Bioanalysis & Biomedicine http://dx.doi.org/10.4172/1948-593X.

1000115
Volume 7(1): 001-068 (2015) - 01 J Bioanal Biomed ISSN: 1948-593X JBABM, an open access journal
Open Access Tanna et al., J Bioanal Biomed 2015, 7:1 Research Article Open Access

Abstract
Research suggests that ~60% of patients prescribed cardiovascular drugs do not take their medication
correctly. The analysis of dried blood samples (DBS) by liquid chromatography-high resolution mass
spectrometry (LC-HRMS) for assessing medication adherence to candidate therapeutic drugs used in
cardiovascular therapy was investigated. Specificity using this analytical method was based on the
measurement at the accurate mass to charge ratio of the target analyte. To evaluate the method 8mm discs
were punched from each DBS and extracted followed by subjecting to LC-HRMS analysis. Trials on 6
commonly UK used cardiovascular drugs are reported demonstrating the ability of the system to detect the
target analytes during the 24 hour repeat prescription cycle. Samples from volunteers with confirmed adherence
were used to validate the response from the system as were samples from volunteers receiving no medication.
No false positives were observed and adherence assessment for bisoprolol, ramipril, amlodipine, valsartan,
doxasozin and simvastatin was demonstrated using the LC-HRMS method. Furthermore examples of incorrect
adherence were identified.

Keywords: Cardiovascular medications; LC-HRMS; LC-MS; Dried blood samples

 
Introduction
 
Liquid chromatography - high resolution mass spectrometry (LCHRMS) analyses now rival LC-
MS/MS techniques in terms of both compound specificity and quantitative detection capabilities [1-4].
LCMS/ MS techniques depend on the predetermination of the fragments ions from a precursor ion
characteristic of the target analyte. For the drug captopril [5], for example, the precursor ion would be
MH+ at m/z 218.0 and the previously identified fragment ions are m/z 172.0 and 116.0. These are the
values applied to MS1 and MS2 in an LC-MS/MS (triple quadrupole) instrument in order to detect
captopril during the elution of a sample. In the HRMS (Time of Flight MS) instrument all ions are
recorded during sample elution and this data is then scanned for the presence of ions at m/z 218.0845
characteristic of captopril. In analyses of this type the ToF MS measures m/z values typically to an
accuracy of 10 parts per million in mass. This approach means that the LC-HRMS results can be re-
interrogated for other analytes at a later date without the need to re-run samples. In this paper LC-
HRMS analyses of Dried Blood Spot (DBS) samples are used to assess patient adherence to prescribed
medication.
 
Adherence to medication refers to whether a patient takes their medication exactly as prescribed by the
clinician or doctor [6], for example, three times a day after meals or one to be taken at night.
Furthermore the complete course of medication should be taken as required by the prescription.
Despite what might be expected levels of adherence to medication are NOT good. Examples of poor
adherence include ~40% for people with heart disease in the US and UK, ~ 50% for patients with
breast cancer and as low as ~15% for some haematological cancers [7]. It is not surprising therefore
that there are some 320,000 unnecessary deaths in the EU and USA annually resulting from improper
use of medicines [8]. Other consequences of poor adherence to medication include medicine wastage
and extended patient illness resulting in additional hospital and healthcare costs [9]. Clearly therefore
medication adherence must be regarded as one of the most understated problems for the healthcare
systems worldwide. In 2003 the World Health Organization suggested that ‘improving medication
adherence would provide more benefits to people worldwide than the development of new medicines’
[10]. In the UK the medicines costs, within the NHS, constitute the second largest identifiable unit
after staff costs [11]. Improved adherence to medication offers an opportunity to reduce or at least
optimize some of the £11 billion current costs to the NHS.
 
Direct analysis of patient biofluids (blood, urine or saliva) provides the only unambiguous assessment
of adherence to prescribed medication. Other recognized methods of assessment can produce
misleading information, for example, tablets are collected but may not be taken, there are optimistic
answers to questionnaires and patients may mislead clinicians [12]. Whilst both urine and saliva
analyses can be used to show adherence the relationship between both the time of ingestion and the
dose taken cannot readily be established. The work reported here demonstrates that the analyses of
Dried Blood Spots (DBS) samples, collected from a minimally invasive finger prick, can provide a
quantitative assessment of adherence to medication. The advantages of DBS based methods coupled
with improved analytical instrumental capability has led to a surge in the use of this sampling
methodology for various applications [13,14].
 
Experimental
 
Target cardiovascular (CV) medication
 
The selection of specific cardiovascular medication was informed by discussion with practicing
clinicians and a survey of drug prescribing in the UK. The medicines identified as frequently
prescribed CV drugs in the UK and selected for this study were:
 
•    Bisoprolol                   beta blocker
 
•    Ramipril                      ace inhibitor
 
•    Simvastatin                 statin
 
•    Amlodipine                 calcium channel blocker
 
•    Doxazosin                  alpha blocker
 
•    Valsartan                   angiotensin receptor blocker.
 
Table 1 details the relevant pharmacokinetic (PK) information which will influence the detection
capabilities required for this investigation. The aim of this work was to investigate if the presence of
specified target drugs can be confirmed in blood samples from individual volunteers and therefore the
ranges in the responses from different volunteer/drug combinations is more important than a mean
value. Specifically therefore the worst case scenario, i.e. the lowest likely drug concentration in the
DBS sample, must be considered. This will occur for a combination of low bioavailability, low dose,
rapid elimination (short thalf) with a low Cmax developed in the shortest time (tmax). In this respect
simvastatin should pose the major challenge. The other major factor affecting the level of drug to be
detected was the time delay between the patient taking the medication and the subsequent provision of
the blood spot sample.
 
The data in (Table 1) shows the drug concentration in blood rising to a maximum (Cmax) usually after a
short time (tmax) and then decreasing exponentially at a rate governed by thalf. This data is usually
derived from experiments based on a single dose given to healthy volunteers. For long-term adherent
volunteers a ‘steady state’ condition develops in which the initial rise in concentration is less marked
and the rate of decrease is reduced. Under adherence conditions the steady state level, of the drug in
blood, is the minimum level of drug available for detection. An indication of patient non-adherence
will be derived from a combination of no signal above the instrument noise level and the passage of at
least 5 half-lives abstinence.
 
Volunteer samples
 
In the initial phase of this investigation two sets of volunteers were selected from informed colleagues:
 
• A group who routinely took one or more of the target medicines
 
• A group who were prescribed none of the target medicines.
 
The volunteers in the first group, provided blood samples at specified times after taking known
medication in order to provide controlled tests of the detection system. Analysis of DBS samples from
the second group, volunteers known to take none of the target drugs, was used to provide baseline
reference data for the trial samples. Replicate (n=5) ~30 μl volume blood spot samples were collected
on Whatmann 903 sample paper either in the laboratory or by volunteer self-collection at home. The
delay time between taking the prescribed medication and DBS sample collection was noted. After
collection the samples were allowed to dry under ambient conditions for a minimum of 2 hours and
were then sealed into plastic bags containing a dessicant. Self-collection at home was seen as a move
towards cost saving versus conventional liquid blood sample collection. Volunteers willing to try this
approach attended a laboratory training session.
 
Chemicals and materials
 
Acetonitrile, methanol and water of LC-MS grade were purchased from Sigma-Aldrich (Poole, UK).
The active pharmaceutical ingredients (API) Atenolol (R-(+), 99%), bisoprolol hemifumarate salt,
ramipril, valsartan, amlodipine besilate, simvastatin and doxazosin mesilate were also purchased from
Sigma-Aldrich (Poole, UK). Formic acid, auto-sampler vials with 250 μl inserts and vial caps were
purchased from Agilent Technologies (Cheshire, UK). Specimen collection paper type 903, micro-
centrifuge tubes (1.5 ml), volumetric pipettes, pipette tips and polyethylene bags were obtained from
Fisher Scientific (Loughborough, UK). An 8 mm diameter punch was obtained from Maun Industries
Ltd. (Nottingham, UK). Lithium heparin coated blood collection tubes were purchased from
International Scientifique Supplies Ltd. (Bradford, UK). Fresh blank blood was obtained from
informed volunteers in line with De Montfort University Ethics Protocols.
 
Sample analysis
 
The preparation of standard solutions and spiked blood spot samples to produce calibration data for
quantitative determinations has been detailed elsewhere [2] and is not duplicated here. An 8 mm disc
was punched from the centre of the DBS sample and transferred to a 1.5 ml micro-centrifuge tube. A
150 μl of extraction solvent consisting of methanol/water (70:30, v/v) plus the internal standard (20
ng/ml) was added to this. Sample tubes were then vortexed for 1 min and sonicated for 30 min. They
were then centrifuged for 10 min at 13.2 x g and each extract was transferred to an auto-sampler vial
for analysis by LC-HRMS.
 
The LC-HRMS system consisted of an Agilent 1290 UPLC coupled to an Agilent 6530 QTOF mass
spectrometer, used in the TOF only mode. The target drugs were analysed on an Zorbax Eclipse C18
rapid resolution HD column (Agilent Technologies, Cheshire, UK, 100 mm x 2.1 mm i.d., 1.8 μm
particle pore size) which was preceded by a 0.3 μm inline filter (Agilent Technologies, Cheshire, UK).
The column oven temperature was set to 40°C. Sample injection volume was 20 μl. The mobile phase
consisted of water containing 0.2% v/v formic acid (eluent A) and acetonitrile containing 0.2% v/v
formic acid (eluent B) and was delivered at 0.6 ml/min with gradient elution. The mobile phase was
initiated at 5% B and maintained for 0.5 min before increasing to 20% B and then to 95% B by 1.5
min and held until 3.0 min before returning to 5% B. The gradient elution programme was then held
for 1.5 min to re-equilibrate the column prior to the next injection. The mass spectrometer was
operated in the electrospray positive ion mode. The MS source and chamber conditions were
optimised to give maximum analyte signal intensities as follows: Fragmentor voltage: 165V;
Skimmer: 65V; Gas Temperature: 350°C; Dry Gas: 10 l/min; Nebuliser: 50.0 psig; Sheath Gas
Temperature: 400°C; Sheath Gas Flow: 12 l/min. Mass Range: 100-1000 m/z; Recording Rate: 1 Hz.
HRMS lock reference masses: 121.0508 m/z and 922.00987 m/z. Data acquisition was controlled by
the Mass Hunter Workstation Software for TOF/Q-TOF version B.04.00 (Agilent Technologies) and
the acquired data was processed using Qualitative Analysis B.04.00 and Quantitative Analysis B.04.00
software (Agilent Technologies). External calibration of the TOF mass spectrometer was performed
daily prior to starting the analysis.
 
Validation
 
A validation of this approach, following international guidelines, including data on selectivity,
linearity, sensitivity, intra and inter-assay accuracy and precision has already been published [2].
 
Results and Discussion
 
Selectivity
 
Before any analyses could be undertaken it was necessary to determine the accurate masses of the
target analytes and internal standard. Standard mass spectra in the full scan range 100-1000 m/z were
obtained by injection of a multicomponent standard solution of the target drugs and the internal
standard (20 ng/ml) in a mixture of methanol and water (70:30, v/v). The most intense ions under the
chosen operating conditions were:
 
               Drug                           m/z                      Species
 
               Bisoprolol                  326.2326             MH+
 
               Ramipril                     417.2384             MH+
 
               Simvastatin                441.2611             MNa+
 
               Amlodipine               431.1344              MNa+
 
               Doxazosin                 452.1928             MH+
 
               Valsartan                  436.2343             MH+
 
               Atenolol (IS)             267.1703             MH+
 
Figure 1 shows the Extracted Ion Chromatograms (EICs) for these compounds using the appropriate
accurate masses. These traces show that there were no interferences at the same retention time of each
of the drugs which confirmed the good selectivity of the method.
 
Volunteer samples
 
To date a total of 488 samples of different combinations of volunteer/ target drug/time delay after
dosing have been received from the volunteers taking medication including 40 samples from
volunteers not prescribed any of the medicines investigated in this project. Analytical investigations
routinely involve blank samples, baseline samples, calibration samples and the test samples. In this
investigation blank samples were those provided by the volunteers known not to be taking any of the
subject medicines. Baseline samples were obtained from volunteers immediately prior to them taking
the due dose of medication. These samples corresponded to delays of at least 24 hours and
demonstrating a detection capability at this level eliminates the possibility of reporting false negatives.
A false negative output would occur if the system was unable to detect the real levels of the target
drug present for an adherent volunteer (Figure 1).
 
Sample Quality: In order to provide useable data the blood sample must be uniform and of sufficient
size to provide an 8mm diameter punched disc. All the laboratory collected samples met these
requirements but 26 of 135 DBS samples collected at home were unsatisfactory. The spots on the
unsatisfactory samples were either too small or smeared which meant the blood sample was not
uniform. This represented a 19% failure rate for home sample collection.
 
Sample time delay distribution: As might be expected, assuming most volunteers take their
medication in the morning, the majority of the samples were collected within 12 hours of the dose
being taken. More than 60% of the samples collected were within this timeframe and 26% had delay
times between 12 and 18 hours. The delay time for simvastatin medication, taken at night, was either
less than 4 hours (50% of samples) or in excess of 16 hours (40% of samples) corresponding to an
overnight delay period. Periods in excess of 24 hours were derived from judicious delays in taking the
following dose. These results are summarized in Table 2. The total success of this phase of the
investigation is testament to both the resolute adherence of the volunteers and to the performance of
the system under this mode of operation. Inspection of the data for periods of >24 hours would suggest
that whilst ions appropriate to simvastatin were detectable the levels seen would have been below the
limits of quantification.
 
Qualitative assessment of adherence
 
All data was processed as the ratio of the peak area for the particular accurate mass divided by the
peak area for the internal standard from the same sample extract. This approach was designed to
reduce variations in the very low levels detected, resulting from minor differences in extraction
efficiency and the analytical conditions. The baseline samples, i.e. those with a delay between 24 and
25 hours all showed a detectable signal for all the relevant target API for those volunteers who were
known to be taking the specified medicines. This would be expected for regular medicine users who
would develop a ‘steady state’ level of the target drug in the blood. By contrast analysis of the samples
from volunteers not taking any of the medicines (blank samples) produced no signal greater than the
noise level at the retention times identified to be of interest. This observation confirms both the
performance of the approach i.e. identifying absence of the target drugs and also that there were no
other species present that could lead to an interfering signal. All of the samples from the control
adherents to medication showed the presence of the expected target drugs which may either confirm
good adherence or that knowing a test is coming will ensure the appropriate action, taking the
medicine, occurs.
 
Quantitative detection of the target cardiovascular drugs
 
The quantitative work that has been carried out has been reported elsewhere [2] and has been validated
in line with International guide lines on Bioanalytical method validation as summarized below:
 
• Specificity-good for all the APIs investigated
 
• Variation in accuracy and precision less than 15%
 
• Linearity better than 0.991
 
• Determination of LoD typically better than 1.0 ng/ml
 
• Recovery range from ~98% for bisoprolol to ~40% for simvastatin
 
• Matrix effects < 15%
 
• Samples stable for 12 weeks.
 
Quantitative information not only confirms that the medicine was taken but may also offer a further
degree of assessment of precise adherence to prescription instructions. The concentrations of the target
CV drugs determined in this work should relate to the data in Table 1 which cites literature
information on the maximum concentrations (Cmax /ng/ml) of these target drugs in the blood. The
quantitative results were examined and in the measured concentrations were all of the same order as or
below the Cmax levels from Table 1. In one set of replicates the level determined for the simvastatin
concentration was 50% higher than the maximum expected. This high level raised a question since it is
known that eating grapefruit products when taking simvastatin should be stopped. Under normal
conditions the bioavailability of simvastatin is only ~ 5% with the remainder being metabolised before
it can be absorbed into the blood. Grapefruit products compete with this metabolic pathway and
consequently the levels of simvastatin in the blood can rise significantly [21]. When questioned, the
volunteer explained that he took all his pills at the same time so he did not forget the simvastatin
which should be taken at night. There was no evidence of grapefruit in the diet but one of his other CV
drugs was known to have a similar effect on the metabolism of simvastatin. Here we have an example
of the ability to identify non-adherence to prescription instructions, resulting in a medication error,
which could only be identified from quantitative data.
 
Conclusion
 
The advantages of using LC-HRMS analyses of the target CV drugs in DBS samples have been
demonstrated for assessing medication adherence. The developed DBS based method correctly
assessed adherence in a non-clinical setting and furthermore samples collected at home provided a
viable but limited route to valuable data collection. Qualitative data provides a quick but limited
assessment of adherence whereas quantitative data enabled a less obvious form of non-adherence to be
identified. It is essential to ensure that the limit of detection for each target CV drug is below the
steady state level for adherent volunteers.
 
References
 
1. Lawson G, Cocks E, Tanna S (2012) Quantitative determination of atenolol in dried blood spot
samples by LC-HRMS: a potential method for assessing medication adherence. See comment
in PubMed Commons below J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 897: 72-79.

2. Lawson G, Cocks E, Tanna S (2013) Bisoprolol, ramipril and simvastatin determination in

dried blood spot samples using LC-HRMS for assessing medication adherence. See comment
in PubMed Commons below J Pharm Biomed Anal 81-82: 99-107.

3. Zhang T, Watson DG, Azike C, Tettey JN, Stearns AT, et al. (2007) Determination of
vancomycin in serum by liquid chromatography-high resolution full scan mass spectrometry.
See comment in PubMed Commons below J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci
857: 352-356.

4. Jiwan JL, Wallemacq P, Hérent MF (2011) HPLC-high resolution mass spectrometry in

clinical laboratory? See comment in PubMed Commons below Clin Biochem 44: 136-147.

5. Lawson G, Mulla H, Tanna S (2012) Captopril determination in dried blood spot samples with
LC-MS and LC-HRMS: A potential method for neonate pharmacokinetic studies. J Bioanal
Biomed 4: 016-025.

6. Anon (2012) Medication adherence. Patient Resource Cancer Guide.

7. Tanna S, Lawson G (2014) Dried blood spot analysis to assess medication adherence and to
inform personalization of treatment. See comment in PubMed Commons below Bioanalysis 6:
2825-2838.

8. Anon (2008) PGEU GPUE Policy Statement - Targeting adherence. Brussels.

9. Jackevicius CA, Li P, Tu JV (2008) Prevalence, predictors, and outcomes of primary

nonadherence after acute myocardial infarction. See comment in PubMed Commons below
Circulation 117: 1028-1036.

10. WHO (2003) Adherence to long-term therapies: Evidence for action. (1st edition) Sabete E, ed.
Geneva, Switzerland: WHO Publications 211.

11. http://www.nhsconfed.org/resources/key-statistics-on-the-nhs Accessed 16 October 2014.pdf

12. Ruddy K, Mayer E, Partridge A (2009) Patient adherence and persistence with oral anticancer
treatment. See comment in PubMed Commons below CA Cancer J Clin 59: 56-66.

13. Tanna S, Lawson G (2011) Analytical methods used in conjunction with dried blood spots.
Anal Methods 3: 1709-1718.

14. Lewis R, Maclean D, Ioannides C, Johnston A, McDevitt DG (1988) A comparison of

bisoprolol and atenolol in the treatment of mild to moderate hypertension. See comment in
PubMed Commons below Br J Clin Pharmacol 26: 53-59.
 15. Hosie J, Meredith P (1991) The pharmacokinetics of ramipril in a group of ten elderly patients
with essential hypertension. See comment in PubMed Commons below J Cardiovasc
Pharmacol 18 Suppl 2: S125-127.

16. Shah SK, Asnani AJ, Kawade DP, Dangre SC, Arora SK, et al. (2012) Simultaneous
quantitative analysis of olmesartan, medoxomil and amlodipine besylate in plasma by high
performance liquid chromatography technique. J Young Pharm 4: 88-94.

17. Vincent J, Harris SI, Foulds G, Dogolo LC, Willavize S, et al. (2000) Lack of effect of
grapefruit juice on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of amlodipine. See comment
in PubMed Commons below Br J Clin Pharmacol 50: 455-463.

18. Meredith PA, Elliott HL (1992) Clinical pharmacokinetics of amlodipine. See comment in
PubMed Commons below Clin Pharmacokinet 22: 22-31.

19. Zaid AN, Cortesi R, Qaddomi A, Khammash S (2011) Formulation and bioequivalence of two
valsartan tablets after a single oral administration. See comment in PubMed Commons below
Sci Pharm 79: 123-135.

20. Chung M, Vashi V, Puente J, Sweeney M, Meredith P (1999) Clinical pharmacokinetics of

doxazosin in a controlled-release gastrointestinal therapeutic system (GITS) formulation. See
comment in PubMed Commons below Br J Clin Pharmacol 48: 678-687.

21. Lilja JJ, Neuvonen M, Neuvonen PJ (2004) Effects of regular consumption of grapefruit juice
on the pharmacokinetics of simvastatin. See comment in PubMed Commons below Br J Clin
Pharmacol 58: 56-60.

Abstrak
Penelitian menunjukkan bahwa obat kardiovaskular ~ 60% pasien yang diresepkan tidak minum obat
mereka dengan benar. Analisis sampel darah kering (DBS) dengan resolusi kromatografi tinggi
spektrometri massa cair (LC-HRMS) untuk menilai kepatuhan minum obat untuk calon obat terapi yang
digunakan dalam terapi kardiovaskular diselidiki. Kekhususan menggunakan metode analisis ini
didasarkan pada pengukuran di massa akurat untuk mengisi rasio target analit. Untuk mengevaluasi
cakram 8mm metode yang menekan dari setiap DBS dan diekstraksi diikuti dengan menundukkan
analisis LC-HRMS. Percobaan pada 6 umum Inggris menggunakan obat kardiovaskular yang dilaporkan
menunjukkan kemampuan sistem untuk mendeteksi analit sasaran selama 24 jam siklus resep ulangi.
Sampel dari relawan dengan kepatuhan dikonfirmasi digunakan untuk memvalidasi respon dari sistem
seperti sampel dari relawan tidak menerima pengobatan. Tidak ada positif palsu yang diamati dan
penilaian kepatuhan untuk bisoprolol, ramipril, amlodipine, valsartan, doxasozin dan simvastatin
ditunjukkan dengan menggunakan metode LC-HRMS. Selanjutnya contoh kepatuhan yang salah
diidentifikasi.
Kata kunci: obat kardiovaskular; LC-HRMS; LC-MS; Sampel darah kering

Pengantar
Cair kromatografi - resolusi tinggi spektrometri massa (LCHRMS) analisis sekarang teknik LC-MS / MS
saingan dari segi kekhususan senyawa dan kemampuan deteksi kuantitatif [1-4]. Teknik LCMS / MS
tergantung pada takdir ion fragmen dari karakteristik ion prekursor dari target analit. Untuk kaptopril
obat [5], misalnya, prekursor ion akan MH + pada m / z 218,0 dan ion fragmen diidentifikasi sebelumnya
adalah m / z 172,0 dan 116,0. Ini adalah nilai-nilai yang diterapkan ke MS1 dan MS2 dalam LC-MS / MS
(triple quadrupole) instrumen untuk mendeteksi kaptopril selama elusi sampel. Dalam HRMS (Waktu
Penerbangan MS) instrumen semua ion dicatat selama sampel elusi dan data ini kemudian dipindai
untuk kehadiran ion pada m / z 218,0845 karakteristik kaptopril. Dalam analisis jenis ini ToF MS
mengukur m nilai / z biasanya dengan akurasi 10 bagian per juta massa. Pendekatan ini berarti bahwa
hasil LC-HRMS dapat kembali diinterogasi selama analit lain di kemudian hari tanpa perlu kembali
menjalankan sampel. Dalam makalah ini LC-HRMS analisis kering Blood Spot (DBS) sampel yang
digunakan untuk menilai kepatuhan pasien terhadap obat yang diresepkan.
 
Kepatuhan terhadap obat mengacu pada apakah pasien mengambil obat mereka persis seperti yang
ditentukan oleh dokter atau dokter [6], misalnya, tiga kali sehari setelah makan atau satu yang akan
diambil pada malam hari. Selain kursus lengkap obat harus diambil seperti yang dipersyaratkan oleh
resep. Meskipun tingkat apa yang dapat diharapkan dari kepatuhan terhadap pengobatan yang tidak
baik. Contoh ketidakpatuhan termasuk ~ 40% bagi penderita penyakit jantung di AS dan Inggris, ~ 50%
untuk pasien dengan kanker payudara dan serendah ~ 15% untuk beberapa jenis kanker hematologi [7].
Hal ini tidak mengherankan karena itu ada beberapa 320.000 kematian yang tidak perlu di Uni Eropa dan
Amerika Serikat setiap tahunnya akibat penyalahgunaan obat-obatan [8]. Konsekuensi lain dari
ketidakpatuhan terhadap pengobatan termasuk obat pemborosan dan penyakit pasien diperpanjang
sehingga rumah sakit dan kesehatan tambahan biaya [9]. Jelas karena itu kepatuhan minum obat harus
dianggap sebagai salah satu masalah yang paling bersahaja untuk sistem kesehatan di seluruh dunia.
Pada tahun 2003 Organisasi Kesehatan Dunia menyatakan bahwa 'meningkatkan kepatuhan minum
obat akan memberikan manfaat lebih kepada orang-orang di seluruh dunia dari pengembangan obat-
obatan baru' [10]. Di Inggris biaya obat-obatan, dalam NHS, merupakan unit diidentifikasi terbesar
kedua setelah biaya staf [11]. Peningkatan kepatuhan terhadap pengobatan menawarkan kesempatan
untuk mengurangi atau setidaknya mengoptimalkan beberapa biaya saat £ 11000000000 pada NHS.
Analisis langsung dari biofluids pasien (darah, urine atau air liur) menyediakan satu-satunya penilaian
ambigu kepatuhan terhadap obat yang diresepkan. Metode lain yang diakui penilaian dapat
menghasilkan informasi yang menyesatkan, misalnya, tablet dikumpulkan namun tidak dapat diambil,
ada jawaban optimis kuesioner dan pasien dapat menyesatkan dokter [12]. Sementara kedua analisis
urin dan air liur dapat digunakan untuk menunjukkan kepatuhan hubungan antara kedua waktu
menelan dan dosis yang diambil tidak bisa mudah dibentuk. Pekerjaan dilaporkan di sini menunjukkan
bahwa analisis kering Spots Darah (DBS) sampel, dikumpulkan dari jari tusukan invasif minimal, dapat
memberikan penilaian kuantitatif kepatuhan terhadap pengobatan. Keuntungan dari metode berbasis
DBS ditambah dengan peningkatan kemampuan instrumen analisis telah menyebabkan lonjakan dalam
penggunaan metodologi sampling ini untuk berbagai aplikasi [13,14].
 
Eksperimental
Menargetkan kardiovaskular (CV) obat
Pemilihan obat kardiovaskular tertentu diberitahu oleh diskusi dengan berlatih dokter dan survei resep
obat di Inggris. Obat-obatan diidentifikasi sebagai sering diresepkan obat CV di Inggris dan dipilih untuk
penelitian ini adalah:
• Bisoprolol beta blocker
• Ramipril ace inhibitor
• Simvastatin statin
• Amlodipine calcium channel blocker
• Doxazosin alpha blocker
• Valsartan blocker reseptor angiotensin.
 
Tabel 1 rincian farmakokinetik yang relevan (PK) informasi yang akan mempengaruhi kemampuan
deteksi yang diperlukan untuk penelitian ini. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki apakah
kehadiran obat target yang ditetapkan dapat dikonfirmasi dalam sampel darah dari relawan individu dan
oleh karena rentang dalam tanggapan dari kombinasi relawan / obat yang berbeda lebih penting
daripada nilai rata-rata. Secara khusus karena itu skenario terburuk, yaitu konsentrasi obat
kemungkinan terendah dalam sampel DBS, harus dipertimbangkan. Hal ini akan terjadi karena
kombinasi bioavailabilitas rendah, dosis rendah, eliminasi yang cepat (thalf pendek) dengan Cmax
rendah yang dikembangkan dalam waktu singkat (tmax). Dalam hal simvastatin ini akan menimbulkan
tantangan besar. Faktor utama lainnya yang mempengaruhi tingkat obat untuk dideteksi adalah waktu
tunda antara pasien mengambil obat dan penyediaan berikutnya dari sampel tempat darah.
 
Data pada (Tabel 1) menunjukkan konsentrasi obat dalam darah meningkat hingga maksimum (Cmax)
biasanya setelah waktu yang singkat (tmax) dan kemudian menurun secara eksponensial pada tingkat
diatur oleh thalf. Data ini biasanya berasal dari eksperimen berdasarkan dosis tunggal yang diberikan
kepada relawan yang sehat. Untuk relawan patuh jangka panjang kondisi 'steady state' berkembang di
mana kenaikan awal dalam konsentrasi kurang ditandai dan tingkat penurunan berkurang. Dalam
kondisi kepatuhan tingkat steady state, obat dalam darah, adalah tingkat minimum obat yang tersedia
untuk deteksi. Indikasi pasien non-kepatuhan akan berasal dari kombinasi tidak ada sinyal di atas tingkat
kebisingan alat dan bagian dari setidaknya 5 setengah-hidup pantang.

Sampel relawan
Pada tahap awal penyelidikan ini dua set relawan dipilih dari rekan diinformasikan:
• Kelompok yang secara rutin mengambil satu atau lebih obat-obatan sasaran
• Kelompok yang tidak ada obat yang diresepkan sasaran.
Para relawan di kelompok pertama, memberikan sampel darah pada waktu yang ditentukan
setelah minum obat yang dikenal untuk memberikan tes dikendalikan dari sistem deteksi. Analisis
sampel DBS dari kelompok kedua, relawan dikenal untuk mengambil tidak ada obat sasaran, digunakan
untuk menyediakan data referensi dasar untuk sampel uji coba. Mereplikasi (n = 5) ~ 30 ml darah
Volume sampel tempat dikumpulkan pada Whatmann 903 kertas sampel baik di laboratorium atau
relawan diri koleksi di rumah. Waktu tunda antara mengambil obat resep dan pengumpulan sampel DBS
tercatat. Setelah koleksi sampel dibiarkan kering di bawah kondisi ruangan selama minimal 2 jam dan
kemudian disegel dalam kantong plastik berisi dessicant.Selain a. Self-koleksi di rumah itu dipandang
sebagai langkah menuju penghematan biaya dibandingkan pengambilan sampel darah konvensional
cair. Relawan bersedia untuk mencoba pendekatan ini menghadiri sesi pelatihan laboratorium.
 
Bahan kimia dan bahan
Asetonitril, metanol dan air dari LC-MS kelas yang dibeli dari Sigma-Aldrich (Poole, UK). Bahan aktif
farmasi (API) Atenolol (R - (+), 99%), bisoprolol garam hemifumarate, ramipril, valsartan, amlodipine
besilate, simvastatin dan doxazosin mesilate juga dibeli dari Sigma-Aldrich (Poole, UK). Asam format,
botol auto-sampler dengan 250 ml menyisipkan dan topi botol yang dibeli dari Agilent Technologies
(Cheshire, Inggris). Koleksi spesimen kertas jenis 903, tabung mikro-centrifuge (1,5 ml), pipet volumetrik,
kiat-kiat pipet dan kantong plastik yang diperoleh dari Fisher Scientific (Loughborough, Inggris). Sebuah
8 mm diameter pukulan diperoleh dari Maun Industries Ltd (Nottingham, Inggris). Lithium heparin darah
dilapisi tabung koleksi yang dibeli dari International Scientifique Supplies Ltd (Bradford, Inggris). Darah
segar kosong diperoleh dari relawan informasi sejalan dengan De Montfort University Etika Protokol.
 
Analisis sampel
Persiapan larutan standar dan sampel darah berduri tempat untuk menghasilkan data kalibrasi untuk
penentuan kuantitatif telah rinci di tempat lain [2] dan tidak diduplikasi di sini. Sebuah 8 mm disc
dipukul dari pusat sampel DBS dan ditransfer ke 1,5 ml mikro-centrifuge tabung. Sebuah 150 ml pelarut
ekstraksi yang terdiri dari metanol / air (70:30, v / v) ditambah standar internal (20 ng / ml) ditambahkan
ke ini. Tabung sampel kemudian vortexed selama 1 menit dan disonikasi selama 30 menit. Mereka
kemudian disentrifugasi selama 10 menit pada 13,2 xg dan masing-masing ekstrak dipindahkan ke botol
auto-sampler untuk analisis dengan LC-HRMS.
 
Sistem LC-HRMS terdiri dari Agilent 1290 UPLC digabungkan ke Agilent 6530 QTOF spektrometer massa,
yang digunakan dalam TOF hanya modus. Obat Target dianalisis pada Zorbax Eclipse C18 resolusi cepat
kolom HD (Agilent Technologies, Cheshire, Inggris, 100 mm x 2,1 mm id, 1,8 m partikel ukuran pori) yang
didahului dengan filter 0,3 um inline (Agilent Technologies, Cheshire, Inggris). Kolom oven suhu
ditetapkan untuk 40 ° C. Volume injeksi sampel adalah 20 ml. Fase gerak terdiri dari air yang
mengandung 0,2% v / v asam format (eluen A) dan asetonitril mengandung 0,2% v / v asam format
(eluen B) dan disampaikan pada 0,6 ml / menit dengan elusi gradien. Fase gerak dimulai pada 5% B dan
dipelihara selama 0,5 menit sebelum meningkat menjadi 20% B dan kemudian ke 95% B 1,5 menit dan
berlangsung hingga 3,0 menit sebelum kembali ke 5% B. Program gradien elusi kemudian ditahan
selama 1,5 min untuk kembali menyeimbangkan kolom sebelum injeksi berikutnya. Spektrometer massa
dioperasikan dalam mode ion positif electrospray. MS sumber dan ruang kondisi yang dioptimalkan
untuk memberikan intensitas sinyal analit maksimum sebagai berikut: tegangan Fragmentor: 165V;
Skimmer: 65V; Suhu Gas: 350 ° C; Gas kering: 10 l / min; Nebuliser: 50,0 psig; Selubung Gas Suhu: 400 °
C; Selubung Gas Flow: 12 l / min. Mass Range: 100-1000 m / z; Rekaman Tingkat: 1 Hz. HRMS mengunci
massa referensi: 121.0508 m / z dan 922,00987 m / z. Pengambilan data dikendalikan oleh Software
Mass Hunter Workstation untuk versi TOF / Q-TOF B.04.00 (Agilent Technologies) dan data yang
diperoleh diolah dengan menggunakan Analisis Kualitatif B.04.00 dan software Analisis Kuantitatif
B.04.00 (Agilent Technologies). Kalibrasi eksternal dari spektrometer massa TOF dilakukan setiap hari
sebelum memulai analisis.

Pengesahan
 Sebuah validasi dari pendekatan ini, mengikuti pedoman internasional, termasuk data selektivitas,
linieritas, sensitivitas, intra dan akurasi antar-assay dan presisi telah diterbitkan [2].
 
Hasil dan Diskusi
Selektivitas
Sebelum analisis bisa dilakukan itu perlu untuk menentukan massa akurat dari analit sasaran dan
standar internal. Spektrum massa standar dalam kisaran full scan 100-1000 m / z diperoleh dengan
injeksi larutan multikomponen standar obat sasaran dan standar internal (20 ng / ml) dalam campuran
metanol dan air (70:30, v / v). Ion-ion yang paling intens di bawah kondisi operasi yang dipilih adalah:
 
               Obat m/z Spesies
 
               Bisoprolol 326.2326 MH +
 
               Ramipril 417.2384 MH +
 
               Simvastatin 441.2611 MNA +
 
               Amlodipine 431.1344 MNA +
 
               Doxazosin 452.1928 MH +
 
               Valsartan 436.2343 MH +
 
               Atenolol(IS) 267,1703 MH +
 
Gambar 1 menunjukkan Extracted Ion Kromatogram (EICs) untuk senyawa ini menggunakan massa yang
akurat sesuai. Jejak ini menunjukkan bahwa tidak ada gangguan pada saat retensi yang sama dari
masing-masing obat yang dikonfirmasi selektivitas yang baik dari metode ini.

Sampel relawan
Sampai saat ini total 488 sampel kombinasi yang berbeda dari relawan / target obat / waktu tunda
setelah dosis telah diterima dari sukarelawan minum obat termasuk 40 sampel dari para relawan tidak
diresepkan salah satu obat diselidiki dalam proyek ini. Penyelidikan analitis rutin melibatkan sampel
kosong, sampel awal, sampel kalibrasi dan sampel uji. Dalam penelitian ini sampel kosong adalah yang
disediakan oleh para relawan yang diketahui tidak akan mengambil salah satu obat-obatan subjek.
Sampel awal yang diperoleh dari relawan segera sebelum mereka mengambil dosis karena obat. Sampel
ini berhubungan dengan keterlambatan minimal 24 jam dan menunjukkan kemampuan deteksi pada
tingkat ini menghilangkan kemungkinan pelaporan negatif palsu. Sebuah output negatif palsu akan
terjadi jika sistem tidak dapat mendeteksi tingkat nyata dari obat ini target relawan patuh (Gambar 1).
 
Kualitas sampel: Dalam rangka untuk menyediakan data yang bisa digunakan sampel darah harus
seragam dan ukuran yang cukup untuk memberikan diameter 8mm disc menekan. Semua sampel
laboratorium yang dikumpulkan memenuhi persyaratan ini, tetapi 26 dari 135 sampel DBS yang
dikumpulkan di rumah yang tidak memuaskan. Bintik-bintik pada sampel yang tidak memuaskan yang
terlalu kecil atau dioleskan yang berarti sampel darah tidak seragam. Ini mewakili tingkat kegagalan 19%
untuk koleksi sampel rumah.
 
Contoh waktu tunda distribusi: Seperti bisa diduga, dengan asumsi sebagian besar relawan minum obat
mereka di pagi hari, sebagian besar sampel dikumpulkan dalam waktu 12 jam dari dosis yang diambil.
Lebih dari 60% dari sampel yang dikumpulkan dalam jangka waktu ini dan 26% memiliki delay waktu
antara 12 dan 18 jam. Waktu tunda untuk pengobatan simvastatin, diambil pada malam hari, itu baik
kurang dari 4 jam (50% dari sampel) atau lebih dari 16 jam (40% dari sampel) sesuai dengan periode
penundaan semalam. Periode lebih dari 24 jam berasal dari penundaan bijaksana dalam mengambil
dosis berikut. Hasil ini dirangkum dalam Tabel 2. Total keberhasilan fase ini dari penyelidikan adalah
bukti kedua kepatuhan tegas dari para relawan dan kinerja sistem di bawah modus operasi.
Pemeriksaan data untuk periode> 24 jam akan menunjukkan bahwa sementara ion yang tepat untuk
simvastatin yang terdeteksi pada tingkat yang terlihat akan menjadi di bawah batas kuantifikasi.
 
Penilaian kualitatif kepatuhan
Semua data diolah sebagai rasio area puncak untuk massa akurat tertentu dibagi dengan luas puncak
untuk standar internal dari ekstrak sampel yang sama. Pendekatan ini dirancang untuk mengurangi
variasi dalam tingkat yang sangat rendah terdeteksi, akibat perbedaan kecil dalam efisiensi ekstraksi dan
kondisi analitis. Sampel awal, yaitu orang-orang dengan penundaan antara 24 dan 25 jam semua
menunjukkan sinyal terdeteksi untuk semua API sasaran yang relevan bagi para relawan yang diketahui
mengambil obat-obatan tertentu. Hal ini akan diharapkan untuk pengguna obat biasa yang akan
mengembangkan tingkat 'steady state' obat target dalam darah. Dengan analisis kontras sampel dari
para relawan tidak mengambil salah satu obat-obatan (sampel kosong) tidak menghasilkan sinyal lebih
besar dari tingkat kebisingan pada waktu retensi diidentifikasi untuk menarik. Pengamatan ini
menegaskan baik kinerja pendekatan yaitu mengidentifikasi adanya obat sasaran dan juga bahwa tidak
ada spesies lain yang hadir yang dapat menyebabkan sinyal mengganggu. Semua sampel dari penganut
kontrol untuk obat menunjukkan adanya target obat yang diharapkan yang mungkin baik untuk
mengkonfirmasi kepatuhan yang baik atau yang mengetahui tes akan datang akan memastikan tindakan
yang tepat, mengambil obat, terjadi.

Deteksi kuantitatif dari target obat kardiovaskular

Pekerjaan kuantitatif yang telah dilakukan telah dilaporkan di tempat lain [2] dan telah divalidasi sesuai
dengan garis panduan Internasional tentang validasi metode Bioanalytical dengan rincian sebagai
berikut:
 • Kekhususan-baik untuk semua API diselidiki
• Variasi akurasi dan presisi kurang dari 15%
• Linearitas lebih baik dari 0,991
• Penentuan LOD biasanya lebih baik dari 1,0 ng / ml
• Bidang Pemulihan dari ~ 98% untuk bisoprolol untuk ~ 40% untuk simvastatin
• Efek Matrix <15%
• Sampel yang stabil selama 12 minggu.
 
Informasi kuantitatif tidak hanya menegaskan bahwa obat itu diambil, tetapi juga dapat menawarkan
tingkat lanjut dari penilaian kepatuhan yang tepat untuk petunjuk resep. Konsentrasi target obat CV
ditentukan dalam pekerjaan ini harus berhubungan dengan data pada Tabel 1 yang mengutip informasi
literatur tentang konsentrasi maksimum (Cmax / ng / ml) dari obat-obatan target dalam darah. Hasil
kuantitatif diperiksa dan dalam konsentrasi yang diukur adalah semua urutan yang sama seperti atau di
bawah tingkat Cmax dari Tabel 1. Dalam satu set ulangan tingkat ditentukan untuk konsentrasi
simvastatin adalah 50% lebih tinggi dari maksimum yang diharapkan. Tingkat tinggi ini menimbulkan
pertanyaan karena diketahui bahwa makan produk jeruk saat mengambil simvastatin harus dihentikan.
Dalam kondisi normal bioavailabilitas simvastatin hanya ~ 5% dengan sisanya yang dimetabolisme
sebelum dapat diserap ke dalam darah. Produk Grapefruit bersaing dengan jalur metabolisme ini dan
akibatnya tingkat simvastatin dalam darah dapat meningkat secara signifikan [21]. Ketika ditanya,
relawan menjelaskan bahwa ia mengambil semua pil pada waktu yang sama sehingga ia tidak
melupakan simvastatin yang harus diambil pada malam hari. Tidak ada bukti dari jeruk dalam diet tapi
salah satu obat CV yang lain dikenal memiliki efek yang sama pada metabolisme simvastatin. Di sini kita
memiliki contoh kemampuan untuk mengidentifikasi non-kepatuhan terhadap instruksi resep, sehingga
kesalahan pengobatan, yang hanya dapat diidentifikasi dari data kuantitatif.
Kesimpulan
Keuntungan menggunakan LC-HRMS analisis dari target obat CV dalam sampel DBS telah dibuktikan
untuk menilai kepatuhan terhadap pengobatan. Metode DBS yang dikembangkan berdasarkan benar
dinilai kepatuhan dalam pengaturan non-klinis dan selanjutnya sampel yang dikumpulkan di rumah
disediakan rute yang layak tetapi terbatas pada pengumpulan data yang berharga. Data kualitatif
memberikan penilaian cepat tetapi terbatas kepatuhan sedangkan data kuantitatif memungkinkan
bentuk yang kurang jelas non-kepatuhan untuk diidentifikasi. Hal ini penting untuk memastikan bahwa
batas deteksi untuk masing-masing obat sasaran CV bawah tingkat steady state untuk relawan patuh.