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Fines Estrictamente Académicos. Artículo Free de Nature
Fines Estrictamente Académicos. Artículo Free de Nature
The dynamics of antimicrobial resistance (AMR) in developing countries are poorly understood, especially in
community settings, due to a sparsity of data on AMR prevalence and genetics.
We used a combination of phenotyping, genomics and antimicrobial usage data to investigate patterns of AMR
amongst atypical enteropathogenic Escherichia coli (aEPEC) strains isolated from children younger than five
years old in seven developing countries (four in sub-Saharan Africa and three in South Asia) over a three-year
period.
We detected high rates of AMR, with 65% of isolates displaying resistance to three or more drug classes.
Whole-genome sequencing revealed a diversity of known genetic mechanisms for AMR that accounted for >
95% of phenotypic resistance, with comparable rates amongst aEPEC strains associated with diarrhoea or
asymptomatic carriage.
Genetic determinants of AMR were associated with the geographic location of isolates, not E. coli lineage, and
AMR genes were frequently co-located, potentially enabling the acquisition of multi drug resistance in a single
step.
Comparison of AMR with antimicrobial usage data showed that the prevalence of resistance to fluoroquinolones
and third-generation cephalosporins was correlated with usage, which was higher in South Asia than in Africa.
This study provides much-needed insights into the frequency and mechanisms of AMR in intestinal E. coli in
children living in community settings in developing countries.
Una vez que E. Coli está adherida a los enterocitos, inyecta a la célula una serie de proteínas
mediante el sistema de secreción tipo III (SSTT) (figura 1B). La mayor parte de estas
proteínas está codificada en el cromosoma de EPEC, dentro de una isla de patogenicidad de
35 kb conocida como el locus de la eliminación del enterocito o LEE (figura 2B).21-23
Una secuencia contig es una secuencia continua (no contigua) resultante del
reensamblaje de los pequeños fragmentos de ADN generados por las estrategias de
secuenciación de abajo hacia arriba . Este significado de contig es consistente con la
definición original de Rodger Staden (1979). [5]
La estrategia de secuenciación de
ADN de abajo hacia arriba consiste en cortar el ADN genómico en muchos
fragmentos pequeños ("abajo"), secuenciar estos fragmentos, volver a ensamblarlos
en contigs y eventualmente todo el genoma ("arriba"). Debido a que la tecnología
actual permite la secuenciación directa de solo fragmentos de ADN relativamente
cortos (300-1000 nucleótidos), el ADN genómico debe fragmentarse en pedazos
En proyectos de secuenciación ascendente,El
pequeños antes de la secuenciación. [6]
ADN amplificado se corta al azar en fragmentos de tamaño apropiado para la
secuenciación. Las lecturas de secuencia posteriores, que son los datos que contienen
las secuencias de los fragmentos pequeños, se colocan en una base de datos. El
luego busca en esta base de datos pares de lecturas
software de ensamblaje [6]
superpuestas. El ensamblaje de las lecturas de dicho par (que incluye, por supuesto,
solo una copia de la secuencia idéntica) produce una lectura contigua más larga
(contig) del ADN secuenciado. Repitiendo este proceso muchas veces, al principio
con los pares cortos iniciales de lecturas, pero luego usando pares cada vez más largos
que son el resultado del ensamblaje anterior, se puede determinar la secuencia de
ADN de un cromosoma completo.
● IS 26: Las secuencias de inserción (IS) son la forma más simple de ADN móvil auto
movilizable que se encuentra en bacterias y arqueas. Se definen como que contienen
solo genes necesarios para su propia transposición
● Integrón clase I:
Un integrón es un elemento genético dinámico, que codifica para una integrasa con
actividad de recombinación sitio específica y acumula una combinación de genes
estructurales organizados como un operón. Estos elementos genéticos son
considerados sistemas de expresión, debido a que son capaces de integrar y expresar
genes denominados casetes, los cuales en su mayoría confieren resistencia a los
antimicrobianos
● Bombas de eflujo: Las llamadas MDRs son bombas de transporte activo sintetizadas
a partir de una proteína precursora, presentes en todas las células (bacterianas,
hongos, células cancerígenas) 1 . Las MDR se encargan de impulsar protones y en una
reacción de intercambio molecular exportan al espacio extracelular gran variedad de
moléculas extrañas. Estas proteínas se sintetizan en todos los seres vivos, como
mecanismo de depuración o supervivencia al ataque de agentes o moléculas externas
que puedan representar un daño potencial a la célula
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VITEK 2 es un sistema que utiliza tarjetas con reactivos colorimétricos, las que son
inoculadas con la suspensión de un cultivo puro microbiano y el perfil de desarrollo es
interpretado de forma automática. Las tarjetas reactivas tienen 64 pozos que
contienen, cada uno, un sustrato de prueba individual. Con estos sustratos se miden
varias actividades metabólicas como acidificación, alcalinización, hidrólisis
enzimáticas y desarrollo en presencia de sustancias inhibidoras. Las tarjetas están
selladas en ambos lados por una película clara que evita el contacto entre las
diferentes mezclas sustrato-microorganismo y a la vez permite la transmisión del
nivel de oxígeno apropiada. Cada tarjeta tiene un tubito de transferencia pre-insertado
para la inoculación. Estas tarjetas tienen códigos de barras que contienen información
sobre el tipo de producto, número de lote, fecha de caducidad y un identificador único
que puede ser ligado a la muestra ya sea antes o después de cargar la tarjeta al
sistema. Existen 4 tipos de tarjetas reactivas disponibles para la identificación de
diferentes clases de organismos: 1. GN – Bacilos Gram negativos fermentadores y no
fermentadores. 2. GP - Cocos y bacilos no formadores de esporas Gram positivos 3.
YST – Levaduras y organismos levaduriformes 4. BCL – Bacilos formadores de
esporas Gram positivos.
● Agar Macconkey: El agar MacConkey es un medio de cultivo selectivo y diferencial
para bacterias diseñado para aislar selectivamente bacilos Gram negativos y entéricos
(encontrados normalmente en el tracto intestinal) y diferenciarlos sobre la base de la
fermentación de la lactosa.1 El cristal violeta y las sales biliares inhiben el crecimiento
de organismos grampositivos, lo que permite la selección y el aislamiento de bacterias
gramnegativas. Las bacterias entéricas que tienen la habilidad de fermentar lactosa
pueden ser detectadas utilizando el carbohidrato lactosa y el indicador de pH rojo
neutro
Esta fórmula fue diseñada sabiendo que las sales biliares precipitan por acción de
ácidos y que determinados microorganismos entéricos fermentan la lactosa, mientras
que otros no presentan dicha capacidad. Posteriormente, este medio fue modificado
varias veces6,7. MacConkey Agar es sólo ligeramente selectivo, dado que la
concentración de sales biliares, que inhiben los microorganismos gram positivos, es
baja en comparación con otros medios de siembra en placa entéricos. Se recomienda
el uso de este medio con muestras clínicas que posiblemente contengan flora
microbiana mixta, tales como la orina y muchas otras más, dado que permite una
agrupación preliminar de Enterobacteriaceae y otros bacilos gram negativos en
fermentadores y no fermentadores de lactosa7-10. La fórmula de MacConkey II Agar
se diseñó para mejorar la inhibición de la proliferación de la especie Proteus, lograr
una mejor diferenciación de los organismos fermentadores y no fermentadores de
lactosa y alcanzar un crecimiento superior. En MacConkey II Agar, las peptonas
proporcionan los nutrientes. El cristal violeta inhibe las bacterias gram positivas, en
especial los enterococos y estafilococos. La diferenciación de los microorganismos
entéricos se logra mediante la combinación de lactosa y el indicador de pH rojo
neutro. Se producen colonias incoloras o de
Por qué se usa MHA para las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos?
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● SRT2: una herramienta basada en mapeo de lectura para la detección rápida y precisa
de genes, alelos y tipos de secuencia multilocus (MLST) a partir de datos de WGS.
Usando> 900 genomas de patógenos comunes, mostramos que SRST2 es altamente
preciso y supera los métodos basados en ensamblaje en términos de detección de
genes y asignación de alelos. Aquí hemos demostrado el uso de SRST2 para la
vigilancia del genoma microbiano en una variedad de entornos de salud pública y
hospitalarios. Ante las crecientes amenazas de resistencia a los antimicrobianos y la
virulencia emergente entre los patógenos bacterianos, SRST2 representa una
herramienta poderosa para extraer rápidamente información clínicamente útil de datos
sin procesar de WGS
SRST2 está diseñado para realizar dos tareas clave: (i) detectar la presencia de un gen
o locus, y (ii) determinar el alelo coincidente preciso o más cercano para ese locus,
entre un conjunto de posibles secuencias de alelos de referencia. El enfoque se ilustra
en la Figura 1. Se debe proporcionar una base de datos de secuencias de referencia en
formato fasta, en el que los encabezados de fasta indiquen tanto el locus (para que se
puedan comparar alelos del mismo locus) como un nombre único para cada alelo. En
el caso de los datos MLST, se proporciona una base de datos adicional de perfiles ST
como texto delimitado por tabuladores, que asigna ST a combinaciones únicas de
alelos. Los datos actuales de MLST (secuencias de alelos y definiciones de perfil),
adecuados para su uso con SRST2, se pueden descargar de pubmlst.org
automáticamente utilizando el script getmlst.py suministrado con SRST2. Otras bases
de datos de secuencias se pueden formatear fácilmente para usar con SRST2 usando
los scripts provistos con el programa. Se puede analizar cualquier cantidad de bases
de datos de secuencias en una sola ejecución, lo que permite la tipificación simultánea
de MLST, genes de resistencia y genes de virulencia.
● Paquete R STATS
● Replicón: Se conoce como replicón a la unidad de ADN en la cual ocurre un acto
individual de replicación. Cada replicón dispara solo una vez en cada ciclo celular. El
replicón debe poseer los elementos de control necesarios para la replicación. Tiene un
origen en el cual se inicia la replicación y puede o no tener un sitio de terminación.
Las bacterias y arqueobacterias pueden contener información genética adicional en
forma de plásmidos, cada plásmido representaría un replicón.
Uno de los mecanismos por los cuales se controla la actividad del origen del replicón
es mediante la metilación del ADN. El oriC de la bacteria E. Coli contiene 11 copias
de la secuencia GATC/CTAG el cual es un blanco para metilación en la posición N6
de la adenina por la enzima Dam metilasa.
es un algoritmo y
● BLAST:( herramienta de búsqueda de alineación local básica ) [2]
un programa para comparar información primaria de secuencias biológicas, como las
secuencias de aminoácidos de proteínas o los nucleótidos de secuencias de ADN y / o
ARN . Una búsqueda BLAST permite a un investigador comparar una secuencia de
nucleótidos o proteína de sujeto (llamada consulta) con una biblioteca o base de datos
de secuencias, e identificar secuencias de biblioteca que se asemejan a la secuencia de
consulta por encima de un cierto umbral.
● Plásmido pCERC2 y pCERC1: pCERC1, que contiene estos genes de resistencia
fue recuperado y secuenciado. Se construyeron deleciones, y la región de replicación
pCERC1 se limitó a un segmento de 1 kb que porta genes para ARN que están
estrechamente relacionados con los ARN de iniciación de replicación ColE1. Los
ensayos de reacción en cadena de la polimerasa, desarrollados para detectar el grupo
de genes sul2-strA-strB en este contexto, identificaron un plásmido de resistencia a
estreptomicina y sulfonamida, pCERC2, idéntico a pCERC1 sin el casete dfrA14 en
dos E. Coli aislamientos. El análisis bioinformático reveló plásmidos similares a
pCERC1 y dos miembros más de esta familia. Uno, el probable progenitor, lleva solo
el gen sul2 adyacente al pequeño elemento móvil CR2. El otro tiene un grupo de
genes de resistencia variante que ha evolucionado a partir de pCERC2 mediante la
adquisición del determinante de resistencia a la tetraciclina tet (A). Se han detectado
pCERC1 y pCERC2 en muchos países, lo que indica una distribución global y
parecen haber estado circulando en bacterias Gram negativas durante más de 25 años.
El otro tiene un grupo de genes de resistencia variante que ha evolucionado a partir de
pCERC2 mediante la adquisición del determinante de resistencia a la tetraciclina tet
(A). Se han detectado pCERC1 y pCERC2 en muchos países, lo que indica una
distribución global y parece haber estado circulando en bacterias Gram negativas
durante más de 25 años. El otro tiene un grupo de genes de resistencia variante que ha
evolucionado a partir de pCERC2 mediante la adquisición del determinante de
resistencia a la tetraciclina tet (A). Se han detectado pCERC1 y pCERC2 en muchos
países, lo que indica una distribución global y parece haber estado circulando en
bacterias Gram negativas durante más de 25 años.
● Unicycler:
La plataforma de secuenciación de ADN Illumina genera lecturas precisas pero cortas,
que pueden usarse para producir ensamblajes genómicos precisos pero fragmentados.
Las plataformas de secuenciación de ADN de Pacific Biosciences y Oxford Nanopore
Technologies generan lecturas largas que pueden producir ensamblajes genómicos
completos, pero la secuenciación es más costosa y propensa a errores. Existe un
interés significativo en combinar datos de estas tecnologías de secuenciación
complementarias para generar conjuntos "híbridos" más precisos. Sin embargo,
existen pocas herramientas que realmente aprovechen los beneficios de ambos tipos
de datos, a saber, la precisión de las lecturas cortas y el poder de resolución
estructural de las lecturas largas. Aquí presentamos Unicycler, una nueva herramienta
para ensamblar genomas bacterianos a partir de una combinación de lecturas cortas y
largas, que produce ensamblajes que son precisos, completos y rentables. Unicycler
crea un gráfico de ensamblaje inicial a partir de lecturas cortas utilizando el
ensamblador de novo SPAdes y luego simplifica el gráfico utilizando información de
lecturas cortas y largas. Unicycler utiliza un nuevo alineador semi-global para alinear
lecturas largas al gráfico de ensamblaje. Las pruebas en lecturas sintéticas y reales
muestran que Unicycler puede ensamblar contigs más grandes con menos desarme
que otros ensambladores híbridos, incluso cuando la profundidad de lectura larga y la
precisión son bajas. Unicycler es de código abierto (GPLv3) y está disponible en
github.com/rrwick/Unicycler. Las pruebas en lecturas sintéticas y reales muestran que
Unicycler puede ensamblar contigs más grandes con menos ensamblajes que otros
ensambladores híbridos, incluso cuando la profundidad de lectura larga y la precisión
son bajas. Unicycler es de código abierto (GPLv3) y está disponible en
github.com/rrwick/Unicycler. Las pruebas en lecturas sintéticas y reales muestran que
Unicycler puede ensamblar contigs más grandes con menos desarme que otros
ensambladores híbridos, incluso cuando la profundidad de lectura larga y la precisión
son bajas.
Resumen
Ciertos patotipos de Escherichia coli son causas importantes de diarrea en los niños,
especialmente en los países en desarrollo de África subsahariana y Asia meridional 1 . La E.
coli intestinal también es una fuente importante y un reservorio de genes que codifican la
resistencia a los antimicrobianos (AMR). Un patotipo de E. coli intestinal , conocido como E.
coli enteropatógena atípica (aEPEC), se define por la presencia de la isla de patogenicidad
llamada locus de borrado de enterocitos (LEE), además de la ausencia de toxinas Shiga (que
denotan E. coli enterohemorrágica ) y “bundle-forming pilus” IV (Bfp)(indicando EPEC
típico) 2 . E. coli enteropatógena atípica causa una variedad de síntomas de la enfermedad
que van desde diarrea esporádica y persistente hasta una colonización asintomática 1 , 3 , 4 ,
5 . Recientemente identificamos distintos linajes de aEPEC, incluidos 10 grupos clonales
comunes 6 .
Mejorar nuestro conocimiento de la AMR entre E. coli que vive en el intestino es importante
por 2 razones: (1) E. coli es una causa principal de infecciones extra intestinales y las cepas
que colonizan el tracto gastrointestinal de los pacientes son el reservorio principal de estas
infecciones; y (2) la mayoría de los AMR en E. coli está codificada en elementos genéticos
móviles que son transferibles entre bacterias, lo que permite la rápida diseminación y
mantenimiento de genes de resistencia entre bacterias de diferentes especies 23 , 24 . Aunque
los antimicrobianos no se recomiendan para el tratamiento de la gastroenteritis no
complicada, se administran comúnmente a niños con diarrea en países en desarrollo para
tratar la disentería 25 y diarrea prolongada, de la cual aEPEC es una causa principal 4 , 5
Aquí presentamos datos de AMR de 185 aislamientos de aEPEC recolectados durante el
Global Enteric Multicenter Study (GEMS) 1 , 26 . Utilizando datos de susceptibilidad
fenotípica y análisis de secuencia de genoma completo, determinamos la prevalencia, los
mecanismos de resistencia y los posibles factores de variación en los perfiles de AMR.
Estos aislamientos, recolectados de niños sanos que viven en un entorno comunitario y niños
con diarrea en 7 sitios en África subsahariana y el sur de Asia, brindaron una oportunidad
única para investigar la prevalencia de la AMR en bacterias intestinales que no se
seleccionaron en función del perfil AMR.
Resultados
Fig. 1: Prevalencia del contenido de genes asociados a AMR y fenotipos de AMR en 185
aislados de aEPEC.
Determinantes genéticos de la AMR
Los genomas de los 185 aislamientos de aEPEC se seleccionaron para determinar los
determinantes genéticos conocidos de AMR, incluidos los genes adquiridos horizontalmente
y las mutaciones puntuales en los genes cromosómicos asociados con la resistencia a las
fluoroquinolonas y la nitrofurantoína (Figura 1b ; Figura complementaria 1 y Tabla
complementaria 4 ). Se detectaron más de 40 genes AMR adquiridos diferentes, junto con 4
mutaciones puntuales (2 en gyrA , 1 en parC (tanto gyrA y parC están asociados con la
resistencia a quinolona) y 1 en RTCNA(asociado con resistencia a la nitrofurantoína)). Se
observó una gran diversidad de genotipos de AMR, con 104 combinaciones distintas de
determinantes de AMR en los 185 aislamientos (Fig. 1b , Fig. 1 complementaria ). Sin
embargo, se detectaron 4 genes AMR adquiridos en más de la mitad de los aislados. Estos
EM (ampicilina), strA y strB (estreptomicina) y sul2 (sulfonamidas). Se
fueron alelos de bla T
detectaron alelos de genes de dihidrofolato reductasa ( dfr ) que codifican resistencia a
trimetoprima en 132 aislados (71%). Los más comunes de estos fueron dfrA1 (12%), dfrA5
(23%), dfrA7( 20%) y dfrA8 (16%).
Como la MDR era común en las bacterias estudiadas (Fig. 1 ), planteamos la hipótesis de que
esto se debía a la transferencia conjunta de grupos de genes AMR a través de elementos
móviles. La matriz de co-ocurrencia por pares de genes AMR era escasa (figura
complementaria 2 ), con solo unos pocos grupos de genes frecuentemente detectados juntos
en el mismo genoma. El valor medio de co-ocurrencia en todos los pares de genes fue de 6.4
cepas. La Figura 2a muestra redes de co-ocurrencia de genes AMR, construidas usando
diferentes umbrales para la co-ocurrencia a través de la colección aEPEC. La red de genes
más común comprendía sul2 , strA y strB , que coexistieron en 112 genomas (61%); la
combinación de sul2 , strAy strB ocurrió con bla TEM-198 en 46 (25%) y con bla T
EM-191
en 20 (11%; y los genomas complementarios Fig. 2 y Fig. 2a ). Usando un umbral mínimo de
co-ocurrencia en ≥20 cepas (media más SD de todos los valores de co-ocurrencia),
EM-198 , así
detectamos una gran red de genes que comprenden sul2 , strA , strB y bla T
como sul1 , bla T
EM -191 , dfrA14 , dfrA8 , dfrA7 , tet (A) y tet (B).
Los genes sul2 , strA y strB frecuentemente se mueven juntos en plásmidos pequeños
(aproximadamente 6,000 pares de bases (kbp)) relacionados con pCERC2 29 (Fig. 2b ). La
combinación de la cadena principal del plásmido pCERC2 y las secuencias sul2 , strA y strB
estaba presente en 42 aislamientos, 40 de los cuales (95%) también portaban secuencias del
gen dfrA , incluidos dfrA1 , dfrA14 y dfrA8 . En algunos genomas, las secuencias de
plásmidos podrían resolverse por completo, lo que demuestra que el gen dfr estaba ubicado
en el plásmido. Por ejemplo, GEMS cepa 400897 llevada el gen dfrA1 adyacente a strB en un
plásmido similar a pCERC2, mientras que la cepa GEMS 402635 portaba dfrA14 insertado
dentro de strA como en pCERC1 29 (Fig. 2b ).
EM
Los genes sul2 , strA y strB también se presentan junto con los genes bla T
(predominantemente bla TEM-198 ) en el transposón Tn 6029 , que se encuentra
comúnmente en E. coli en un rango de cadenas principales plasmídicas distintas 27 , 29 , 30
(Fig. 2c ) Tn 6029 es movilizado por las copias flanqueantes de IS 26 . Una tercera copia de
EMy los otros genes AMR, lo que resulta en la separación del
IS 26 se encuentra entre bla T
transposón en 2 contigs separados en ensamblajes de lectura corta (Fig. 2c ). Detectamos la
presencia de ambos Tn 6029 contigs en 33 genomas, por lo que es probable que lleven el
transposón completo. Como la secuencia flanqueante IS 26 está presente en muchos lugares
diferentes, no pudimos determinar el sitio de inserción de Tn 6029 dentro del genoma
borrador. Sin embargo, Tn 6029 se encuentra con frecuencia dentro de Tn 1696 , que incluye
un integrón de clase I que transporta genes AMR variables (que a menudo incluyen genes dfr
) dentro del casete, y sul 1 downstream (Aclaración: upstream (algo así como contra
corriente o río arriba) si es hacia el extremo 5', o downstream (río abajo) si es hacia el
extremo 3) abajo del cassette. Para un ejemplo de una estructura de transposón compuesta del
plásmido Salmonella pSRC26 31 , véase la Fig. 2c . En total, identificamos secuencias de
integrones de clase I en 38 genomas de aEPEC, 26 de los cuales incluyeron ambos Tn 6029
contigs. En la Fig. 2c se muestra un gráfico de ensamblaje de ejemplo, que muestra cómo
estos contigs están conectados entre sí de manera consistente con los transposones
compuestos previamente secuenciados . En general, identificamos 5 casetes de genes integron
diferentes, el más frecuente de los cuales portaba dfrA7 ( n = 30 genomas, incluidos 25 con
Tn 6029 ), mientras que los otros portaban dfrA1 ( n = 4), dfrA1 y aadA ( n = 1 genoma,
que también portaba Tn 6029 ), dfrA17 y aad5 ( n = 2), y dfrA5 ( n = 1).
Fig. 3: El contenido del gen AMR se explica por la región de aislamiento, no por el
estado de la enfermedad o el grupo clonal.
El análisis discriminante de los componentes principales 33 en la matriz binaria de los
determinantes genéticos de AMR (Tabla complementaria 4 ; Fig. 3b, c ) reveló que los
primeros 20 componentes principales representaron > 93% de la variación en los perfiles de
AMR y fueron retenidos para el análisis discriminante por filogenética linaje (grupos clonales
como se definió anteriormente 6 ; Figura complementaria 1 ) o por origen geográfico (África
Oriental, África Occidental y Asia; Figura 3 y Figura complementaria 3 ).
La variación en AMR no se asoció con el grupo clonal, aparte de CG378, que se caracterizó
por la ausencia de los genes AMR más comunes: variantes de bla TEM , sul2 , tet (A ) y tet
(B) , y la presencia del gen catA poco común. , detectado en 7 de 9 aislamientos CG378 en
comparación con 15 de 176 no CG378 ( P <10 -4 , prueba exacta de Fisher, dos colas). La
variación en los determinantes de AMR se asoció con la región de origen (Fig. 3b y Fig. 3b
suplementaria ). La función discriminante 1 (DF1) separó aislamientos asiáticos de africanos
y se asoció con gyrA p olimorfismos de un sólo nucleótido; DF2 separó los aislamientos de
África oriental y occidental y se asoció con dfrA8 , dfrA5 , tet (A) y sul2 . La Figura 3d
muestra la distribución de los alelos dfrA a través de los sitios GEMS. Por ejemplo, dfrA1
predominó en los sitios asiáticos y dfrA8 fue más común en los sitios de África occidental,
mientras que dfrA14 y dhfr7 fueron comunes en Mozambique y Kenia, respectivamente.
Además, tet (A) fue más común en los sitios de África occidental y oriental que en Asia.
Estas diferencias genéticas se reflejaron en los fenotipos AMR, como la resistencia a la
ciprofloxacina (n = 8, 12%) y cefalosporinas de tercera generación (ceftazidima y
ceftriaxona, ambas n = 6; 9%) se identificaron solo en cepas de Asia, mientras que la
resistencia a la tetraciclina fue más común en África (África Oriental, n = 44, 60%; África
occidental, n = 33, 72%) que en los aislamientos asiáticos, n = 27, 41%; P <0.05, prueba
exacta de Fisher, dos colas; Fig. 4a ).
Fig. 4: Fenotipos de AMR por región y uso de antimicrobianos en los sitios de estudio.
La AMR y los datos de uso informados aquí, se recopilaron en 7 sitios de estudio en Asia y
África, utilizando los mismos protocolos, lo que permite las comparaciones entre los sitios 26
, 34 . No se dispone de datos nacionales de vigilancia de AMR de estos países; y los datos de
AMR sobre E. coli en estos países pertenecen principalmente a aislamientos que causan
infecciones extra intestinales, y a un número limitado de medicamentos (principalmente
cefalosporinas y fluoroquinolonas de tercera generación) 14 , 19 , 21 , 22 , 35. Además, los
datos de fondo disponibles públicamente sobre el uso de antimicrobianos en los siete sitios de
estudio son limitados. Por ejemplo, la base de datos MIDAS de IMS Health incluye datos de
uso para India, Pakistán y Bangladesh informados en conjunto sin métodos detallados de
recopilación o interpretación de datos; y no hay datos para Mozambique, Gambia, Kenia y
Malí.
Casi la mitad de todos los aislamientos fueron resistentes a las penicilinas, trimetoprima
y tetraciclinas. Las tasas de resistencia a estos fármacos fueron generalmente más bajas
entre los aislamientos asiáticos (21-62%) que en los aislamientos de África (59-84%);
mientras que en los sitios asiáticos se detectó resistencia a fármacos más nuevos, como
ceftriaxona, fluoroquinolonas y azitromicina (Fig. 4a ). Estos patrones fueron ampliamente
consistentes con los datos de uso de antimicrobianos en los sitios de estudio correspondientes,
que mostraron que la ciprofloxacina y la azitromicina se usaban comúnmente para tratar
la diarrea en Asia, mientras que el trimetoprim-sulfametoxazol era la base del
tratamiento en África (Fig. 4b, c ). Las altas frecuencias de resistencia a la ciprofloxacina en
los sitios asiáticos son similares a las tasas reportadas previamente entre los casos clínicos de
E. coli en intestino (incluidos múltiples patotipos) en estos países 17 , 19 , 21 , 22 , 36 .
Detectamos aislados productores de BLEE en los sitios de estudio de Asia, pero no en África.
Se han informado niveles mucho más altos de infecciones por E. coli extra-intestinales
(incluida la bacteriemia) en hospitales de Asia y África 16 , 19 , 35 , especulamos que esto
puede reflejar la selección debido al uso de cefalosporina de tercera generación a tasas más
altas en hospitales que en la comunidad, y / o la difusión de los linajes de E. coli
extra-intestinales productores de BLEE , como ST131.
De acuerdo con nuestros datos relacionados con los fenotipos de AMR, encontramos que los
determinantes genéticos de la resistencia eran similares en bacterias aisladas de casos
diarreicos y controles asintomáticos (Fig. 3a , Tabla complementaria 6 ) y no estaban
asociadas con el linaje clonal de la cepa, pero asociado con la región geográfica donde se
aislaron las bacterias (Fig. 3b, c ; Suplementaria Fig. 3 ). Estos hallazgos son consistentes
con la hipótesis de que las diferencias en las frecuencias de los genes que codifican AMR en
diferentes regiones reflejan la selección debido a las diferencias en la exposición a los
antimicrobianos (Fig. 4b, c ). En un fuerte apoyo de esta explicación, las mutaciones en los
QRDRs de gyrA y parC se asoció significativamente con la frecuencia del uso de
ciprofloxacina en los siete sitios de estudio (Fig. 5 ). El mismo patrón de mutaciones
puntuales en los QRDR de genes cromosómicos se ha observado en otras enterobacterias
asociadas con el sur de Asia, incluidas Salmonella enterica serovar Typhi 37 , 38 y Shigella
sonnei 39 .
La situación era más compleja para los genes AMR transferidos horizontalmente asociados
con la resistencia a fármacos más antiguos. Aunque los alelos dfr individuales se
distribuyeron de manera diferente entre los sitios (Fig. 3d ) y contribuyeron a los
componentes ortogonales de la función discriminante regional (Fig. 3b ), la prevalencia
general de los genes dfr fue relativamente alta (50-90%) en cada sitio y no asociado
significativamente con el uso de trimetoprima para la diarrea (Figs. 3d y 4b, c) De manera
similar, los genes que codifican la resistencia a la ampicilina, la estreptomicina y la
tetraciclina fueron comunes en los sitios donde estos medicamentos rara vez o nunca se
usaron para el tratamiento de la diarrea. También encontramos evidencia de varios elementos
comunes que median la AMR a estos medicamentos más antiguos, incluidos los plásmidos
pequeños y los integrones de clase I (Fig. 2 ). Esto podría deberse a: (1) una falta de costo de
aptitud física asociada con estas resistencias(Aclaración: sí hay poco o ningún costo de
acondicionamiento físico tienen más probabilidades de persistir en ausencia de
tratamiento con antibióticos. Ejemplo: Una cepa de mosca de D. melanogaster, C4 es resistente a la toxina del
hongo, la alfa-amanitina. La alfa-amanitina bloquea la actividad del ARN pol II. Esta cepa tiene una mutación que altera la estructura del
ARN pol II y es así como es resistente a la toxina. Tiene una ventaja en presencia de la toxina. Sin embargo, en ausencia de la toxina, tiene
una supervivencia pobre en comparación con su contraparte de tipo salvaje que no tiene la mutación. La mutación tiene una ventaja en
presencia de la toxina pero una desventaja en ausencia de la toxina. En otras palabras, la mutación tiene un costo de aptitud, lo que
resulta en el mantenimiento de los genes en la población de E. coli después de que el
consumo de drogas disminuye 8 , 10 , 30 , 40 , 41 ; (2) co-selección para resistencia a
múltiples fármacos cuyos genes asociados están presentes en los mismos elementos móviles
42 ,43 ; y / o (3) selección debido a la exposición al fármaco no relacionada con el
tratamiento de la diarrea. No pudimos distinguir entre hipótesis utilizando nuestros datos,
aunque es bastante probable la exposición a antimicrobianos de otras fuentes. Por ejemplo,
aunque encontramos que la trimetoprima, sola o combinada con sulfametoxazol, se usó con
menos frecuencia en la India que los agentes alternativos para el tratamiento de la diarrea,
otros estudios han reportado el uso frecuente de trimetoprima en hospitales, entornos
comunitarios 36 y agricultura en la India; También hay evidencia de su presencia en el medio
ambiente, particularmente en aguas superficiales 44. Los estudios futuros se beneficiarían de
datos adicionales sobre exposiciones a antimicrobianos clínicos y agrícolas, y ensayos para
agentes antimicrobianos seleccionados en orina y el medio ambiente.
Tampoco pudimos determinar la ubicación precisa de la mayoría de los genes AMR y los
elementos móviles asociados a partir de nuestros datos de secuencia de lectura corta. Otros
experimentos como la conjugación o la secuencia de lectura larga 38 , 45 , 46 podrían
resolver esto en el futuro. Sin embargo, es notable que los plásmidos similares a pCERC (que
a menudo tenían resistencia a la estreptomicina, sulfonamidas y trimetoprima) son comunes
en E. coli , posiblemente porque su pequeño tamaño (~ 6 kb) impone un bajo costo de aptitud
29 , 47.. También es notable que estos y muchos de los otros genes AMR que detectamos
también están asociados con transposones compuestos que pueden integrarse en el
cromosoma bacteriano, donde se mantienen a un costo de acondicionamiento físico más bajo
que los plásmidos codificadores de resistencia grandes 27 , 31 , 38 . Muchos de los elementos
móviles que detectamos se han informado ampliamente en E. coli y otras Enterobacteriaceae
de muestras intestinales y extra intestinales humanas y muestras de animales 29 , 38 , 48 , 49 ,
50 . E. coli enteropatógena atípica tiene múltiples reservorios y nuestra colección incluyó una
amplia diversidad filogenética dentro de la población de E. coli (90 linajes únicos 6 ); y no
encontramos diferencias en la AMR entre los aislamientos cultivados de los casos y la
colonización asintomática. Por lo tanto, aunque los aislamientos no fueron recolectados para
el propósito específico de la vigilancia de AMR, pueden ser ampliamente representativos de
E. coli intestinal en estos entornos.
Nuestros datos llenan vacíos importantes de información sobre la prevalencia de AMR entre
E. coli intestinal en niños de países en desarrollo de África y Asia. En particular, nuestro
estudio demostró que la resistencia a múltiples fármacos 'más antiguos' (ampicilina,
tetraciclina, estreptomicina y trimetoprima-sulfametoxazol) era común en todos los sitios, y
que la resistencia a los antimicrobianos 'más nuevos', como las fluoroquinolonas y la
azitromicina, solo ha surgido en sitios asiáticos donde se usan estos medicamentos en el
tratamiento de la diarrea. La resistencia a los medicamentos más antiguos también era común
en estos sitios, de modo que solo los aislamientos asiáticos eran resistentes a siete u ocho
categorías de antimicrobianos, lo que indica que los patrones cambiantes de uso de
antimicrobianos conducen a una acumulación de determinantes de resistencia en lugar de su
reemplazo
Métodos
Para los ensayos VITEK2, los aislamientos puros se tiñeron en placas de agar MacConkey y
se incubaron a 37 ° C durante la noche. Los aislamientos se subcultivaron luego en placas de
agar sangre de caballo (HBA) para cultivo fresco y se incubaron durante la noche a 37 ° C. Se
seleccionaron de una a tres colonias de cada placa de HBA y se suspendieron en solución
salina a una absorbancia de ~ 0,5 unidades MacFarlane antes de someterse a análisis
VITEK2. Los datos brutos MIC de los ensayos VITEK2 se muestran en la Tabla
complementaria 7 .
Se descargó una versión con formato SRST2 de la base de datos 55 del gen ARG-ANNOT
AMR de https://github.com/katholt/srst2 . Todos los conjuntos de lectura de secuencia se
examinaron contra la base de datos usando SRST2 para detectar la presencia de genes de
resistencia adquiridos conocidos en cada genoma 56 . Los genes de la β-lactamasa, ampC1 ,
ampC2 y ampH , se excluyeron del análisis, ya que en E. coli son genes centrales que
normalmente no confieren resistencia a los antibióticos. Los resultados se transformaron en
una tabla binaria en R para indicar la presencia / ausencia de alelos de genes de resistencia
adquiridos (Tabla complementaria 4 ).
Todos los análisis estadísticos se realizaron con el paquete R Stats versión 3.4.0. La
capacidad de los genotipos para predecir los fenotipos de susceptibilidad a los medicamentos
se evaluó comparando los fenotipos de susceptibilidad a los antimicrobianos (S, I y R) con la
presencia de genes y mutaciones asociados a AMR conocidos. Los errores en la predicción de
la susceptibilidad a los antimicrobianos se caracterizaron como muy importantes (llamando a
un aislado resistente susceptible) o mayores (llamando a un aislado susceptible resistente) 60
, 61 . Los estándares actualmente aceptados para errores muy grandes y tasas de errores
mayores son <1.5% y <3%, respectivamente 60. Aquí, se dijo que ocurrieron errores muy
importantes cuando un aislado era fenotípicamente resistente, pero no se detectaron genes o
mutaciones de resistencia conocidos, mientras que se cometieron errores importantes cuando
un aislado portaba determinantes de resistencia conocidos pero era fenotípicamente
susceptible. El análisis estadístico para determinar la sensibilidad, especificidad, VPP y VPN
se calculó en el paquete epiR (v0.9-93) 62 para R, utilizando la función epi.stats con
intervalos de confianza de 0.95 para cada antimicrobiano probado.
Se construyó una matriz de coincidencia por pares de genes AMR adquiridos mediante la
transformación de la matriz de contenido de genes binarios AMR en R. Las relaciones de
co-ocurrencia se visualizaron entre todos los pares de genes utilizando el paquete de mapas
de fenat (v1.0.8) en R ( https: / /CRAN.R-project.org/package=pheatmap ) (Figura
complementaria 2 ). Las redes de genes concurrentes, en los que los nodos representan genes
y los bordes representan una frecuencia de concurrencia que excede un umbral dado
(establecido en ≥20, ≥33, ≥46, ≥100 genomas), se visualizaron en R usando el paquete igraph
(v1.1.2) 63 en R.
Se descargó una versión con formato SRST2 de la base de datos de PlasmidFinder 64 de
https://github.com/katholt/srst2 para la detección de 80 secuencias de marcadores de
replicones de plásmidos conocidas. Todos los conjuntos de lectura de secuencia se
examinaron contra la base de datos usando SRST2 para detectar la presencia de estos
replicones en cada genoma. Los resultados se transformaron en una tabla binaria en R para
indicar presencia / ausencia.
Los genes comunes asociados a AMR que se demostró que coexisten, específicamente bla
TEM-198 , sul1 , sul2 , strA , strB , múltiples alelos dfrA , tet (A) y tet (B) , se investigaron
más a fondo en los ensamblajes del genoma de aEPEC para determinar si fueron
transportados en los mismos elementos móviles. Los ensamblajes del genoma aEPEC
generados previamente 6 fueron interrogados con BLAST (v2.3.30), utilizando como
consultas los genes AMR y las secuencias de los plásmidos pCERC1 (acceso JN012467 ) y
pCERC2 (acceso KX291024 ), y los transposones Tn 6029( acceso GQ150541 ) 27 , Tn 1721
(acceso X61367 ) 67 y Tn 10 (acceso AF223162 ) 68 . Por ejemplo, si la columna vertebral
pCERC2 y los genes AMR se detectaron en un solo contig en el ensamblaje del genoma,
inferimos que estos genes se movían juntos en un plásmido relacionado con pCERC2. Dos
aislamientos representativos de aEPEC que se identificaron como portadores de un esqueleto
de plásmido similar a pCERC2 con diferentes inserciones de genes dfr (cepas 402635 y
400879) se seleccionaron como representantes para un análisis posterior. Estos genomas se
volvieron a ensamblar con Unicycler (v0.2.0) 69 , anotado con Prokka (v1.12)70 y en
comparación con las secuencias de referencia para pCERC1 y pCERC2 usando BLAST.
Luego se exploraron las comparaciones utilizando la Herramienta de comparación Artemis
71 y se trazaron con genoplotR (v0.8.7) en R 72 .
Se infirió que los aislados de E. coli enteropatógenos atípicos eran probablemente portadores
de Tn 6029 o transposones relacionados si BLAST detectaba toda la región de repC a strB en
un solo contig y también se detectaba una variante bla TEM (predominantemente bla
TEM-198 ) en El genoma. (Tenga en cuenta que no es posible ensamblar la secuencia
EM está separado del resto
completa del transposón a partir de lecturas cortas, ya que bla T
del transposón por copias repetidas de IS 26 que causan una ruptura en el gráfico de
ensamblaje). Una cepa representativa que coincide con este patrón (401596) se volvió a
montar con Unicycler 69y la conectividad de los genes Tn 6029 en los gráficos de ensamblaje
resultantes se visualizaron usando Bandage (v0.8.1) 73 .
Los datos sobre el uso de antimicrobianos en cada uno de los siete sitios GEMS se obtuvieron
como parte del protocolo GEMS original 1 , 26 . Estos datos incluyen detalles de los
antimicrobianos prescritos para todos los casos que presentan diarrea acuosa o disentería en
las clínicas del estudio y fueron documentados por un miembro del equipo clínico de GEMS
26 . Dos de los medicamentos registrados se excluyeron del análisis actual: pivmecillinam,
porque no se usó a ningún nivel discernible, y metronidazol, que es activo contra protozoos y
bacterias anaerobias obligatorias solo 76 y, por lo tanto, no pertenece a E. coli, que es
intrínsecamente resistente a este agente. La frecuencia de las recetas para cada medicamento
en cada sitio se visualizó en R, utilizando el paquete ggplot2 (v2.2.1) 33 .