Chương 6.

Sản xuất L (+) - axit lactic từ bã mía được xử lý

trước bằng axit sử dụng Bacillus coagulans DSM2314 trong
chiến lược thủy phân và lên men đồng thời
Tóm tắt
Bối cảnh: Các loại đường có nguồn gốc từ bã mía giàu lignocellulose có thể được sử
dụng làm nguyên liệu sản xuất L (+) - axit lactic. Trong nghiên cứu này, bã mía đã được
xử lý bằng axit sẽ được thủy phân với enzyme cocktail GC220 và được lên men bởi vi
khuẩn ưa nhiệt trung bình Bacillus coagulans DSM2314. Quá trình đường hóa và lên men
được thực hiện đồng thời (SSF), thêm bã mía đã được xử lý bằng axit trong một mẻ hoặc
trong hai giai đoạn. SSF đã được thực hiện ở liều lượng enzyme thấp 10,5-15,8 FPU / g
DW (dry weight) bã mía.
Kết quả: SSF theo mẻ đầu tiên cho năng suất trung bình 0,78 g / l / h, không đủ để cạnh
tranh với các quy trình sản xuất axit lactic sử dụng đường tinh khiết. Việc bổ sung 1 g / l
furfural vào canh trường giống có thể làm tăng tính kháng của B. coagulans đối với các
sản phẩm phụ có trong lignocellulose ở quá trình tiền xử lý. Sử dụng các phân tử có chứa
furfural đã tăng năng suất lên 0,92 g / l / h, với tổng sản lượng axit lactic là 91,7 g/l trong
thiết bị phản ứng với thể tích khởi động 1 lít, chứa bã mía 20% W / W. Bã mía trong các
quá trình này được hòa tan với một phần chất lỏng (chất lỏng thu được trực tiếp sau quá
trình tiền xử lý axit), để tăng nồng độ đường. Hòa tan các sợi bã mía bằng nước làm tăng
năng suất trung bình lên 1,14 g / l / h, với tổng sản lượng axit lactic là 84,2 g/l trong tb
phản ứng có thể tích khởi động 1 lít. Do sự tích lũy nhanh chóng của axit lactic, hoạt
động của enzyme bị ức chế trong SSF hai giai đoạn. Điều này dẫn đến tổng sản lượng
axit lactic thấp hơn một chút là 75,6 gram. Tuy nhiên, SSF hai giai đoạn dẫn đến năng
suất axit lactic trung bình là 1,81 g / l / h. Năng suất trung bình trong 23 giờ đầu tiên là
2,54 g / l / h tương tự như năng suất thu được trong quá trình lên men với đường cao cấp.

Kết luận: Trong nghiên cứu này, người ta đã chứng minh rằng việc sản xuất axit lactic từ
lignocellulose đã được thực hiện thành công nhờ quy trình SSF hai giai đoạn, kết hợp bã
mía được xử lý bằng axit và enzyme cocktail, B. coagulans được tiền nuôi cấy trước với
sự hiện diện của furfural. Trong bài báo này:
- Nghiên cứu về việc bổ sung furfural vào canh trường giống B. coagulans có lợi ích
trong quá trình lên men sử dụng bã mía được xử lý bằng axit làm cơ chất. tác dụng
ức chế của các sản phẩm phụ có thể giảm đi bằng cách thêm nồng độ thấp của
furfural, một trong những sản phẩm phụ ức chế được tìm thấy trong bã mía được
xử lý bằng axit, để tiền nuôi cấy B. coagulans. Sử dụng canh trường giống mà 1 g /
l furfural đã được thêm vào khi cấy chủng giúp tăng năng suất axit lactic, sản
 lượng và hiệu giá trong các quá trình lên men với cơ chất là bã mía được xử lý
trước bằng axit.
- Một quy trình SSF hấp dẫn về mặt kinh tế và có thể cạnh tranh với sản xuất axit
lactic trên đường tinh luyện, năng suất và sản lượng axit lactic tương tự như lên
men trên đường cao cấp đạt được.

Giới thiệu
Cơ chất: việc tìm kiếm các nguyên liệu thay thế là mục tiêu chính của nghiên cứu hiện tại
.Lignocellulose, bao gồm 60-75% đường polimer , là một nguyên liệu thay thế thú vị.

Tiền xử lý nguyên liệu: Một sự kết hợp giữa tiền xử lý hóa học nhiệt và thủy phân
enzyme có thể được sử dụng để thu được đường monomer từ lignocellulose. Tuy nhiên,
tiền xử lý nhiệt hóa học ở nhiệt độ cao, áp suất cao cũng dẫn đến sự hình thành các sản
phẩm phụ như axit hữu cơ, phenolics và furan. Các hợp chất này có thể ảnh hưởng tiêu
cực đến sự phát triển của vi sinh vật và sự hình thành sản phẩm trong quá trình lên men.
Sau khi tiền xử lý nhiệt hóa học, việc tách chất lỏng rắn được thực hiện:, Tiền xử lý axit
là một phương pháp tiền xử lý nhiệt hóa học thường được đề xuất để phân hủy
lignocellulose. Một sự kết hợp của pH thấp và nhiệt độ cao (một phần) thủy phân
hemiaellulose, làm tăng khả năng tiếp cận enzyme với cellulose và do đó chuyển đổi
thành glucose đơn phân. Không chỉ hemiaellulose bị ảnh hưởng, lignin và cellulose cũng
có thể bị suy giảm (một phần), thủy phân 80 đến 90% xylan thành xyloza, 10-25%
glucans được monome hóa thành glucose. Kết hợp với giai đoạn thủy phân enzyme, hiệu
quả chuyển đổi glucan thành glucose lên tới 85% có thể đạt được (Kootstra et al. 2009).
Thủy phân axit là hiệu quả nhất đối với lignocellulose với hàm lượng lignin thấp như cây
monocottype, do loại bỏ lignin rất vừa phải trong quá trình tiền xử lý. Nổ hơi là một quá
trình trong đó sinh khối được xử lý bằng hơi nước nóng (180 đến 240 ° C) dưới áp suất (1
đến 3,5 MPa), sau đó là sự giải nén nổ của sinh khối dẫn đến vỡ cấu trúc cứng của sợi
sinh khối.). Sau khi tiền xử lý, một sự phân tách chất lỏng rắn đã diễn ra bằng cách ép các
chất rắn bằng một máy ép piston lớn. Phần chất lỏng được lưu trữ ở -20ºC. (hình 1).
Điều này dẫn đến một phần rắn trong sợi bã mía có mặt chủ yếu là cellulose, trong khi đó
nó cũng có thể chứa một phần của hemicellulose và lignin. Phần lỏng chứa một số loại
đường oligomeric và monomeric có nguồn gốc từ hemicellulose, nhưng cũng có một
phần của lignin. (1) đường đơn là đường đơn có mặt trước khi xử lý enzyme, đường
depolyme hóa là đường bị depolyme hóa thành đường đơn trong quá trình xử lý enzyme.
Quá trình thủy phân và lên men riêng biệt (SHF) là một quá trình thường được mô tả
để monome hóa đường (hemi)cellulosic và để lên men các loại đường này thành axit
lactic theo hai bước riêng biệt. Trong quá trình thủy phân enzyme, làm tăng nồng độ
đường ức chế hoạt động enzyme, hiệu quả thu được nồng độ đường cao 10. Trong các
quá trình đường phân và lên men đồng thời (SSF), các enzyme và vi sinh vật đồng thời
hoạt động trong cùng một thiết bị phản ứng. Điều này làm giảm sự ức chế sản phẩm đối
với hoạt động của enzyme, vì các loại đường đơn phân giải phóng được tiêu thụ trực tiếp
bởi vi sinh vật 11. Các điều kiện áp dụng trong các quy trình SSF như pH và nhiệt độ
phải phù hợp cho cả enzyme cocktail và vi sinh vật.

Bacillus coagulans là một chủng thú vị để sản xuất axit lactic từ lignocellulose trong quy
trình SSF 11. Nó có thể lên men cả glucose và xyloza lên men với hiệu suất chuyển đổi
trên 90% W / W. Hơn nữa, B. coagulans tạo ra axit lactic với năng suất cao 2,5-3 g / l / h.
Nó có thể phát triển trong môi trường axit nhẹ trong khi nó cũng là một loại ưa nhiệt vừa
phải với nhiệt độ tăng trưởng tối ưu khoảng 50 ° C, tương tự như điều kiện tối ưu cho các
loại cocktail enzyme thương mại như GC220 (Genencor, Đan Mạch) và CTeC2
(Novozymes, Đan Mạch) . Tuy nhiên, sự tăng trưởng của B. coagulans có thể bị ức chế
bởi các sản phẩm phụ có trong lignocellulose được tiền xử lý.
Vật liệu và phương pháp
Hóa chất, enzyme và sinh khối: Tất cả các hóa chất được sử dụng: có độ tinh khiết ít
nhất 98%.
Ammonium phosphate (NH4)3PO4
Canxi hydroxide Ca(OH)2
Yeast extract, peptone, glucose và BIS Tris.
Loại cocktail enzyme: Genencor GC220, có hoạt tính 105 FPU / ml.
Cây mía. Bã mía được xử lý trước 15 phút ở 170 ° C sử dụng axit sulfuric 0,76%, sau đó
là nổ hơi. Vật liệu rắn cuối cùng chứa 47% glucan (polysacarit có nguồn gốc từ D-
glucose, được liên kết bởi các liên kết glycosid) và 3% xylan (hemixenluloza từ gốc
xylose). %w/dw bã mía ban đầu.

Vi sinh vật
Bacillus coagulans DSM 2314 dưới dạng đông khô (DSMZ, Đức). Các tế bào được tạo
huyền phù trong 30 phút trong môi trường PYPD 5 ml (chiết xuất men 5 g / l, peptone 10
g / l, glucose 20 g / l và BIS-Tris 10 g / l đệm) , được khử trùng trước 20 phút ở 121 ° C.
Các tế bào được chuyển sang bình kỵ khí 60 ml chứa 50 ml môi trường PYPD và được
nuôi trong 16 giờ đến mật độ quang đo ở 660nm (OD660) khoảng 2. Sau khi thêm
glycerol để đạt nồng độ 15% v / v trong mẫu, các tế bào được lưu trữ trong ống 1,5 ml ở
-80 ° C cho đến khi sử dụng.

Chuẩn bị canh trường giống

Bình kỵ khí vô trùng 60 ml được đổ đầy môi trường PYPD 50 ml cho mẫu đối chứng,
hoặc môi trường PYPD đậm đặc 25 ml được khử trùng ở 121 ° C trong 20 phút và 25 ml
dung dịch furfural 2 g / l (tiệt trùng trong 1 giờ ở 85 ° C). Các bình kỵ khí được cấy với
250 µl B. coagulans (OD=2) để có được OD660 khởi đầu 0,01 và được nuôi cấy trong tủ
ấm ở 50 ° C mà không lắc. Khi đạt được OD660 bằng 1, xảy ra sau khoảng 15 giờ đối với
mẫu đối chứng và sau khoảng 25 giờ đối với các canh trường có chứa furfural, những
canh trường này đã được sử dụng cấy cho thiết bị SSF Batch.
Batch Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF)
Quá trình lên men được thực hiện trong các thiết bị phản ứng Multifors (Infors, Thụy Sĩ),
được khử trùng trong 20 phút ở 121 ° C. SSF bao gồm hai giai đoạn, giai đoạn tiền thủy
phân từ 4 - 6 giờ và giai đoạn lên men. Trong giai đoạn tiền thủy phân, 645 gram bã mía
rắn đã được xử lý trước không washed (trọng lượng khô 31% W / W), tương ứng với 200
gram trọng lượng khô, đã được thêm vào thiết bị lên men, cùng với 245 ml nước vô trùng
hoặc simulated liquid fraction chứa (NH4) 3PO4 20,4 g / l (table 1). (Bã mía đã được
tiền xử lý có khả năng giữ nước cao, dẫn đến có độ nhớt tại nồng độ chất tan (DW) cao.
Vì bã mía có DW 31% W / W sau khi tiền xử lý nhiệt hóa học, nó phải được pha loãng
trước khi thủy phân và lên men)
Phần rắn được rửa và không được rửa (ưu và nhược điểm): Hàm lượng chất rắn trong bã
ngô được xử lý trước bằng NaOH có thể lên tới 20% (w / w); tuy nhiên, các chất ức chế
như axit formic và axit axetic có trong các vật liệu tiền xử lý NaOH (Toquero và Bolado,
2014). Rửa có thể loại bỏ các chất ức chế; tuy nhiên, rửa đòi hỏi một lượng nước lớn và
dẫn đến làm loãng vật liệu, điều này có thể cản trở nồng độ chất rắn cao. Vật liệu mới rửa
dễ bị nhiễm nên phải được lên men càng sớm càng tốt để tránh ô nhiễm bởi các vi sinh
vật khác. Các chất ức chế đã đc cải thiển bằng pp tiền nuôi cấy chủng.
Bảng 1: thành phần của phần chất lỏng thu được sau khi chất lỏng rắn của bã mía được
xử lý trước bằng axit, như được xác định trong một nghiên cứu trước đây (van der Pol
2015). Sự hiện diện của các hợp chất khác nhau được thể hiện bằng gam trên 245 ml
phần lỏng.
25% tổng số enzyme được thêm vào. Độ pH 5.0 và được kiểm soát bằng cách thêm 4N
Ca (OH) 2. Nhiệt độ của thiết bị lên men được đặt ở mức 50 ° C, tốc độ máy khuấy ban
đầu được bắt đầu ở mức 40 rpm và tăng lên 100 rpm trong giờ đầu tiên khi độ nhớt của
sinh khối giảm và không áp dụng sục khí. Sau giai đoạn tiền thủy phân, 100 ml của 100 g
/ l chiết xuất nấm men (yeast extract) đã được thêm vào và môi trường lên men được cấy
canh trường chủng giống (5% V / V).
B. coagulans có sự tăng trưởng tối ưu ở nhiệt độ 50 - 54 ° C và pH là 5.8 - 6,5, nhưng có
thể phát triển ở một phạm vi nhiệt độ rộng trong khoảng 30-58 ° C và phạm vi pH là 4,8-
7,5. Quá trình thủy phân bã mía đã được tiền xử lý đã đạt được nhờ enzyme cocktail
Genencor GC220, có nhiệt độ tối ưu là 50 ° C và pH tối ưu là 5.0. Ở pH 5,8, tỷ lệ chuyển
đổi glucan thành glucose bằng GC220 bằng 85% tỷ lệ chuyển đổi ở pH 5. Vì điều kiện
cho các quá trình SSF, 50 ° C và pH 5,8 đã được chọn. Trong quá trình lên men, tốc độ
máy khuấy được đặt ở mức 100 rpm, nhiệt độ được kiểm soát ở mức 50 ° C và độ pH
được kiểm soát ở mức 5,8 bằng cách thêm 4N Ca (OH) 2. Tổng lượng cocktail enzyme
GC220 được thêm vào trong SSF là 10% V / DW (ml enzyme/gram bã mía khô:200gram
tổng) tương đương 10,5 FPU trên mỗi gam bã mía khô , 12,5% V / DW tương đương
13,1 FPU trên mỗi gram bã mía khô hoặc 15% V / DW tương đương 15,8 FPU mỗi g bã
mía khô. Tại các khoảng thời gian đều đặn trong tất cả các thí nghiệm SSF, các mẫu 10
ml đã được lấy và bảo quản ở -20 ° C cho đến khi phân tích được thực hiện.
Quá trình đường phân và lên men đồng thời hai giai đoạn (SSF)
Giai đoạn tiền thủy phân SSF hai giai đoạn đã được bắt đầu với việc bổ sung 322,5 gram
bã mía đã được xử lý trước, tương đương với 100 gram trọng lượng khô, 245 ml 20,4 g / l
(NH4) 3PO4 trong nước vô trùng và 25% tổng số enzyme sử dụng. Độ pH ban đầu được
đặt thành pH 5 bằng cách thêm 4N H2SO4 hoặc 4N Ca (OH) 2, và sau đó được kiểm soát
bằng cách thêm 4N Ca (OH) 2. Nhiệt độ được giữ ở mức 50 ° C và khuấy được giữ ở
mức 100 RPM. Quy trình cấy giống sau khi thủy phân tương tự như SSF theo mẻ. Vào
4,5h hoặc 9,5h, 322,5 gram bã mía được xử lý trước được thêm dần dần trong khoảng
thời gian 1,5 giờ, trong khi tốc độ khuấy được tăng lên 150 rpm. Tổng cộng, 15% V /
DW enzyme đã được thêm vào, tương ứng với 15,8 FPU / g DW bã mía tiền xử lý.
Phân tích axit lactic, đường đơn và sản phẩm phụ lignocellulosic
Phân tích axit lactic và đường được thực hiện bằng hệ thống HPLC Waters e2695
(Milford, Hoa Kỳ) được trang bị chỉ số khúc xạ Waters RI2414 và máy đo quang phổ UV
/ Vis Waters 2489 ở bước sóng 210nm. Cột được sử dụng là cột trao đổi ion Shodex RS
pak KC-811 (chiều dài 300 mm - I.D. 8 mm), được kiểm soát ở 65 ° C. Khi rửa giải,
H2SO4 3mM trong nước milliQ đã được sử dụng. Lưu lượng sử dụng là 1 ml / phút. Các
mẫu được lấy trong SSF đã tan băng và xoáy. 1,5 ml mẫu được chuyển vào ống
eppendorf 2 ml và đặt trong khối gia nhiệt trong 15 phút ở 70 ° C, đảm bảo tất cả canxi
lactate được hòa tan. Các mẫu được ly tâm trong 4 phút với tốc độ 13.200 vòng / phút.
250 Phal của supernatant được trộn với 250 Pha nước và 500 Phal của axit phthalic 1M
H2SO4 / 1mM (được sử dụng làm chất chuẩn nội) trong nước milliQ. Các mẫu được làm
nóng trở lại đến 70 ° C trong 15 phút, làm nguội trong 2 giờ, được lọc bằng bộ lọc
Spartan 0,2 để đảm bảo tất cả canxi được kết tủa và loại bỏ, và chất siêu nhiên được đo
bằng HPLC.
Phân tích Glucan, xylan và axit uronic
Thành phần và hàm lượng đường trung tính được xác định trùng lặp theo Englyst và
Cummings 17. Sau khi thủy phân trước với 72% (w / w) H2SO4 trong 1 giờ ở 30 ° C, các
mẫu được thủy phân bằng H2SO4 1 M ở 100 ° C 3 h. Các monosacarit được dẫn xuất
thành axetat aldit của chúng và được phân tích bằng sắc ký khí (Focus-GC, Thermo khoa
học, Waltham, MA, Hoa Kỳ). Inositol được sử dụng làm tiêu chuẩn nội bộ. Hàm lượng
axit uronic được xác định trùng lặp theo xét nghiệm m-hydroxydiphenyl tự động so màu
18, sử dụng máy phân tích tự động (Skalar Analytical B.V., Breda, Hà Lan). Axit
Galacturonic được sử dụng để hiệu chuẩn.

Ảnh hưởng của nồng độ axit lactic đến quá trình thủy phân enzyme
Bình lắc 150 ml chứa 6,5 gram bã mía đã được xử lý trước bằng axit, tương ứng với 2
gram DW. Đối với các bình lắc này, 15 ml axit citric 0,1M và 23 ml Na2HPO4.12H2O
đã được thêm vào để thu được dung dịch đệm ở pH 5,8. Đối với các bình này, 0, 1,25, 2,5
và 5 ml dung dịch axit -lactic (D / L) (80% trong H 2, mật độ 1,2 g / ml) đã được thêm
vào. Nước MilliQ được sử dụng để đặt thể tích làm việc cuối cùng ở mức 50 ml. Độ pH
được thiết lập lại thành 5,8 bằng cách sử dụng các viên KOH khi cần thiết. Các bình lắc
được ủ trong 15 phút ở 50 ° C và 100 RPM. Sau khi bổ sung 100 bial của enzyme
cocktail GC220, các bình đựng được lắc ở 50 ° C và 200 RPM. Sau 1 và 2 giờ, các mẫu
được lấy, được làm nóng ngay lập tức đến 98 ° C trong 10 phút để làm bất hoạt các
enzyme, làm lạnh trên nước đá, được lọc bằng các bộ lọc Spartan 0,2 và được lưu trữ ở 4
° C. Nồng độ glucose được đo bằng phương pháp HPLC được mô tả trước đây.
Tính toán xác định sản lượng, hiệu suất axit lactic, và monome hóa đường.
Do thể tích có sự thay đổi lớn trong SSF, các giá trị được tính toán lại thành gram trên
mỗi mẻ thay vì gram trên mỗi lít để xác định sản lượng và tổng lượng axit lactic được tạo
ra. Thể tích của lò phản ứng tại thời điểm t (VR, t) được tính dựa trên lượng cơ sở được
thêm vào theo tỷ lệ phần trăm của tổng lượng cơ sở được thêm vào tại thời điểm t (Bt),
thể tích của lò phản ứng tại T = 0 tính bằng lít ( VF, 0), thể tích xác định của lò phản ứng
ở cuối SSF tính bằng lít (VF, kết thúc) và tổng thể tích mẫu được lấy tại thời điểm t tính
bằng lít (VS). Lượng axit lactic tính bằng gam tại thời điểm t (ALA, t) được tính dựa trên
nồng độ axit lactic tính bằng gam trên lít được xác định qua HPLC tại thời điểm t (CLA,
t), thể tích của lò phản ứng tại thời điểm t (VR, t) và hệ số hiệu chỉnh lượng axit lactic
được lấy ra bằng cách lấy mẫu tại mẫu n (CFLA, n). Phần rắn chứa 47% glucans và 3%
xylans khi thêm vào thiết bị phản ứng. Do phản ứng monome hóa là phản ứng thủy phân,
trọng lượng phân tử tăng từ 162 gram mỗi mol glucan tiểu đơn vị lên 180 gram / mol
glucose và từ 132 gram mỗi mol xylan tiểu đơn vị lên 150 g / mol xyloza, do đó, lượng
tối đa là đường đơn có thể được hình thành từ 200 gram vật liệu rắn trọng lượng khô là
110,2 gram đường. Trong các thí nghiệm trước đó và bằng phân tích glucan / xylan còn
lại ở cuối SSF (bảng 3), người ta đã quan sát thấy rằng từ 200 gram sinh khối rắn đã được
xử lý trước, 92 gram đường được monome hóa bởi cocktail enzyme và do đó có sẵn cho
lên men.
Sản xuất axit lactic có thể được ước tính dựa trên lượng Ca (OH) 2 được thêm vào lò
phản ứng. Nồng độ axit lactic tại một thời điểm nhất định (ALA, t) được tính bằng cách
lấy lượng bazơ được thêm vào tại một mốc thời gian nhất định (Bt) chia cho tổng lượng
bazơ được thêm vào (Bt = end) và nhân với hiệu giá axit lactic cuối cùng (ALA, t = end)
được đo bằng triplo thông qua HPLC. Tính toán tổng thể là: Không có sự khác biệt trong
sản xuất axit lactic lớn hơn 2 gram giữa các tính toán dựa trên bổ sung Ca (OH) 2 và
phân tích HPLC của các mẫu được lấy tại các thời điểm khác nhau trong SSF.
Kết quả và thảo luận
Batch SSF, bã mía hòa tan với phần lỏng thu được sau tiền xử lý bằng axit hóa
Vì axit lactic là một hóa chất có giá trị gia tăng thấp, nó đòi hỏi phải chuyển đổi hiệu quả
vật liệu lignocellulose thành axit lactic có sản lượng, hiệu suất và hiệu giá cao. Hàm
lượng chất khô của sợi bã mía sau khi tiền xử lý và tách chất lỏng là 31% W / W. Nồng
độ chất khô bã mía trên 20% (W / W, trọng lượng khô) dẫn đến độ nhớt quá cao trong
thiết bị lên men. Do đó, phần rắn được pha loãng bằng cách thêm 245 ml phần lỏng, thu
được trong quá trình tách chất lỏng rắn được thực hiện trực tiếp sau quá trình tiền xử lý
nhiệt hóa học.
Trong quy trình SSF theo mẻ, tổng sản lượng axit lactic 77,6 gram đã thu được trong thiết
bị lên men với thể tích ban đầu 1 lít, với nồng độ axit lactic cuối cùng là 64,1 g / l. Năng
suất axit lactic trung bình là 0,78 g / l / giờ, thấp so với 2,5-3 g / l / giờ được quan sát cho
các quá trình lên men axit lactic sử dụng đường tinh khiết (bảng 2b). Hiệu suất chuyển
đổi của lignocellulose thành axit lactic là 74% W / W, trong khi năng suất chuyển đổi
trên các loại đường đơn là 80% W / W. Vì cả năng suất và năng suất trung bình đều
không đủ để cạnh tranh với các quy trình sử dụng đường nguyên chất, quy trình SSF nên
được tối ưu hóa để tăng năng suất axit lactic trên vật liệu lignocellulose.

Batch SSF được cấy chủng với B. coagulans có chứa furfural

Trong nghiên cứu trước đây, người ta đã phát hiện ra rằng việc bổ sung furfural vào các
phân tử của B. coagulans đã cải thiện sự tăng trưởng và sản xuất axit lactic trên các cơ
chất nhiều sản phẩm phụ lignocellulose 15. Do đó, hiệu quả của việc bổ sung furfural vào
các phân tích cũng đã được nghiên cứu trong một thiết lập SSF sử dụng sợi bã mía được
hòa tan với phần lỏng.
Việc bổ sung 1 g / l furfural vào canh trường giống, được sử dụng làm chủng giống cho
thí nghiệm SSF theo mẻ, đã giảm pha lag trong 20 giờ (Bảng 2a, hình 2). Bên cạnh việc
giảm pha lag, năng suất của axit lactic trên tổng lượng đường lignocellulose là 87% W /
W khi sử dụng phương pháp nuôi cấy furfural, cao hơn đáng kể so với 74% W / W được
quan sát thấy khi sử dụng phương pháp nuôi cấy thông thường. Bổ sung Furfural làm
tăng tổng sản lượng axit lactic được tạo ra trong thiết bị lên men với thể tích khởi đầu 1
lít 18% đến 91,7 gram, trong khi năng suất axit lactic trung bình tăng từ 0.78 lên 0,92 g /
l/ h. Năng suất axit lactic tối đa là 4.2 g / l / h,

Nó đã được tìm thấy rằng gđ nhân giống với sự hiện diện của furfural có lợi cho quá trình
lên men bằng cách sử dụng sợi bã mía được xử lý bằng axit trong SSF. Do đó, tất cả các
thí nghiệm SSF sau đó đã được cấy giống B. coagulans tiền nuôi cấy với sự hiện diện của
furfural.
Batch SSF, hòa tan bã mía với nước
Mặc dù sản xuất axit lactic đủ và năng suất chuyển đổi cao của lignocellulose thành axit
lactic đã được quan sát thấy trong mẻ SSF được hòa tan với phần lỏng, năng suất trung
bình vẫn chưa thể cạnh tranh với năng suất đạt được trên các loại đường cao cấp. Điều
này chủ yếu được gây ra bởi một giai đoạn lag dài khoảng 40 giờ. Phần chất lỏng chứa
khoảng 20 gram đường mỗi lít, nhưng nó cũng chứa 2 g / l axit axetic, 1 g / l furfural và
một số sản phẩm phụ khác ở nồng độ nhỏ (Bảng 1). Những sản phẩm phụ này bổ sung
cho những chất có trong sợi bã mía đã được xử lý trước và là một trong những thách thức
chính khi sử dụng lignocellulose được xử lý trước trong quá trình lên men. Mặc dù việc
bổ sung thêm một lượng nhỏ đường có thể rất thú vị để tăng nhẹ tổng sản lượng axit
lactic, nhưng có một rủi ro là lượng bổ sung các sản phẩm phụ gây ức chế dẫn đến giảm
năng suất. Do đó, các thí nghiệm đã được thực hiện trong đó phần rắn được hòa tan với
nước milliQ thay vì phần lỏng. Tương tự như kết quả quan sát được đối với mẻ SSF được
hòa tan với phần lỏng, sử dụng canh trường giống có chứa furfural cho SSF được hòa tan
trong nước dẫn đến giảm thời gian pha lag trong 15 giờ so với sử dụng phương pháp
kiểm chứng (dữ liệu không được hiển thị). Giai đoạn sản xuất cho thấy năng suất axit
lactic cao, với năng suất axit lactic tối đa là 4.2 g / l / h, tương tự như mẻ SSF được hòa
tan với phần lỏng.
Batch SSF sử dụng phần rắn hòa tan với nước được thực hiện với hai nồng độ enzyme
khác nhau, 7.5% V / DW và 15% V / DW (Hình 2 và bảng 2a). Trong cả hai quá trình lên
men, nồng độ đường giảm trong giai đoạn sản xuất và đạt mức dưới 5 g / l sau 52 và 55
giờ đối với quá trình lên men với cocktail enzyme 10% V / DW và 15% V / DW. Thiết bị
lên men trong đó sử dụng 7.5% V / DW enzyme cho thấy năng suất axit lactic giảm mạnh
sau 52 giờ xuống chỉ còn 0,51 g / l / h (trong khi SSF chứa 15% V / DW cho thấy năng
suất trung bình là 1,44 g / l / h trong khoảng từ 55 đến 62 giờ). Vào lúc 66 giờ, cocktail
enzyme bổ sung 5ml (2,5% V / dW) vào mẻ đã bs 7.5% enzyme đã được dùng để tăng
nồng độ enzyme lên 10% V / DW. Ngay lập tức, nồng độ glucose tăng lên, đạt nồng độ
tối đa 5 g / l và việc sản xuất axit lactic được tiếp tục theo cách tương tự như đã được
quan sát cho quá trình lên men sử dụng enzyme 15% V / DW. Điều này cho thấy quá
trình thủy phân đường của enzyme là bước giới hạn tốc độ của quá trình lên men chứa
cocktail enzyme 7,5% V / DW, trong khi enzyme 10% V / DW là liều lượng enzyme đủ
cao.
Sau 68 giờ, quá trình với cocktail enzyme 15% V / DW đã đạt được nồng độ axit lactic là
70,4 g / l, tương đương với tổng sản lượng axit lactic là 83,8 gram. Điều này tương ứng
với năng suất sản xuất axit lactic trên tổng lượng lignocellulose là 83% W / W và hiệu
suất chuyển đổi của B. coagulans của đường monomeric thành axit lactic là 92% W / W.
Nhìn chung, năng suất axit lactic trung bình là 1,14 g / l / h đã đạt được, cao hơn đáng kể
so với năng suất trung bình 0,92 g / l / giờ quan sát được đối với mẻ SSF được hòa tan
với phần lỏng. Tuy nhiên, so với SHF, thời gian xử lý 68 giờ trong mẻ SSF là ngắn. Khi
so với SHF, quá trình thủy phân enzyme một mình trong SSF có thể mất từ 48-72 giờ và
quá trình lên men tiếp theo cần thêm 40-60 giờ. Liều lượng enzyme 10,5-15,8 FPU / g
DW được sử dụng cho mẻ SSF tương đối thấp, trong hầu hết các nghiên cứu khác, liều
lượng của enzyme là 20-40 FPU / g DW đã được sử dụng. Thủy phân enzyme được coi là
một bước quá trình tốn kém trong việc chuyển đổi lignocellulose do chi phí cao của
cocktail enzyme kết hợp với liều lượng bổ sung cao. Trong một nghiên cứu trước đây,
trong đó ethanol được sản xuất từ lignocellulose ở quy mô thương mại, người ta đã tính
toán rằng liều lượng của enzyme 18 FPU / g DW đóng góp vào 19% tổng chi phí sản xuất
ethanol.
Quá trình đường phân và lên men đồng thời hai giai đoạn (SSF) fed-batch
Mặc dù năng suất tối đa trong mẻ SSF tương tự như quan sát thấy với quá trình lên men
bằng đường cao cấp, năng suất trung bình vẫn còn thấp do giai đoạn lag dài. Sự kết thúc
của pha lag trùng với độ nhớt của quá trình nuôi cấy giảm do thủy phân enzyme, cho thấy
rằng pha lag dài là do độ nhớt cao của môi trường. Việc giảm độ nhớt có thể đạt được
bằng cách thêm vật liệu lignocellulose vào hai giai đoạn, thay vì thêm tất cả
lignocellulose như một đợt khi bắt đầu SSF. Sử dụng phương pháp này, các vi sinh vật
trực tiếp bắt đầu phát triển mà không có pha lag có thể nhìn thấy sau khi cấy chủng, và
việc sản xuất axit lactic đáng kể đã được quan sát trong vòng 3 giờ. Sau 37 giờ, tổng sản
lượng axit lactic 75,9 gram đã đạt được với năng suất axit lactic trung bình là 1,81 g / l /
giờ và năng suất tối đa là 4,3 g / l / giờ (bảng 2a, hình 2). Trong 23 giờ đầu tiên của SSF
hai giai đoạn, năng suất trung bình 2,54 g / l / h đã được quan sát. Năng suất này gần với
năng suất trung bình 2,5-3 g / l / h (bảng 2b) thường thấy trong quá trình lên men của B.
coagulans sử dụng đường cao cấp làm nguồn carbon.

Năng suất acid lactic trung bình (average lactic acid productivity) trong SSF hai giai đoạn cao
hơn nhiều so với SSF theo mẻ, nhưng tổng sản lượng axit lactic (total lactic acid production)
và hiệu suất chuyển hóa axit lactic trên lignocellulose (lactic acid production yields ) thấp
hơn một chút trong các thí nghiệm SSF hai giai đoạn. Trong các nghiên cứu trước đây,
người ta cho rằng hoạt động của các enzyme có trong cocktail có thể bị ức chế do tăng
nồng độ axit lactic. Hoạt tính của GC220 đã được thử nghiệm với sự hiện diện của nồng
độ axit lactic cao. Một thí nghiệm để xác định hoạt động của enzyme ban đầu cho thấy
rằng sự hiện diện của 50 g / l axit lactic dẫn đến giảm 51% lượng monome hóa glucan bởi
enzyme cocktail GC220, trong khi sự hiện diện của axit lactic 100 g / l dẫn đến ức chế
hoàn toàn các enzyme. Người ta cũng thấy rằng glucans và xylans dư hơn 11% đã có mặt
ở cuối SSF hai giai đoạn so với cuối SSF theo mẻ (bảng 3). Trong mẻ SSF, tổng cộng
93,4 gam polyme đường đã được monome hóa, trong khi ở SSF hai giai đoạn, 83,2 gam
polyme đường được monome hóa (bảng 3). Do SSF mẻ cho thấy giai đoạn lag dài có
nồng độ axit lactic thấp (g/l) , có thể gợi ý rằng các enzyme trong SSF mẻ ít bị ức chế,
dẫn đến tăng khả năng monome hóa so với SSF hai giai đoạn. Cả SSF mẻ và SSF hai giai
đoạn đều cho kết quả chuyển đổi tương tự của các loại đường đơn thành axit lactic
khoảng 90% W / W. Do đó, hiệu giá axit lactic thấp hơn được quan sát thấy trong SSF
hai giai đoạn có thể là do giảm quá trình thủy phân enzyme của các polyme
lignocellulose.

Phần kết luận

Việc sản xuất axit lactic từ bã mía được xử lý trước bằng axit được thực hiện với hai quy
trình khác nhau, SSF theo mẻ và SSF hai giai đoạn. Trong các quá trình này, quá trình
thủy phân và lên men enzyme được kết hợp với thời gian xử lý ngắn hơn so với SHF.
Mục tiêu của nghiên cứu này là đạt được năng suất axit lactic trong các thí nghiệm SSF
sử dụng lignocellulose tương tự như lên men sử dụng đường cao cấp làm nguyên liệu. Nó
đã được chứng minh rằng việc bổ sung furfural vào tiền nuôi cấy đã làm giảm giai đoạn
pha lag (do acid lactic là sp bậc 1 nên tỷ lệ thuận với sự tăng trưởng của sinh khối VSV
do đó nên vào pha lag càng nhanh càng tốt) và tăng sản xuất axit lactic. Trong đợt SSF,
có thể tạo ra tới 91,7 g/l axit lactic, với năng suất chuyển đổi của đường đơn thành axit
lactic là 94% W / W, và sản lượng axit lactic trên tổng lượng đường có trong bã mía được
xử lý trước là 87% W / W. Năng suất trong đợt SSF 0,78-1,14 g / l / h vẫn còn thấp so với
năng suất 2,5-3 g / l / h đạt được trên các loại đường cao cấp.
Trong SSF hai giai đoạn, độ nhớt của dịch lên men đã giảm. Điều này dẫn đến năng suất
trung bình trong toàn bộ quá trình 1,81 g / l / h. Trong 23 giờ đầu tiên của quá trình lên
men, năng suất axit lactic trung bình 2,54 g / l / h đã được quan sát. Năng suất này tương
tự như năng suất thu được trong quá trình lên men sử dụng đường cao cấp làm nguyên
liệu. Có thể kết luận rằng việc sản xuất đầy đủ axit lactic từ lignocellulose đã được thực
hiện thành công nhờ quy trình SSF sử dụng kết hợp bã mía tiền xử lý axit, B. coagulans
làm vi sinh vật và GC220 làm cocktail enzyme. Hơn nữa, việc cải thiện quá trình thủy
phân enzyme ở nồng độ axit lactic cao sẽ làm tăng khả năng cạnh tranh của quá trình SSF
so với sử dụng đường cao cấp.
Khi các quy trình SSF như đề xuất trong nghiên cứu này được so sánh với các quy trình
khác, có thể kết luận rằng việc sản xuất đầy đủ axit lactic từ lignocellulose đã được thực
hiện thành công bởi một quy trình SSF sử dụng kết hợp bã mía được xử lý bằng axit, B.
coagulans làm vi sinh vật và GC220 như enzyme cocktail (Bảng 5). Hơn nữa, việc cải
thiện quá trình thủy phân enzyme ở nồng độ axit lactic cao sẽ làm tăng thêm khả năng
cạnh tranh của quá trình SSF so với sử dụng đường cao cấp.

Kiến thức bổ sung

1. Enzyme cocktail
Hỗn hợp hoặc sự kết hợp của các enzyme khác nhau, làm hiệu quả cho phản ứng xúc
tác.
Thông tin cụ thể về enzyme sử dụng: file acid lactic enzyme.
2. Chương 5: sự hiện diện của furfural
Phân tích RNA-seq đã được thực hiện để xác định các cơ chế có thể đằng sau việc
giảm độc tính của các sản phẩm phụ khi các tế bào được nuôi cấy chuẩn bị giống với
sự hiện diện của furfural.
Mục đích: Sản phẩm phụ do quá trình tiền xử lý hóa học của lignocellulose có thể ức
chế quá trình lên men của đường lignocellulose thành axit lactic. Furfural là một sản
phẩm phụ như vậy, được hình thành trong quá trình tiền xử lý axit. Lên men có kiểm
soát pH với thể tích ban đầu 1 lít, chứa môi trường YP và hỗn hợp các sản phẩm phụ
lignocellulose, được tiêm với các chất của B. coagulans DSM2314 được thêm vào 1 g
/ l furfural. Việc bổ sung furfural dẫn đến tăng L (+) - năng suất axit lactic theo hệ số
2 đến 1,39 g / l / h, tăng sản xuất axit lactic từ 54 đến 71 gram và tăng năng suất
chuyển đổi đường thành axit lactic từ 68% đến 88% W / W. Hiệu suất được cải thiện
không phải do tiêu thụ hoặc chuyển đổi furfural, chỉ ra rằng các tế bào có được dung
sai cao hơn đối với furfural. Sự thích nghi này trùng hợp với sự kéo dài đáng kể của
các tế bào B. coagulans và sự điều hòa của các con đường liên quan đến quá trình
tổng hợp các thành phần của thành tế bào như bacillosamine, peptidoglycan và
spermidine. Hơn nữa, một sự điều hòa đã được quan sát đối với SigB và các gen được
SigB quảng bá như NhaX và YsnF. Những gen này có liên quan đến phản ứng căng
thẳng trong trực khuẩn.
Nuôi cấy trong bình kỵ khí ở quy mô 50 ml
Nuôi cấy được thực hiện trong bình kỵ khí thủy tinh 50 ml, được bịt kín bằng nút cao
su và nắp uốn bằng nhôm, trong tủ ấm đặt ở 50 ° C mà không lắc.
Dung dịch hỗn hợp phụ phẩm Lignocellulose và dung dịch phụ phẩm đơn được đun
nóng ở 85 CC trong 1 giờ. Một hỗn hợp sản phẩm phụ axit-150 lignocellulose đã
được sử dụng trong thí nghiệm này, giống như chất nền lignocellulose bã mía được xử
lý bằng axit có chứa 150 g / l đường đơn lignocellulose (bảng 1) (van der Pol et al
2015). Mà ta có cứ 1 kg bã mía sau tiền xử lý bằng acid và enzyme thu được khoảng
600g đường đơn tổng (125,9 + 484.22 kg) với phần rắn không được rửa, lượng đường
thu được nhiều hơn.
Hỗn hợp sản phẩm phụ + các sản phẩm phụ đơn lẻ được thử nghiệm.
Các sản phẩm phụ được kiểm tra là furfural, vanillin, syringaldehyd, axit axetic và
axit formic.
Các bình ban đầu: được sử dụng để làm canh trường giống cho các bình sau được cấy
250 micro lít của tủ đông lạnh để thu được OD660 0,01 bắt đầu và chứa 25 ml môi
trường PYPD đậm đặc gấp 2 lần và 25 ml dung dịch chứa 1 sản phẩm phụ nồng độ
gấp 2 lần mong muốn hoặc hỗn hợp sản phẩm phụ của bã mía sau xử lý axit-150 đậm
đặc gấp 2 lần được thêm vào.
Các bình mới, để đánh giá hiệu ứng thích ứng, chứa 25 ml môi trường PYPD đậm đặc
gấp 2 lần và 25 ml hỗn hợp axit-150 đậm đặc 2 lần. Các bình này được cấy bằng canh
trường lấy từ các bình ngay trước đó, sử dụng lượng từ 200 micro l đến 500 micro lít
để thu được OD660 bắt đầu trong bình mới 0,01.
Nuôi cấy trong bình kỵ khí 50 ml, được sử dụng làm chất cấy cho lên men
Bình kỵ khí vô trùng 50 ml được đổ đầy 25 ml môi trường PYPD đậm đặc gấp 2 lần
và 25 ml nước chứa 2 g / l furfural hòa tan trong nước (furfural trong dung dịch cuối
cùng là 1g / l trong bình kỵ khí). Các bình kỵ khí được cấy với giống 250 muyl B.
coagulans để thu được OD khởi đầu ở 660nm 0,01 và được nuôi cấy trong tủ ấm ở 50
° C mà không bị lắc. Khi canh trường đạt OD660 bằng 1, xảy ra trong khoảng 15 giờ
đối với các mẫu kiểm chứng và khoảng 24 giờ đối với các phân tích có chứa furfural,
phân tích này được sử dụng làm canh trường giống cấy cho lên men có kiểm soát pH
1 lít.
Nuôi cấy lên men kiểm soát pH 1 lít
Quá trình lên men được thực hiện trong các TB phản ứng Multifors 1,5 lít (Infors,
Thụy Sĩ). Mỗi quá trình lên men bắt đầu với 100 g / l hỗn hợp đường, chứa 3,3 g / l
galactose, 24,2 g / l xyloza và 72,5 g / l glucose. Lên men được thực hiện bằng môi
trường peptone chứa 10 g / l men chiết xuất và 10 hoặc 20 g / l peptone làm nguồn
nitơ (môi trường YP10 / YP20). Lên men được thực hiện bằng môi trường amoni
chứa 10 g / l men chiết xuất, 2 g / l (NH4) 2PO4 và 3,5 g / l (NH4) 2PO4 làm nguồn
nitơ (môi trường YA). Các thành phần môi trường được hòa tan trong 500 ml nước
milliQ trong bình lên men đã khử trùng trước, pH được đặt dưới 5,5 với axit citric để
giảm phản ứng Maillard, và thiết bị lên men bao gồm môi trường 500 ml được khử
trùng trong 12 phút ở 121 ° C. Sau khi khử trùng, 500 ml nước MilliQ vô trùng hoặc
500 ml hỗn hợp phụ phẩm cô đặc gấp 2 lần, được làm nóng trước ở 85 CC trong 1 giờ
(bảng 1), được thêm vào thiết bị lên men. Thiết bị lên men được tiêm 50 ml (5% V /
V) của một mẫu nuôi cấy, trong đó thêm 1 g / l furfural, hoặc một bộ lọc tham chiếu
mà không cần bổ sung furfural, dùng làm đối chứng. Nhiệt độ được kiểm soát ở 50 °
C, độ pH được duy trì ở pH 6 với 4N KOH và khuấy được kiểm soát ở 100 RPM.
Không có sục khí hoạt động được áp dụng trong quá trình lên men. Tại các khoảng
thời gian đều đặn trong quá trình lên men, các mẫu 10 ml đã được lấy, OD ở 660nm
được xác định và phần còn lại của mẫu được đông lạnh ở -20 ° C để phân tích HPLC.
CHÚ Ý: sản phẩm phụ chỉ được hình thành ngay sau quá trình tiền xử lý bằng acid
của lignocellulose, sau đó quá trình thủy phân bằng enzyme không tạo sản phẩm phụ
nữa và không gây ảnh hưởng tới qtr lên men, do chỉ thủy phân cellulose, hemi thành
đường thôi.
3. Lignocellulose và bã mía
Cellulose là các mạch thẳng dài của các đơn vị glucose liên kết sấp ngửa với nhau bằng liên kết 1,4 β
glucozit. Ngoài ra, phần lớn cellulose có cấu trúc tinh thể nên bền và có tính đàn hồi. Do đó,
cellulose khó bị hòa tan trong nước và một số dung môi [1,2,10,11].

Hemicellulose cũng là các đại phân tử nhưng mạch được cấu tạo từ các đường năm cacbon pentose
và các đường sáu cacbon hexose. Tuy nhiên, các đường năm cacbon là chủ yếu. Đối với các loại gỗ
mềm và các loại cỏ, bèo,…, phần lớn đường pentose trong hemicellulose là mannose, trong khi đó
đối với gỗ cứng là đường năm xylose. Do mạch hemicellulose ngắn hơn và có cả mạch nhánh nên so
với cellulose thì hemicellulose dễ bị thủy phân hơn [2].

Thành phần thứ ba của lignocellulose là lignin. Lignin là một polymer dạng vòng được tổng hợp từ
tiền phenylpropanoid, bao gồm p-coumaryl alcohol, coniferyl alcohol and sinapyl alcohol. Lignin có
cấu tạo phức tạp và cấu trúc vững bền với thành phần các polymer này là khác nhau giữa các loài.
Lignin có nhiệm vụ bảo vệ thành phần cellulose và hemicellulose của lignocellulose. Do vậy, lignin rất
khó bị phân hủy.

Vì có mạng lignin bao bọc xung quanh nên muốn thu được các loại đường cấu thành cellulose và
hemicellulose, đầu tiên sinh khối lignocellulose phải được loại bỏ cấu trúc lignin, được gọi là giai
đoạn tiền xử lý. Phá hủy cấu trúc tinh thể lignocellulose. Phá hủy cầu trúc lignin và hemicellulose.

Nhiệt thủy phân, nổ hơi là các phương pháp tiền xử lý vật lí áp dụng cho vật liệu lignocellulose.
Chúng không có nhiều hiệu quả việc bẻ hãy cấu trúc lignin nhưng chúng làm phồng, yếu cấu trúc, tạo
thuận lợi cho sự thủy phân các mạch nguyên liệu của giai đoạn kế tiếp [12].

Thủy phân là giai đoạn quan trọng cho sản xuất ethanol từ lignocellulose. Qua quá trình thủy phân,
cellulose và hemicellulose giải phóng ra các đường đơn như glucose, xylose
Tuy nhiên, vì sự thủy phân bằng hóa chất thường xảy ra trong điều kiện đặc biệt, nhiệt độ cao, áp
suất cao nên dễ tạo ra các độc tố hay chất kìm hãm như furfural, hydroxymethyl furfural (HMF) và
các hợp chất phenol (Hình 2 và 3), do vậy, khử độc là giai đoạn tiếp theo cần được tiến hành [15,16].

Thủy phân bằng enzym được tiến hành bằng cách thêm enzym thương mại hay nuôi cấy vi sinh vật
để tiết enzym cho sự thủy phân cellulose và hemicellulose.

Hệ enzym cellulose bao gồm (1) Endo-1,4-β-glucanases (EG), (2) Exo-1,4-βglucanases or

cellobiohydrolases (CBH) and (3) β– glucosidases (EC) [15].

Hệ enzyme phân hủy hemicellulose bao gồm endo-1,4- β-xylanase (endoxylanase), 1,4-βxylosidase,
α-Larabinofuranosidase, α-4-O-methyl-Dglucuronidase, acetyl xylan esterase, ferulic acid esterase
and p-coumaric acid esterase, acetyl-4-Omethylglucuronoxylan [18]. Chức năng và hoạt động của
các enzyme này được thể hiện ở Hình 4 và 5.

Các hỗn hợp phức tạp của các enzyme có chứa cellulase, cellubiohydrolase, xylanase,
endoglucanase,-glucosidase và glucoamylase, được sử dụng để khử các cellulose và hemiaellulose
tiền xử lý (Verardi et al. 2012). Ví dụ về các loại cocktail enzyme có bán trên thị trường có chứa
enzyme phân hủy cellulose và hemiaellulose là Accellerase 1500, GC 220 và CTEC 2/3, được sản xuất
bởi Novozymes và Dupont.
Giai đoạn khử độc
Việc khử độc không những tốn chi phí mà phương pháp nào cũng làm thất thoát một lượng các
đường khi loại bỏ độc chất nên cần phải cân nhắc có nên tiến hành khử độc hay không. Vì vậy, lựa
chọn phương pháp tiền xử lý, thủy phân ít tạo ra chất cản trở, ít làm thất thoát các loại đường là
điều quan trọng trong sản xuất ethanol từ lignocellulose. Ngoài ra, lựa chọn các chủng vi sinh vật lên
men có sức chống chịu cao với độc tố và các chất cản trở là xu hướng hiện nay để công nghiệp hóa
quy trình sản xuất ethanol từ lignocellulose.

4. Quá trình tách phần rắn và lỏng sau tiền xử lý bằng acid

Trong hầu hết các nghiên cứu, việc sản xuất axit lactic từ lignocellulose được thực hiện theo ba giai
đoạn.

Trong giai đoạn đầu tiên, một tiền xử lý nhiệt hóa học được thực hiện trên nguyên liệu
lignocelluloserich, làm tăng khả năng tiếp cận cellulose.

Tiền xử lý này được theo sau bởi một quá trình thủy phân enzyme, trong đó các loại đường được
giải phóng dưới dạng monome.

Các loại đường sau đó được lên men thành axit lactic.

Quá trình này được gọi là thủy phân và lên men riêng biệt (SHF). Thay vì áp dụng quá trình thủy
phân và lên men enzyme riêng biệt, các bước quy trình này có thể được kết hợp trong quá trình
đường hóa và lên men đồng thời (SSF). Khi các quá trình riêng biệt được sử dụng, quá trình thủy
phân enzyme chỉ mất từ 48 đến 72 giờ và các enzyme bị ức chế trong hoạt động bởi nồng độ cao
của các loại đường đơn phân được hình thành (Lee et al 2004, Ouyang et al. 2013). Khi quá trình
thủy phân và lên men enzyme được kết hợp trong quy trình SSF, đường đơn phân có thể được vi
sinh vật tiêu thụ trực tiếp, điều này sẽ cho phép quá trình thủy phân enzyme nhanh hơn nhiều, do
sự ức chế sản phẩm bị giảm. Do đó thời gian xử lý trong quy trình SSF có thể được giảm mạnh.
Thành công tiềm năng của việc kết hợp cả hai bước phụ thuộc vào độ pH và nhiệt độ tối ưu của cả
hai quá trình. B. coagulans có nhiệt độ và pH tối ưu gần với nhiệt độ của các loại cocktail enzyme
như GC220 hoặc CTeC 2/3, làm cho quá trình kết hợp trở nên khả thi.
5. Chủng VSV sử dụng Bacillus coagulan

Các vi khuẩn, nấm và nấm men khác nhau có khả năng lên men đường thành axit lactic
(AbdelRahman et al. 2011, Hofvendahl và Hahn-Hägerdal 2000). Trong luận án này, một số chủng
trực khuẩn, lactobacillus và geobacillus đã được đánh giá về tiềm năng của chúng như là chủng sản
xuất axit lactic. Đối với các thí nghiệm lên men quy mô 1 lít, Bacillus coagulans DSM2314 được chọn
làm chủng sản xuất. Chủng này có một số lợi ích khi so sánh với các chủng sản xuất axit lactic khác:

• B. coagulans sản xuất axit lactic theo kiểu lên men đồng hình, cả từ glucose và xyloza, hai loại
đường phong phú nhất được tìm thấy trong lignocellulose được xử lý trước. Do đó, sản lượng axit
lactic cao trên cả hai loại đường có thể đạt được. Hơn nữa, axit lactic được sản xuất là L (+) - axit
lactic tinh khiết (Otto 2004). Độ tinh khiết quang học của axit lactic rất quan trọng để trùng hợp axit
lactic thành PLA.

• B. coagulans có tốc độ tăng trưởng tối ưu ở nhiệt độ khoảng 50 ° C, trong đó hầu hết các trực
khuẩn (lacto) cho thấy sự tăng trưởng tối ưu giữa 30 ° C và 37 ° C (Abdel-Rahman et al. 2011,
Hofvendahl và Hahn-Hägerdal 2000, Maas et al. 2008). Sau khi xử lý hóa học, lignocellulose được xử
lý trước có nhiệt độ gần 100 ° C. Làm mát lignocellulose tiền xử lý là một hoạt động tốn kém và tốn
thời gian ở quy mô lớn hơn. Hơn nữa, hầu hết các loại cocktail enzyme được sử dụng để thủy phân
lignocellulose cho thấy các hoạt động cao nhất ở nhiệt độ từ 40 ° C đến 60 ° C. Khi B. coagulans được
sử dụng làm sinh vật sản xuất, một quá trình kết hợp thủy phân enzyme và lên men có thể được áp
dụng.

Trong luận án này, người ta cũng thấy rằng B. coagulans có thể tạo ra axit lactic với năng suất tối đa
trên 5 g / l / h, đồng thời chuyển hóa năng suất glucose và xyloza thành axit lactic trên 90% W / W.
Những năng suất và năng suất chuyển đổi này cao khi so sánh với kết quả thu được đối với các vi
sinh vật khác (Abdel-Rahman và cộng sự 2011, Hofvendahl và Hahn-Hägerdal 2000).

So Sánh SSF và SHF

So với SHF, thời gian xử lý 68 giờ trong mẻ SSF là ngắn. Khi so với SHF, quá trình
thủy phân enzyme một mình trong SSF có thể mất từ 48-72 giờ và quá trình lên men
tiếp theo cần thêm 40-60 giờ.
Liều lượng enzyme 10,5-15,8 FPU / g DW được sử dụng cho mẻ SSF tương đối thấp,
trong hầu hết các nghiên cứu khác, liều lượng của enzyme là 20-40 FPU / g DW đã
được sử dụng. Thủy phân enzyme được coi là một bước quá trình tốn kém trong việc
chuyển đổi lignocellulose do chi phí cao của cocktail enzyme kết hợp với liều lượng
bổ sung cao. Trong một nghiên cứu trước đây, trong đó ethanol được sản xuất từ
lignocellulose ở quy mô thương mại, người ta đã tính toán rằng liều lượng của
enzyme 18 FPU / g DW đóng góp vào 19% tổng chi phí sản xuất ethanol.
Trong quá trình thủy phân enzyme, làm tăng nồng độ đường ức chế hoạt động
enzyme, hiệu quả thu được nồng độ đường cao 10. Trong các quá trình đường phân và
lên men đồng thời (SSF), các enzyme và vi sinh vật đồng thời hoạt động trong cùng
một thiết bị phản ứng. Điều này làm giảm sự ức chế sản phẩm đối với hoạt động của
enzyme, vì các loại đường đơn phân giải phóng được tiêu thụ trực tiếp bởi vi sinh vật.

SO sánh SSF và Two-stage SSF