TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 99-104

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS

SINH TỔNG HỢP NATTOKINASE

Lê Thị Bích Phượng*, Võ Thị Hạnh, Trần Thạnh Phong,

Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Lê Thị Hương
Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)phuongbl58@yahoo.com

TÓM TẮT: Nattokinase là enzyme làm tan huyết khối, được phát hiện trong Natto vào năm 1980. Trong
bài báo này, hai chủng Bacillus sp.7.2 và Bacillus sp.NP3 chọn lọc được, có khả năng sinh tổng hợp mạnh
enzyme làm tan huyết khối (nattokinase). Trên môi trường hạt đậu nành, chiều dày môi trường 2,5 cm,
nhiệt độ phòng, sau 40 giờ lên men, hai chủng Bacillus sp.7.2 và Bacillus sp.NP3 sinh ra nattokinase (470
FU/g), chiếm khoảng 70-85% so với hoạt tính protease tổng. Kết quả này cho thấy rằng, chúng ta có thể
chủ động sản xuất sản phẩm nattokinase hoạt tính cao, giá thành thấp để vệ sức khỏe người dân, mà không
phụ thuộc vào thực phẩm chức năng chứa enzyme nattokinase ngoại nhập.
Từ khóa: Bacillus, enzyme làm tan huyết khối, nattokinase.

MỞ ĐẦU hóa bởi ion Zn2+ nhưng bị ức chế bởi ionFe3+ và

Hiện nay, tỷ lệ mắc bệnh nghẽn động mạch
do các cục máu đông (thrombus) như chứng nhồi
máu cơ tim hay nhồi máu não đang tăng cao ở
Việt Nam cũng như trên thế giới. Vì vậy, enzyme
nattokinase được quan tâm nghiên cứu sản xuất
và sử dụng rộng rãi để phòng ngừa bệnh nghẽn
động mạch do các cục máu đông [9].
Nattokinase (EC 3.4.21) là serine protease
gồm 275 axít amin, hoạt động ở pH tối ưu từ 8-
10, nhiệt độ tối ưu từ 30-70oC, có trọng lượng
phân tử từ 27,7-44 kDa, điểm đẳng điện (pI)
8 và cấu trúc tương đồng với subtilisin. Cơ chế
hoạt động của nattokinase là trực tiếp phân cắt
fibrin trong huyết khối và gián tiếp bằng cách
hoạt hoá sự sản xuất urokinase và plasmin
trong mô [7].
Nhiều chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân
lập từ các loại thực phẩm lên men truyền thống là
nguồn giống quan trọng có khả năng sản xuất các
enzym làm tan huyết khối, như B. natto phân lập
từ thực phẩm Natto, Nhật [3], Bacillus
amyloliquefaciens DC-4 từ Douchi, Trung Quốc
[8], Bacillus sp. CK 11-4 TỪ Chungkook-Jang và
Bacillus sp. DJ-4 từ Doe-Jang, Hàn Quốc [4, 5].
Nattokinase được tinh sạch từ dịch nuôi cấy
B. subtilis natto B-12 (phân lập được từ natto)
có độ tinh sạch gấp 51,6 lần và hiệu suất thu hồi
43,2% so với hoạt tính ban đầu, trọng lượng
phân tử 29 kDa, hoạt động ở pH và nhiệt độ tối
ưu tương ứng là 8 và 40oC, enzyme được hoạt
Al3+ [14].
Chủng B. subtilis được nuôi cấy chìm chứa
glucose 10 g/l, peptone 50 g/l và các chất
khoáng; ở điều kiện trong bình tam giác sau 12
giờ nuôi cấy, hoạt tính nattokinase là 630
UI/ml; ở điều kiện trong nồi lên men, sau 10 giờ
nuôi cấy, hoạt tính nattokinase cao nhất là 3,400
UI/ml. Tuy nhiên, ở điều kiện nuôi cấy theo mẻ
có bổ sung cơ chất dinh dưỡng trong nồi lên
men, sau 19 giờ nuôi cấy, hoạt tính nattokinase
là 7,100 UI/ ml, cao gấp 2,1 lần so với không bổ
sung cơ chất [2].
B. subtilis sinh tổng hợp nattokinase cao
(459,11 FU/ml) trong môi trường lỏng chứa cao
cám mì (1,5-3o Brix), cao đậu nành (1,0-2oBrix),
glucose (0,6-2%), trong thời gian 24-36 giờ ở
27oC [11].
Trong môi trường lỏng chứa peptone từ đậu
nành 8,28 g/l, CaCl2 0,64 g/l và cao nấm men
0,74 g/l, B. natto NLSSE sinh tổng hợp
nattokinase đạt 1300 UI/ml [6].
B. subtilis LD-8 sinh tổng hợp nattokinase
cao trong môi trường lỏng chứa bột gạo 5%, bột
đậu nành 4%, NH4NO3 0,5% và CaCl2 0,01%
(w/w), pH 7 và tỷ lệ giống 5%, sau 72 giờ nuôi
cấy, hoạt nattokinase đạt được là 4220 U/ml [13].
B. subtilis được nuôi cấy trên cơ chất bã bậu
nành (độ ẩm 80%), ở 37oC trong 20 giờ, hiệu
suất nattokinase cao nhất là 0,108 g/150 g cơ
chất (dạng ướt) [15].

99

Bacillus natto được nuôi cấy trong môi
trường lỏng tối ưu: glucose 0,065%; KH2PO4
0,0016% và MgSO4 0,0016%, sau 72 giờ nuôi
cấy trên máy lắc ở 37o C, hoạt tính nattokinase
đạt được 12,34 FU/ml [12].
B. subtilis được nuôi trên môi trường lên
men bán rắn chứa cơ chất bã đậu và cám mì,
dưới các điều kiện nuôi cấy tối ưu như độ ẩm
ban đầu 65%, pH 8, và nhiệt độ 35o C, hoạt tính
nattokinase đạt được là 1577 UI/g [1].
Hiện nay, trên thị trường đang lưu hành một
số thực phẩm chức năng chứa nattokinase dưới
dạng viên nhộng nhập khẩu từ Nhật Bản, Hoa
Kỳ như Nattospes (3000 FU/g), Japato (600
FU/g), Nattokinase plusTM (3000 FU/g), Dosaka
(300 FU/g)... với đơn giá rất cao (trên 10 triệu
đồng/kg). Dạng thực phẩm truyền thống của
Nhật Bản cũng được nhập khẩu nhưng không
được dùng phổ biến vì nặng mùi, nhớt, rất khó
ăn, không phù hợp với khẩu vị người Việt Nam,
hoạt tính nattokinase cũng thấp.
Vì vậy, mục đích của nghiên cứu này nhằm
chủ động nguồn giống bằng cách tuyển chọn
một số chủng Bacillus spp. từ bộ sưu tập giống
của Viện Sinh học nhiệt đới và phân lập từ thực
phẩm Natto có khả năng sinh tổng hợp mạnh
nattokinase trên cơ chất đậu nành, so sánh hoạt
tính nattokinase thu nhận được từ các chủng
Bacillus spp. chọn được với các thực phẩm chức
năng chứa nattokinase nhập khẩu trên thị
trường, thăm dò khả năng cạnh tranh, nghiên
cứu công nghệ và sản xuất thử nghiệm sản
phẩm nattokinase làm thực phẩm chức năng tiện
sử dụng, giá thành thấp
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Các chủng Bacillus spp. lấy từ bộ sưu tập
của phòng Vi sinh và phân lập được từ Natto
thương phẩm lưu hành tại tp Hồ Chí Minh và
Nhật Bản.
Nguyên liệu
Đậu nành hạt, thực phẩm natto của Nhật
Bản (G), thực phẩm chức năng Nattokinase
(E)và Nattokinase (H).
Hóa chất phân tích
Fibrinogen (SIGMA, F8630), Thrombin
100
Le Thi Bich Phuong et al.
(SIGMA, T6634).
Phương pháp
Phân lập vi khuẩn: Các chủng Bacillus
được phân lập từ Natto thương phẩm bằng
phương pháp trải trên môi trường thạch cao thịt
pepton (MPA) chứa 0,5% cao thịt, 1% peptone,
ủ ở nhiệt độ thường trong thời gian 1-2 ngày.
Các khuẩn lạc được làm thuần và bảo quản
trong ống thạch nghiêng ở 4oC.
Chọn lọc chủng vi khuẩn: Các chủng vi
khuẩn được cấy điểm trên môi trường MPA,
nuôi cấy 24 giờ ở nhiệt độ phòng, dùng khoan
nút chai khoan các thỏi thạch có vi khuẩn
sinh trưởng tốt, đặt lên bề mặt môi trường
thạch casein 1% và đĩa máu đông, ủ ở 37oC, đo
đường kính vòng phân giải casein sau 20 giờ ủ
và vòng phân giải máu đông sau 4 giờ ủ.
Lên men rắn thu nattokinase: Các chủng
Bacillus spp. được nuôi trên đậu nành hạt đã
hấp chín với tỉ lệ giống 2%, chiều dày môi
trường 2,5 cm, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng, thời
gian lên men 27-48 giờ để thu enzyme protease
và nattokinase. Sản phẩm enzyme thô thu được
sau sấy khô ở 40oC và xay nhuyễn.
Phân tích định tính và định lượng protease
và nattokinase: Protease tổng bao gồm
nattokinase và các protease khác, nếu hoạt tính
protease tổng cao thì hoạt tính nattokinase cũng
có khả năng cao. Do hóa chất phân tích
nattokinase rất đắt tiền, nên trong một số thí
nghiệm có thể gián tiếp định tính và định lượng
protease. (1). Định tính protease theo phương
pháp đục lỗ thạch trên môi trường casein 1%,
agar 2%. Cho 0,1 ml các dịch chiết enzyme vào
các lỗ, ủ ở 37oC trong thời gian 20 giờ, đo
đường kính vòng phân giải casein; (2). Định
lượng hoạt tính protease theo phương pháp
Anson cải tiến; (3). Định tính nattokianse dựa
vào khả năng hòa tan huyết khối lợn. Phương
pháp tự chế này có thể cho thấy kết quả trực
tiếp về khả năng làm tan cục huyết khối: Cho 2
ml dịch chiết enzyme (ở các độ pha loãng 10
lần) vào 2 g huyết lợn đông, ủ 37oC trong 4 giờ.
Cân trọng lượng cục huyết đông còn lại sau khi
ủ. So sánh khả năng hòa tan cục huyết khối của
các mẫu lên men; (4). Định tính nattokinase
theo phương pháp đục lỗ thạch chứa hỗn hợp 5
ml dung dịch 0,96% (w/v) fibrinogen, 5 ml

dung dịch 2,35% (w/v) agarose và 0,1 ml dung
dịch thrombin (20 UI/mL). Mỗi lỗ được cho vào
20 µl dịch chiết enzyme ở độ pha loãng 100 lần,
ủ ở 37o C trong 21 giờ. Hoạt tính làm tan fibrin
của các dịch enzyme được so sánh bằng cách đo
kích thước vòng phân giải xung quanh các lỗ
(Choi và Kim (2001). Định lượng hoạt tính
nattokinase bằng phương pháp của Japan Bio
Science Laboratory Co., Ltd. (JBSL). Một đơn
vị (1 FU) được định nghĩa là lượng enzyme
phân giải sợi fibrin (hình thành sau phản ứng
giữa fibrinogen và thrombin) mà làm tăng sự
hấp thụ của dịch thuỷ phân tại bước sóng 275
nm bằng 0,01 trong thời gian một phút dưới các
Hình 1. Khả năng phân giải casein và làm tan huyết khối của các chủng Bacillus
Hình 2. Khả năng sinh nattokinase của các chủng Bacillus theo thời gian
Hình 1 cho thấy, đường kính vòng phân giải
casein và làm tan huyết khối của các chủng
Bacillus 7.2 (3,4 cm và 2,3 cm) và NP3 (3,5 cm
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 99-104
điều kiện phản ứng.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus
spp. có khả năng làm tan huyết khối
Các chủng Bacillus spp. từ bộ sưu tập giống
của phòng Vi sinh (được mã hoá là 12D1,
12D2, và 7.2) và phân lập từ thực phẩm Natto
của Nhật Bản (được mã hóa là 1, 2, 3, 4, 6, 7,
NP1, NP2 và NP3) được chọn lọc bằng phương
pháp phân tích định tính dựa vào đường kính
vòng phân giải casein và khả năng làm tan
huyết khối, kết quả ghi nhận được chỉ ra trong
hình 1.
và 2,5 cm) là lớn nhất, của các chủng 12D2,
NP1, NP2 lớn hơn các chủng còn lại, nên năm
chủng này được chọn cho các khảo sát tiếp theo.
101
 Le Thi Bich Phuong et al.

Khả năng sinh ra nattokinase của các chủng
Bacillus spp. trên môi trường đậu nành
Các chủng Bacillus 7.2, 12D2, NP1, NP2,
và NP3 được nuôi cấy trên cơ chất đậu nành
trong hộp Petri ở nhiệt độ phòng trong thời gian
27, 40 và 48 giờ nuôi ủ. Hoạt tính nattokinase
của các mẫu enzyme thô được trình bày trong
hình 2.
Hình 2 cho thấy, trong số 5 chủng Bacillus
khảo sát, hai chủng 7.2 và NP3 sinh tổng hợp
nattokinase hoạt tính cao nhất (464.4 FU/g và
472.2 FU/g) sau 40 giờ nuôi cấy. Nên hai chủng
7.2 và NP3 được chọn cho các khảo sát tiếp theo.
Kết quả phân tích định lượng này cũng trùng với
kết quả phân tích định tính.
Các mẫu nattokinase thô 7.2 (A) và NP3 (B)
thu nhận từ môi trường nuôi cấy chủng Bacillus
7.2 và NP3 được so sánh với Nattokinase (E) và
Nattokinase (H) và thực phẩm Natto của Nhật
(G) về khả năng làm tan huyết khối, phân giải
fibrin, hoạt tính protease và nattokinase. Kết
quả được ghi nhận trong bảng 1.

Bảng 1. Kết quả phân tích định tính, định lượng nattokinase và protease
% Hòa tan Vòng phân giải Protease Nattokinase Nattokinase/
Mẫu enzyme
huyết khối fibrin (cm) (UI/g) (FU/g) protease (%)
7,2 (A) 99 2,3 681 466,4 68,5
NP3 (B) 99 2,6 564 472,5 83,7
Nattokinase (E) 71 1,3 KXĐ 88,8 KXĐ
Nattokinase (H) 100 2,6 1098 480,2 47,4
Natto-Nhật (G) 30 0,8 44,46 40,5 91
(KXĐ): Không xác định.

Hình 3. Đường kính vòng phân giải fibrin của các mẫu nattokinase

Kết quả từ bảng 1 và hình 3 cho thấy, ở độ
pha loãng 10 lần, khả năng làm tan huyết khối
của nattokinase 7.2 và NP3 tương đương nhau
(khoảng 99%), và cao hơn 1,4 lần mẫu
Nattokinase E (71%). Ở độ pha loãng 100 lần,
kích thước vòng phân giải fibrin và hoạt tính
nattokinase của mẫu NP3 (2,6 cm và 472,5
FU/g) là tương đương so với mẫu Nattokinase
H (2,6 cm và 480,2 FU/g), và cao hơn mẫu 7.2
(2,3 cm và 466,4 FU/g), nattokinase E (1,3 cm
và 88,8 FU/g) và Natto - Nhật G (0,8 cm và
40,5 FU/g). Tỷ lệ nattokinase/protease của mẫu
NP3 (83,7%) cao hơn các mẫu còn lại, ngoại trừ
Natto-Nhật G (chiếm 91%). Hai mẫu
nattokinase 7.2 và NP3 dù ở dạng thô, nhưng
hoạt tính nattokinase cao tương đương so với
các loại thực phẩm chức năng khảo sát.
Các mẫu thực phẩm chức năng khảo sát có
hoạt tính nattokinase thấp hơn so với số liệu in
trên bao bì, nguyên nhân có thể do điều kiện
vận chuyển, lưu kho và thời gian bảo quản lâu
nên ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm.
Kết quả cũng chứng tỏ hai phương pháp
định tính và định lượng hoạt tính nattokinase là
trùng khớp. Các mẫu có hoạt tính protease cao
thì hoạt tính nattokinase cũng cao, vì vậy
phương pháp phân tích protease có thể được sử

102

dụng để chọn lọc sơ bộ các chủng vi khuẩn sinh
tổng hợp nattokinase.
Sản xuất thử chế phẩm nattokinase qui mô 5
kg/mẻ
Dựa trên các nghiên cứu trước đây về các
điều kiện nuôi cấy Bacillus spp. sinh enzyme
protease trên môi trường rắn, chủng NP3 được
nuôi cấy trực tiếp trên đậu nành hấp chín trên
khay (dài 40 cm × rộng 30 cm × cao 5 cm ) ở
Bảng 2. Hoạt tính nattokinase và protease của các đợt sản xuất
Đợt sản xuất Protease (UI/g) Nattokinase (FU/g)
1 557
2 560
3 565
Tuy nhiên, để triển khai sản xuất
nattokinase làm thực phẩm, cần tối ưu hóa môi
trường và các điều kiện nuôi cấy, xây dựng qui
trình công nghệ hoàn chỉnh, tăng tính ổn định
và thời gian bảo quản của sản phẩm, cũng như
cải tiến đặc tính của sản phẩm cho dễ sử dụng
và giảm giá thành.
KẾT LUẬN
Hai chủng Bacillus sp.7.2 và Bacillus
sp.NP3 chọn lọc được có khả năng sinh ra
nattokinase khoảng 470 FU/g trên môi trường
đậu nành hạt hấp chín ở điều kiện nuôi cấy trên
đĩa petri và trên khay, và hoạt tính này chiếm
khoảng 85% so với protease toàn phần.
Hoạt tính nattokinase và protease của mẫu
NP3 và 7.2 tương đương với một số thực phẩm
chức năng hiện đang bán trên thị trường. Kết quả
nghiên cứu này cho thấy khả năng có thể chủ
động sản xuất sản phẩm nattokinase trong nước,
có chất lượng tốt, giá thành rẻ, góp phần giảm
thiểu các bệnh tai biến mạch máu não, đột quị do
huyết khối và bảo vệ sức khỏe công đồng.
Lời cảm ơn: Công trình có sự hỗ trợ về kinh phí
của Đề tài cơ sở năm 2011 (Viện Sinh học nhiệt
đới).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bao Y., Chen J., Qian Z., Ni M., Wang P.,
2004. Optimization of the technique of solid
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 99-104
nhiệt độ phòng, trong thời gian 40 giờ. Hoạt
tính nattokinase và protease của các mẫu
nattokinase thô được chỉ ra trong bảng 2.
Kết quả thu được (bảng 2) chứng tỏ hoạt
tính nattokinase và protease trung bình của các
mẻ sản xuất ở điều kiện lên men rắn trên khay
tương đối ổn định, tương ứng là 475 FU/g và
protease 560 UI/g. Nattokinase chiếm phần lớn
trong protease tổng (trên 80%).
Nattokinase/protease (%)
476,8 85,6
470,4 84,0
475,6 84,1
fermentation of nattokinase, Journal of
Shenyang Pharmaceutical University,
21(6): 468-471.
2. Cho Y. H., Song, J. Y., Kim K. M., Kim M.
K., Lee I. Y., Kim S. B., Kim H. S., Han N.
S., Lee B. H., Kim B. S., 2010. Production
of nattokinase by batch and fed-batch
culture of Bacillus subtilis. New
Biotechnology, 27(4): 341-346.
3. Fujita M., Nomura K., Hong K., Ito Y.,
Asada A., Nishimuro S., 1993. Purification
and characterization of a strong fibrinolytic
enzyme (nattokinase) in the vegetable
cheese natto, a popular soybean fermented
food in Japan. Biochem. Biophys. Res.
Commun., 197(3): 1340-1347.
4. Kim W., Choi K., Kim Y., Park H., Choi J.,
Lee Y., Oh H., Kwon I., Lee S., 1996.
Purification and characterization of a
fibrinolytic enzyme produced from Bacillus
sp. strain CK 11-4 screened from
Chungkook-Jang. Appl. Environ.
Microbiol., 62(7): 1488-2482.
5. Kim S., Choi N., 2000. Purification and
characterization of subtilisin DJ-4 secreted
by Bacillus sp strain DJ-4 screened from
Doen-Jang. Biosci. Biotechnol. Biochem.,
64: 1722-1725.
6. Liu J. G., Xing J. M., Chang T. S., Ma Z.
Y., Liu H. Z., 2005. Optimization of
103
 Le Thi Bich Phuong et al.

nutritional conditions for nattokinase
production by Bacillus natto NLSSE using
statistical experimental methods. Process
Biochem., 40: 2757-2762.
7. Meruvu H., Vangalapati M., 2011.
Nattokinase: A Review on Fibrinolytic
Enzyme, International Journal of Chemical,
Environmental and Pharmaceutical
Research, 2(1): 61-66.
8. Peng Y., Huang Q., Zhang R. H., Zhang Y.
Z., 2003. Purification and characterization
of a fibrinolytic enzyme produced by
Bacillus amyloliquefaciens DC-4 screened
from douchi, a traditional Chinese soybean
food. Comp Biochem Physiol. Biochem.
MolBiol., 134: 45-52 .
9. Peng Y., Yang X., Zhang Y., 2005.
Microbial fibrinolytic enzymes: an overview
of source, production, properties, and
thrombolytic activity in vivo. Appl
Microbiol Biotechnol., 69: 126-132.
10. Sumi H., Hamada H., Tsushima H., Mihara
H., Muraki H., 1987. A novel fibrinolytic
enzyme (nattokinase) in the vegetable
cheese Natto; a typical and popular soybean
food in the Japanese diet. Experientia,
43(10): 1110-1111
11. Wang D. S., Torng C. C., Lin I. P., Cheng
B. W., Liu H. R., 2006. Optimization of
nattokinase production conduction using
response surface methodology. Journal of
Food Process Engineering, 29: 22-35.
12. Wang J. K., Chiu H. H., Hsieh C. S., 2009.
Optimization of the Medium Components
by Statistical Experimental Methods to
Enhance Nattokinase Activity, Fooyin. J.
Health Sci., 1(1): 21-27.
13. Wang S. H., Zhang C., Yang Y. L., Diao
M., Bai M. F., 2008. Screening of a high
fibrinolytic enzyme producing strain and
characterization of the fibrinolytic enzyme
produced from Bacillus subtilis LD-8547,
World J. Microbiol. Biotechnol. 24: 475-
482.
14. Wang C., Du M., Zheng D., Kong F., Zu G.,
Feng Y., 2009. Purification and
Characterization of nattokinase from
Bacillus subtilis Natto B-12. J. Agric. Food
Chem., 57: 9722-9729.
15. Zu X., Zhang Z., Yang Y., Che H., Zhang
G., Li j., 2010. Thrombolytic Activities of
Nattokinase Extracted from Bacillus Subtilis
Fermented Soybean Curd Residues.
International Journal of Biology, 2(2).

ISOLATION AND SELECTION OF SOME BACILLUS STRAINS CAPABLE

OF NATTOKINASE PRODUCTION

Le Thi Bich Phuong, Vo Thi Hanh, Tran Thanh Phong,

Le Tan Hung, Truong Thi Hong Van, Le Thi Huong
Institute of Tropical Biology, VAST

SUMMARY

Nattokinase enzyme, found in Natto in 1980 by Dr. Sumi (Japan), can dissolve blood clots. In this paper,
two strains of Bacillus sp.7.2 and Bacillus sp.NP3 were selected for nattokinase production. On the steamed
soybean substrate, at room temperature, after 40 hours of fermentation, the nattokinase activity was about 470
FU/g, which accounted for about 70-85% as compared to the total protease activity. These results show that
we can produce the nattokinase enzyme at low cost for healthcare of the Vietnamese people, and are not
dependent on imported functional foods containing nattokinase enzyme.
Keywords: Bacillus sp., fibrinotic enzyme, nattokinase.

Ngày nhận bài: 21-6-2012

104