CHƯƠNG 3: HỆ ENZYME SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH

SẢN XUẤT PHÔ MAI CAMEMBERT

3.1. Chymosin ( Rennin)

3.1.1. Giới thiệu chung.

Chymosin (Rennin) một protease được tìm thấy trong rennet. Chymosin là một
endopeptidase aspartic. Chymosin là một enzyme đông tụ sữa ở dịch tiêu hóa của động
vật nhai lại sơ sinh, nó giúp đông tụ sữa và sữa được tiêu hóa trong ruột lâu hơn => hấp
thu tốt hơn. Nó được khám khá bởi Heinz năm 1951, số phân loại E.C.3.4.23.4.

Chymosin của bò là một protease aspartyl được chiết xuất từ dạ dày (dạ dày thứ tư) của
bê con còn bú. Enzyme này là được tiết ra ở dạng tự nhiên dưới dạng tiền chất không hoạt
động, prochymosin, được chuyển đổi không thể đảo ngược thành chymosin hoạt động do
kết quả của sự phân giải protein hạn chế. Enzyme này có hoạt tính đông tụ sữa rất cao
nhưng lại có hoạt tính phân giải protein thấp. Sự kết hợp này của đặc điểm làm cho
chymosin đặc biệt thích hợp để sử dụng trong sản xuất pho mát. Chymosin do tế bào
chính của tuyến dạ dày tiết ra để tiêu hóa sữa cho động vật mới sinh, đặc biệt ở ngăn thứ 4
dạ dày bê dưới 5 tuổi. Khi bê càng gần 5 tháng tuổi, bắt đầu ăn, thành phần rennin trong
rennet giảm dần và được thay thế bằng pepsin

Chymosin được thay thế bằng pepsin khi bê già đi, tuy nhiên, pepsin có xu hướng dẫn đến
mất chất béo cao hơn vì sữa đông được tạo thành có cấu trúc lỏng hơn, mở hơn so với cấu
trúc được hình thành từ chymosin. Ít nhiều có sự đồng thuận của 2 ý kiến ủng hộ
chymosin là enzym tạo pho mát. Do sản xuất chymosin từ dạ cỏ của bê còn hạn chế, nên
cần có các phương pháp thay thế để sản xuất đủ chymosin của bò đáp ứng nhu cầu ngày
càng tăng trên toàn cầu, dẫn đến việc sản xuất chymosin thông qua công nghệ DNA tái tổ
hợp. Chymosin nhân bản có thể được sản xuất bởi các vi sinh vật khác nhau và không có
sự khác biệt lớn nào có thể được phát hiện giữa các loại pho mát được làm bằng enzym tự
nhiên và chymosin nhân bản.
Với đặc tính sinh học đó, enzyme Chymosin ứng dụng rộng rãi để làm đông tụ sữa trong
sản xuất pho mát. Ngày trước người ta sản xuất enzyme chymosin chủ yếu từ bê và cừu
con. Nhưng vì việc sản xuất phô mai trên thế giới ngày càng tăng cùng với việc sụt giảm
số lượng bê, cừu bị giết mổ, đồng thời quá trình thu nhận enzyme từ động vật phức tạp,
tốn nhiều chi phí dẫn đến giá thành enzyme đắt nên xu thế hiện này người ta sản xuất
enzyme tái tổ hợp Chymosin từ vi sinh vật bằng cách chuyển gen Chymosin của bò vào ở
E. coli, Aspergillus niger var awamori và K. lactis.

3.1.2. Thành phần cấu tạo enzyme Chymosin từ dịch tiêu hóa bê.

Chymosin là enzyme thủy phân liên kết peptide, có trọng lượng phân tử 35.6 kDa.
Chymosin là enzyme bao gồm một chuỗi polypeptit đơn của 323 axit amin với các liên
kết disulfua nội phân tử. Các chế phẩm của men dịch vị bê có chứa hai dạng chymosin, A
và B. Sự khác biệt duy nhất giữa chymosin A và B là một axit amin trong chuỗi
polypeptit; chymosin A chứa dư lượng axit aspartic ở vị trí 286, trong khi chymosin B
chứa dư lượng glycine ở cùng vị trí

Về mặt cấu tạo phân tử, Chymosin có mạch polypeptide có gắn glycine trong mạch
có vòng carbon. Các liên kết hydro có thể đóng vai trò quan trọng trng việc bảo vệ cấu
trúc bậc 2,3 của chymosin ở dạng hoạt động. Cấu trúc bậc nhất của rennin cũng có nét
tương tự pepsin ở phân đọan mạch đầu C, ở đọan mạch gần liên kết disulfur và phần
đọan mạch chứa aspartic acid ở trung tâm họat động.

Thành phần hóa học chymosin chứa nhiều amino acid có tính acid hơn amino acid
kiềm tính, nhưng tỷ lệ thấp hơn so với pepsin. Trong thành phần của chymosin còn chứa
nhiều prolin, serin và trong phân tử có chứa tới 3 cầu disulfur. Do đó, chymosin thể hiện
tính acid yếu hơn pepsin.

Chymosin bê được sử dụng để làm pho mát thương mại thường được tìm thấy
trong men dịch vị, một chiết xuất không tinh khiết được lọc từ dạ dày bê. Trong men dịch
vị của bê, 5-20% hoạt động đông tụ sữa là do pepsin của bò và lượng pepsin trong rennet
là hàm của tuổi, thời kỳ cai sữa và chế độ ăn của bê có dạ dày được xử lý trong quá trình
chuẩn bị. Khi hỗn hợp pepsin và chymosin được sử dụng để làm phô mai cheddar, hàm
lượng nitơ phi protein và chất béo cao hơn được tìm thấy trong whey khi men dịch vị
chứa hàm lượng pepsin cao hơn được sử dụng. Mặc dù không có sự khác biệt đáng kể về
thành phần, hương vị hoặc kết cấu của pho mát được làm với các hàm lượng pepsin khác
nhau, năng suất với pepsin bò nguyên chất thấp hơn 0,25% so với trường hợp với rennet,
một sự khác biệt đáng kể về mặt kinh tế. Ngoài ra, pepsin có hoạt tính phân giải protein
lớn hơn chymosin ở tất cả các giá trị pH từ 2 đến 6. Nếu hoạt động phân giải protein quá
mức, năng suất của pho mát và khả năng giữ lại chất béo của sữa đông có thể bị giảm.
Quá trình phân giải protein quá mức trong quá trình chín cũng có tác dụng không mong
muốn đối với cơ thể và hương vị của pho mát thành phẩm. Vì những lý do này, nên sử
dụng rennin có mức pepsin giảm trong sản xuất pho mát. Pepsin bò có thể bị bất hoạt ở
pH kiềm, ví dụ, bằng cách ủ ở pH 7-7,3 trong 30 phút ở 30 ° C. nhưng không phải là
không làm bất hoạt một số chymosin. Do các điều kiện quan trọng cần thiết để khử hoạt
tính chọn lọc pepsin, các phương pháp tách pepsin và chymosin được ưu tiên hơn so với
kỹ thuật bất hoạt chọn lọc.

3.1.3. Đặc tính và khả năng thủy phân của Chymosin

3.1.3.1. Đặc tính

https://www.brenda-enzymes.org/literature.php?e=3.4.23.4&r=708236

- Trọng lượng phân tử 35.6 kDa, khi proenzyme được đưa đến pH 4,2, việc laoij bỏ
42 gốc ở đầu N tạo ra chymosin ở dạng hoạt động 356 kDa

- Độ ổn định của dung môi hữu cơ. Chymosin mất 50% hoạt tính sau khu ủ trong
4,6 M ure ử 37 độ C trong 30 Phút

- Tinh sạch bằng sắc ký cột DEAE-cellulose, lọc gel.

- Điều kiện bảo quan: 4 độ C, pH 3. Và pH=6.2, có độ ổn định tối đa trong 3 ngày.

- pH tối ưu: 3.7 đối với chymosin B và 4.2 đối với chymosin A

- Chymosin tinh thể ổn định tối ưu ở pH từ 5.3-6.3, enzyme ở định vừa phải ở pH 2
nhưng không ổn định ở pH khoảng 3.5 và trên 6.5. Tại pH 7, enzyme không hoạt động.
 - pI= 4.55

3.1.3.2. Đặc hiệu thủy phân

Chymosin chỉ thủy phân đặc hiệu liên kết peptide và không làm ảnh hưởng đến
liên kết ester và amin. Chymosin đặc hiệu có tác dụng mạnh lên các liên kết được tạo nên
bởi tyrosine và phenyl alanine ( tạo mùi vị đặc trưng cho phomai)

Chymosin tác động lên cơ chất casein của sữa bò và những loại sữa khác. Đặc tính
thủy phân casein của rennin phụ thuộc vào rất nhiều pH. ở pH 6.8 rennin phân cắt trung
bình 1/33, còn pH=2.3. thì phân cắ 1/8 số liên kết peptide trong phân tử casein.

3.2. Sự hoạt hóa prochymosin thành chymosin.

Chymosin có trong màng nhày dạ dày ở dạng không hoạt động zymogen được gọi
là prochymosin. Prochymosin có trọng lượng phân tử khoảng 36kDa-37kDa và điểm đẳng
điện pI=5. Trong môi trường kiềm, prochymosin bền hơn chymosin nhưng nếu pH >= 11
prochymosin bị mất khả năng chuyển hóa thành chymosin. Trong điều kiện pH=6.5 và ở
nhiệt độ phòng, sau 24 gườ có khoảng 5% prochymosin tự chuyển hóa thành chymosin. ở
pH = 5-6, prochymosin có thể chuyển hóa thành chymosin dưới tác dụng của pepsin bằng
cách phân tử prochymosin một đoạn polypeptide có phân tử khoảng 5.3kDa-6.3kDa.

3.3. Quá trình đông tụ sữa.

Quá trình đông tụ casein sữa bằng tác nhân enzyme chymosin

Giai đoạn 1: enzyme chymosin xúc tác thủy phân liên kết peptide tại một vị trí đặc
hiệu trong phân tử casein K

Casein K giữ vai trò quan trọng trong việc ổn định cấu trúc micelle của sữa. Đầu
amino của phân tử casein k ( đầu ưa béo) được liên kết với các phân tử casein anpha s, và
beeta trng micelle luôn hương về tâm micelle, còn đầu carboxyl (đầu ưu nước) luôn
hướng ra ngoài vùng biên micelle. Chymosin sẽ xúc tác thủy phân liên kết peptide tạo vị
trí giữa acid amin số 105 (phe) và acid amin số 106(met) trong phân tử casein K
 Kết quả là đoạn caseinglucopeptide được tách ra khỏi phân tử caseink và hòa tan
vào dung dịch. Rieeg phân đoạn paracasein vẫn còn gắn lại trên các gốc micelle và làm
cho micllr dễ hợp lại với nhau chuẩn bị tạo khối đông

Trong giai đoạn thứ nhất, chỉ có các phân tử casein k bị thủy phân bởi chymosin tại
vị trí liên kết đặc hiệu nói trên. Các phân tử thủy phân casein anpha s và beta gần như k
thay đổi.

Giai đoạn 2: Đông tụ casein

Ở giai đoạn này, các micelle sau khi bị mất đoạn caseinglucopeptide trong phân tử
caseink bắt đầu liên kết lại với nhau. Đó là hiện tượng giảm sự tích điện bề mặt của
micelle,, từ đó lực đẩy tĩnh điện giữa các micelle cũng bị giảm. Bề mặt micelle trở nên ưu
béo hơn do chỉ chứa các phân đoạn paracaseink và chúng có thể liên hợp lại với nhau một
cách dễ dàng hơn. Ngoài ra, phần tích điện dương của phân đoạn paracaseinK có thể
tương tác với phần tích điện âm của phân tử casein anpha s và B. cầu calcium phosphate
sẽ xuất hiện giữa các micelle và góp phàn làm tăng kích thước khối đông tụ.
 Trong quá trình liên hợp lại với nhau dể tạo nên khối đông, các micelle sẽ kéo một
số phân tử lipid cacf các hợp chất có trong sưã như lactose, vitamin… Như vật, trong cấu
trúc geo của khối đông, ngoài casein là thành phần chính, người ra còn tìm thấy lipid,
lactose, nước và một số chất khác.

Các nhà nghiên cứu cho rằng sự dôn tụ sữa chỉ xảy ra khi có hơn 85% caseink
trong micelle bị phân hủy bởi enzyme. Khi sử dụng chymisun để dông tụ, hàm lượng
casein thu được trong khối đông có thể lên đến 95% tổng lượng casein ban đầu có trong
sữa. Ngược lại, khi sử dụng các protease từ nấm sợi để đông tụ, hiệu suất thu hồi casein
trong khối dông chỉ đạt 40-45%. Bên cạnh đó, quá trình thủy phân protein diễn ra mạnh
mẽ và làm tăng đáng kể hàm lượng nito amin trong huyết thanh sữa.

Giai đoạn 3: Kết thúc quá trình đông tụ và tách huyết thanh sữa.

Khi casein đã đông tụ hoàn toàn, người ta thực hiện giai đoạn tách khối đông ra
khỏi huyết thanh sũa. Ở giai ddoaonj anfy, sự xúc tác của enxtme chymosin không làm
thay đổi đánh kể cấu trúc của khối đông. Hàm lượng nito amin trong sữa gần như k thay
đổi.

3.4. Phương pháp thu nhận

3.4.1. Hóa chất

Nguyên liệu: ngăn thứ 4 dạ dày bê con ( dạ múi khế) dưới 5 tháng tuổi.

Quy trình: gồm 2 giai đoạn

Giai đoạn 1: thu Protein tổng ( thu nhận dung dịch rennet)

1. Xử lý sơ bộ: thu nhận dạ dày bê, tách mỡ, rửa sơ: lấy phần múi khế của bào tử
khê và lộn ngược một cách nhẹ tay để bỏ hết thức ăn dư thừa, tách bỏ phần mỡ,
cân trọng lượng. Rửa nhẹ bằng nước lạnh, không nên rửa kỹ sẽ làm mất
enzyme. Sau đó rửa bằng dung dịch muối Nacl 15%
2. Xay nhuyễn- phá vỡ tế bào
 - Dùng kéo cắt nhuyễn màng nhầy dạ dày thành miễng nhỏ khoảng 1 cm rồi
xay nhuyễn đồng nhất nhằm phá vỡ các mô tế bào tạo điều kiện cho quá
trình trích ly.
- Thêm HCl 0,2% để cgubgr pH 2-3 và 0.7% acid boric trên tổng thể tích để
bảo quản ( tỷ lệ 1:3V) hoặc nước muối 10% ( tỷ lệ 1:3V)
- Giữ mẫu trong tủ ấm 35-40 độ C qua 30 giờ.
 Mục đích: ở pH 2-3 và nhiệt độ 35-40 độ C giúp quá trình hoạt hóa
prochymosin thành chymosin
- Thêm HCl 6 M chỉnh lại pH của dung dịch về 4 sẽ cho hoạt tính enzyme
cao và khả năng hòa tan tốt.
3. Lọc tiếp tuyến. => thu được dịch Rennet chứa chymosin hoạt động và
chymosin bất hoạt
Kết thúc giai đoạn 1, thu được dung dịch rennet có màu hổ phách nhạt đến màu
nâu đậm được bảo quản ở nồng độ muối cao 14-20% và thêm chất bảo quản
như sodium benzoate, propylene glycol.

Giai đoạn 2: thu nhận và tinh sạch chymosin từ dịch chiết.

1. Khuấy: Dịch rennet được khuấy đều, bổ sung thêm chất bảo quản nitri bezoat 1%
và propylene glycol để trách VSV phát triển trong dung dịch và chống oxy hóa
2. Tủa: tủa phân đoạn bằng NaCl bão hòa.enzyme được tủa bằng Nacl tinh thể nồng
độ khoảng 22-23% vào, khuấy nhẹ cho đến khi dung dịch bão hòa. Làm lạnh trong
20 phút.
3. Ly tâm” thu được rennin thô ( chứa muối, các protein lạ và ít protrin tinh khiết)
4. Sấy khô: sau khi ly tâm thu phần tủa, đem sấy khô ở nhiệt độ phòng

Tinh sạch rennin thô:

Phương pháp1: thẩm tích bằng màng bán thấm ( cellophan).

Phương pháp 2: Sắc khí cột DEAE sephadex G-50

Bảo quản:
Sấy đông khô

https://xemtailieu.com/tai-lieu/thu-nhan-enzyme-rennin-tu-da-day-be-dinh-kem-file-
1382945.html

https://www.freepatentsonline.com/4666843.html?query=calf+rennet&stemming=on

https://www.slideshare.net/luongnguyenthanh/qttb3-1-1

https://www.scribd.com/document/122697077/Phomai-Camembert

https://www.brenda-enzymes.org/literature.php?e=3.4.23.4&r=708236

https://drive.google.com/file/d/0BwixbaqeX0X2VWgtaVh1RnRGYWs/view