Professional Documents
Culture Documents
Vera Knezevic 2019 PCR DNK Mikrobiologija
Vera Knezevic 2019 PCR DNK Mikrobiologija
Vera Knezevic 2019 PCR DNK Mikrobiologija
(Seminarski Rad)
Student: Mentor:
Knežević Vera Prof. dr Miroslav Petkovićić
SADRŽAJ
1. UVOD.................................................................................................................................3
3. ZAKLJUČAK.....................................................................................................................8
4. LITERATURA....................................................................................................................9
1. UVOD...............................................................................................................................10
3. ZAKLJUČAK...................................................................................................................16
4. LITERATURA.................................................................................................................17
Stranica 2 od 17
Seminarski rad
1. UVOD
Patogeni uzrokovani hranom, koji uzrokuju bolesti, glavna su prijetnja javno zdravlje
širom svijeta, posebno za djecu, starije osobe i imunokompromitirane pojedince. Broj
potencijalno štetnih bakterija je veliki i specifičan za određene izvore hrane.
Stranica 3 od 17
Seminarski rad
Sve otopine treba pripremiti s sterilnom vodom PCR kvaliteta. Reagensi trebaju biti
slobodni od RNaze i DNaze.
2. 10x izotermni pufer. Pufer u koncentraciji od 10x sadrži 200 mM Tris-HCl, 100
mM (NH4) 2S04, 500 mM KCl, 20 mM MgS04, i 1% Tween® 20 pripremljen na 8.8 na 25°C.
Čuvati na -20°C.
Stranica 4 od 17
Seminarski rad
oligosama. Prije prve upotrebe, prajmeri trebaju biti hidrirani do koncentracije od 100 μM.
Ukratko centrifugirajte oligo prije prvog otvaranja epruvete. Da bi se hidratizovala 25 nmol
oligo do 100 μM, u epruvetu treba dodati 250 µl vode PCR-kvaliteta. Jednom hidriran, čuvati
na -20°C. Za detekciju E. coli korišteni su prajmeri za uidA gen (sekvence dostupne u Tabeli
1).
12. Real-time PCR mašina (npr., Loopamp Realtime Turbidimeter, Eiken Chemical
Company).
3. 25 nmol DNK oligosaharida. Prije prve upotrebe, prajmeri trebaju biti hidrirani do
koncentracije od 100 μM. Ukratko centrifugirajte oligo prije prvog otvaranja epruvete. Da bi
se hidratizovala 25 nmol oligo do 100 μM, u epruvetu treba dodati 250 µl vode PCR-
kvaliteta. Nakon hidriranja, čuvajte na -20°C. Za detekciju salmonele, korišteni su prajmeri
za hilA, fliC, sdf i sefA gene (sekvence dostupne u Tabeli 2).
Stranica 5 od 17
Seminarski rad
Stranica 6 od 17
Seminarski rad
1. Uzorak svinjskog mesa treba najprije razrijediti dodavanjem PBS-a u omjeru 1:10
w / v.
4. Inkubirati u PCR stroju u stvarnom vremenu pri 98°C tokom 2 minute, nakon čega
slijedi 38 ciklusa od: 98°C tokom 15 sekundi, 60°C tokom 15 sekundi i 72°C tokom 1
minute.
Stranica 7 od 17
Seminarski rad
3. ZAKLJUČAK
Stranica 8 od 17
Seminarski rad
4. LITERATURA
2. Jones MK, Oliver JD (2009) Vibrio vulnificus: disease and pathogenesis. Infect
Immun 77:1723–1733
3. Skarp CPA, H€anninen ML, Rautelin HIK (2016) Campylobacteriosis: the role of
poultry meat. Clin Microbiol Infect 22:103–109
5. Scallan E, Hoekstra RM, Angulo FJ, Tauxe RV, Widdowson MA, Roy SL, Jones
JL, Griffin PM (2011) Foodborne illness acquired in the United States-major pathogens.
Emerg Infect Dis 17:7–15
7. Hiett KL, Cox NA, Stern NJ (2002) Direct polymerase chain reaction detection of
Campylobacter spp. in poultry hatchery samples. Avian Dis 46:219–223
8. Winters DK, O’Leary AE, Slavik MF (1997) Rapid PCR with nested primers for
direct detection of Campylobacter jejuni in chicken washes. Mol Cell Probes 11:267–271
Stranica 9 od 17
Seminarski rad
1. UVOD
Stranica 10 od 17
Seminarski rad
Tabela 4: Mediji
Hemikalije:
Stranica 11 od 17
Seminarski rad
Stranica 12 od 17
Seminarski rad
Oprema:
Metode:
Obogaćivanje uzorka
Ekstrakcija DNK
1. Centrifugirajte uzorke na 380 g (2000 okr / min) tokom 2 minute kako biste
uklonili ostatke hrane koje filter ne zadržava u vrećici za homogenizaciju.
5. Nakon enzimske lize, dodati 300 μL GuSCN-a i miješati snažno (može se koristiti
vrtlog). Prenesite 400 µL u epruvetu koja sadrži 400 μL 100% izopropanola. Centrifugirajte
na 16,000 g (13,000 obrtaja u minuti) tokom 10 minuta.
Stranica 13 od 17
Seminarski rad
Multiplex qPCR
4. Ova metodologija pokazala se pouzdanom kada su niski nivoi (<10 cfu / 25 g) oba
cilja ubačene u pred-obogaćeni bujon. Čak i kod tako niske početne koncentracije bakterija
očekuje se da vrijednosti Cq za pozitivne uzorke budu ispod 35.
5. Negativni uzorci će imati vrijednost “No Cq” za ciljeve, invA i / ili prfA, dok su
pozitivni za IAC. Očekuje se da pozitivni uzorci imaju Cq vrijednost nižu od 35 za ciljne
gene i mogu biti negativni za IAC. Ako nema pojačanja za ciljne gene kao i za IAC, tada se
uzorak mora ponovno analizirati.
Stranica 14 od 17
Seminarski rad
Stranica 15 od 17
Seminarski rad
3. ZAKLJUČAK
Stranica 16 od 17
Seminarski rad
4. LITERATURA
1. Jadhav S, Bhave M, Palombo EA (2012) Methods used for the detection and
subtyping of Listeria monocytogenes. J Microbiol Methods 88:327
8. Kim HC, Bhunia AK (2008) SEL, a selective enrichment broth for simultaneous
growth of Salmonella enterica, Escherichia coli O157: H7, and Listeria monocytogenes. Appl
Environ Microbiol 74:4853–4866
10. Ruiz-Rueda O, Soler M, Calvo L (2010) Multiplex real-time PCR for the
simultaneous detection of Salmonella spp. and Listeria monocytogenes in food samples. Food
Anal Methods 4:131–138.
Stranica 17 od 17