7/8/2020

PHÂN TÍCH HÓA LÝ

THỰC PHẨM 2
TS. DƯƠNG HỮU HUY
PHONE: 0987.513.138 Lịch sử hình thành sắc kí

EMAIL: huydh@hufi.edu.vn Năm 1906 - Mikhail

SemenovichTswett(1872-1919)
đã thí nghiệm tách chất
Bằng cột sắc ký lần đầu tiên

1
 7/8/2020

Phương pháp phân tích sắc kí Quá trình tách

• Đại cương về sắc kí (Chromatography) • Cổ điển
• Sắc kí lỏng (Liquid Chromatography – LC)
• Sắc kí khí (Gas Chromatography – GC)

2
 7/8/2020

Quá trình tách Sắc kí ?

 Là phương pháp tách (trong pttp sắc kí được ứng dụng
• Hiện đại rộng rãi để định lượng các hợp chất, đặc biệt là hàm lượng
nhỏ)
 Dựa trên 2 quá trình
– Hấp phụ
– Giải hấp phụ
 Xảy ra liên tục giữa 2 pha
– Pha tĩnh (cột sắc kí): chất rắn hoặc lỏng
– Pha động: là chất lỏng (LC) hoặc chất kí (GC)

☼ SK hấp phụ (Adsoprtion chromatography):

Phân loại
Pha tĩnh: là chất rắn và chất PT được hấp phụ lên
• Dựa vào bản chất của quá trình sắc kí
– Sắc kí hấp phụ (Absorption [Liquid – Solid] trên bề mặt rắn
Chromatography)
– Sắc kí phân bố (Partition [Liquid – Liquid]
Pha động: lỏng (Liquid – solid chromatography)
Chromatography)
Pha động: khí (Gas – solid chromatography)
– Sắc kí ion (Ion Chromatography)
– Sắc kí loại trừ kích thước Cơ chế: chất phân tích phân bố giữa 2 pha theo cơ
• Dựa vào trạng thái pha động
– Sắc kí lỏng - LC chế Hấp phụ - Giải hấp phụ (Sorption – desorption)
– Sắc kí khí - GC

12

3
 7/8/2020

 SK phân bố (Partition chromatography): Liquid – liquid partition chromatography:

Pha tĩnh: chất lỏng gắn trên bề mặt chất mang rắn - Nếu pha tĩnh: phân cực (polar: nước, methanol)
trơ và pha động: không phân cực (non – polar:
Pha động: lỏng (Liquid – liquid partition hexane)

chromatography) SK pha thường (Normal phase chromatography)

(PT hiệu quả cho các chất phân cực: các chất
Pha động: khí (Gas – liquid chromatography)
phân cực bị giữ lại trên cột lâu hơn các chất
Cơ chế: chất phân tích phân bố giữa 2 pha
không phân cực)

13 14

Chất phân tích phân bố giữa

- Nếu pha tĩnh: không phân cực pha động và pha tĩnh
và pha động: phân cực
 SK pha đảo (reversed phase chromatography)
(Chất không phân cực được giữ trên cột lâu hơn
chất phân cực)
Sắc kí pha đảo được sử dụng
rất phổ biến trong thực tế!!!

15 16

4
 7/8/2020

 SK trao đổi ion (ion exchange chromatography) Sắc kí lỏng và sắc kí khí
Pha tĩnh: nhựa trao đổi ion (hợp chất có khả năng Pha động: chất lỏng (dung môi hữu cơ, dd acid,
baz, đệm,…..)
trao đổi ion)
 Sắc ký lỏng (Liquid chromatography)
Pha động: lỏng
Pha động: chất khí (H2, Ar, He,….)
Cơ chế: cân bằng trao đổi ion giữa chất phân tích
 Sắc ký khí (Gas chromatography)
trong MP và ion trong SP
 Hợp chất có ái lực ít với pha tĩnh thì có xu
hướng ra khỏi cột trước
 Hợp chất có ái lực nhiều với pha tĩnh bị giữ lại
17
lâu hơn cột và ra sau 18

Sắc kí đồ - Chromatogram Đặc điểm

peak sắc kí
• Trục hoành:
thời gian lưu
• Trục tung: tín
hiệu.
• Peak sắc kí:
• Đồ thị biễu diễn mối quan hệ giữa tín hiệu – nồng – Chiều cao, h
độ - thời gian. – Chiều rộng, W
– Định tính: dựa vào thời gian lưu – Diện tích, S
– Định lượng: dựa vào diện tích hay chiều cao peak

5
 7/8/2020

Một vài sắc kí đồ Các đại lượng đặc trưng trong sắc kí

• PP sắc kí có • Thời gian lưu tR.

thể tách và xác • Hệ số phân bố K.
định đồng thời • Hệ số chọn lọc α.
rất nhiều chất • Hệ số dung lượng k’.
trong cùng 1 • Số đĩa lý thuyết N.
lần phân tích! • Chiều cao đĩa lý thuyết H.
• Độ phân giải Rs.
• Phương trình Van Deemter

Thời gian lưu - tR Thời gian lưu - tR

Là thông số quan trọng và đặc trưng cho từng
chất phân tích trong điều kiện xác định.
Dùng để định tính (một phần!).
• Là thời gian chất phân Thời gian lưu của chất được quyết định bởi:
tích đi ra khỏi cột, có
tính đến tương tác với - Pha tĩnh (loại, cỡ hạt, độ xốp, loại xốp,…)
pha tĩnh.
• Thời gian lưu chết tM: - Pha động (loại khí, thành phần, tốc độ,…)
là thời gian chất phân
tích đi ra khỏi cột khi - Bản chất và cấu trúc chất PT
không có tương tác
với cột. - Nhiệt độ cột trong quá trình chạy SK.
• Thời gian lưu thực t’R
= tR - tM

6
 7/8/2020

Hệ số phân bố K Hệ số phân bố K
• Là đại lượng đặc trưng cho cân bằng động của K phụ thuộc các yếu tố:
chất phân tích giữa 2 pha: tĩnh và động - Bản chất, cấu trúc phân tử của chất PT, nhóm
K = CS/CM
chức, nhóm thế,..
– CS và CM: là nồng độ chất trong pha tĩnh và pha
động. - Bản chất, loại và cấu trúc SP
– K càng lớn chất giữ lại càng lâu trên cột
- Bản chất, thành phần và tốc độ MP
- Nhiệt độ cột tách

Hệ số chọn lọc - 
 = Hệ số tách của hai chất

tr,B  tm t 'B k 'B

   
tr,A  tm t'A k 'A

t’A và t’B: thời gian lưu thực của chất A và B

k‘A, k’B: hệ số chứa của chất A và B
Với 2 chất kề nhau:
 = 1: không có sự tách sắc ký của 2 chất
  1: có sự tách sắc ký của 2 chất
27

7
 7/8/2020

Hệ số dung lượng k’ (K’) Số đĩa lý thuyết N

• Đại lượng đăc trưng - Số đĩa lý thuyết (N): biểu thị
cho sự di chuyển của số lớp chất di chuyển trong
chất phân tích trên cột.
cột. N = 16(tR/wb)2 = 5.545(tR/w0.5)2
k'=K’=KAVS/VM tR : thời gian lưu tòan phần
wb và w0.5 là độ rộng peak đo
• Cách xác định:
tại chân đường nền và tại
k'=(tR-tO)/tO
nửa chiều cao peak
Số đĩa lý thuyết thực (hiệu dụng) N’:
N’ = 16(t’R/wb)2 = 5.545(t’R/w0.5)2

- Chiều cao đĩa lý thuyết: bề dày của lớp chất Độ phân giải Rs
mẫu trong cột tách • Là đại lượng cho phép
đánh giá hai chất có thể
h = L/N tách ra khỏi nhau không.
Chiều cao đĩa lý thuyết hiệu dụng: WA, WB; độ rộng đáy của peak

H = L/N’ sắc ký hai chất A và B

t'RA, t’RB: thời gian lưu của hai
L : chiều dài cột tách (mm)
chất A và B
H, h: mm
• .

8
 7/8/2020

Độ phân giải Rs Hiện tượng kéo đuôi, đầu của peak sắc kí
• Muốn tăng độ phân giải Rs => tăng α, k, N

Ưu điểm của PP sắc ký

 Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất

 Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột
SẮC KÝ LỎNG
 Độ nhạy cao (ppm-ppb) (Liquid chromatography)
 Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100µL)
 PT nhanh

35 36

9
 7/8/2020

Giới thiệu
SKL chia thành 2 nhóm
- Sắc ký lỏng (Liquid chromatography)
- SK lỏng áp suất thường (sắc ký cổ điển)
Pha động: Chất lỏng. Vai trò: hòa tan và di
- SK lỏng cao áp (SKL hiệu năng cao: HPLC)
chuyển chất phân tích (rửa giải chất PT)
(High Performance Liquid Chromatography)
Pha tĩnh: rắn (sắc kí hấp phụ) hoặc lỏng (sắc kí
High Pressure Liquid Chromatography
phân bố). Vai trò: giữ chất phân tích.

37 38

Dựa vào bản chất của quá trình sắc ký, HPLC: - Dựa vào trạng thái pha tĩnh

- SK hấp phụ Pha động: Lỏng SK lỏng – lỏng (LLC)

- SK phân bố pha thường (normal phase Pha tĩnh: Lỏng (Liquid – liquid
chromatography chromatography)
- SK phân bố pha đảo (reversed phase
chromatography)
Pha động: lỏng SK lỏng – rắn (LSC)
- SK trao đổi ion và cặp ion (ion exchange chr., ion
Pha tĩnh: Rắn (Liquid – solid
pair chromatography)
chromatography)
- SK rây phân tử (size exclusion chromatography)
39 40

10
 7/8/2020

Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC

Ưu điểm của phương pháp sắc ký lỏng
- Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất Van tiêm mẫu
- Không cần làm bay hơi mẫu (phân tích các chất kém
bền nhiệt)
Cột – Pha tĩnh
- Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột
- Độ nhạy cao (ppm-ppb) nhờ đầu dò Bơm
- Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100L)
Đầu dò

MP Recorder
41 42

LC Instrumentation
Sơ đồ đơn giản (tối thiểu)  The Agilent 1100, a typical modern LC system

Solvent reservoirs

Solvent degasser

Pump

Autosampler
1. Dung môi (pha động)
2. Bơm cao áp Column oven
3. Bộ phận tiêm mẫu
4. Cột sắc kí (pha tĩnh) DAD
5. Đầu dò (detector)
6. Bộ phận điều khiển, ghi nhận và xử lý tín hiệu.

11
 7/8/2020

Pha động (mobile phase):

Bơm cao áp (hệ thống cung cấp dung môi)
- Thường là nước và dung môi hữu cơ + một số
- Bơm pha động vào cột tách
chất cần thiết khác (đệm pH)
- Điểu khiển tốc độ dòng, áp suất của pha động
- MP cần đuợc tối ưu hóa để quá trình tách tốt!!!

45 46

Van bơm mẫu (Injection valve):

Có 2 hệ bơm: - Bơm mẫu PT vào cột tách theo những lượng mẫu
- Hệ đẳng dòng (isocratic). Ví dụ: nhất định
- Hệ Gradient: thành phần pha động thay đổi - Van 6 chiều có chứa các vòng mẫu có thể tích 20,
trong quá trình chạy SK. Ví dụ: 50 hay 100 µL
Tiêm mẫu bằng tay

Tiêm mẫu tự động

47 (Autosampler) 48

12
 7/8/2020

Six-port
HPLC valve
Vial • Mô tả cách hoạt động của van 6 cổng!

49 50

Cột tách (Column)

Detector: Thiết bị phát hiện chất phân tích (định tính và
- Cột chứa pha tĩnh
định lượng)
- Yếu tố quyết định quá trình tách sắc ký
♣ UV hay UV-Vis: detector phổ hấp thu phân tử
- Cột tách có kích cỡ khác Xác định các chất có khả năng hấp thu quang
nhau
♣ Huỳnh quang (Fluorescence detector): xác định các chất
- Chiều dài: 10 – 25cm
có khả năng phát huỳnh quang
- Đường kính: 2 – 5mm
- Alflatoxin, Mycotoxin, Amino Acid, thuốc trừ sâu họ
Carbamate,….

51 52

13
 7/8/2020

Hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu:

♣ Đầu dò chỉ số khúc xạ (Refractive Index Detector:
- Thu thập và xử lý kết quả
RI)
- Recorder, Computer + printer, software
♣ Đầu dò độ dẫn (Conductivity detector):
Xác định các ion vô cơ, hữu cơ
♣ Đầu dò khối phổ (MS: mass spectrometry)
Xác định phần lớn các chất hữu cơ

53 54

Các quá trình tách trong sắc ký lỏng

- Quá trình quan trọng nhất trong phương pháp sắc
ký
HPLC của - Những cân bằng động xảy ra giữa pha tĩnh và pha
Perkin Elmer động trong cột sắc ký
- Là sự vận chuyển và phân bố liên tục của chất PT từ
đầu cột đến cuối cột

55 56

14
 7/8/2020

- Chất phân tích luôn phân bố giữa 2 pha, trong đó

- Thời gian chất PT bị pha tĩnh lưu giữ (thời gian
pha động luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất lưu) quyết định bởi:
định hoặc gradient Bản chất của pha tĩnh, cấu trúc và tính chất của
- Hiệu quả của quá trình tách phụ thuộc rất nhiều vào chất PT
tương tác giữa các chất trong pha tĩnh và pha động Bản chất và thành phần của pha động dùng để
- Mục đích chính của sắc ký là tách và định lượng các rửa giải chất PT ra khỏi cột sắc ký (pha tĩnh)
chất trong hỗn hợp chất phức tạp

57 58

- Ghi lại toàn bộ quá trình tách sắc ký của hỗn hợp - Sắc ký đồ phản ánh quá trình tách sắc ký trong
chất PT  sắc ký đồ gồm nhiều peak. cột tốt hay không tốt.

- Đặc điểm của peak PT: - Tách tốt: hỗn hợp có bao nhiêu chất  có bấy
Các peak có thể tách rời nhau hoàn toàn nhiêu peak riêng biệt không chập nhau

Chập nhau một phần - Chất nào bị lưu giữ mạnh sẽ được rửa giải ra
sau cùng, chất lưu giữ kém sẽ ra trước
Chập nhau hoàn toàn

59 60

15
 7/8/2020

3 tương tác chính:

- Sự tương tác và cân bằng của chất PT với SP
- Sự tương tác và cân bằng của chất PT với MP
- Sự tương tác của SP và MP

61 62

Ftot = Fa + Fb + Fc
- Chất nào có lực tương tác lơn nhất sẽ bị giữ lại
PT lâu trên cột
Fb - Chất nào có F nhỏ  bị rửa giải đầu tiên
Fa
- Ftot khác nhau nhiều thì quá trình tách tốt
Fc
SP MP

63 64

16
 7/8/2020

Cột nhồi trong sắc ký pha thường

Sắc ký lỏng pha thường và pha đảo
- Cột silica trung tính:
Pha thường Pha đảo -Bề mặt có chứa nhóm phân
H H H cực (ưa nước): -OH
Cột Phân cực Không phân
(Pha tĩnh) cực O O O
-Xác định các chất không
Si Si Si phân cực hoặc ít phân cực
Pha động Không phân Phân cực
O O O O
cực

Si
Si
65 66

- Cột silica trên nền mạch carbon: - Dung môi chủ yếu: không phân cực
-Si-CH2CH2CH2CN + Hydrocarbon: hexan, pentan, octan
-Si-CH2CH2CH2NH2 + Aromatic hydrocarbon: benzen, toluen, xylen,…
-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH) + Chloroform CHCl3
+ Cột cyano: đa mục đích + Methylene chloride CH2Cl2
+ Cột amino: phân tích đường - Dung môi phụ: phân cực hoặc hơi phân cực
+ Cột diol: protein + Ethanol, methanol,….

67 68

17
 7/8/2020

Liên kết hydrogen và thời gian lưu Liên kết hydrogen

♣ Mẫu phân tích có:
HO 1
Mạnh
–COOH: nhóm carboxyl
Phân Liên kết hydrogen
SiOH –OH : nhóm hydroxyl
cực 2 1 mạnh
SiOH –NH2 : nhóm amino
Yếu
♣ Mẫu phân tích có nhóm tert-butyl hoặc các nhóm
Rất yếu
OH không phân cực lớn
Rt  LK hydrogen sẽ yếu
2
69 70

Cột nhồi trong sắc ký pha đảo

- Cột: không phân cực
- Pha động: phân cực  Xác định chất phân cực, không phân cực và
- Cột silica đã alkyl hóa các nhóm –OH trên bề mặt ít phân cực
silica trung tính:
Cột C18 (ODS) Bề mặt không phân
cực
Cột C8 (octyl)
Cột C4 (butyl) hay ít phân cực
Cột phenyl (kỵ nước)
71 72

18
 7/8/2020

Thời gian lưu và liên kết kỵ nước Dung môi trong HPLC pha đảo
HO
1 - Dung môi phân cực:
C18 (ODS) Yếu
Methanol (CH3OH: MEOH), acetonitrile (CH3CN:
ACN)
Mạnh - Dung dịch đệm
OH 1 2  Tối ưu hóa tỉ lệ dd đệm/ dung môi rất quan trọng
2
để quá trình tách tốt

73 74

So sánh pha thường và pha đảo

Ứng dụng của HPLC
Thông số Normal Phase Reversed Phase
- Chủ yếu xác định các hợp chất hữu cơ khó bay hơi
Độ phân cực của cột Cao Thấp
trong nhiều đối tượng khác nhau:
Độ phân cực của dung Thấp Cao
môi + Amino acid
Thứ tự rửa giải Chất kém phân Chất phân cực ra
cực ra trước trước + Acid hữu cơ
Tăng độ phân cực Rửa giải nhanh Rửa giải chậm
+ Thuốc trừ sâu
dung môi hơn hơn
+ ….

75 76

19
 7/8/2020

77

Giới thiệu
- GC: PPPT hiện đại được sử dụng nhiều trên TG

SẮC KÝ KHÍ (từ 1952)

- PP đứng đầu trong việc tách và phân tích các hợp
(Gas chromatography) chất bay hơi:
+ Các chất khí, lỏng, chất hòa tan,…
+ Vật liệu vô cơ và hữu cơ
Vd: Có thể tách các chất có nhiệt độ bay hơi rất gần
nhau: Benzen và cyclohexan (80.1 và 80.8oC)
79 80

20

- Sắc ký khí: mẫu được tách do sự phân bố giữa
pha tĩnh và pha động nhờ cơ chế hấp phụ, phân
bố hoặc kết hợp cả 2 cơ chế.
 Pha tĩnh: rắn hoặc lỏng
 PHA ĐỘNG: CHẤT KHÍ
Phân loại SKK:
+ SK Khí - rắn (Gas – solid chromatography):
Pha tĩnh là chất hấp phụ rắn, chất PT hấp
phụ trên bề mặt rắn của SP
(SK hấp phụ: absorption chromatography)
 GC: là quá trình tách các chất trong một hỗn
hợp mẫu ở trạng thái khí. Chất mang hay pha
động (MP) là chất khí, còn mẫu có thể ở trạng
thái khí hay lỏng hoặc rắn (phải được hóa hơi
trước)
7/8/2020
+ SK Khí – lỏng (Gas – liquid chromatography) Pha
tĩnh: là chất lỏng hấp phụ lên trên bề mặt rắn
trơ (bề mặt rắn trơ gọi là chất mang pha tĩnh)
(Vật liệu tách có thể là ở dạng bột thô được tẩm
một pha lỏng và nhồi vào cột mà dòng khí mang
có thể len lỏi đi qua)
(Sắc ký phân bố: Partition chromatography)
SK khí – lỏng được sử dụng nhiều nhất trong GC
81 82
83 84
21

Sơ đồ và vai trò của từng bộ phận
trong thiết bị sắc ký khí
- Lò cột: điều khiển nhiệt độ cột tách
- Cột tách: nơi xảy ra các quá trình tách chất. Có 2
lọai cột: Cột nhồi (pack column) và cột mao quản
(capillary column), dài từ 2 – 50 m
- Đầu dò (detector): Phát hiện và định lượng chất
PT (FID, TCD, ECD, MS, NPD,….)
- Hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu: dùng để
thu thập và tính toán các kết quả.
87
7/8/2020
Các bộ phận cơ bản bao gồm :
- Nguồn cung cấp khi mang: bình khí hoặc máy
sinh khí (H2, N2, He, Ar: tùy thuộc detector)
- Hệ thống điều khiển áp suất hoặc tốc độ dòng
khí
- Buồng bơm mẫu: có nhiều loại khác nhau tùy
mục đích phân tích
86
- Khí mang: mẫu từ buồng bay hơi được dẫn vào
cột tách trong lò cột nhờ khí mang
- Quá trình SK xảy ra trong cột (Column)
- Sau khi được tách trên cột, các cấu tử lần lượt
đi ra khỏi cột và vào detector.
- Tín hiệu ghi nhận được chuyển sang tín hiệu
điện và được xử lý.
88
22
 7/8/2020

Injector

AIR
Sắc ký đồ
AUTOSAMPLER

SEPTUM PURGE
Peak sắc ký
INJECTOR DETECTOR COMPUTER

Column
OVEN

H2

SPLIT
COLUMN

Carrier gas N2(He)

MAKE UP

LOÏC AÅM moisture filter PRINTER

LOC HYDROCARBON hydrocarbon filter

LOÏC OXYGEN oxygen filter

Detector
tM tR1 tR2 tR3 tR4
Start Mỗi peak sắc ký ứng với một hoặc một nhóm
89
cấu tử của hỗn hợp cần tách 90

Các đại lượng đặc trưng của SKK

This image cannot currently be displayed.

 Thời gian lưu (Retention time)

Đường nền

Start

91 92

23

• Thời gian lưu (giữ) toàn phần tR : thời gian tính từ lúc
bơm mẫu đến điểm cực đại của peak (Thường gọi là
thời gian lưu) (tR thời gian lưu của một cấu tử từ khi
vào cột đến khí tách ra ngoài cột)
Thời gian chết t0 : thời gian một chất hoàn toàn không
tương tác với cột tách (không bị lưu giữ) đi qua cột
(các chất như methan, argon… thường được sử
dụng tùy đầu dò) (thời gian lưu của cấu tử trơ)
93
 Hệ số tách của hai chất, 
t 'A
 
t 'B
t’A và t’B: thời gian lưu của chất A và B
Với 2 chất kề nhau:
 = 1: không có sự tách sắc ký của 2 chất
  1: có sự tách sắc ký của 2 chất
95
7/8/2020
Thời gian lưu thực t’R: thời gian chất bị lưu giữ
trong pha tĩnh. Tính theo công thức:
t’R = tR – t0
Thời gian lưu của chất được quyết định bởi:
- Pha tĩnh (loại, cỡ hạt, độ xốp, loại xốp,…)
- Pha động (loại khí, thành phần, tốc độ,…)
- Bản chất và cấu trúc chất PT
- Nhiệt độ cột trong quá trình chạy SK
94
 Hệ số phân bố:
 Là đại lượng đặc trưng cho cân bằng động
của chất trong hai pha: pha tĩnh và pha động
 Tính theo công thức:
Kpb = CiSP/CiMP
CiSP, CiMP : nồng độ chất i trong pha tĩnh và pha
động
 Kpb càng lớn chất càng bị giữ lại lâu trong cột
96
24
 7/8/2020

Hệ số dung tích (capacity factor): k

Kpb phụ thuộc các yếu tố:
- Đại lượng biểu diễn mối tương quan giữa thời
- Bản chất, cấu trúc phân tử của chất PT, nhóm
gian của chất tan lưu lại trong SP so với thời gian
chức, nhóm thế,..
chất tan lưu lại trong MP
- Bản chất, loại và cấu trúc SP
k = ni,sp/ni,mp = t’R/tM
- Bản chất, thành phần và tốc độ MP
ni,sp : số mol chất i trong pha tĩnh
- Nhiệt độ cột tách
ni,mp: số mol chất i trong pha động
k càng lớn: chất PT càng bị giữ lâu trong cột
97 98

Mối liên hệ giữa hệ số phân bố và hệ số dung tích:  Độ phân giải R:

Kpb = k   - Là đại lượng cho phép đánh giá hai chất có thể
: tỷ số pha tách ra khỏi nhau không
 = VMP/VSP RA/B = 2(tRA – tRB)/(wA+ wB)
Vmp: thể tích cột bị chiếm bởi pha khí
WA, WB; độ rộng đáy của peak sắc ký hai chất A và B
Vsp: thể tích cột bị chiếm bởi pha tĩnh
tRA, tRB: thời gian lưu của hai chất A và B

99 100

25
 7/8/2020

KHẢ NĂNG TÁCH THEO R Số đĩa của cột tách và chiều cao đĩa (h) và :

R KHẢ NĂNG GHI CHÚ

- Số đĩa lý thuyết (n): biểu thị số lớp chất di chuyển
TÁCH trong cột.
0.5 BẮT ĐẦU NHẬN RA
PEAK THỨ 2 n = 16(tR/wb)2 = 5.545(tR/wh)2
<1 < 94% KÉM, KHÔNG TÁCH
ĐƯỢC
tR : thời gian lưu tòan phần
wb và wh là độ rộng peak đo tại chân đường
1 - 94% - 100% TÁCH ĐƯỢC
1.5 nền và tại nửa chiều cao peak
1.5 100% TÁCH HOÀN TOÀN
101 102

This image cannot currently be displayed.

Số đĩa lý thuyết hiệu dụng N:
N = 16(t’R/wb)2 = 5.545(t’R/wh)2
- Chiều cao đĩa lý thuyết: bề dày của lớp chất mẫu
trong cột tách
wh
h = L/n
Chiều cao đĩa lý thuyết hiệu dụng:
H = L/N
wb
L : chiều dài cột tách (mm)
H, h: mm
103 104

26
 7/8/2020

Có 2 loại cột tách:

Các loại cột dùng trong SKK
- Cột nhồi
Có nhiều dạng cột tách khác nhau trong SKK. Các - Cột mao quản
cột tách thỏa mãn các yêu cầu sau:
- Đảm bảo trao đổi chất tốt giữa pha động và pha Cột nhồi (packed column):
tĩnh. Thép không rỉ, đồng, thủy
- Độ thấm cao tức độ giảm áp suất nhỏ với một tinh dài 3 – 5 m
tốc độ khí mang nhất định ID: 2 – 3 mm,
- Có khoảng nhiệt độ sử dụng lớn và làm việc Được nhồi đầy SP với
được ở nihệt độ cao đường hạt 100 – 120 mesh
(150 – 125µm)

105 106

- Cột nhồi: phân tích các hợp chất đơn giản Chất mang pha tĩnh
Do chiều dài ngắn  Số đĩa lý thuyết ít
Chất mang cho sắc ký cột nhồi:
Cột mao quản (capillary column)
- Chất mang thường là đất diatomit
- Cột bằng thủy tinh, L = 15 – 100m
- Đất nung với CaCO3 ở nhiệt độ 900oC thu được
ID: 150 – 850µm
dạng bột có diện tích bề mặt 1 – m2/g
Bên ngoài bao bằng lớp polyme dày 200 - 350µm để mao quản
- Thành phần chủ yếu: SiO2 và Al2O3 và 1 ít kim loại
dẻo, cuộn tròn được
kiềm, kiềm thổ
Thạch anh nóng chảy (Fused silica)
- Khi xử lý bằng các PP khác nhau sẽ có nhiều lọai
có độ trơ và mềm dẻo hơn chất mang khác nhau.

107 108

27
 7/8/2020

Một số chất mang thường sử dụng

Yêu cầu của pha tĩnh trong cột SK:
Chất mang Các chất được tách Các chất không
tách được - Ít bay hơi
Chromosorb 101 Este, ete, keton, Amin, Anilin - Bền nhiệt
Porapak P và PS hydrocarbon, alcol, acid
béo, glycol - Trơ về mặt hóa học với chất phân tích và khí mang.
Chromosorb 102 Khí nhẹ và bền, acid có Amin, Anilin
Porapak Q phâh tử lượng thấp,
- Pha tĩnh của cột và các chất phân tích cần có độ
alcol, hydrocarbon,
phân cực tương tự thì mới tách tốt (các chất giống
glycol, nitril, nitroalkan
Chromosorb 103 Amin, amid, alcol, Các chất có tính nhau hòa tan tốt vào nhau)  SP được chọn dựa
aldehyde, keton acid, glycol,
nitril, nitroalkan vào độ phân cực
….
109 110

Các loại SP trong SKK Câu trúc pha tĩnh:

• R = CH3: Polydimethyl
SP trong SKK: chất rắn hay lỏng
R R R siloxane
- SP rắn, xốp có cỡ hạt từ 3 – 5µm, Sxốp 200 – 500 • Khi thay thế nhóm methyl
m2/g R – Si – O – Si – O – Si – R
bằng các nhóm khác sẽ
- SP lỏng được giữ trên cột tách nhờ chất mang dẫn đến sự thay đổi độ
R R
trơ R
phân cực và khả năng
n
Chất mang: tách
Poly alkyl siloxane
- Silica (silanol, dầu silicon, Si(OH)4) Phenyl – C6H5
- Al2O3 (ít dùng) CH3 R CH3 Cyano-propyl – C3H6-CN

- Cao phân tử hữu cơ: polystyren H3C Si O Si O Si CH3 Trifluropropyl - C3H6CF3

CH3 R CH3

111 112

28
 7/8/2020

- Hiện nay có khỏang 700 pha tĩnh đã sử dụng Chất PT được chia thành các nhóm theo độ phân
trong GC. cực:
- Có 3 nhóm SP : - Nhóm rất phân cực: nước, glycol, glyxerin,
+ Loại không phân cực polyphenol, các acid dicarboxylic,…
+ Loại ít phân cực - Nhóm phân cực: alcol mạch thẳng, acid béo
+ Loại phân cực mạnh hữu cơ, phenol, amin bậc 1 và 2, hợp chất nitro
Mỗi SP thích hợp cho một loại nhóm chất phân
và nitril có chứa hydro,….
tích cần tách.
113 114

- Nhóm phân cực vừa phải: các ete, alkanal, alkanon, Một số pha tĩnh thường sử dụng
este, amin bậc 3, các nitro và nitril không chứa Pha tĩnh Tên Tính phân cực Ứng dụng
thường
hydro,….
dùng
- Nhóm ít phân cực: hydrocarbon thơm, các alken đã Polydimethy OV – 1 Không phân cực Hydrocarbon; nhân
halogen hóa một phần l siloxan SE – 30 (Max: 3500C) thơm; dược phẩm ;
steroid; PAHs, PCB’s
- Nhóm không phân cực: alkan, thioalkanon, các alkan …
đã halogen hóa,…. 5% phenyl - OV – 3 Hơi phân cực Axit béo đã ester
Polydimethy SE - 52 (350) hóa ; alkaloid; dược
Nguyên tắc chọn pha tĩnh: chất giống nhau hòa tan tốt l siloxan phẩm; các hợp chất
vào nhau halogen hóa

115 116

29
 7/8/2020

Pha tĩnh Tên Tính phân cực Ứng dụng

thường
dùng
Polyethylene
Pha tĩnh Carbowax
Tên thường dùng Phân cực cực
Tính phân Axit
Ứngtự do; alcol;
dụng
glycol (250) ether; tinh dầu; glycol

50% phenyl - OV- 17 Phân cực trung Dược phẩm

Polydimethyl bình Glycol
siloxan 200 Pesticides

Cyano- OV - 275 Phân cực cao Acid béo chưa no

propyl- 250 Acid tự do
polymethyl Alcol
siloxan

117 118

MP trong SKK: khí mang (Carrier gas)

Khí mang ↔ Pha động
Khí mang chạy liên tục qua thiết bị
Mang hơi mẫu qua cột và qua detector
Yêu cầu của MP:
- Trơ (INERT): không PUHH với mẫu và SP
- Tương thích với detector: No noise or explosions
- Độ tinh khiết cao
119 120

30
 7/8/2020

Các loại DETECTOR

 Các loại pha động:
Phát hiện và định lượng chất PT: chuyển hóa các
- H2, N2, He (Heli), Ar (Argon), không khí sạch, hỗn
đại lượng không điện (nồng độ chất phân tích)
hợp 2 khí (Vd: Ar + CH4)
thành đại lượng điện.
Vd: detector TCD: khí He, H2
Có khoảng 30 loại detector:
FID: N2
- Đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID: Flame Ionization
Detector)
- Đầu dò bắt giữ điện tử (ECD: Electron Capture
Detector)
121 122

Detector Ion hóa ngọn lửa FID

- Đầu dò dẫn nhiệt (TCD: Thermal Conductivity - Sử dụng phổ biến, PT nhiều loại chất : đặc biệt
Detector) hydrocarbon (các hợp chất chứa C)
- Độ nhạy cao (LOD: 2 – 20pg/mL)
- Đầu dò khối phổ (MS: Mass spectrometry)
- Khí mang: hỗn hợp H2 + không khí
- Đầu dò quang kế ngọn lửa (Flame Photometric Nguyên tắc hoạt động:
Detector) - Nhờ nhiệt độ của ngọn lửa H2/KK: các phân tử
- Đầu dò NPD (Nitrogen Phosphorus Detector) từ cột tách đi vào buồng đo (Flow – cell) của
detector sẽ bị bẻ gãy mạch, bị ion hóa nhờ có
- Đầu dò ion hóa bằng photon PID Oxy không khí  tạo thành các ion và electron
(Photoionization Detector)  Làm thay đổi độ dẫn buồng đo
123 124

31
 7/8/2020

C6H6  6CH
6CH + O2  6CHO+ + 6e

Không phát hiện

được CO2, NOx,
SO2, NH3, H2S, hợp
chất halogen….

125 126

Detector bắt giữ điện tử ECD

- Sử dụng phổ biến, PT nhiều loại chất: các chất
giàu điện tử như hợp chất chứa halogen, thuốc
trừ sâu, PCBs, dioxin,…
- Độ nhạy cao (LOD: 2 – 10pg/mL)
- Khí mang: He và N2
Nguyên tắc hoạt động: dựa trên khả năng nhận
điện tử trong pha khí

127 128

32
 7/8/2020

Detector dẫn nhiệt TCD

- Xác định các chất khí, chất dễ bay hơi, đặc biệt
các khí mà FID không xác định được: CO2, Ar,
NOx,…
- LOD: 250 – 600pg/mL
- Khí mang: H2, He
Nguyên tắc: đo liên tục độ dẫn nhiệt của dòng khí
mang từ cột tách đi vào buồng đo
129 130

Khối phổ MS  Bản chất của phổ là đo số khối m/Z của chất PT
- Vạn năng, đắt tiền, không dùng phổ biến như tạo ra trong buồng ion hóa, gồm các số khối m/Z
FID và ECD của:
- Độ nhạy cao (0.5 – 5 pg/mL) + Ion phân tử của chất
Cấu tạo của MS gồm các bộ phận: + Các mảnh ion của chất (chất PT bị phá vỡ tạo
+ Nguồn ion hóa chất PT (ionizer) ra)
+ Thiết bị phân tích khối (ion analyzer)
+ Detector
131 132

33
 7/8/2020

Ion
Phân tử

GC
IONIZER

GC: Chất PT được hóa hơi, sau đó hh khí đi qua

cột và được tách trên cột • Flash\New Folder\GC-MS.swf

MS: ph tử khí được ion hóa 133 134

Vd: peak cơ bản trong phổ của Methanol:

CH3OH + e-  CH3OH+• (m/z 32) + 2e-
CH3OH+•  CH2OH+ (m/z 31) + H•
 CH3+ (m/z 15) + •OH
CH2OH+  CHO+ (m/z 29) + H2
(M+•: ion phân tử); các mảnh ion, các mảnh không
tích điện
 Phân tử CH3OH đã sinh ra 4 số khối

135 136

34
 7/8/2020

Alkane Aromatic
Hexane Naphthalene
C6H14 C10H8
MW = 86.18 MW = 128.17

137 138

Ether Điều khiển nhiệt độ trong GC

Ethyl methyl ether
C3H8O - Chế độ đẳng nhiệt (isothermal): nhiệt độ cột giữ
MW = 60.10 không đổi trong quá trình chạy SK
- Chế độ Gradient nhiệt độ: nhiệt độ cột thay đổi
Tách ở chế độ đẳng nhiệt:
- Đơn giản
- Tách các chất có nhiệt độ hóa hơi không khác
nhau nhiều
139 140

35
 7/8/2020

- Với hh mẫu phức tạp: chất trong mẫu PT có nhiệt

độ hóa hơi khác nhau  hiệu quả tách kém
- Chủ yếu áp dụng cho sắc ký cột nhồi
Tách ở chế độ gradient nhiệt độ:
- Dùng phổ biến cho cột mao quản
- PT hỗn hợp chất phức tạp
- Tăng hiệu quả tách
- Rút ngắn thời gian PT
141 142

Phương pháp nạp mẫu vào cột tách GC

- Nạp mẫu vào buồng hóa hơi
- Nhờ khí mang dẫn hơi mẫu vào cột tách
Các cách nạp mẫu:
 Nạp mẫu trực tiếp (manual injection)
 Nạp mẫu gián tiếp có chia dòng
 Nạp mẫu gián tiếp không chia dòng
 Nạp mẫu khí

143 144

36
 7/8/2020

Các yếu tố ảnh hưởng trong GC - Thành phần mẫu, dung môi hòa tan,
- Điều kiện cột tách và SP - Cách xử lý mẫu

- Chất khí mang, thành phần, tốc độ
- Bơm mẫu vào cột tách, khối lượng mẫu
- Các điều kiện và chương trình nhiệt độ chạy SK
- Điều kiện phát hiện chất, detector và các thông số
của detector
145
Tối ưu hóa các điều kiện cho hệ GC
Khi áp dụng quy trình có sẵn, cần:
- Phải kiểm tra quy trình dựa vào các mẫu chuẩn,
mẫu kiểm chứng  xem các điều kiện của quy
trình đó có phù hợp không  cần sửa đổi, cải tiến,
bổ sung,….
- Xác định độ thu hồi (recovery), độ đúng,….
146

Phân tích định tính trong GC

Phương pháp định tính:
Nguyên tắc: - Chuẩn bị mẫu Pt và mẫu chuẩn trong cùng điều
- Mỗi chất PT có một thời gian lưu tRi nhất định đặc
kiện
trưng cho chất PT.
- Chọn điều kiện chạy SK
 Định tính các chất
- So sánh thời gian lưu của các chất trong SK đồ mẫu PT - Chạy SK và ghi phổ đồ của mẫu chuẩn
với các chất trong SK đồ mẫu chuẩn - Chạy SK và ghi phổ đồ của mẫu PT
 Trong mẫu có chất PT nào
- So sánh SK đồ của chất chuẩn và mẫu PT

147 148

37
 7/8/2020

Phân tích định lượng trong GC

- Dựa vào chiều cao peak

- Dựa vào diện tích peak
- Chất chuẩn
- PP đường chuẩn
- Pp nội chuẩn (internal standard)

149 150

38