PCR i RT-PCR

Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR – polymerase chain reaction) jest techniką pozwalającą na powielanie
fragmentów sekwencji DNA (kwas 2’deoksyrybonukleinowy) odwzorowując w warunkach in vitro proces
replikacji zachodzący in vivo. Przyrost ilości produktu w reakcji w teorii jest wykładniczy (bardzo często
używane jest określenie ekspotencjalny). Fragment sekwencji docelowej w większym łańcuchu
dwuniciowego DNA jest oskrzydlony za pomocą pary jednoniciowych oligonukleotydowych starterów,
najczęściej o długości od około 16 do 28 nukleotydów. Startery są zaprojektowane w taki sposób, aby były
komplementarne do zdefiniowanej sekwencji docelowej na obu niciach DNA przy 3’ końcu badanej
sekwencji, oskrzydlając w ten sposób powielany fragment.
PCR składa się z trzech zasadniczych etapów: (1) denaturacji dwuniciowej struktury DNA, (2)
hybrydyzacji starterów do matrycy (annealing) i (3) elongacji, podczas której startery są wydłużane przez
polimerazę DNA zależną od matrycy i tworzona jest kopia nici macierzystej w typowej replikacji
półzachowawczej z zachowaniem zasady komplementarności. Wydłużanie startera przebiega w kierunku od
5’ do 3’ startera.
Wszystkie składniki reakcji dodane są w znacznym nadmiarze, umożliwiając powtarzanie kolejnych
kroków reakcji zwykle 30-55-krotnie. Nici zsyntetyzowane w poprzednim cyklu reakcji stanowią matryce w
następnym cyklu, ulegając jednocześnie zawężeniu do fragmentów zawartych pomiędzy starterami. W
przeciwieństwie do replikacji zachodzącej in vivo, w przypadku PCR startery nie ulegają odbudowaniu,
wchodząc w skład produktu docelowego. Podwojenie ilości produktu (przy wydajności reakcji 100%, często
określanej jako wydajność = 2) prowadzi do powielenia wykładniczego.
Zastosowanie polimerazy Taq pochodzącej z Thermus aquaticus, pozwala na przeprowadzenie
reakcji w odizolowanych warunkach, zwiększając wydajność i zmniejszając możliwość kontaminacji próby.
Po przeprowadzonej łańcuchowej reakcji polimerazy próby najczęściej analizuje się za pomocą
technik elektroforetycznych na żelach agarozowych lub poliakrylamidowych, stosując odpowiednio barwienie
bromkiem etydyny lub związkami srebra. Elektroforeza stosowana jest jako metoda jakościowa, pozwalająca
na potwierdzenie wielkości powstałego produktu w odniesieniu do wzorca wielkości (markera), dając
odpowiedź czy produkt reakcji o właściwej wielkości jest wykrywalny za pomocą metody, czy też nie.
Najczęściej produkty następnie poddawane są reakcji sekwencjonowania w celu potwierdzenia ich sekwencji
nukleotydowej. Rzadziej, Elektroforeza wykorzystywana jest jako metoda półilościowa (często określana jako
„na oko”) pozwalając za pomocą badań densytometrycznych na określenie ilości powstałego kwasu
nukleinowego w porównaniu z wzorcem o znanym stężeniu. PCR i elektroforeza służą więc głównie do
określania obecności DNA o określonej wielkości a standardowa wielkość wykorzystywanych amplikonów z
powodu niskiej „siły rozdzielczej” agarozy waha się najczęściej w granicach 200-600pz.
W reakcji bardzo ważne jest dobranie odpowiednich warunków, zarówno do stosowanej polimerazy,
matrycy jak i starterów. Najważniejszym czynnikiem, wpływającym na powstanie odpowiedniego produktu
jest temperatura annealingu, która jest obliczana początkowo teoretycznie a następnie w warunkach
laboratoryjnych zmieniana w ten sposób, aby uzyskać najsilniejszy i najbardziej specyficzny produkt. Startery
najczęściej są w ten sposób projektowane, aby łączyć się z matrycą w jednym czasie w tej samej
temperaturze. Jednak, jeśli ze względu na różnorodność sekwencji genetycznej nie jest możliwe dobranie
jednakowej temperatury, jednym ze sposobów obejścia tego problemu jest zastosowanie „podwójnego
annealingu” – najpierw w wyższej temperaturze, a następnie w niższej. Za niska temperatura annealingu
powoduje powstawanie niespecyficznych produktów, zbyt wysoka powoduje, iż produkt nie powstaje.
Również stężenie samego startera może negatywnie wpływać na ilość powstałych nici DNA. Przy zbyt
niskim stężeniu primerów, z powodu ich wyczerpania reakcja nie dojdzie do fazyplateau, a gdy będzie ich
zbyt dużo powstaną produkty niespecyficzne.

Na odpowiednie łączenie się starterów i katalityczną aktywność polimerazy mają jony dwuwartościowe,
najczęściej jony Mg2+. Dodanie do reakcji zbyt małej ilości magnezu może doprowadzić do bardzo niskiej
specyficzności produktów, zbyt wysokie stężenie magnezu może spowodować inhibicję działania polimerazy
lub niską wydajność łączenia się starterów z matrycą. Inne kationy dwuwartościowe mogą zmieniać
aktywność polimerazy, powodując m.in. występowanie aktywności star (czyli zwiększenie ilości błędów
popełnianych podczas polimeryzacji). Stężenie samej polimerazy, przechowywanej w stokach glicerynowych
jest również ważne w reakcji. W tym przypadku, na jakość i ilość produktu bardziej niekorzystnie wpływa zbyt
duża ilość polimerazy w próbie.

Czystość, jakość i ilość uzyskiwanego produktu można również poprawiać poprzez dodawanie odpowiednich
związków chemicznych, np. DMSO (pozwala na lepszą denaturację matryc bogatych w G (guanina) i C
(cytozyna) a także obniża temperaturę annealingu), betaina i albumina bydlęca (BSA) – zwiększają
specyficzność produktu.
W niektórych badaniach, np. wielu markerów nowotworowych ważna jest ekspresja danego genu a
nie jego obecność w genomie. W tym wypadku stosując technikę RT-PCR (odwrotna transkrypcja połączona
z łańcuchową reakcją polimerazy) bada się kwas rybonukleinowy (RNA). Z powodu jego mniejszej
stabilności w porównaniu z DNA, a także braku odpowiednich narzędzi molekularnych, specyficzne
powielanie RNA jest bardzo mało wydajne. Do badań RNA wykorzystuje się więc rozbudowaną technikę
PCR, poprzedzoną procesem odwrotnej transkrypcji z zastosowaniem wirusowych odwrotnych transkryptaz.
Powoduje to przepisanie sekwencji RNA na sekwencję komplementarnego do niego DNA (cDNA), który
następnie jest powielany w procesie PCR i dopiero wtedy poddawany analizie na żelach. RT najczęściej
przeprowadzana jest z wykorzystaniem odwrotnej transkryptazy (np. Verte M-MLV wirusa leukemii Moloneya
i specyficznego startera albo uniwersalnego startera oligo(d)T10-18 (dla mRNA).

Również techniki PCR i RT-PCR mają zastosowanie w lokalizacji kwasów nukleionowych w

komórkach poprzez zastosowanie ich in situ. Reakcję przeprowadza się nie w naczyniu reakcyjnym lecz
bezpośrednio na odpowiednio przygotowanej tkance lub rozmazie komórkowym. Stosuje się wtedy również
odpowiednio zmodyfikowane nukleotydy (znakowane najczęściej fluorochromami, takimi jak FITC, Cy3, Cy5
lub kropkani kwantowymi albo też techniką digoksygenina-avidyna-streptavidyna i odpowiednim enzymem).
W związku z tym, iż najczęściej PCR i RT-PCR w swojej klasycznej odmianie są technikami raczej
jakościowymi niż ilościowymi, w ostatnich latach coraz częściej stosowane są techniki PCR i RT-PCR w
czasie rzeczywistym (real-time PCR oraz RT real-time PCR).

Real-time PCR
PCR w czasie rzeczywistym z zastosowaniem Sybr Green I

W celu określenia ilości DNA lub poziomu ekspresji genów może zostać zastosowana technika
ilościowa real-time PCR, gdzie z wykorzystaniem znaczników fluorescencyjnych przeprowadzana jest
ilościowa łańcuchowa reakcja polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR, Real Time PCR).

Specyficzny fragment analizowanego genu jest otrzymany na drodze amplifikacji z zastosowaniem matrycy
cDNA, genowo specyficznych starterów oraz znacznika fluorescencyjnego Sybr Green I. Znacznik
wbudowuje się w strukturę dwuniciowego DNA, co powoduje około tysiąckrotny wzrost poziomu
fluorescencyji. Profil termiczny wyznaczany jest na podstawie zarówno temperatury annealingu starterów, jak
i długości amplikonu. Ponieważ stosuje się bardzo krótkie amplikony (80-200pz), czas przeprowadzania
reakcji ulega znacznemu skróceniu. Wbudowywanie Sybr Green I jest stale monitorowane podczas
zachodzenia reakcji, pozwalając na określenie tzw. Ct (treshold cycle) czyli cyklu, w którym fluorescencja jest
rejestrowana przez detektor jako wyższa niż fluorescencja tła. Im Ct następuje szybciej, tym wyjściowa ilość
DNA (lub cDNA) dla danego genu była większa. Dla każdego z badanych genów wyznacza i uwzględnia się
również wydajność reakcji amplifikacji. W przypadku badania ilościowego jest to ważne, gdyż wydajność
reakcji wpływa na ilość powstającego produktu i tym samym Ct. Wydajność reakcji wyznacza się na
podstawie krzywej wzorcowej przygotowywanej poprzez dziesiętne rozcieńczenia matrycy. Wydajność
powinna być wysoka (minimum powyżej 1,8 lecz nie może przekraczać 2 – czyli wydajności 100%).
Dodatkowo zarówno wydajność reakcji amplifikacji genu badanego jak i genu referencyjnego powinna być
zbliżona.
Ilość powstawianego produktu (najczęściej w badaniach ekspresji genów) odnoszony jest do poziomu
ekspresji genu referencyjnego lub do wykorzystywanego standardu (np. ilości DNA amplifikowanego ze
znanej ilości kopii DNA danego genu). Genem referencyjnym najczęściej jest gen kodujący białka
metabolizmu podstawowego (housekeeping gen), np. HPRT, GAPDH, B2M, ACTB, CYC i inne. Niesłychanie
ważne jest odpowiednie dobranie genu referencyjnego. Powinien się on charakteryzować minimum trzema
cechami: (1) poziom ekspresji w badanym typie tkanki powinien być stały, (2) na poziom ekspresji genu
referencyjnego nie powinna mieć wpływu ekspresja genu badanego i (3) poziomy ekspresji genu
referencyjnego i badanego powinny być zbliżone.

Nasilenie ekspresji badanych genów najczęściej oceniane jest na podstawie porównania CR (concentration
ratio) pomiędzy badanymi próbami. CR jest obliczane po reakcji real-time PCR na podstawie kalkulacji
przyrostu fluorescencji powstającego produktu względem wydajności reakcji a następnie przyrównania
ekspresji badanych genów do genu referencyjnego (również normalizowanego względem krzywej
wzorcowej). Przy wykorzystaniu Sybr Green I dodatkowo zamiast identyfikacji produktu za pomocą
elektroforezy żelowej wykorzystuje się oznaczanie produktu na podstawie krzywej topnienia. Powielony
produkt reakcji poddaje się topieniu od temperatury 65oC do temp. 95oC z ciągłym pomiarem fluorescencji.
Urządzenie dokonuje pomiaru i dokonuje obliczeń temperatury, w której następuje największy spadek
fluorescencji, oznaczający stopienie połowy produktu który występuje w badanej próbie w przewadze,
wskazując powstanie specyficznego/niespecyficznego produktu na podstawie temperatury jego topnienia,
np. tzw. Struktur primer-dimer.

Zastosowanie Sybr Green I wymaga bardzo dokładnego dobrania warunków reakcji, ponieważ urządzenie
mierzy fluorescencję niespecyficznie wbudowywanego Sybr Green I, a tym samym, jeśli powstają produkty
niespecyficzne, ich poziom jest również mierzony podczas przebiegu reakcji, powodując przesunięcie Ct i
wyniki przez to są zawyżone. Niespecyficznie powstałe produkty widoczne są jako dodatkowe piki na
krzywej topnienia.

real-time PCR z zastosowaniem sond hydrolizujących typu TaqMan

Sondy hydrolizujące typu TaqMan bardzo uprościły w ostatnich latach badania za pomocą techniki PCR i RT-
PCR w czasie rzeczywistym. Pozwalają one na oznaczanie przyrostu fluorescencji tylko dla genu badanego,
nie analizując powstawania produktów niespecyficznych. Podczas badań bardzo często wykorzystywane są
ośmionukleotydowe modyfikowane sondy typu LNA (Locked Nucleic Acids) które wraz z odpowiednimi
starterami zapewniają specyficzność reakcji. Dodatkowo im krótsza jest sonda TaqMan tym wykazuje
większą stabilność. Zarówno startery jak i sonda mogą być komplementarne do wielu miejsc genomu, przy
jednoczesnym zachowaniu specyficzności pomiaru fluorescencji dla badanej próby. Dzieje się tak dlatego, iż
pomiar dokonywany jest tylko dla miejsc (amplikonów) w których jednocześnie łączą się oba startery i sonda.
Sondy TaqMan mają na 5’końcu znacznik fluorescencyjny np. FAM oraz wygaszacz (quencher) na 3’końcu
(najczęściej BBQ - BlackBerry Quencher). Zadaniem quenchera jest wygaszanie fluorescencji generowanej
przez fluor ochrom. Sondy zaprojektowane są w taki sposób, aby łączyły się w temperaturze około 10oC
wyższej niż temperatura annealingu starterów, czyli łączą się jako pierwsze do matrycy. Następnie po
połączeniu starterów z matrycą przeprowadzana jest elongacja, podczas której sonda jest hydrolizowana i
fluorochrom oraz quencher przechodzą do mieszaniny reakcyjnej. Powoduje to ich oddzielenie od siebie a
tym samym brak wygaszania. Detektor może więc wykryć przyrost fluorescencji. Zastosowanie tego typu
sond pozwala również na przeprowadzenie reakcji dla genu referencyjnego i badanego w jednej reakcji,
gdyż mogą one być wyznakowane różnymi znacznikami i posiadać różne quenchery, przez co w
odmiennych kanałach detekcji wykrywana jest fluorescencja. Jednak reakcja taka wymaga kompensacji
koloru. Również w tym przypadku stosuje się obliczanie wydajności reakcji na podstawie krzywej wzorcowej
oraz przyrównuje się ekspresję genu badanego do próby referencyjnej.

Zastosowanie SimpleProbe w reakcji RealTime PCR

Technika sond hybrydyzujących SimpleProbe, pozwala na analizę różnicy fluorescencji pomiędzy dysocjacją
(melting) specyficznych genowo wyznakowanych sond SimpleProbe. SimpleProbe są wygaszone w
mieszaninie reakcyjnej a sygnał fluorescencyjny pochodzący z sondy zależy od stanu hybrydyzacji z matrycą
(sygnał fluorescencyjny pochodzi tylko z hybrydowego połączenia sekwencja docelowa+sonda). Analiza
pomiaru stanu wzbudzenia fluorochromu połączonego z SimpleProbe odbywa się podczas krzywej
topnienia. Stosuje się je zwykle do oznaczeń miejsc polimorficznych. Pokazuje zarówno genotyp osobnika
dzikiego, mutanta jak i heterozygoty wykorzystując różnicę w temperaturze topnienia sond idealnie
sparowanych z matrycą (perfect match) a występowaniem niesparowania (mismatch). Przeprowadzenie
reakcji jest połączeniem techniki amplifikacji produktu z zastosowaniem sond TaqMan i oznaczeniem krzywej
topnienia z wykorzystaniem Sybr Green I. W przypadku tej techniki również wyznaczyć można krzywą
wzorcową i oznaczenie wydajności, jednak nie jest to konieczne np. przy poszukiwaniu SNP dla których
technika ta została początkowo stworzona.

Specyficzny fragment analizowanego genu otrzymany jest na drodze amplifikacji z zastosowaniem matrycy
DNA, genowo specyficznych starterów oraz sond hybrydyzacyjnych typu SimpleProbe zaprojektowanych dla
badanego genu. Profil termiczny wyznaczany jest na podstawie długości amplikonu, oraz wyznaczonej
temperatury hybrydyzacji sondy i starterów.