Professional Documents
Culture Documents
LP5: Culturile În Vitro
LP5: Culturile În Vitro
LP5: Culturile În Vitro
Culturile in vitro
2
Scurt istoric al culturilor in vitro
• - 1902 - Haberlandt proposed concept of in vitro cell culture • - 1964 - Guha and Maheshwari produced first haploid
• - 1904 - Hannig cultured embryos from several cruciferous species plants from pollen grains of Datura (Anther culture)
• - 1922 - Kolte and Robbins successfully cultured root and stem • - 1966 - Steward demonstrated totipotency by
tips respectively regenerating carrot plants from single cells of tomato
• - 1926 - Went discovered first plant growth hormone –Indole • - 1970 - Power et al. successfully achieved protoplast
acetic acid fusion
• - 1934 - White introduced vitamin B as growth supplement in • - 1971 - Takebe et al.regenerated first plants
tissue culture media for tomato root tip
from protoplasts
• - 1939 - Gautheret, White and Nobecourt established
• - 1972 - Carlson produced first interspecific hybrid of
endless proliferation of callus cultures
Nicotiana tabacum by protoplast fusion
• - 1941 - Overbeek was first to add coconut milk for cell division in
Datura • - 1974 – Reinhard introduced biotransformation in
plant tissue cultures
• - 1946 - Ball raised whole plants of Lupinus by shoot tip culture
• - 1977 - Chilton et al. successfully integrated Ti
• - 1954 - Muir was first to break callus tissues into single cells
plasmid DNA from Agrobacterium tumefaciens in
• - 1955 - Skoog and Miller discovered kinetin as cell division hormone plants
• - 1957 - Skoog and Miller gave concept of hormonal control • - 1978- Melchers et al. carried out somatic hybridization
(auxin: cytokinin) of organ formation of tomato and potato resulting in pomato
• - 1959 - Reinert and Steward regenerated embryos from • - 1981- Larkin and Scowcroft introduced the
callus clumps and cell suspension of carrot (Daucus carota)
term somaclonal variation
• - 1960 - Cocking was first to isolate protoplast by enzymatic
degradation of cell wall • - 1983 - Pelletier et al.conducted intergeneric cytoplasmic
hybridization in Radish and Grape
• - 1960 - Bergmann filtered cell suspension and isolated single cells
by plating • - 1984 - Horsh et al. developed transgenic tobacco
• - 1960 - Kanta and Maheshwari developed test tube by transformation with Agrobacterium
fertilization technique • - 1987 - Klien et al. developed biolistic gene transfer
• - 1962 - Murashige and Skoog developed MS medium with method for plant transformation
higher salt concentration • - 2005 - Rice genome sequenced under International
Rice Genome Sequencing Project
Plant Tissue Culture: Current Status and Opportunities,
Altaf Hussain, Iqbal Ahmed Qarshi, Hummera Nazir and Ikram Ullah,
Exemple de culturi “in vitro” :
4
Termeni frecvent utilizaţi în culturile in vitro de ţesuturi
Altaf Hussain, Iqbal Ahmed Qarshi, Hummera Nazir and Ikram Ullah,
Recent Advances in Plant in vitro Culture
ISBN 978-953-51-0787-3, 2012, Publisher: InTech
Termen Semnifica
ţie
Adventitious development of organs such as buds, leaves, roots, shoots and somatic embryos from shoot and root tissues and callus
Aseptic technique procedures used to prevent the introduction of microorganisms such as fungi, bacteria, viruses and phytoplasmas into
cell, tissue and organ cultures, and cross contamination of cultures
Axenic culture a culture without foreign or undesired life forms but may include the deliberate co-culture with different types of cells,
tissues or organisms
Callus an unorganized mass of differentiated plant cells
Cell culture culture of cells or their maintenance in vitro including the culture of single cells
Chemically defined a nutritive solution or substrate for culturing cells in which each component is specified
medium
Clonal propagation asexual multiplication of plants from a single individual or explant
Clones a group of plants propagated from vegetative parts, which have been derived by repeated propagation from a single
individual. Clones are considered to be genetically uniform
Termen Semnifica
ţie
Ex vitro organisms removed from tissue culture and transplanted; generally plants to soil or potting mixture.
Hormone generally naturally occurring chemicals that strongly affect plant growth
Laminar Flow Hood an enclosed work area where the air is cleaned using HEPA filters
Meristem a group of undifferentiated cells situated at the tips of shoots, buds and roots, which divide actively and give rise to
tissue and organs
Micropropagation multiplication of plants from vegetative parts by using tissue culture nutrient medium
Propagule a portion of an organism (shoot, leaf, callus, etc.) used for propagation
Somatic embryos non-zygotic bipolar embryo-like structures obtained from somatic cells
Subculture the aseptic division and transfer of a culture or portion of that culture to a fresh synthetic media
Tissue culture in vitro culture of cells, tissues, organs and plants under aseptic conditions on synthetic media
• BAP 6 - Benzylaminopurine
• 2,4 D - 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
• EDTA - Ethylenediaminetetraacetic acid
• EtOH - Ethanol
• GA3 - Gibberellic acid
• IAA - Indole-3-acetic acid
• IBA - lndole-3-butyric acid
• NAA - Naphthaleneacetic acid
• KN - Kinetin
Mediul de cultură MS (Murashige, T. & F. Skoog)
I II III
Mediu cultură Mediu cultură
pentru alge pentru rădăcini
(Uspenski, (White, 1943)
1927)
Mediu nutritiv cu
săruri minerale
(Knop, 1865) Mediu cultură
pentru calus
(Gautheret, 1939)
U s p e n s k i E. E. (1927), Eisen als Faktor für die Verbreitung Gautheret, R. (1939). Sur la possibilité de réaliser la culture indéfinie des
niederer Wasserpflanzen, Pflanzenforschung, 9, Jena, citat de tissues de tubercules de carotte. C. R. Soc. Biol. Paris 208: 118–120, citat
Stefan GUMINSKI, în OUTLINE OF THE HISTORY OF STUDIES de Ian M. Sussex, în THE SCIENTIFIC ROOTS OF MODERN PLANT
ON THE EFFECT OF HUMIC COMPOUNDS ON ALGAE BIOTECHNOLOGY, The Plant Cell, 2008 vol. 20 no. 5 1189-1198
Oceanologia, 17 (1983), PL ISSN 0078-3234
Compoziţia de bază a mediilor de cultură
Macro- MS G5 LM VW Km NN
elemen W M
te Murashige Gambo Lloyd şi Vacin şi Kudson Nitsch şi
White Mitra el
şi Skoog rg et McCown Went modific Nitsch
mg.l1- all. at
all.
Ca3(PO4)2 200.0
Na2SO4 200.0
KCl 65.0
K2SO4 990.0
Abobkar I. M. Saad and Ahmed M. Elshahed, în Plant Tissue Culture Media, Recent Advances in Plant in vitro
Culture, 2012, Publisher: InTech, www.intechopen.com/../recent-advances-in-plant-in-vitro-culture
Exemple de medii de cultură
Micro- MS G5 LM VW Km NN
elemen W M
te Murashige Gambo Lloyd şi Vacin şi Kudson Nitsch şi
White Mitra el
şi Skoog rg et McCown Went modific Nitsch
mg.l1- all. at
all.
Co(NO3)2.6H2 0.05
O
2O
Exemple de medii de cultură
Vitamine
, alte MS G5 W LM VW Km M NN
suplimen Murashige Gambo Lloyd şi Vacin şi Kudson Nitsch şi
te mg.l1- White Mitra el
şi Skoog rg et McCown Went modific Nitsch
all.
all. at
Ca- 1.0
panthothen
ate
Celula somatica?
Somaclona?
Hibridul somatic?
Embriocultura? = cultura de embrioni imaturi
Celula somatica? = toate celulele corpului (cu excepția celor sexuale). Este diploidă,
având 2n cromozomi.
DIRECTĂ :
celule/ţesuturi ale explantelor -> embrioni
INDIRECTĂ:
celule ale explantelor -> calus/suspensie celulară -> embrioni somatici
a1 a2
a1. Recoltarea şi fragmentarea
embrionilor imaturi din ovule
h b
a2. Prelevarea de explante din alte
organe ale plantelor (ex. frunze)
Bars represent, in (A–D) 10 μm, in (E) 250 μm, in (F,G) 50 μm, in (H) 100 μm, in (I) 1mm. 14
• Iniţierea embriogenezei are loc artificial
?
gaburi@uaiasi.ro
LP7: Hibridarea somatica
Fuzionarea protoplastilor
Embriogeneza somatica ?
Hibridarea somatica ?
2
Embriogeneza somatica :
3
Denumire/definiţii
În biologia modernă:
Termen introdus de Hanstein în 1880
4
Lipsa peretelui celular
Semipermeabilitate selectivă
Formă sferică
Capacitate de a fuziona
Capacitate de regenerare a
peretelui celular (totipotenţă)
5
W.P. Armstrong, 2012
http://waynesword.palomar.edu/lmexer1.htm#elodea
6
1. Izolarea protoplaştilor
mecanică enzimatic
ă
2. Purificarea protoplaştilor
Filtra Purifica Spăla
re re re
3. Fuziunea protoplaştilor
• frunze tinere
• apexuri
• rădăcini
• fructe
• petale
• coleoptile
• cotiledoane
• noduri rădăcini
• meristeme embrionare
• suspensii celulare embriogene
9
Klercker, 1892, citat de Cocking, 1972 Protoplast isolation flowchart for the cutting method
- http://www.slideshare.net/shivam_hayabusa/protoplast- (upper) and the Tape-Arabidopsis Sandwich method (lower).
culture Wu et al. Plant Methods 2009 5:16 doi:10.1186/1746-4811-5-
- http://nptel.ac.in/courses/102103016/module1/lec12/10.html 16
10
Bazată pe principiul plasmolizei în
soluţie hipertonică
-În anul 1892, Klercker izolează pentru prima dată protoplaşti,
prin metoda mecanică;
PLASMOLÍZĂ, plasmolize, s.f. (Bot.)
Fenomen de contracţie si de - Limbul frunzei a fost imersat într-o soluţie hipertonică de
desfacere a citoplasmei, provocat de manitol (13%), ce a indus plasmoliza;
pierderea apei din ţesutul vegetal viu.
(Din fr. Plasmolyse, dex98) - Limbul frunzei, rămas în continuare în soluţie, după
plasmoliza completă, a fost secţionat cu un bisturiu foarte bine
ascuţit;
Dezavantaje
- Aplicabilă doar ţesuturilor cu - Unor celule le-a fost secţionat doar peretele celular, rezultând
celule puternic vacuolate protoplaşti integri; multor celule le-a fost afectat întreg
conţinutul, în încercarea de a secţiona peretele celular;
- Rezultă un număr redus de
protoplasti - Protoplaştii prinşi în celule au fost “încurajaţi” să iasă în afară
prin reducerea uşoară a osmolarităţii (concentraţiei soluţiei), ce
- Este un proces laborios şi
a forţat protoplaştii să se umfle (să-şi mărească volumul) şi să
foarte meticulos (chiar plicticos)
iasă la suprafaţa limbului secţionat;
- Protoplaştii obţinuţi au o
-Protoplaştii obţinuţi au fost separaţi de cei distruşi şi de
viabilitate scăzută
rămăşiţele de ţesut vegetal
11
- Utilizată pentru
variate ţesuturi şi
organe
- Rezultă un număr
ridicat de protoplaşti
- Viabilitate ridicată a
protoplaştilor
12
• In 1960, E.C. Cocking demonstrează posibilitatea izolării
enzimatice a unui număr ridicat de protoplaşti din celulele
plantelor superioare, după următoarea metodă:
- sterilizarea frunzelor
- desprinderea epidermei inferioare a frunzelor
- introducerea frunzelor în soluţie cu un amestec de enzime
pentru plasmoliză
- izolarea/recoltarea protoplaştilor
A. Hidroliza enzimatică secvenţială , cu mai multe
etape, sequential isolation):
1. Soluţie cu o enzimă de macerare (pectinază , macerozină,
pectolyase)
2. Spălare cu soluţie CPW liberă de
enzime 3.Centrifugare uşoară, 100 g
4. Separarea peleţilor şi resuspendarea într-o soluţie cu o enzimă
care hidrolizează resturile pereţilor celulari (celulază sau
hemicelulază)
5. Spălarea cu CPW pentru eliminarea resturilor.
B. Hidroliza enzimatică mixtă , cu o singură etapă,
mixed enzymatic approach)
• 1. Ţesutul vegetal este plasmolizat în prezenţa unui amestec
de două enzime, pectinază şi celulază, astfel că au loc simultan
procesele de separare a celulelor şi de degradare a peretelui
celular
Protoplasts
CPW-Cocking, Peberdy and White –Cell Washing and 13% mannitol
13
Protoplast Isolation and Regeneration
http://nptel.ac.in/courses/102103016/module1/lec12/1.html
Fuzionarea protoplastilor – PURIFICAREA PROTOPLAŞTILOR
Filtrare
Centrifugare
Spălare
• 6-18 ore de incubare a materialului
vegetal în soluţia enzimatică;
(H)
separarea protoplaştilor
(I)
soluţie osmotică cu o concentraţie identică celei din
soluţia
(J)
(solidă, în partea superioară = peleţi de protoplaşti)
(K)
cu o pipetă şi centrifugat din
(L)
de cultură, cu o anume densitate a protoplaştilor
(după o prealabilă analiză a densităţii cu
Protoplast Isolation and Regeneration
http://nptel.ac.in/courses/102103016/module1/lec12/1.html
Hemocitometru
http://bpsstaging.com/bitesizebio/13687/cell-counting-with-a-
hemocytometer-easy-as-1-2-3/ http://www.appstate.edu/~rosea/pmb.html
• HIBRIDĂRI SOMATICE ÎNTRE SPECII ÎNDEPĂRTATE = HIBRIZI SOMATICI (fertili
sau sterili, poliploizi) şi CIBRIZI
Protoplast fusion for production of tetraploids and triploids: applications for scion and rootstock breeding in citrus. Jude W.
Grosser • Fred G. Gmitter Jr, Published online: September 2010, Springer Science+Business Media B.V. 2010
B. Indusă prin diferite metode, cu scopul obţinerii de heterokarioni sau hibrizi somatici:
• 1. mecanice
• 2. chimice: NaNO3, high Ca2+, polyethylene glycol (PEG),
• 3. fizice: stimuli electrici
a.Celule binucleate =
heterokarioni sau heterocite
• Protoplast vegetal
• Izolare protoplaşti vegetali
• Cultură de protoplaşti
• Fuziunea protoplaştilor sau hibridarea somatică
• Hibrid somatic simetric
• Hibrid somatic asimetric (cybrid)
?
gaburi@uaiasi.ro
LP8: Inginerie genetică (I)
1. ETAPA PREŞTIINŢIFICĂ( . -> 1865)
• primele observaţii corecte privind agregarea familială şi transmiterea ereditară a unor boli
(hemofilie, polidactilie, albinism);
• numeroase interpretări erau însă eronate. Se caracterizează prin lipsa cunoştinţelor privind
procesele debază (concepţie, reproducere etc), eludarea analizei şi absenţa unei teorii generale,
convingătoare, care să explice fenomenele ereditare.
2. ETAPA FUNDAMENTĂRII GENETICII CA STIINŢĂ ŞI INTRODUCERII SALE ÎN MEDICINĂ (1865-1960)
• Gregor Mendel (1865): conceptul genei şi formulează legile eredităţii;
• T. H. Morgan: teoria cromosomică a eredităţii; Lucrari stiintifice: Mecanismul Eredității
Mendeliene (1915), Teoria Genelor (1926);
• F. Galton (1890): introduce conceptul interacţiunii dintre ereditate şi mediu;
• Era geneticii moleculare: demonstrarea rolului genetic al ADN (Avery et al. 1944) şi descoperirea
modelului structurii ADN (Watson şi Crick, 1953).
Metode directe
1. Metoda “biolistics”
2. Transformarea protoplastelor
a. Microinjectarea
b. Electroporarea
c. sonicarea
3. Electroforeza
4. Utilizarea fibrelor de carbora de siliciu
Metode indirecte – TRANSFORMAREA MEDIATA
Metode:
4. Transferul genei
https://www.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna- 15
cloning-tutorial/a/restriction-enzymes-dna-ligase
Molecula monocatenară de ARN mesager serveşte ca matriţă pentru sinteza unei
catene de ADN complementar (ADNc) realizată de enzima transcriptază inversă.
Astfel se obţine o moleculă ADNc bicatenar care va corespunde genei (mai exact
exonilor din genă) care în celulă a produs (prin transcripţie) ARNm ce a servit ca
matriţă pentru ADNc. În acest mod s-a sintetizat pentru prima dată gena pentru beta
globină.
Metoda se bazează pe polimerizarea
deoxiribonucleotidelor ce alcătuiesc o
catenă de ADN, într-o ordine prestabilita
̆/determinată anterior. Ea se deduce pe
baza secvenţei de aminoacizi a proteinei
codificată de genă, cu ajutorul codului
genetic, care stabileşte pentru fiecare
aminoacid codonul (trinucleotidul)
corespunzător. Alteori, secvenţa de
nucleotide a genei ce va fi sintetizată se
stabileşte prin alte metode. Această
tehnică se foloseşte mai des pentru
obţinerea unor oligonucleotide
corespunzătoare unei părţi din genă,
utilizate fie ca sonde fie ca amorse, în alte
tehnici de analiză moleculară.
Clonarea ADN in vivo utilizează mecanismul natural de replicare al ADN în celule şi
implică patru etape majore:
Vectorii
- un vector este o moleculă naturală de ADN utilizată pentru transportul
secvenţelor de ADN exogen într-o celulă gazdă. El trebuie să fie capabil să se
replice activ şi independent de genomul gazdei (de aceea se mai numeşte şI
replicon), din care apoi va fi izolat în formă pură.
(1) Plasmidele - se găsesc natural în bacterii, cărora le conferă rezistenţa la diferite antibiotice şi metale grele. Ele suntalcătuite dintr-o
moleculă mică (de circa 2-5 Kb) de ADN bicatenar circular extracromosomial, care se replicăcomplet independent de cromosomul
bacterian. Prezintă un situs de iniţiere a replicării (origine) şi unul sau maimulţi markeri de selecţie (de obicei gene care conferă rezistenţă
la antibiotice). Au un situs unic de restricţie (situatîntr-o genă de"selecţie") unde poate fi inserat un fragment de ADN exogen (de la circa
1 Kb, până la maximum 10kb) rezultând unplasmid recombinant.
(2) Bacteriofagii (sau pe scurt fagii) sunt virusuri care infectează şi distrug bacteriile. Ei posedă un sistem de penetrarea bacteriei în care
îşi introduc ADN; se se replică autonom, rapid şi intens (circa un milion de copii). Multiplicareafagului în bacterie16se traduce după un
timp, prin liza ei. În tehnicile de ADN recombinant se folosesc în specialfagii lambda (λ) ce atacă E. coli. ADN fagic bicatenar şi linear, de
aproximativ 45 Kb, este"împachetat" în capsula virusului. El posedă două extremităţi coezive /adezive, numitecos(care
permitcircularizarea ADN fagic pătruns în bacterie) şi un "fragment intern", neesenţial pentru replicare, care poate fidecupat şi înlocuit cu
o moleculă de ADN exogen (10-20 Kb), formând fagi recombinanţi. Pe culturide geloză fagii recombinaţi se recunosc prin plaje de liză, pe
un "covor" bacterian.
(3) Cosmidele sunt vectori artificiali constituiţi dintr-un plasmid clasic la care s-au adăugat secvenţele cos ale faguluilambda, secvenţe
care permit împachetarea unor segmente de ADN exogen mai lungi decât în fagi. Cosmidele funcţionează iniţial ca nişte fagi şi după
infecţia bacteriei aceşti pseudofagi se recircularizează şi sereplică ca un plasmid, dar mult mai lent, fiind şi mult mai mari. Avantajul
cosmidelor este că permit inserţia şiclonarea unor fragmente foarte lungi de ADN (până la 50 Kb).
(4) "Cromosomii artificiali bacterieni (BACs)” derivă din plasmidul de fertilitate din E.Coli şi este capabil să incorporeze fragmente de
ADN până la 300 kb.
(5) " Cromosomii artificiali de levuri (YACs de la yeast artificial chromosomes) sunt plasmide care posedă centromerul şi telomerele
originale, elementele necesare replicării şi segregării mitotice a cromosomilor în celedouă celule fiice de Saccharomyces cereviseae
(drojdia folosită în brutării). În rest cromatidele YAC vor fi alcătuitedin ADN exogen. După "fabricare" cromosomii artificiali sunt introduşi
în levuri şi se comportă ca şicromosomii normali. YAC poate încorpora fragmente foarte mari de ADN (până la 1000 Kb) şi permite
replicarea ADN de eucariote cu secvenţe repetitive de ADN. Totuşi multe gene umane au mărimi de 2-3 Mb şi în acestecazuri analiza lor cu
vectorii convenţionali necesită clonarea unor fragmente suprapuse de genă, din care să se reconstituie ulterior secevnţa originală şi
integrală a genei.
(6) Alţi vectori. În afara celor patru tipuri principale de vectori de clonare, în cazuri speciale, se folosesc şi alte tipuride vectori.Vectorii
"navetă", destinaţi a fi utilizaţi şi la procariote şi la eucariote. Ei pot introduce o secvenţă de ADN în celulele eucariote (transfecţie), care
ulterior va fi recuperată prin clonaj într-o bacterie, în scopul studieiimodificările pe care le-a suferit în celula eucariotă."Vectori de
expresie". Unii vectori sunt prelucraţi într-un modparticular adăugându-li-se, în vecinătatea situsului de inserţie a ADN exogen,
semnalele necesare transcripţiei.Aceşti vectori pot funcţiona în bacterii sau drojdii determinând sinteza proteinei corespunzătoare genei
pe care oconţin."Vectorii virali"pentru celulele eucariote sunt retrovirusurile, adenovirusurile, virusul SV 40 şi virusurile detip Herpes.
Sunt folosiţi în experienţe de introducere (încorporare) a ADN în celule eucariote numite generic transfecţie.
Clonarea ADN in vivo utilizează mecanismul natural de replicare al ADN în celule şi
implică patru etape majore:
http://med.stanford.edu/allergyandasthma/news/news-from-our-center/crispr.html
Metode indirecte – TRANSFORMAREA MEDIATA
Metode directe
1. Metoda “biolistics”
2. Transformarea protoplastelor
a. Microinjectarea
b. Electroporarea
c. sonicarea
3. Electroforeza
4. Utilizarea fibrelor de carbora de siliciu
Metoda biolistică (“biolistics”) sau “particle gun”, de împuşcare directă a ADN în
ţesuturi ţintă este o metodă de transformare genetică a plantelor foarte rapida.
37
după Songstad şi colab., 1995
Transformarea genetică prin această tehnologie este relativ simplă, constând în
vortexarea (agitarea) ţesuturilor împreună cu ADN şi fibre de carbură de siliciu.
Astfel, fibrele penetreaza ̆ pereţii celulari
permiţând ADN sa ̆ pătrunda ̆ în citoplasmă.
Organismele modificate genetic (OMG)
www.ucsusa.org/.../
pharmcorn_plate.jpg http://www.sathguru.com/images/agri-
and-food-biotechnology.jpg
Ameliorarea conventionala vs Organisme modificate genetic (OMG)
SIGUR NESIGUR
Ameliorarea conventionala vs Organisme modificate genetic (OMG)
HibridareMutagenezaIncrucisari
Poliploidizareinterspecifice
OMG CRISPR
Gene
afectate
3
Ameliorarea conventionala vs Organisme modificate genetic (OMG)
Ameliorarea conventionala:
Desmembrez ambele masini, pana la ultima piesa, si le reansamblez amestecand totul.
Dupa SELECTIE aleg masina care are sistemul radio/audio.
OMG:
Iau sistemul radio/audio din masina veche si il instalez in masina noua.
Ameliorarea conventionala vs Organisme modificate genetic (OMG)
bob.usuhs.mil/biochem/nutrition/ images/keratomalacia-1.jpg
Exemple de OMG: Golden Rice
GGDP vitamin-A
GGPP
Phytoene synthase (psy)
(daffodil)
Phytoene Problem:
Rice Phytoene desaturase (crtl)
lacks
Program these enzymes
Funding:
Rockefeller Lycopene
Foundation,
Swiss Federal
Institute
Of Technology,
European
Community beta-Carotene
Biotech
= (bacteria)
prov
Lycopene ß-cyclase (lcy)
itam
in A (daffodil)
Exemple de OMG: Tomatele FLAVR SAVR
Problema:
FlavrSavr is discontinued
as gene has been inserted to cultivar that lacked
consistent production qualities
Exemple de OMG: PLANTE TRANSGENICE TOLERANTE LA ERBICIDE
Erbicide non-selective
(Roundup Ultra si Liberty)
Roundup® (chemical name: glyphosate)
Liberty® (glufosinate).
Roundup Ready® and
Liberty Link®
transgenic varieties
of common crops
are completely resistant
to those herbicides
(Finale, Basta, Ignite)
Exemple de OMG: PLANTE TRANSGENICE TOLERANTE LA ERBICIDE
RoundUP
Culturi:
Soia Roundup Ready (RR) poseda o gena transferata de la E. coli
Porumbul RR poseda o gena EPSP transferata la porumb
+ Glyphosate
X
Plant
EPSP
synthase
Fara
X
3-Enolpyruvyl shikimic acid-5-phosphate
(EPSP)
nuaminoacizi, planta
supravetuieste
X
X
Ar omatic
Cazul 2: Plante rezistente la Roundup
Shikimic acid + Phosphoenol pyruvate
+ Glyphosate
Pierderile globale cauzate de insecte s-ar putea ridica anual la 4000 de md. dolari (daca nu s-ar
aplica nici o masura de combatere) actualmente fiind de aprox. 100 md.
Strategia: gene din bacteria de sol Bacillus thuringiensis (Bt). In conditii de stres bacteria formeaza
un endospor. Celula bacteriana se degradeaza eliberandu-se sporul si cristalul. Insectele ingereaza
cristalele proteice, iar proteina este fragmentata in doua de enzimele din aparatul digestiv.
Endotoxina formeaza un complex cu receptori specifici cu membrane epiteliului intestinal.
Exemple de OMG: Bumbac Bt
Source: USDA
Normal Transgenic
transgene = Bt protein
Exemple de OMG: tomate transgenice la Sclerotinia
Transgenic Wild-type
Exemple de OMG: Banana afectate de Xanthomonas Wilt (BXW)
Xanthomonas campestris
- 2001 in Ethiopia
- 2010 toata regiunea Great Lakes (East Africa)
Tripathi, L., Mwaka, H., Tripathi, J.N. and Tushemereirwe, W. 2010. Expression of sweet
pepper Hrap gene in banana enhances resistance to Xanthomonas campestris pv.
musacearum. Molecular Plant Pathology.
Mediawatch on the first results of a field trial of Xanthomonas wilt resistant GM bananas,
published 26 September 2014.
OMG: Argumente impotriva cultivarii
Reactii alergice
Unii oameni cred că alimentele cu OMG au un potențial mai mare de a declanșa reacții alergice. Acest lucru se datorează faptului că
acestea pot conține gene de la un alergen - un aliment care provoacă o reacție alergică.
Organizația Mondială a Sănătății (OMS) descurajează inginerii genetici să utilizeze ADN-ul de la alergen, cu excepția cazului în care pot
dovedi că genele însăși nu provoacă această problemă.
Este de remarcat faptul că nu au existat rapoarte privind efectele alergice ale oricărui produs alimentar modificat genetic prezent în
prezent pe piață.
Cancer
Unii cercetători cred OMG pot contribui la dezvoltarea cancerului. Ei susțin că, deoarece boala este cauzată de mutații în ADN, este
periculoasă introducerea de noi gene în organism.
Societatea Americana pentru Cancer (ACS) a spus ca nu exista nici o dovada pentru aceasta. Cu toate acestea, aceștia observă că nici o
dovadă de vătămare nu este aceeași cu dovada siguranței și că obținerea unei concluzii necesită mai multă cercetare.
Rezistență antibacteriană
Există îngrijorarea că modificarea genetică, care poate stimula rezistența culturii la boală sau poate face mai tolerantă la erbicide, ar
putea afecta capacitatea oamenilor de a se apăra împotriva bolilor.
Există o mică șansă ca genele din produsele alimentare să poată transfera în celule celulele sau bacteriile din intestin. Unele plante OMG
conțin gene care le fac rezistente la anumite antibiotice. Această rezistență ar putea fi transmisă oamenilor.
Există o îngrijorare crescândă la nivel global că oamenii devin tot mai rezistenți la antibiotice. Există șanse ca alimentele modificate
genetic să contribuie la această criză.
OMS au spus că riscul transferului de gene este scăzut. Cu toate acestea, ca măsură de precauție, acesta a stabilit orientări pentru
producătorii de alimente cu OMG.
Majoritatea vegetalelor au
continut ridicat de pesticide
LP10. Extracția ADN-ului genomic
Science 2018, Vol 362, Issue 6413
Genotip = totalitatea materialului genetic al unui organism.
Gena = secventa de nucleotide care contine informatia necesara sintezei unei proteine
sau a unei molecule de ARN.
Codon = o succesiune de 3 nucleotide sau baze azotate (ex. ATG, CGT etc) care codifica
un aminoacid (64 codoni).
1912 Fizicianul Sir William Henry Bragg, și fiul său, Sir William Lawrence Bragg
• descoperă că pot deduce structura atomică a cristalelor din modelele lor de
difracție cu raze X.
ADN
ARN
Proteina
!!!!! 4 nucleotide (ATCG) => 64 codoni (serie de 3 nucleotide) => 20 aminoacizi
STOP
START
Gena = secventa de nucleotide care contine informatia necesara sintezei unei proteine
ATG….exon.…AAAGTT…exon…AATCGT…exon….TAA
START STOP
ATG….exon.…AAAGT-intron-AGGTT…exon…AATGT-intron-AGCGT…exon….TAA
ATG….exon.…AAAGTT…exon…AATCGT…exon….TAA
Proteina
In general, la eucariote 1-2% din genom este alcatuit din gene.
Ex: La H. sapiens, 98% din genom contine secvente non-codificatoare.
>BnaA01g00030D
ATGGCGGAGGAAGACGTGTCGCGCAATTTCCGAGCCCTGGTGGAGAACGCGGACCGCAAGTTCGCGAGAGTCCG
CGATCTCCCGGCCTTCGGGCGAGCGCAGAGCCACTACTTCCACAAGGTCTTCAAGGCCTACATGAAGCTCTGGAAT
TACCAGCAGTCCCACCGGCCCAAGCTCGTCGCGTCGGGGCTGAACCGGTGGGAGATCGGCGAGATCGCGAGCCG
GATTGGGCAGCTCTACTTCAGCCAGTACATGAGGACCAGCGAGGCTCGCTTCCTCCTCGAGTCCTACGTCTTCTAC
GAGGCCATTCTCAAGCGGAGGTACTTCGAGGAAGGGGAGGAGAGGAAGGATCTCAGCGCGAGGTCCAAGGAGCT
GAGGTTCTACGCGAGGTTCTTGCTCGTTGCGTTGATTGTTGATCGGAGGGAGATGGTTTTGCACTTGGCTGAGAAG
CTTAGGGCTTTGGTTGATGACAGCAAGTCTAATTTTAGGGTAAAAGATTTAATCTTTTTGATTTGAGGCTTTTGAGAAT
TGAGCCTCTGGTTGAATAAAGTTTTGATCTTTTGGTGCAGGAGACCAACTTTAAGGAGTGGAGGATAGTTGTGCAAG
AGATCACTCGGTTTACTAAAGCTGACGTGGACTTAACTTATGTCAGGCCGCTTCGTTACTGCGCTATGCTTGATTCCT
ATCCAGCTTCTCACACGTACCTAGCGAGGTTCCACGCTAAGAAGCTCTTCAAGTTTCGTGATGCTCTATTAGCTAGCT
ATCACCGTAACGAGGTAAGCATTAAACAAGCAGTGTTTTGTTTTTATTGAACCTAAGATTCATACGCTGTGGCCTTTGT
AATCATTTAGGTGAAATACGCTGAAGTGACGTTGGATACGTATAGAATGATGCAGTGTTTAGAGTGGGAGCCTAGTGG
GTCTTTTTACCAGAAGCGGCCTGTTGAGACGAAAGAGAATGGCTTTGTGGTTGATCATACGCTGACTTCTGGGATTA
TAGATATGAAATTGGCTGCTGATATGGCTGATCCGTCGTTACCTCCTAATCCTAGGAAGGCAGTTCTTTATCGTCCCAC
AGTCTCTCACTTGCTTGCGGTGAGTTTTTTTTTTATCTGTTTCATATAGGAAAATAATCTTTAGGAGTTTCTGATTTTTTT
TTCCTTTATATATGTTCAGGTCTTGGCGATGATCTGTGATGAGCTCTCTCCAGAGTGTGTGATGCTGATATATCTATCG
GCTTCAGGTTTAGTTTTTTTTTTGTTGTCACTTTGGAACTTCTTGATGTTAACATGGTGACGGTTATCCAGGTGGTCCT
GCTGCTCGTGAGAATGTTGCGCAACCGGAGAACGCTGTCGGTTCAAGCAGAACATCAAAAAGCAAGCTGCTTGGC
CGAGCTTCCCAAGAGCAGAAGAGTTACAAGTCAGAACCTCTTAGCAACGGACACAAATCTTCTGGGGGTTATTATGA
TGATTATCTTTGGTTAGGTCCTAGAGGAGGCTCTGGTAAGTTGTTTTCCTCGGATTTACATTGTTATATGTCTCCAGTG
GGCAGTGAATGAGCAGACTTTTCTCGCTCACTGTCTTGTTTTTTTTTGTTTTCAGGTTCAAACAACCTTTACCCTGGT
GATCTAATACCTTTTACAAGGAAACCGCTTTTCTTGGTCATTGATAGCGACACTAGCCGAGCATTCAAGGCAGGTTTG
TCCTAACTTAGTCTTATCATTCTCTCAGGAGATTCTTATAGTTGTTCTTTGTCACTGTGCGATATTGGCTAACGGATTGT
GAGCTTCAGGTTTTGAATGGTGCAGAGAGAGGGGAGCCTGTTGCTCTACTTCTTTCTCCTCTGAAGCCATCTCTGGA
GAACCCATCTGCTGATGATACAGCAGCAGCATTAAACGGAAGCCAGTTTACTTTTTTCTTGACAGCTCCTTTACAAGC
ATTCTGTCAAATGCTGGGCCTCTCGAACTCGGATCCCGAACCTGTAAGTACCTTAAATGAAGCAAAGCATATGTTATC
ATGATGTGGTGGCATTGCTTCTTACCATCTTGATCACATATCTTCAGGAGGTTTATGATGAAGCAGAGAGCATACTATC
TGCTTCTTTCTCTGAGTGGGAAACGATCCTCCTGACTTCCAAAGTGTTGAATCTTGTCTGGGCTCAGGTCTTGCCTG
13
ATCAGTTCTTGAGACGGCTGATTCTCAGTAA
MATERIALE
• 10 ml apă distilată
• sare (10%)
• 10 ml săpun sau lichid de spălat vase
• Iso-propanol sau Et-OH 96%
• filtru
• plăci Petri
• pipetă
• tuburi Eppendorf (1.5 ml)
• tuburi Falcon (10/50ml)
• vas Erlinmeyer (50ml)
• pungă resigilabilă
Etape (1/2):
Puneți filtrul într-un vas Erlinmeyer (50ml) cu sticlă limpede, fixând partea
superioară a filtrului în jurul cupei.
16
Te uiți la ADN!
https://askabiologist.asu.edu/activities/banana-dna 17
1. Distrugerea (liza) celulelor: prin mojarare sau sonicare și tratament cu
soluții tampon specifice (cu săruri minerale)
• Distractie placuta!
gaburi@uaiasi.ro
LP11. Polymerase Chain Reaction (Reacţia de
Polimerizare în Lanţ)
• Descoperita de către K. Mullis şi echipa sa. Nu se foloseau ADN polimeraze
termostabile şi nici aparate automate pentru reproducerea ciclurilor de
temperatură.
2
Are loc amplificarea unui fragment de ADN utilizând primeri (markeri moleculari) sintetici
desemnaţi pe bază de complementaritate.
Amplificare
Termocicler Sistem pentru preluarea imaginilor
6
ADN
ADN
ADN
ADN
Diagnostic medical
Genotipare Medicina
personalizata
Agricultura Evolutie
Criminalistica
1. ADN cu un grad înalt de puritate – verificare spectrofotometrică (A260/A280).
2. ADN polimeraza
6. Apă ultrapură–NucleaseFree
Exemple:
• izoenzime
• RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms),
• RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA),
• AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms),
• STS (Sequence Tagged Site),
• SSR (Simple Sequence Repeat),
• SNP (Single Nucleotide Polymorphisms),
• KASP (Kompetitive Allele Specific PCR),
etc. 5
Primii markeri?
Primii markeri? Fenotipul
Primii markeri? Fenotipul
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11
Markeri genetici