Почнемо з того, що взагалі таке вже відома нам ламарківська система, що дозволяє

регулювати не лише вірогідність виникнення зміни в певному місці генома, але й напевне
«знати» її якісний характер - CRISPR-Cas.
CRISPR / Cas9 - це нова технологія редагування геномів вищих організмів, що базується на
імунній системі бактерій. В основі цієї системи - особливі ділянки бактеріальної ДНК,
короткі паліндромний кластерні повтори, або CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short
Palindromic Repeats). Між ідентичними повторами розташовуються фрагменти ДНК -
спейсери, що відрізняються один від одного, багато з яких відповідають ділянкам геномів
вірусів, що паразитують на цій бактерії. При попаданні вірусу в бактеріальну клітину він
виявляється за допомогою спеціалізованих Cas-білків (CRISPR-associated sequence -
послідовність, асоційована з CRISPR), пов'язаних з CRISPR РНК. Якщо фрагмент вірусу
«записаний» в спейсерами CRISPR РНК, Cas-білки розрізають вірусну ДНК і знищують її,
захищаючи клітину від інфекції.
У початку 2013 року кілька груп вчених показали, що системи CRISPR / Cas можуть
працювати не тільки в клітинах бактерій, але і в клітинах вищих організмів, а значить,
CRISPR / Cas-системи дають можливість виправляти неправильні послідовності генів і
таким чином лікувати спадкові захворювання людини .

Експеримент з людськими ембріонам

У 2015 році китайські вчені зробили спробу виправити геном людського ембріона. Вони
взяли запліднену людську яйцеклітину із зіпсованим геном, що призводить до хвороби
крові бета-таласемії. У клітку були введені білок Cas9 і РНК-гід, які повинні були знайти і
«розкусити» неправильну копію гена з подальшою репарацією по здорової матриці. В
результаті експерименту в 5-10% ембріонів мутація, відповідальна за виникнення хвороби
у дорослих людей, дійсно була виправлена. Це хороша новина.
Погана новина полягала в тому, що у всіх клітинах пролікованих ембріонів була присутня
велика кількість мутацій, які з'явилися зовсім не там, де передбачалося. Таким чином,
технологія потребує вдосконалення, вона недостатньо точна. Точне редагування
виходить, коли ділянку ДНК-мішені довжиною трохи більше 20 нуклеотидів
комплементарно взаємодіє з повністю відповідним йому РНК-гідом. Але ж в геномі може
існувати велика кількість варіантів послідовності-мішені, що відрізняються від неї лише на
одну букву, ще більше варіантів, що відрізняються на дві, і так далі. Кожна з таких
варіантних мішеней взаємодіє гірше, ніж ідеально підходить мішень, припустимо в 10
разів гірше. Але так як таких послідовностей багато, неправильного впізнавання (а отже,
розрізання і редагування) уникнути дуже важко. Як з цим бути, поки неясно. Очевидно,
потрібно покращувати специфічність білка Cas9 і дуже ретельно вибирати гіди.
Паралельно з цією системою на даний час розвиваються ще дві схожих ZFNs i TALENs.

ZFN
Перша стратегія редагування геном використовує власні ендонуклеази ДНК, які
називаються цинк-пальцевими нуклеазами (ZFN).
Цинкові пальці - фактори транскрипції; кожен модуль пальця розпізнає три-чотири основи
послідовності, і змішуючи та співставляючи ці модулі, дослідники можуть більш-менш
орієнтуватися на будь-яку послідовність, яку вони бажають (з деяким обмеженням: Sigma
Aldrich , яка комерціалізує технологію ZFN, може виробляти робочу ZFN приблизно кожні
50 bp в середньому, каже Грег Девіс, головний науково-дослідний розробник, який
очолює технологію редагування геномів у компанії).
ZFN - гетеродимер, в якому кожна субодиниця містить домен цинкового пальця і домен
FokI ендонуклеази. Домени FokI повинні димеризуватися для активності, таким чином
збільшуючи специфічність цілі, забезпечуючи, щоб відбулися два проксимальних події, що
зв'язують ДНК, для досягнення подвійного розриву ланцюга.
Отримане в результаті розщеплення - це те, що дає змогу працювати більшості  технологій
редагування геномів . Після створення перерви клітина прагне її відновити. Найпростішим
методом є «негомологічне кінцеве приєднання» (NHEJ), при якому клітина, по суті, шліфує
два кінці розбитої ДНК і скріплює їх назад разом, часто створюючи зрушення
кадру. Альтернативний метод - це гомологічний ремонт. Тут клітина намагається
виправити розрив, використовуючи іншу копію послідовності як резервну копію - іншу
(нерозривну) хромосому, наприклад. Надаючи власний шаблон, користувачі можуть
змусити систему ненавмисно вставити потрібну послідовність.
Технологія ZFN належить Sangamo BioSciences , яка використовує її для розробки
терапевтичних продуктів. Однак для дослідницьких застосувань Сангамо ліцензував
технологію Sigma Aldrich.
За словами менеджера сегмента ринку функціональної геноміки, Шона Шафера, компанія
пропонує як спеціальні, так і нестандартні ZFN CompoZr® за ціною від 4 000 до 7 000
доларів за штуку. Ці ферменти були перевірені до продажу, але нещодавно компанія
запровадила "швидкий ZFN" варіант для тих, хто бажає пропустити перевірку, надавши
чотири користувацьких ZFN за 3000 доларів.
"Ми знаємо, що якщо ми надішлемо чотири пари ZFN для нокауту, 90% часу хоча б один
буде успішним", - каже Шафер.
Сигма Олдріх також нещодавно запустила набір флуоресцентних білків ZFN, завдяки чому
користувачі можуть вибирати (за допомогою проточної цитометрії) клітини, які насправді
експресують фермент. Мета - зробити більш ефективним скринінг. "Ви обробляєте
клітини, після чого вам доведеться пройти два-чотири тижні одноклітинного клонування, і
ми намагаємось також допомогти цьому процесу", - каже Шафер.

TALEN
Хоча цинкові пальці працюють, вони порівняно дорогі і вигадливі у виготовленні, і
дослідникам, як правило, доводиться замовляти їх у Sigma Aldrich (хоча, наприклад,
існують і дизайни домашнього приготування, наприклад, на Addgene.org ). Однак останнім
часом було виявлено подібну, але значно більш гнучку систему.
Ефекторні нуклеази, що нагадують активатор транскрипції, або TALEN - це димерний
фактор транскрипції / нуклеази, побудований з масивів від 33 до 35 модулів амінокислот,
кожен з яких націлений на один нуклеотид. Збираючи ці масиви просто так, дослідники
можуть орієнтуватися майже на будь-яку послідовність, яка їм подобається.
Стівен Еккер, директор Центру досліджень наркоманії Майо в Центрі раку Клініки Майо,
порівнює TALEN та ZFN сьогодні з транзисторами та вакуумними трубами у 1950-х
роках. "Ви могли б, в принципі, розробити те, що ми сьогодні приймаємо як належне [з
вакуумними трубами], але це було б дуже важко; транзистори зробили речі набагато
доступнішими та простішими ». Аналогічно, ZFN надали основоположний доказ принципу
технології редагування геномів, але« TALEN прийшли і роблять більшу частину того, що
роблять ZFN, але дешевше, швидше і краще ».
Особливо дешевше. Лабораторії можуть створювати власні TALEN за частину вартості
ZFN. Addgene продає індивідуальні плазміди TALEN за 65 доларів за штуку, а комплекти -
за кілька сотень доларів. Популярний комплект Golden Gate TALEN 2.0 від Dan Voytas
коштує 425 доларів.
Войтас, професор та директор Центру інженерії геномів університету Міннесоти (а також
консультується з головним науковим співробітником компанії Cellectis Plant Biosciences,
що займається розробкою TALEN для сільськогосподарських застосувань), розробляє
стратегії оптимізації редагування геномів у рослинах. Його університетська лабораторія, за
його словами, є "платформою агностиком" - вони використовують ZFN, TALEN та
нововиявлену систему CRISPR / Cas (див. Нижче).
В даний час Войтас каже, що віддає перевагу TALENs, оскільки його команда має
найбільше досвіду та успіху в їх використанні. Але TALEN також є набагато більшими
молекулами, ніж ZFN, зазначає він, і їх може бути складно доставити ефективно.
Щоб використовувати його комплект Golden Gate, каже Войтас , користувачі
спочатку ідентифікують потрібний сайт, що зв'язує TALEN . Потім вони вибирають плазміди
в комплекті для кожного необхідного модуля, який можна буде поетапно відщепити і
зібрати приблизно за тиждень.
Останнім і найскладнішим етапом є перевірка того, що фермент працює за
призначенням. "У певних системах саме валідація функції може бути справжньою
точкою", - говорить він.
Якщо ви хочете, щоб ваш TALEN був виготовлений для вас,  Cellectis Bioresearch продає як
власні, так і попередньо виготовлені ферменти. Недійсний, користувацький TALEN коштує
3360 доларів, а дизайн, затверджений у клітинах людини, коштує 5000 доларів, - каже
заступник генерального директора компанії Жан-Чарльз Епінат. Час виконання замовлень
на замовлення становить близько двох тижнів. Life Technologies також пропонує власні
TALEN під своїм брендом GeneArt® - а також домени TAL, злиті з доменами активатора чи
репресора, для контролю експресії генів.
Feature ZFNs TALENs CRISPR-Cas9
Length of
recognized 9–18 bp 30–40 bp 22 bp + PAM sequence
DNA target
Mechanism
of target DNA–protein DNA–RNA interaction via
DNA–protein interaction
DNA interaction Watson-Crick base pairing
recognition
Mechanism
Double-strand
of DNA Double-strand break Single- or double-strand
break induced
cleavage and induced by FokI break induced by Cas9
by FokI
repair
Challenging. Available
libraries of zinc finger motifs
with pre-defined target
Easy. TALE motifs
specificity, but zinc finger Easy. SgRNA design based
with target
Design motifs assembled in arrays on complementarity with the
specificities are
can affect specificity of target DNA.
well defined.
neighboring zinc finger
motifs, making the design
challenging.
TALEs do not
Expression vectors for Cas9
require linkages.
available. SgRNA can be
Requires engineering Cloning of
delivered to cells as a DNA
Cloning linkages between zinc separate TALE
expression vector or directly
finger motifs. motifs can be
as an RNA molecule or pre-
done using Golden
loaded Cas9-RNA complex.
Gate assembly . 5
Джерела

1. https://postnauka.ru/faq/59807
2. https://www.ptglab.com/news/blog/crispr-cas9-talens-and-zfns-the-battle-in-gene-editing/
3.