14주차

Chromatography

김나희 조교
Purpose

• 정상, 역상 크로마토그래피를 이해하고, 이동상과 고정상의 개념

을 배운다.

• TLC과 Columm 크로마토그래피로 색소를 분리함으로써, 크로마

토그래피의 원리와 극성의 개념을 배운다.
Theory

재결정

증류

혼합물의 분리방법 추출

크로마토그래피

여과

침전
Theory

 크로마토그래피(Chromatography) 재결정
적절한 정지상과 이동상을 사용하여 혼합물 내 시료들의 이동속도 차이를 이용하여 분리하는 방법

증류
• 크로마토그래피의 구성
혼합물의 분리방법 추출
-고정상(Stationary phase)
분리, 정제될 물질이 올려질 지지제 크로마토그래피
-이동상(Mobile phase)
여과
고정상에 올려질 물질을 이동시키기 위한 수단

침전
Theory
• 정상 크로마토그래피
- 실리카겔이나 알루미나 같이 극성이 큰 정지상과 극성이 작은 용액을 이동상으로 사용하여 극성이 작은
물질이 더 빨리 용출된다.

• 역상 크로마토그래피
- 정상 크로마토그래피와는 반대로 정지상은 비극성이고, 극성이 큰 이동상을 사용하여 극성이 큰 물질이
더 빨리 용출된다.
Theory

• 크로마토그래피의 종류
- 흡착 크로마토그래피 (Adsorption Chromatography)
: 화합물이 고체 표면에 흡착되는 정도

- 겔 투과 크로마토그래피 (Gel permeation Chromatography)

: 작은 용질이 겔 틈새를 통과하는 정도(입자크기차이)

- 이온교환 크로마토그래피 (Ion exchange Chromatography)

: pH를 조절해가며, 화합물이 해리해서 생기는 이온들의 전하차이

- 분배 크로마토그래피 (Partition Chromatography)

: 용매에 녹는 정도(극성, 분배계수)가 다른 점 이용
Theory

• 극성(polarity)
분자 내에서 원자 간 전기 음성도 차이에 의한 전자 구름의 비대칭성을 갖는 성질.

• 분배계수(partition coefficient)
극성이 다른 용매 A, B에 어떤 물질이 (일정한 온도 및 압력에서) 평형에 도달하였을 때
각 용매 내 물질의 농도의 비

K(분배계수)＝CA/CB
Theory

 정상 크로마토그래피
1) TLC ( Thin Layer Chromatography )
실리카겔 지지체를 알루미늄판에 얇고 균일하게 펼친 고정상을
사용한 크로마토그래피.

 특징
- 원리 : 실리카겔의 실란올기와 이동상 사이에 분배되는 계수에
따라서, 전개제가 퍼져 올라가면서 혼합물 분리
- 적은 양의 시료 검출 가능
- 유기화합물의 분리에 많이 사용됨

 물질이 고정상에 흡착되는 시간이 길수록 이동한 거리 짧아 진다.

Theory
 Rf값 (Rate of flow, Retention factor)
크로마토그래피에서 각 화합물의 이동비, 고유한 값을 나타내므로, 물질 확인에 용이함.
TLC 이동상은 Butanol, Acetic acid, Ammonia 등 물보다 극성이 작은 화합물의 혼합액 사용.

Rf = 성분물질이 이동한 거리 / 용매가 이동한 거리(cm)

Theory
2) Column Chromatography
- 유리관과 같은 원기둥 모양의 관에 실리카겔이나 이온교환
수지 등을 충전해, 소량의 혼합물을 압력을 가하며 분리한다.

 특징
- 충진제 종류에 크로마토그래피 종류가 구분.
- 정지상은 코팅되어 있는 고체 입자나 액체.
- 관의 윗 부분에 혼합물을 넣고 관 아래로 용출 시키며,
물질이 단위 시간 당 이동 거리를 측정해 분리.

 물질이 고정상에 흡착되는 시간이 길수록 용리 시간이 늦어 진다.

Chemical & Apparatus

Chemicals Apparatus
M.W. m.p. b.p. Density - TLC Plate
Name Formula (g/mol) (℃) (℃) (g/mL)
- 10mL 주사기
Methanol CH3OH 32.04 -97.6 64.7 0.792 - 10mL 메스실린더
Acetic acid CH3COOH 60.05 16.2 117.5 1.049 - 모세관
- 500mL 비커
1-Butanol CH3(CH2)3OH 74.12 -89.8 117.7 0.81
- 100mL 삼각 플라스크
Silica gel SiO2 60.08 1710 2230 2.65 - Pasteur pipette
적색색소 - - - - - - 저울
- 솜
청색색소 - - - - - - Spatula
황색색소 - - - - - - 시계접시
Chemical & Apparatus

Chemicals Structure
황색 제4호 청색 제1호 적색 제40호

Name: Tatrazine CI food yellow 4 Name: Brilliant blue FCF Name: Allura red
(CAS:1934-21-0) (CAS:3844-45-9) (CAS:25956-17-6)
• Chemical formula : C16H9O9N4S2Na3 • Chemical formula : C37H31O9N2S3Na2 • Chemical formula : C18H14O8N2S2Na2
• MW : 534.38g/mol • MW : 792.88g/mol • MW : 496.43g/mol

출처: 식품의약품안전청
Cautions

• TLC판을 비커에서 전개제에 전개 시, 용매가 날아가지 않도록 시계접시로 막아준다.

• 휘발이 강하고 유독한 유기용매를 사용하므로, 시료와 Butanol, 전개제는 후드 안에서

사용하도록 한다.
Procedure
실험 A. TLC판에 의한 색소의 분리
1) TLC 판 아래(일자로 반듯한 부분)에서 1.0 cm 간격을
연필로 밑줄 긋고, 약 1 cm 간격으로 5개의 점을 찍는다.

2) 적색색소①, 청색색소②, 황색색소③, 미지시료A, 미지시료B 를 모세관에 묻혀서 점 찍은 곳에 찍는다.

(모든 시료는 MeOH에 녹아 있다.)
3) 전개제( Butanol : Acetic acid : D.W = 60 : 15 : 25 )를 500mL 비커에 약 0.5cm 정도
(TLC의 점이 잠기지 않을 정도)로 붓고, TLC 판의 색소가 퍼지지 않도록 조심스럽게 넣은 후,
시계접시로 덮어준다.
4) 약 1시간 후 TLC 판을 꺼내고 전개제가 이동한 거리를 연필로 표시 후 말리고, 각 색소가 이동한
거리를 표시 후, Rf 값 측정 값을 계산하고 사진 촬영을 한다. (소수점 아래 두자리까지)
Procedure
실험 B. 컬럼 크로마토그래피를 이용한 색소 분리
1) 10mL 주사기에 솜을 얇게 깔아주고, Silica gel을 주사기 눈금 7mL 까지 넣어준다.
2) 주사기 12mL 눈금까지 Butanol을 넣고 Silica gel 이 완전히 적셔질 때까지 기다린 후, 100mL 삼각
플라스크를 주사기 아래에 받치고, 피스톤을 조금만 밀어 넣어 압력을 가하며 Butanol을 흘려 보낸다.
3) Butanol이 충진제 가장 윗부분을 여유 있게 적셔줄 정도까지 확인하며 흘려 보낸다.
*주의 : 피스톤 검정부분만 조금만 넣었다 뺐다를 반복하여, Silica gel 사이에 기포가 생기지 않도록 한다.
Butanol을 충진제 눈금에 정확히 맞추어 흘려 보내면 Silica gel이 마르므로 주의 한다.
4) 미지시료 A를 충진제 윗부분을 모두 덮을 정도로 넣어 준다.
5) 피스톤으로 살짝 눌러 미지시료를 충진제에 적셔준 후, Butanol을 주사기 눈금 10mL 정도까지 채우고
피스톤을 5분 간격으로 아주 조금씩 눌러준다.
6) 용리액(Butanol)을 서서히 흘려주면서 색소가 분리되는 것을 관찰하고, 사진촬영을 한다.
7) 미지시료 B 를 1)~6) 과정을 거쳐 분리하고, 사진촬영을 한다.
Results

실험 A. TLC판에 의한 색소의 분리
• Rf 값
적색 : 4.00/5.75 = 0.474
황색 : 1.76/5.75 = 0.386
청색 : 2.80/5.75 = 0.447

• 미지시료 이동 속도 차이 5.75 cm
미지 시료 A: 청색 > 황색
미지 시료 B: 적색 > 청색

• 색소 극성 크기 비교
황색 > 청색 > 적색
Results

실험 B. 컬럼 크로마토그래피를 이용한 색소 분리
미지시료A 미지시료B
• 용출 순서
미지 시료 A: 청색 → 황색
미지 시료 B: 적색 → 황색

• 극성 크기 비교
미지 시료 A: 황색 > 청색
미지 시료 B: 청색 > 적색
전체 색소 : 황색 > 청색> 적색
Grade

Pre-Report Main Report

- 분리 - TLC, 칼럼 크로마토그래피의 원리,
- 정상, 역상 크로마토그래피 각 이동상, 고정상
- 이동상, 고정상 개념 - TLC Rf 결과 값(유효숫자) 설명
- TLC 크로마토그래피 - 칼럼 크로마토그래피 미지 시료 A, B
- 컬럼 크로마토그래피 분리 결과 설명
- 분배계수/ Rf - 실험 A, B 극성 비교 결과
- 극성, 전기 음성도 - 전개제 증발을 막아야 하는 이유
- 오차 원인