Chapitre 7 Chromatographie d’exclusion stérique La chromatographie d'exclusion stérique (CES) permet de séparer les molécules suivant Jeur taille. Elle utilise pour cela des phases stationnaires qui comportent des pores dans Jesquels les composes vont pouvoir diffuser, plus ou moins suivant leur volume. La vitesse de migration d'un composé va donc dépendre, pour une méme famille de molécules, de sa masse moléculaire. Bien que lefficacité des séparations n’atteigne pas celle que l'on observe habituellement en CLHP. la CES est devenue irremplacable aussi bien dans le domaine de la séparation des macromolécules naturelles que dans Iétude de Ia répartition en masses des polyméres de synthése. L ‘efficacité des séparations n’atteint cependant pas celle de la CLHP : Ia différentiation des composés par leur taille n'est pas le procédé Je mieux adapté aux molécules petites ou moyennes. En revanche, elle s‘avére tres utile pour beaucoup de produits industriels qui sont des mélanges de substances de masses tres différentes. L ‘instrumentation est comparable a celle utilisée en CLHP. 7.1 PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSION STERIQUE (CES) Ta chromatographie d’exclusion stérique (CES) est hasée sur la différence de pénétration des molécules de I’échantillon dans la phase stationnaire (fig. 7.1). La séparation résulte de existence de pores dans la phase stationnair2, dont le diamatre est comparable & celui des espéces présentes lorsqu’elles sont en solution dans la phase mobile. On désigne la CES par filtration sur gel quand la phase stationnaire est hydrophile (phase mobile aqueuse) et par perméation de gel quand elle est hydrophobe (la phase mobile est un solvant organique) Le volume total Vir de phase mobile dans la colonne peut étre décomposé en deux par- ties : le volume interstitiel Vr (extérieur aux pores) et le volume Vp qui est celui des pores. V; représente le volume de phase mobile nécessaire pour transporter, d'une extrémité a Tautre de la colonne, une grosse molécule supposée exclue des pores et Vig = Vi + Vp, Je volume correspondant pour une petite molécule pouvant rentrer dans tous les pores. Les volumes d’élution Vp sont donc compris entre Vy et Vir. Ona: Ve= V+ KVp (7.1) (7.2)© Dunod ~ La phetocopie non autrisée est un det 7 + Chromatographie d’exclusion stérique 115 K, coefficient de diffusion, représente le degré de pénétration d'une esp2ce dissoute dans le volume Vp (0 < K < 1). Pour la plupart des remplissages modernes, Vj et Vp sont tous les deux de I'ordre de 40 % du volume de la colonne vide. m Lorsque V,,/ Vy dépasse 1, le comportement du composé dans la colonne ne suit plus seulement le mécanisme d’ exclusion stérique, mais il s'y ajoute des interactions physico- chimiques avec le support comme en CLHP. Le raisonnement ci-dessus est vérifié dans la pratique : les molécules dont le diamétre est plus grand que celui des plus larges pores (K = 0) sont exclues de la phase stationnaire (d‘oit vient I expression d’ exclusion stérique). Elles traversent la colonne sans étre retenues et forment un seul pic sur le chromatogrammea la position V; (fig. 7.1). Par contre le volume d'élution des tres petites molécules est Viv. Chaque phase stationnaire est donc adaptée a une plage de séparation exprimée sous forme de deux masses, supérieure et inférieure, au- dessus et au-dessous desquelles il n'y a pas d'effet de séparation possible. Pour augmenter cette plage, qui correspond a la différence entre ces deux volumes, on peut mettre bout a bout 2 ou 3 colonnes. particules de get fe phase statonnalre ume dexclusion totale V, ‘domaine de permeation selectve SX permeation ‘ote volume deution Ven Veh Figure 7.1. Migration au travers du gel de phase stationnaire. Chromatogramme figurant une séparation de trois espéces (1,2,3) de tailles différentes en solution. Les molécules les plus grosses 1 arrivent en téte, suivies des molécules moyennes 2 et enfin des petites molécules 3. Les volumes d'élution sont compris entre V, et Vig = Vp + Vj. Image d'un gel poreux pour illustrer la notion de séparation selon la taille des pores. Liefficacité est optimale avec les solvants de faible viscosité et lorsque les séparations sont effectuées a chaud. Les coefficients de diffusion K sont indépendants de la température. 7.2. PHASES STATIONNAIRES ET PHASES MOBILES Les phases stationnaires sont constituées par des polymares réticulés arganiques ou miné- raux (silices greffées de substituants hydroxylés), qui se présentent sous forme de grains sphériques de 3 a 10 jum de diamétre avec des pores compris entre 4 nm et 200 nm. Ces ma- tériaux, communément appelés gels, doivent *ésister a l'effet d’écrasement dai a la pression en téte de colonne et une température de plus de 100 °C pour la technologie actuelle.116 Partie 1+ Méthodes séparatives m La réduction du diametre des particules, gage d'efficacité, a pour effet de diminuer les passages interstitiels ce qui rend plus difficile la migration des grosses molécules exclues. Aussi est-il préférable dans ce cas d’augmenter la taille des particules et de compenser par une colonne plus longue. Les colonnes standards ont une longueur de 30 cm (diametre in- terne de 7,5 mm). Leur efficacité NV peut atteindre 10° plateaux/m. La nature des phases en présence dépend du type de CES : > pour la perméation de gel (GPC) la phase stationnaire la plus courante est un polymere styréne-divinylbenzéne et la phase mobile un solvant organique (fig. 7.2). Le tétrahy- drofuranne, le benzene, le trichlorométhane ainsi que le trichlorobenzéne (réservé aux polyméres de synthese difficiles a solubiliser) sont utilisés. Hydrocarbures saturés linéaires Diesters phtaliques = phialate de dioctyle M = 390 2." dibutyle M = 278 3." diethyle M = 222 4°") dimethyle M = 194 5 toluene M = 92 Ww [a 76 m_10 72 Conditions : colonne PLgel 5 pm, pores de 5 nm, dimensions : 7,5 x 300 mm, Elution par le tetrahydrofurane, debit 1 m/min. Figure 7.2. Perméation de gel. Lorsque la phase stationnaire posséde des setits pores, on peut séparer des composés organiques de faible masse moléculaire. Le toluéne, dans le chromatogramme de droite (plastifiants de polymares), permet de reperer Viy (reproduit avec I’autorisation de la societe Polymer Laboratories) > pour la filtration sur gel on utilise des phases stationnaires polyhydroxylées a base d’alcools polyvinyliques purs ou copolymérisés avec des polyglycérométhacrylates, ou bien des polyacétates de vinyle (fig. 7.3). Ces phases portent le nom de gels car elles gonflent en présence des phases mobiles aqueuses. On fait également appel a des gels de silice poreuse dont la surface est hydrophile (présence du groupement glycéropro- pyle [=Si(CH2)3~O-CH,CH (OH)CH20H)]). Les phénomenes d’adsorption sont faibles, ‘méme pour les petites molécules. Elles servent pour séparer les bio-polyméres (ex. poly- saccharides) ou les macromolécules biologiques (les protéines par exemple), qui exigent une phase mohile aqueuse. 1m Leterme de filtration sur gel ne doit pas étre confondu avec le procédé courant de filtration qui produirait plutot I'effet inverse, a savoir que les plus grosses molécules auraient plus de al & Waverser le fillre que les petites.© Dunod ~ La phetocopie non autrisée est un det 7 + Chromatographie d’exclusion stérique 117 a PS de filration sur gel ‘S200 peer 6 3000 10° 10° 10° 10° lamerre des pores : G2000: 125A; PS de perméation de go! | PLgel Sum, pores 107A. Plgel 5um, pores 10°A | Tine ie} > PLgel MXEDB 10° 10° 10° 10° 10° 10 M(Da) 10° ® PS de fitration sur gel PS di porméation de gol 'M (daltons) M (dalons) a lution (mL) elution (mL) Figure 7.3 Comparaison de colonnes de filtration sur gel et de perméation de gel ot caractéristiques de phases stationnaires. a) Graphe indiquant le domaine de masse de 2 phases en filtration sur gel et de 3 phases en perméation de gel; b) courbes d’étalonnage (logM = f(V)) de ces différentes phases, obtenues avec des protéines connues pour les colonne de filtration sur gel et des standards de polystyréne pour les autres. Une pente faible de la partie linéaire témoigne d'une meilleure résolution entre masses voisines. C'est le cas lorsque les pores ont une dimension réguliére. Les courbes logM = f(K) tracées moins frequemment ont méme aspect (reprodutt avec l'autorisation des sociétes Tosohaas et Polymer Lab,). Pour les protéines on ajoute quelquefois des dénaturants afin de détruire d’éventuels agrégats en phase aqueuse. 7.3, TRAITEMENT DU CHROMATOGRAMME Chaque phase stationnaire est décrite pour un solvant donné par une courbe d’étalonnage établie & partir de macromolécules ou de polymeres monodispersés de masses M connues et de méme structure que I’ échantillon : polystyrénes, polyoxyéthylenes, pullulanes ou po- lyéthyléneglycols... (fig. 7.3 et tableau 7.1). Les courbes représentant log M en fonction du18 1+ Méthodes séparatives volume d’élution ont une allure sigmoidale, mais en faisant des mélanges de phases sta- tionnaires de porosités différentes, on obtient des colonnes mixtes donnant une réponse pratiquement linéaire sur une large plage de masses. Ces courbes restent néanmoins assez indicatives dans la mesure oi tailles et masses ne sont pas des paramétres étroitement liés lorsqu’on passe d’un polymere & un autre. Tableau 7.1. Domaine de perméation (Da) de trois hydrogels en fonction des standards choisis. étalon 62000 pores 12,5nm 3000 pores 25nm __G4000 pores 45 nm Protéine globulaire 5.000 - 100 000 10 000 - 500 000 20 000 - 7 000 000 Dextrane 1900 - 20 000 2.000 - 70 000 44.000 - 500 000 Polyéthyléneglycol 500-15 000 1 000 - 35 000 2.000 - 250 000 7.4 INSTRUMENTATION Le matériel est comparable a celui qui est employé en CLHP si ce n'est que les colonnes ont des volumes plus importants. Pour amélicrer la résolution il est assez courant de mettre en série deux ou ols colunnes aux porosités complémentalres. Le détecteur le plus employé est le réfractometre différentiel. Pour les polymeres, la variation d’indice de réfraction étant généralement indépendante de la masse moléculaire, ce détecteur est considéré comme universel, D'autres détectews sont parfvis ajoutés au réfractométre. [Is sont basés sur l’absorption lumineuse (détecteur UV) la diffusion de la lumiére (fig. 7.4) et la viscosimétrie. Ils donnent des indications complémentaires sur les composés séparés. Jcolonne diazote Figure 7.4 Détecteur a diffusion de la lumiére. La phase mubite en suite de color est Uraisfor- mée, sous leffet d’un courant de diazote, en un brouillard par un dispostif d'atomisation de géo- métrie adaptée. Lorsqu’un composé est élué, les ‘gouttelettes, en s'évaporant, abandonnent en sus- pension de fines partcules, Edlairées par une source laser elles diffusent la lumiére par effet Tyndall (ce {qui se passe est comparable & la diffusion de la lu- miére que l'on observe avec les phares d'une voi- ture par temps de brouillard). Le signal émis par la photodiode est en rapport avec la concentration du composé ainsi élairé, Les facteurs de réponses sont trés voisins quel que soit le composé. Ce détecteur I. nest évidemment pas utilisable pour les composés ON volatils & la température de la zone chauffée.© Dunod ~ La phetocopie non autrisée est un det 7 + Chromatographie d’exclusion stérique 119 7.5 DOMAINES D’‘APPLICATION Comme il est possible de séparer des masses nominales allant de 200 a plus de 10” Da, les principales applications se trouvent dans le domaine de I’analyse des polyméres, qu’ils soient d'origine naturelle ou de synthése. L’absence d’ interaction chimique avec la phase stationnaire, associée a une élution rapide et la récupération totale des analytes, constituent autant d’avantages. La mise au point des analyses est rapide, sachant aussi qu'on n’utilise pas de gradient d’élution puisqu’il n'y a pas dinteraction soluté/phase mobile. Le choix de la phase stationnaire adaptée a la séparation envisagée se fait a partir des courbes d’étalonnage des différentes colonnes disponibles. On retient celle dont la courbe en masses présente une partie linéaire de faible pente recouvrant toute |’ étendue des masses présentes dans I’échantillon (fig. 7.5). II faut que I'étalonnage soit réalisé avec des standards de meme type, les macromolécules pouvant adopter des formes variées allant de la pelote a aspect filiforme. Ainsi le tableau 7.1 montre que les domaines de séparation des 3 gels de Ja figure 7.3 sont différents suivant les standards utilisés. Al "masses Salons 4 5 1-8 500 000 4 2 1.020000 3." 156000 a 4. 28600 es 3.250, af | 9 10 &- 2.040000 6 7.” 330000 &: “68000 9. 9200 L} 10- 580 : , min (ou mt) 9 fe 75 8 é = 4 min (ou ml) 9 12 15 18 2-colonnes PL.gel-MIXED-8 10um debit 1 mL/min dde 300 x 7,5 mm bout a bout Injection 25 Lala cone. de 0.1 % luant ;tevahydrofurane detection UV Figure 7.5 Courbe d’étalonnage d aspect linéaire d'une colonne de perméation de gel. En utilisant, comme le montre la figure, deux mélanges complémentaires d'étalons de polystyréne on dispose d'un nombre suffisant de masses pour étalonner la colonne. La droite obtenue, qui recouvre un large domaine de masses (conséquence d'une phase stationnaire « panachée »), permet, dans un second temps de déterminer la masse moléculaire d'un polystyrene inconnu. En bas, & droite, le dessin symbolise une macro- molécule repliée sur elle-méme par effet du solvant. On désigne ce volume par volume ‘hydrodynamique de la macromolécule.120 1+ Méthodes séparatives 7.5.1 Distribution des masses moléculaires d’un polymére Un polymére, méme chimiquement pur, correspond toujours 4 un mélange de répartition de macromolécules de masses différentes. C’est une application classique de la chromatogra- phie d’exclusion que de déterminer pour ce type d’échantillons la distribution moléculaire, de caractériser la masse la plus probable et la masse moyenne. II faut que I’étalonnage de la colonne puis I’analyse proprement dite soient réalisées avec le méme débit de phase mobile. 7.5.2 Analyses diverses La technique est utile pour analyser les échantillons de composition inconnue, susceptibles de contenir & la fois des polymeres et des petites molécules, ce qui est le cas de nombreux produits commerciaux ou industriels, tels les produits de biodégradation des polyméres. Pour les campasés arganiques courants qui peuvent tre analysés par CLHP ou CPG il ya moins d'applications, sauf pour les sucres et polysaccharides (fig. 7.6) tels l'amidon, la pate a papier, les boissons et certains produits pharmaceutiques. ‘Séparation d'un sirop de mais Séparation d'un mélange de poptides SS 4 & yam colonne HPX-42A ‘colonne Superdex (dextranes) iskientsieall éluant : eau ‘Temp. 85°C. Detection UV (214 nm) Detection : indice de refraction Fear tene Oae Meese 1:glucose_M= 180 2 - aprotinine 6500 2811 s@lucose -18)n 3 -gastrine | 2126 avec:n compris entre 2 et 11 4 substance P 1348, M = 180.x.0 -18(0-1) 5-(G)5 360 1 6 (ay)3 189 7- glycine 5 ——— >< 3 70 15 20_‘mt| Figure 7.6 Chromatogrammes de filtration sur gel. A gauche, séparation d'un mélange d'oligoméres du glucose allant du premier terme {le glucose, M = 180), jusqu’a une vingtaine d’unités (M environ 3 000) (reproduit avec Vautorization de Polymer Lab.) A droite, séparation d'un mélange de diverses protéines et oligoméres de la glycine (reproduit avec ‘autorisation de Pharmacia-Biotech). QUELQUES SITES SUR INTERNET www.alltech.com www.richardscientific.com wwwshimadzu.com wwwpolymerlabs.com www jascoinc.com www.dionex.com© Dunod ~ La phetocopie non autrisée est un det 7 + Chromatographie d'exclusion stérique 121 EXERCICES Solutions en fin d’ouvrage Exercice 7.1 On chromatographie une solution dans le (érahydrofuranne (THE) d'un mélange de po- lystyrénes de masses moléculaires connues sur une colonne (DI = 7,5 mm, L = 300 mm) dont le domaine de perméation s'étend de 490 a 30 000 daltons. La phase éluante est du THE. Son debit est de 1 mL/min. La détection UV est effectuée & 254 nm. A partir du chromatogramme obtenu reproduit ci-aprés : 34500 19200 3250 580 162 4 Seeeucneaas, 89min a) Calculer le volume d’exclusion totale (volume interstitiel) et le volume des pores de la colonne utilisée. b) Calculer le coefficient de diffusion K pour le composé de masse 3 250 Da. On observe quelquefois en CES des valeurs de K supérieures a 1. Interpréter ce phénomene Exercice 7.2 On veut séparer par chromatographie de perméation de gel, un mélange de 4 étalons de polystyréne dont les masses moléculaires sont de 9 200, 76 000, 1,1 x 10° et 3 x 10° daltons. On dispose de 3 colonnes dont les domaines de perméation sont les suivants : A:70000a4 x 10°Da; B:105a1,2x10°Da; C:108a4 x 10° Da Comment peut-on séparer ces 4 polyméres en une seule opération, sachant qu‘on peut mettre bout & bout deux colonnes? Exercice 7.3 En chromatographie d’exclusion stérique, apres injection de polystyrénes étalons, on trouve une relation entre masse molaire et temps de rétention de la forme suivante : log M = 5,865 + 1,411 te — 0,33 ce + 0,016 ce ( oit M est la masse molaire en Dalton et fg le temps de rétention en min a) Calculer, a partir de cette relation, la masse molaire dun soluté qui éluerait avec un temps de rétention égal a 7,48 min dans I'hypothese oit ce polymere est monomasse.122 Partie 1+ Méthodes séparatives b) En réalité, le polymere monomasse n'existe pratiquement pas (excepté pour les étalons).. SNM, On définit une masse molaire moyenne My aaa (2) et une masse molaire moyenne NM} pondérée My = LM (3) ot M; est la masse molaire d'un polymere éluant dans i NM; T'intervalle de temps correspondant a un pic chromatographique et 1V; le nombre de moles de ce polymere. Un logiciel de calcul tranche le pic chromatographique, détermine pour chaque tranche la masse molaire associee et I’aire A,. En supposant le coefficient de reponse k du détecteur constant au cours du pic chromatographique, et en utilisant la relation de base m, = N;-M, = k-A,, transformer les relations (2) et (3) en utilisant uniquement A, et si besoin M, ©) Un rapport chromatographique a donné les résultats suivants + Te | 6.95 7,05 7,15 7,25 7,35 7,45 7,55 7,65 7,75 7,85 7,95 8,05 4) [0 0 1,77 853 17,74 4036 19,44 9,32 2,03 0 0 0 Compléter ce tableau en utilisant la relation (1) et calculer les masses molaires My et My en utilisant les relations (2) et (3).