partir de observaciones de esta clase se ha Iegado a la conclusién de que la membrana mitocondrial interna, en la mayor parte de los tejidos animales, resulta impermeable frente al NADH. Esta barrera de per- meabilidad segrega de un modo efectivo el conjunto de piridin- nucleétidos citoplasmico del mitocondrial. Se plantea ahora una pregunta importante, Dado que mu- chas de las deshidrogenasas NAD-dependientes existentes en el citoplasma pueden reducir al NAD*, c6mo podra reo- xidarse el NADH del citosol a NAD* por la cadena de trans- porte electrénico mitocondrial? Aunque el NADH extramitocondrial no puede por si mis- mo atravesar la membrana mitocondrial interna, los electro- nes detivados del mismo pueden incorporarse a la cadena de transporte electrénico por unas rutas indirectas Iamadas lanzaderas. La primera lanzadera del NADH que se descu- 544 Figura 19-23 La fosforilacién del ADP y la acumulacion de cationes son procesos.alternativos acoplados al transporte electrénico. Ficura 19-24 Micrografia electronica de mitocondrias hepaticas de rata después de la acumulacién de Ca'* y de fosfato acoplada a la respicacién. Las manchas oscuras, de gran densidad electrénica, corresponden a depésitos granulares de fosfato de calcio amorfo.Capitulo 19 Fosforilacién oxidativa, estructura mitocondrial brié fue la lanzadera del glicerofosfato (fig. 19-25). EI NADH del citosol reacciona, en primer lugar, con el fosfato de dihi- droxiacetona, uno de los productos intermediarios de la glu- célisis, reduciéndolo a 1-glicero-3-fosfato, en reaccién que es catalizada por la glicerofosfato-deshidrogenasa NAD-depen- diente que se halla en el citosol: Fosfato de dihidroxiacetona + NADH + H* = teglicero-3-fosfato + NAD* El glicero-3-fosfato asi formado atraviesa facilmente la mem- brana externa y se oxida después, por accién de un segundo tipo de glicero-3-fosfato-deshidrogenasa localizada en la su- perficie externa de la membrana mitocondrial interna; el gli- cero-3-fosfato no necesita atravesar la membrana mitocondrial interna para oxidarse. La glicero-3-fosfato-deshidrogenasa mitocondrial no se halla ligada al NAD*, sino que es una deshidrogenasa que contiene flavina y se designa por FP; su grupo prostético se reduce: Glicero-3-fosfato + FP —> fosfato de dihidroxiacetona + FPH, Figura 19-25 Lanzadera del glicerofosfato para la transferencia de equivalentes de reduccién desde el NADH del citosol a la cadena de transporte electrénico mitocondrial. La glicerofosfato-deshidrogenasa mitocondrial es una flavoproteina estrechamente unida a la membrana interna. Traspasa sus electrones 2 [a ubiquinona (Q), con to que se orilla ef centro I. De aqui que solo se produzcan dos ATP por cada par de electrones que penetran en la cadena. La membrana exterior que es libremente permeable para el fosfato de dihidroxiacetona y para el glicerofostato, no aparece en la figura. NADH +H*+ NAD* glicerofosfato- deshideogenssa “del cited Fosfato de dihidroxiacetona te) glicerafosfato- aePARTE 2. CATABOLISMO Y PRODUCCIGN DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO Membrana interna Matriz Los equivalentes de reduccién del enzima reducido son trans- feridos a la ubiquinona, desde la que pasa al oxigeno a través del sistema citocrémico en la membrana interna. El fosfato de dihidroxiacetona formado en esta reaccién puede volver ahora al citoplasma y aceptar un par de electrones de otra molécula de NADH extramitocondrial. El par redox glicero- fosfato-fosfato de dihidroxiacetona actiia, de este modo, ‘como una lanzadera de equivalentes de reduccién desde el. NADH extramitocondrial a la cadena respiratoria jntramito- condrial. El par de electrones que se incorpora a la cadena respiratoria por mediacién de esta lanzadera provoca la fos- forilacién oxidativa de sélo dos moléculas de ADP en su transporte hasta el oxigeno, ya que los electrones dei L-glicero- 3-fosfato se incorporan a la cadena después del primer centro de conservacién de la energia (véase pag. 526). La lanzadera del glicerofosfato es unidireccional; trans- porta equivalentes de reduccién al interior de las mitocon- drias en algunos miisculos y células nerviosas. En otros teji- dos, particularmente en el higado y en el corazén, actia otro tipo de lanzadera, la del malato-aspartato (fig. 19-26). Esta compleja lanzadera es bidireccional; puede transportar elec- trones desde el NADH extramitocondrial al interior de la mitocondria o desde el NADH intramitocondrial al citosol. La lanzadera del malato-aspartato necesita la cooperacién, de un modo ciclico, de los isozimas citoplasmicos y mitocondria- les de la malato-deshidrogenasa y de la aspartato-glutamato- transaminasa (pag. 574), asi como de los sistemas de trans- porte de la membrana mitocondrial del malato, del a-oxoglu- tarato, del aspartato y del glutamato. La lanzadera malato- aspartato proporciona tres ATPs por molécula de NADH citoplasmica que se oxida, mientras que la lanzadera del glicerofosfato rinde solamente dos. 546 Ficura 19-26 Lanzadera del malato-aspartato para la introduccion de equivalentes de reduccién desde el NADH del citoplasma a la cadena de transporte electrénico de las mitocondrias, Esta tanzadera implica la Patticipacién de tas formas citosolica y mitocondrial de la malato-deshidrogenasa y de la aspartato-transaminasa (pig. 574). somo de los dos transportadores de membrana. Esta lanzadera, que predomina en el higado y en el corazén, da por resultado la fosforilacién de tres moléculas de ADP por molécula de NADH del citosol oxidadaCapitulo 19 Fosforilacién oxidativa, estructura mitocondrial Desplazamiento de Ja capacidad de reducci6n de las mitocondrias al citoplasma Como se vera en el capitulo 23, la biosintesis de la glucosa a partir del piruvato precisa de NADH en el citoplasma para reducir el 1,3-difosfoglicerato a gliceraldehido-3-fosfato. Aun- que las mitocondrias producen continuamente NADH interno procedente de la oxidacién de los sustratos respiratorios, el propio NADH no puede pasar directamente al citosol, pero sus equivalentes de reduccién pueden ser transferidos al NAD* extramitocondrial mediante la lanzadera del malato~ aspartato descrita anteriormente. De un modo analogo, la capacidad reductora intramito- condrial puede emplearse para formar NADPH extramitocon- drial. El isocitrato intramitocondrial puede atravesar la mem- brana mitocondrial mediante el transportador de tricarboxilato (pag. 541) y Megar al citosol, en donde puede ceder elec- trones al NADP* por accién de la forma de isocitrato-deshi- drogenasa, ligada al NADP, del citosol, produciendo, de este modo, NADPH en el citoplasma. La actuacién de los sistemas de lanzadera para el NADH y el transportador del tricarbo- xilato en Ia transferencia de equivalentes de reduccién del NADPH: regula de un modo eficaz la relacién de los pares NADH-NAD* y NADPH-NADP* intra y extramitocon- driales. Integracién de la glucélisis y de la respiracién: Efecto Pasteur Una célula facultativa puede emplear glucosa, bien en condi- ciones anaerébicas 0 aerdbicas, Cuando este tipo de célula utili- za la glucosa en condiciones anaerébicas para formar lactato, la velocidad de escisién de la glucosa es muchas veces mayor de lo que lo es, en la misma célula, en condiciones aerébicas, con objeto de compensar el menor rendimiento de ATP obte- nido por molécula de glucosa durante la glucélisis. Recuérdese que la glucélisis anaerébica registra solamente la formacion neta de dos moléculas de ATP por molécula de glucosa (pag. 442), mientras que la oxidacién aerébica completa libera 36 moléculas de ATP por molécula de glucosa (pag. 526). La célula anaerébica precisaria por tanto 36/2 = 18 veces mas glucosa-por unidad de peso y por unidad de tiempo para producir ATP a la misma velocidad con que lo haria aerdbicamente. Si se admite oxigeno en una suspensién anaerdbica de cé- lulas que emplean glucosa a una velocidad elevada para efectuar la glucélisis, la velocidad de consumo de la glucosa experimenta un descenso extraordinario, a una pequefia frac cién de su velocidad anaerdbica. Al mismo tiempo, la acumula- cién de lactato, que es cuantitativa, en condiciones anaerébicas disminuye hasta ser practicamente nula en presencia de oxi- geno, ya que la respiracién conduce a la formacién cuantita- tiva de CO; y de H,O procedentes de la glucosa, sin que se registre acumulacién de lactato, Este fenémeno, de inhibicién del consumo de glucosa e interrupcién de la acumulacién de lactato con el consiguiente consumo de oxigeno, se lama efecto Pasteur. Fue descubierto por Pasteur hace un siglo, durante sus importantes investigaciones sobre los procesos de fermentacién en la fabricacién del vino, pero es una propiedad manePARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIGN DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO general de todas las células facultativas, incluso las de los animales superiores. Constituye un ejemplo espectacular de la regulacién y de la integracién de dos sistemas multien- ziméticos. La primera cuestién que plantea el efecto Pasteur es la siguiente: ;Cémo es que el consumo de oxigeno provoca el descenso de la velocidad de consumo de la glucosa? Hemos visto ya (pag. 540) que las mitocondrias muestran gran afi- nidad por el ADP, y que cuando se dispone de oxigeno fos- forilan al ADP hasta alcanzar relaciones elevadas de [ATP]/ [ADP]. Hemos visto también (pag. 435), que la fosfofructo- quinasa, que es un enzima alostérico, cataliza una reaccién reguladora en la secuencia glucolitica, a saber, la fosforilacion de la fructosa-6-fosfato a fructosa-1,6-difosfato. La actividad de la fosfofructo-quinasa se ve estimulada por el ADP e inhi- bida por el exceso de ATP. Cuando la relacién de [ATP]/ [ADP] es elevada, la fosfofructo-quinasa se halla severa- mente inhibida; inversamente, cuando esta relacién es baja, Ja actividad del enzima se incrementa. La elevada relacién [ATP]/[ADP] que se produce como resultado de la fosfo- rilacién oxidativa determina, por tanto, que la velocidad de reaccién de la fosfofructo-quinasa descienda mucho y, por tanto, que el proceso de la glucélisis se haga mas lento. Se ha demostrado que este mecanismo se produce realmente en las células intactas, mediante el anilisis de las concentracios nes de glucusa, de glucosa-6-fosfato, de fructosa-6-fosfato y de otros intermediarios glucoliticos existentes en las células intactas, antes y después, de la transicién entre las condiciones anaerébicas y aerdbicas. Si se priva de oxigeno a las células aerébicas, la concentracién de glucosa-6-fosfato y de fructosa~ 6-fosfato disminuye, mientras que la de fructosa-1,6-di- fosfato aumenta; es decir, tenemos un punto de interrup- cidn (pag. 508). Reciprocamente, cuando se suministra oxi- geno a las células anaerébicas, las concentraciones de glucosa-6-fosfato existentes en la célula aumentan, pero la concentracién de fructosa-1,6-difosfato se hace muy pequefia (fig. 19-27). Estas observaciones demuestran que la etapa de Ja fosfofructo-quinasa es, por tanto, crucial en la modulacién de la velocidad de la glucélisis en condiciones aerébicas. Ademas del ATP, pueden actuar como moduladores inhi- bidores de la glucélisis otros productos de la respiracién mito- condrial. El citrato y el isocitrato producidos por el ciclo de Jos 4cidos tricarboxilicos pueden abandonar las mitocon- drias mediante el transportador del tricarboxilato pasando al citosol, en donde pueden actuar como moduladores inhibidores de la fosfofructo-quinasa. La superproduccién de citrato du- rante la respiracién conduce entonces a una disminucién en Ja velocidad de la glucélisis, y por tanto, en el suministro de piruvato a las mitocondrias. Aunque la inhibicién alostérica de la reaccién de la fosfo- fructo-quinasa por el ATP y el citrato constituye el principal mecanismo regulador responsable del efecto Pasteur, pueden participar, o incluso predominar, otros mecanismos en algunos tipos de células. En cualquier caso, la coordinacién de las velocidades de la glucélisis y de la respiracién implica un intercambio estrecho entre los compartimientos mitocondrial y citoplasmico de las células, en las que los sistemas de trans- porte de membrana mitocondriales desempefian un papel 548 Ficura 19-27 Representacisn esquemitica de‘los puntos de interrupcién en la glucdlisis. Muestra la concentracién relative de algunos intermediarios de la secuencia glucolitica (superior) en las células anaerébicas cuando la fosfofructo-quinasa se activa alostéricamente, y (abajo) en las céfulas aerdbicas cuando la fosfofructo-quinasa es inhibida alostéricamente." El punto de interrupeién (pag. 508) es aquel punto de ta secuencia en donde la eliminacién de la inhibicién provoca la disminucién de concentraciones en el estado estacionario de los intermediarios precedentes, y el aumento de concentracion en los que se hallan mas allé de aquél. Clave: G6P = glucosa-6-fostato Fructosa-6-fosfato fructosa-difosfato triosa-fosfatos Células anaerébicas; relacién ATP/ADP baja Gop —> FeP =p FDP—» TP —+ Acelerada por ADP, AMP y otros efectores Células aerdbicas, relacién ATP/ADP elevada cep— rep > rop—> Tp —+ —+ Tnhibida por ATP 0 por citrato Concentraciones relativas de los intermediariosFiourn 19-28 Resumen de tos mecanismos)de control importantes en la glucdlisis y en la respicacion. Las flechas de trazos coloreados muestran el origen de los retroinhibidores (ATP, NADH, cifrato, glucosa-6-fosfato), y las reacciones sobre Jas que ejercen inhibicién (barras coloreadas a través de laé flechas de reaccién). Las reacciones que son promovidas por moduladores positivos (AMP, ADP, NAD!) se designan con flechas coloreadas paralelas a las flechas de la reaccion. Glucégeno wr AD} ane | | Malato ae eae ADP Oxalacetato ‘Transporte Ciclo de Jos electronico acidos y fosforilacion tricarboxilicos oxidativa Capitulo 19 Fosforilacién oxidativa, estructura mitocondrial esencial. Los mecanismos reguladores principales que se hallan implicados en este proceso se resumen en la figura 19-28. del sistema del ATP Carga energé Hemos visto que las concentraciones de ATP y de ADP son elementos importantes en la regulacién alostérica de la glu- célisis y de la respiracién; mas adelante veremos otros nume- rosos casos en los que estos nucleétidos participan en la regulacién metabélica, Ademas, el AMP es otro importante modulador de algunos enzimas alostéricos. El AMP se forma durante la escisién pirofosfolitica del ATP (pag. 420) en ciertas reacciones biosintéticas, pudiendo refosforilarse de nuevo a ADP por accién de la adenilato-quinasa: ATP + AMP == 2ADP En vista de las muchas reacciones metabélicas en las que el ATP, el ADP y el AMP participan como moduladores, D. E. Atkinson ha sefialado que el estado energético de la célula y el equilibrio o contrapesado, de sus moduladores alostéricos, puede expresarse por lo que él Ilama nivel ener- gético de la célula, es decir, la extension con la que el sistema ATP-ADP-AMP se halla , FEBS Lett., 23: 3-19 (1972). 551PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIGN DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO CHAPPELL, J. B.: , Essays Biochem., 6: 1-22 (1970). SENIOR, A. E.: €The Structure of Mitochondrial ATPase», Biochim. Biophys. Acta, 301: 249-277 (1973). skutacney, v.: «Energy Transformation in the Respiratory Chains, Curr. Top. Bioenerg., 4: 127-191 (1972). Importante anélisis del acoplamiento energético. SLATER, E. ¢.: ¢The Coupling between Energy-Yielding and Energy-Uti- lizing Reactions in Mitochondria», Q. Rev. Biophys., 4: 35-71 (1971). WRIGGLESWORTH, J. M., L. PACKER, ¥ D. BRANTON: succinato. 6) a-oxoglutarato —> succinato, en presencia de dinitrofenol. ¢) Succinato —> oxalacetato, d) Gliceraldehido-3-fosfato —> piruvato, en presencia de arseniato. 5524. 8. Capitulo 19 Fosforilacién oxidativa, estructura mitocondrial Escribir ecuaciones igualadas para la combustién completa de las siguientes sustancias a diéxido de carbono y agua, en una célula hepatica tipica, incluyendo todas las etapas de fosforilacién asociadas: supéngase la actuacién de la lanzadera glicerofosfato-fosfato de dihi- droxiacetona: a) Gliceraldehido, b) Acido pirivico, ¢) Acido citrico, d) Acido fumérico, e) Acido oxalacético. Eécribase una ecuacién igualada, incluyendo todas las etapas de fosforilacién asociadas, para la oxidacién completa de la fructosa hasta CO; y agua, tal como ocurriria en una preparacién celular tipica a la que se afiadiese dinitrofenol. Calcilese el porcentaje de eficacia de la conservacién de energia en forma de ATP cuando el succinato se oxida a fumarato por el oxigeno molecular en las mitocondrias intactas. Calcular el porcentaje de eficacia de la conservacién de energia en forma de ATP, cuando la glucosa se oxida a CO; y HAO por el oxigeno molecular, suponiendo la intervencién de la lanzadera del malato-oxalacetato. ‘Se determinaron las concentraciones de fosfato inorgénico y de adenin- dinucledtido en corazones de rata aislados y perfundidos, tanto en condiciones aerébicas como anaerébicas, con los siguientes resultados: Concentracién mM Condiciones ATP ADP AMP = Py Aerébicas 4.2 0.8 0,06 15 Anaerdbicas 3.4 12 02 52 Calcdlese el nivel energético y el potencial de fosforilacién, en cada una de estas condiciones. 553