GENETSKI INŽENJERIZOVANI SISTEMI ZA

PROIZVODNJU REKOMBINANTNIH PROTEINA

 Razvoj procesa sa genetski inženjerizovanim ćelijama
 U procesu postoji zavisnost između izbora biokatalizatora (ćelija) i
bioreaktorskog rešenja.
Molekularan nivo

Sub celularan
nivo

Celularan nivo Biološki

sadržaj

Međućelijske
Inženjerski interakcije
sadržaj
Mikrookolina

Makrookolina
(Bioreaktor)

Integrisani bioproces
(fermentacija i separacija
produkta)
Proizvod Primena
A. Hormoni i peptidni faktori
Humani insulin Diabetes
Faktor VIII-C Hemofilija
Ljudski hormon rasta Deficit u rastu
Eritropoetin Anemija
Interferon-  2a Leukemija, Rak vezan za AIDS
Interferon- beta Rak
Interferon- gama Rak, infektivne bolesti
Stimulišući faktor kolonija granulocita (G-CSF) Efekti hemoterapije, AIDS
B. Enzimi
Tkivni plazminogen aktivator Akutni infarkt miokarda, Šlog
Prourokinaza/urokinaza Srčani napad
C. Vakcine
Hepatitis B Hepatitis B vakcine
Herpes Herpes
D. Monoklonska antitela Širok spektar antitela za dijagnostiku
Prevencija krvnih ugrušaka
Rak dojke, Rak pluća
 Sistemi za proizvodnju rekombinantnih proteina

Zahtevi
 Proizvodi moraju biti izuzetno čisti (da ne bi došlo do
imunološke reakcije kod pacijenata)
 Od izuzetne važnosti za aktivnost terapeutskih proteina je
da je proizvod identičan prirodnom.
 Zato je u najvećem broju slučajeva neophodno da su
postranslacione promene kod proteina (glikozilacija i
fosforilacija) identične ili gotovo identične sa
postranslacionim procesima u prirodnim proteinim ćelija.
 Ponekad se vrše ciljane modifikacije proteina radi
poboljšanja farmakokinetičkih i drugih karakteristika
proteinskog biofarmaceutika
 Proizvodna strategija koja uključuje 1) izbor ćelija
domaćina, 2) izbor vektora, 3) genetičkog materijala, 4)
procesne opreme i 5) tehnoloških parametara se posebno
određuje za svaki pojedinačan postupak u zavisnosti od
njegovih specifičnosti i ograničenja
 Pregled sistema domaćina
Vrsta organizma
Karakteristika E.coli S.cerevisiae P. pastoris Insekti Sisari
Velika brzina rasta +++ ++ ++ -ili +/ - - ili+/ -
Pogodnost genetičkog +++ ++ + +/ - ili + +/ - ili +
sistema
Nivo ekspresije +++ ++ +++ + ili ++ ili - ili +/ - ili
+++ +
Raspoloživost jeftinih +++ +++ +++ - -
medijuma za gajenje
Razgradljivost- +/ - +/ - ili + +/ - ili + ++ ili +++ +++
razmotavanje proteina
Jednostavna glikozilacija Ne Da Da Da Da
Kompleksna glikozilacija Ne Ne Ne Da* Da
Nivo proteolitičke + ili +/ - + + ++ ++
razgradnje
Izlučivanje sekreta obično +/ -; u ++ ++ ++ +++
nekim
slučajevima
++
Bezbednost korišćenja ++ +++ ++ +++ ++

+++ odlično; ++ vrlo dobro; + dobro; +/- slabo; - vrlo loše;*Način glikozilacije se razlikuje od načina glikozilacija kod ćelija sisara
 Escherichia coli kao domaćin
POGODNOSTI:
 Najčešće korišćeni ekspresioni sistem kada se proizvode proteini
kod kojih nisu neophodne posttranslacione modifikacije.
 Genetički najispitaniji i najpoznatiji mikroorganizam, najviše
eksperimentalnog iskustva kao i već razvijeni protokoli za rad.
 E.coli raste prilično brzo i ima sposobnost da dostigne visoke
ćelijske koncentracije (50 g ss/l).
 Ima prilično velike mogućnosti ekspresije proteina. Pri dobro
izabranim kombinacijama vektora i promotora E. coli može proizvesti
količinu od 25-30 % rekombinantnog proteina od ukupnih proteina u ćeliji.
 Može rasti na jednostavnoj i jeftinoj hranjivoj podlozi što ukazuje na
prilično dobre ekonomske predispozicije.
 Velika brzina rasta (malo vreme udvostručenja). Gajenje se može
koncipirati tako da se postignu visoke ćelijske koncentracije (da bi
se izbeglo stvaranje sporednih proizvoda (acetata)- dolivno gajenje.
 Može se postići visoka produktivnost.
 Escherichia coli kao domaćin
MANE:
 E.coli slabo izlučuje proteine van ćelije.
 Kada se proizvode veće količine proteina koje se zadržavaju unutar ćelije može doći
do toga da se jedan deo proteina razgradi pod dejstvom proteolitičkih enzima
aktivnih u citoplazmi, ili se mogu stvoriti nerastvorni agregati proteina koji se nazivaju
inkluziona tela (nastaju razmotavanjem proteina i nisu biološki aktivni).
 Ukoliko se proteinski agregati izdvoje iz ćelija, moguće ih je ponovo rastvoriti i
povratiti im aktivnost, a samim tim i njihovu proteinsku vrednost.
 Prilikom sinteze proteina u citoplazmi E. coli može doći do nemogućnosti stvaranja
disulfidnih veza u proteinu.
 Pošto se proizvod uglavnom zadržava u ćeliji, prilikom separacije proizvoda
neophodno je da se izvrši destrukcija ćelijskih zidova, tj liziranje ćelija. U procesu
liziranja obično dolazi do oslobađanja endotoksina (ili pirogena) iz E. coli.
Endotokisni su lipopolisaharidi koji se nalaze u spoljašnjoj membrani ćelije i mogu
izazvati neželjene negativne efekte u živom organizmu, kao što su povećanje
temperature i eventualno smrt.
 E. coli normalno ne vrši ekskreciju proteina sem u dva slučaja koji predstavljaju
izuzetke, a to su kolicin i hemolizin. (Zato se prilikom konstrukcije vektora genu za
sintezu proteina dodaju ovi ekskrecioni elementi).
 I pored svih nedostataka može se reći da je danas veliki broj biofarmaceutika baziran
na E.coli, a to su: insulin, interferon (α,β,γ), interleukin 2, stimulirajući faktor kolonija
granulocita (G-CSF), humani hormon rasta (hGH) i tkivni plazminogen aktivator
(tPA).
 Gram-pozitivne bakterije kao domaćin
 Bacillus subtilis, predstavlja čestu bakterijsku alternativu E. coli.
 Nema spoljašnju membranu pa se može postići efikasna ekskrecija
proteina.
 Zato se u B. subtilis kao domaćinu komercijalno proizvodi veliki broj
proteina, pre svega enzimi amilaze i proteaze.
OGRANIČENJE
 B. subtilis proizvodi velike količine i širok spektar sopstvenih
proteaza koje mogu vrlo brzo i efikasno razgraditi rekombinantni
proizvod.
 Izvođenje genetičkih manipulacija kod bakterija B. subtilis je prilično
komplikovano, a jedan od razloga je ograničen broj vektora i
promotora koji se mogu koristiti.
 Plazmidi koji se ubace u B. subtilis su mnogo nestabilniji nego kada
se ubace u E. coli.
 I na kraju, sposobnost ekskrecije proteina koja je uočena prilikom
prirodne proizvodnje proteina sa B. subtilis je značajno smanjena
kada se proizvode rekombinantni ili heterologni proteini.
 Pored bakterija iz roda B. subtilis razmatra se korišćenje i drugih
gram-pozitivnih bakterija kao domaćina, i to pre svega Streptococus
cremoris i Streptomyces sp. Međutim, ove bakterije su slabije
genetski definisane od B. subtilis.
 Niže eukariotske ćelije kao domaćini
 Najznačajniji su kvasci i neke plesni.
 Kvasac Saccharomyces cerevisiae je bio prvi sistem na bazi
eukariotskih ćelija za proizvodnju rekombinantnih proteina.
 Prilično je dobro proučen, brzina rasta mu je velika i može dostići
velike koncentracije (može dostići oko 25 % maksimalnog rasta E.coli
u hranjivoj podlozi koja nije previše skupa).
 Pošto su veći od bakterija lakše se izdvajaju iz fermentacione smeše.
 Dobre strane su to što je već dozvoljeno korišćenje S. cerevisiae u
prehrambenoj industriji i nalazi se na listi GRAS (bezbedan za
upotrebu) pa je olakšano dobijanje dozvole za korišćenje ovog
kvasca za proizvodnju rekombinantnih proizvoda.
 Tehnike genetskih manipulacija su poznate i dobro proučene.
 Kvasci su sposobnosti da vrše jednostavnu glikozilaciju proteina i da
vrše njihovu sekreciju. Geni markeri se razlikuju (auksotrofni mutanti).
NEDOSTACI
 S. cerevisiae često vrši hiperglikozilaciju proteina dodajući im veliki
broj manoznih jedinica – ovakav protein je biološki neaktivan.
 Ne može se postići dovoljno visok stepen ekspresije rekombinantnih
proteina, kao ni njihova zadovoljavajuća ekskrecija.
 I pored navedenih mana S. cerevisiae, do sada je proizvedeno i
licencirano više biofarmaceutika na bazi rekombinantnog kvasca
("Novolog"-insulin; "Leukine" -GM-CFS; vakcine, koagulanti, itd)
 Niže eukariotske ćelije kao domaćini
 Neki metilotrofni kvasci kao što su Pischia pastoris i Hansenula
polymorpha su se pokazali interesantnim kao sistemi domaćina za
proizvodnju određenih proteina.
 Ovi kvasci mogu rasti na metanolu kao izvoru energije, a metanol je induktor
tzv. AOX 1 promotora, koji se može koristiti za kontrolu ekspresije proteina.
 Mogu dostići visoke koncentracije u podlozi (do 100 g/l) što omogućava
proizvodnju velikih koncentracija rekombinantnih proteina (čak i više nego
E.coli).
 Pomoću ovih kvasaca se može postići bolja sekrecija proteina i njihova
prostorna uređenost nego sa E. coli .
 Sposobni za prostu glikolizaciju i, za razliku od S. cerevisiae, ne vrše
hiperglikolizaciju proteina. Tehnike genetskih manipulacija su poznate i
dobro proučene.
NEDOSTACI
 Usled njihove velike brzine rasta, velike koncentracije i intenzivne
metaboličke aktivnosti, oslobađa velika količina toplote u okolni prostor koju
je potrebno odvoditi.
 Potrebno dovoditi velike količine kiseonika koja se troše pri snažnoj
metaboličkoj aktivnosti.
 Pošto je metanol zapaljiv, potrebno je preduzeti stroge bezbednosne mere
prilikom rada.
 I pored svih navedenih zahteva, danas se povećava interes za korišćenje
metilotrofnih kvasaca.
 Niže eukariotske ćelije kao domaćini
 Od nižih eukariota od potencijalnog značaja za korišćenje kao sistem
domaćina su i plesni Aspergillus nidulans i Trichoderma reesei.
 Njihove mogućnosti za efikasnu sekreciju proteina su, uopšteno
posmatrano, veće nego kod S. cerevisiae.
 Međutim, plesni su znatno komplikovanije za industrijsko gajenje
zbog njihove micelijalne strukture.
 Mnoge plesni se komercijalno koriste za proizvodnju enzima, jer su
dobri producenti enzima.

NEDOSTACI

 Sadržaj prirodnih proteaza u plesnima može izazvati probleme zbog

razgradnje rekombinantnih proteina.
 Ograničavajući faktor kod plesni je složena konstrukcija genetičkog
ekspresionog sistema
 Nedostatak sekrecionog sistema koji će biti jednako efikasan za
rekombinantne proteine kao što je efikasan prilikom sinteze prirodnih
proteina (enzima)
 Ćelije sisara kao domaćini
 Ćelije sisara se koriste kao sistem domaćina za sintezu rekombinantnih
proteina onda kada je neophodno da se postigne potpuna autentičnost
proteina koja podrazumeva prostorni aranžman amino kiselina u
proteinima, kao i istovetan proces posttranslacionih promena onome koji
se odvija pomoću ćelija u živom organizmu.
 Dobro to što se u ćelijama sisara vrši ekskrecija većine proteina koji su
od komercijalnog interesa.
 Kao sistemi domaćina za proizvodnju rekombinantnih proteina se
najčešće koriste tzv. CHO ćelija (jajne ćelije kineskog hrčka) ili BHK
(bubrežne ćelije mladunca hrčka).
NEDOSTACI
 Gajenje ćelija sisara je vrlo skupo zbog visoke cene hranjivih podloga i
zbog relativno male brzine proizvodnje rekombinantnih proteina.
 Nedovoljna produktivnost koja se može poboljšati izborom adekvatnog
bioreaktorskog rešenja.
 Bolja produktivnost se može ostvariti korišćenjem kontinualnih-
tumorskih ćelijskih linija ali su tada izuzetno strogi zahtevi za
prečišćavanjem proizvoda. Naročito je važno da se potpuno odvoje
nukleinske kiseline iz proizvoda.
 Neophodne su i stroge mere predostrožnosti i zaštite za osobe koje rade
i vrše manipulaciju i gajenje transformisanih ćelija.
 Ćelije sisara kao domaćini
 Vektori koji se uobičajeno koriste u kombinaciji sa ćelijama sisara
kao domaćinima se uglavnom dobijaju iz humanih ili životinjskih
virusa. I ovde postoji određeni stepen sumnje da može doći do
reverzije ovakvog vektora ponovo u formu koja može biti patogena
za ljude.
 Stepen ekspresije većine vektora koji se koriste kao nosioci gena za
proizvodnju proteina u ćelijama sisara kao domaćinima obično nije
visok i iznosi 5 % od ukupnih proteina.
 Da bi se povećala količina rekombinantnih proteina koja se
proizvede u ćelijama sisara (na primer na 100 mg/l), konstruišu se
vektori sa višestruko povećanim brojem kopija.
 Celokupan proces dobijanja stabilne i produktivne ćelijske linije
može trajati i po 6 meseci, na primer kada se radi sa CHO ćelijama.
 Kvalitet proteina može promeniti ukoliko se promeni vreme
separacije u šaržnoj kulturi. Smatra se da ova promena kvaliteta
proteina najčešće nastaje kao rezultat dejstva proteaza i siladaza
(enzim koji uklanja silalnu kiselinu sa vrha glikoziliranih proteina) iz
mrtvih ćelija. Čak i tu se može se desiti i nekompletno procesovanje
proteina (nepotpuna glikozilacija).
 Sistem ćelije insekata-baculovirus kao domaćini
 Ovo je dosta popularan proizvodni sistem laboratorijsog nivoa (100
l). Razlog za to je što je pomoću njega moguće proizvesti prilično
brzo određenu količinu biološki aktivnih proteina, najčešće za
istraživačke svrhe.
 Prirodne ćelije domaćini ovakvog sistema su insekti i to u fazi larve ili
gliste, a tipični su tzv. "armijski" crv (Spodoptera frugiperda) i
kupusni leptir (Trichoplusia ni).
 Kao vektor za prenošenje rekombinantne DNK u ćeliju domaćina se
koristi baculovirus, Autographa californica – nuklearni polihedrinski
virus (Ac NPV). On se sastoji iz nukleokapsida u kome se nalazi
kružna DNK, veličine genoma 130 kb. On prirodno napada insekte.
 Ovaj sistem je vrlo produktivan sistem za proizvodnju
rekombinantnih proteina.
 Sistema insekt-baculovirus je znatno bezbedniji od sistema ćelije
sisara-retrovirusi (ćelijske linije insekata se dobijaju iz jajnih ćelija ili
embriona insekata su kontinualne ćelijske linije, ali nisu
transformisane. Baculovirus nije patogen za biljke ili ćelije sisara).
 Proizvodnja rekombinantnih proteina sa odgovarajućom prostornom
strukturom se može postići za kraće vreme od jednog meseca.
 Korišćenjem kulture ćelija insekata obično se proizvode one forme
rekombinantnih proteina koje imaju manje složenu strukturu .
 Baculovirus i insekti

Spodoptera frugiperda – leptir i crv (armijski crv)

Autographa californica -
Trichoplusia ni– leptir i crv (kupusni leptir)
baculovirus
 Korišćenje transgenih životinja kao domaćina
 Koriste se u slučajevima kada se proteini sa neophodnom biološkom
aktivnošću ne mogu proizvesti u kulturi animalnih ćelija, a pogotovo
ne u nižim sistemima.
 Životinje se genetički manipulišu tako da proizvedu ciljani protein i
oslobode ga u specifičan telesni fluid, kao što su na primer mleko ili
urin.
 Na taj način je moguće postići visoke koncentracije ciljanog proteina.
 Transgene životinje predstavljaju "živi bioreaktor" za proizvodnju
određenih biofarmaceutika.
 Ovaj način dobijanja kompleksnih bioloških proteina je obično vrlo
skup.
 Zadatak bioprocesnog inženjera je da izvrši adekvatnu separaciju i
prečišćavanje proizvoda, pa je neophodan timski rad između
veterinara, odnosno naučnika koji se bave izučavanjem životinja, i
biohemijskih inženjera da bi se projektovao adekvatan sistem
dobijanja fluida koji sadrži proteine.
 Mada je moguće dobiti transgene životinje velikog broja sisara,
osnovne vrste životinja koje se koriste za komercijalnu proizvodnju
su ovce, koze i svinje.
 U nekim slučajevima protein koji se proizvodi može izazvati
zdravstvene probleme kod životinje domaćina. Osim toga, postoji
rizik od prenosa virusa ili priona.
 Potencijalni ili aktuelni terapeutski proteini proizvedeni
iz mleka transgenih životinja

Protein Transgena Ostvarena

životinja ekspresija u mleku
tPA Koza 6 g/l
Interleukin -2 Zec 0,5 mg/l
Faktor VIII Svinja 3 mg/l
AAT (-1 antitripsin)- protein se stvara u Ovca 35 mg/l
jetri, nedostatak utice na bolesti pluća
Faktor IX (Božićni faktor-Hemofilija B) Ovca 1 g/l
α1-antitripsin Koza 20 g/l
Fibrinogen Ovca 5 g/l
Eritropoetin Zec 50 mg/l
Antitrombin III Koza 14 g/l
Humani α-laktoalbumin Krava 2,5 g/l
Insulinski faktor rasta I Zec 1 g/l
Protein C Svinja 1 g/l
Hormon rasta Zec 50 mg/l
Proizvodnja AAT (-1-antitrypsin) pomoću transgenih životinja
1) Ženskoj ovci de daje hormon plodnosti u cilju stimulisanja produkcije
jajnih ćelija i uzima se nekoliko zrelih jajnih ćelija. Prva proizvodnja u
transgenoj ovci Tracy, PPL Pharmaceuticals u Edinburgh-u 1993.
2) Vrši se vantelesna oplodnja jajnih ćelija

3) Konstruiše se plazmid koji sadrži gen za humani AATsa sekvencom

promotora za -laktoglobulin. Stotine kopija ovog plazmida se
mikroinjektiraju u nukleus opodjenog zigota (jajne ćelije). Svega
nekoliko zigota će biti transformisano.
4) Zigot se razmnožava in vitro sve dok se ne podeli do 16 ćelija.
5) Embrion od 16 ćelija se implementira u matericu surogat majke ovce i
svega nekoliko implanta će uspešno izazvati trudnoću.
6) Svi potomci surogat-majke se testiraju na proizvodnju AAT u mleku
(to je jedini način da se nadje koji su zigoti primili AAT gen koji se
ekspresirao. Svega 1 od oko 20 jajnih ćelija će imati tu sposobnost.
7) Skuplja se mleko transgenih ovaca do kraja njihovog života. Mleko
sadrži oko 35 mg AAT po litri. Ove zivotinje se takodje dalje umnožavaju
da bi imale potomke transgenih ovaca za istu svrhu
8) Prečišćavanje preparata AAT koji vredi oko £50 000 po mg.
 Korišćenje transgenih biljaka i kulture biljnog tkiva

 Neki proteini kao što su antitela ili čestice slične virusima (koje čine
vakcine) se mogu proizvesti u biljkama i to relativno jeftino u poređenju
sa drugim sistemima.
 Pošto biljni virusi nisu infektivni za ljude, ne postoje rizici po ljudsko
zdravlje prilikom njihovog korišćenja.
 Uvećanje razmera procesa, kada su u pitanju transgene biljke, se lako
izvodi samo povećanjem površine zasejane biljkama.
 Troškovi kultivacije biljaka su relativno niski.
 Najefikasniji vektor za ubacivanje gena u biljku je zemljišna bakterija
Agribacterium tumefaciens.
 Korišćenjem adekvatnih promotora moguće je izvršiti ekspresiju
rekombinantnih proteina u različite delove biljke, napr. u jestive delove
biljke, što ujedno i smanjuje potrebu za rigoroznim prečišćavanjem.
 Loša strana transgenih biljaka je to što su brzine ekspresije tj.
proizvodnje transgenih proteina relativno niske. Prinos od 1 % od
ukupnih rastvornih proteina se smatra zadovoljavajućim.
 Proizvodnja terapeutskih proteina pomoću transgenih biljaka nije još
našla širu industrijsku primenu. Razlog su navedeni nedostaci ovog
sistema, kao i komercijalna dostupnost pogodnijih ekspresionih
sistema.
 OGRANIČENJA PROCESA SA GENETIČKI
MANIPULISANIM ORGANIZMIMA –
GENETIČKA NESTABILNOST

Stvaranje velike količine rekombinantnih

proteina ima uvek negativne efekte za
ćeliju domaćina, a ponekad može imati i
letalno dejstvo.
Ćelije vremenom gube kapacitet stvaranja
rekombinantnog proteina, a one ćelije koje
izgube sposobnost stvaranja proteina
rastu brže od originalnih ćelija domaćina.
 Ovo vodi genetičkoj nestabilnosti ćelija.
Faktori koji utiču na genetičku stabilnost:
1. segregacioni gubici;
2. strukturna nestabilnost;
3. regulatorne mutacije ćelija domaćina i
4. odnos brzina rasta ćelije bez plazmida ili
izmenjenih ćelija prema brzini rasta
neizmenjenih ćelija koje sadrže
plazmide.
 Segregacioni gubitak
 Segregacioni gubitak se dešava onda kada se ćelija deli tako da jedna
ćelija ćerka uopšte ne dobija plazmide.
 Postoje plazmidi koji se javljaju u ćeliji u velikom broju kopija -obično
više od 20 po ćeliji. Za razliku od njih postoje plazmidi koji se javljaju u
malom broju kopija u ćeliji - svega 1 ili 2 plazmida po ćeliji.
 U ćelijama u kojima se plazmidi javljaju u malom broju kopija stvaraju se
mehanizmi kojima se vrši ravnomerna raspodela plazmida u ćelije ćerke.

Redak
slučaj

Uobičajeni
slučaj

Slučajna distribucija
(binomalna)
 Segregacioni gubitak
 Plazmidi koji se javljaju u velikom broju kopija se raspodeljuju
slučajno (ili skoro slučajno) izmedju ćelija ćerki. Skoro sve ćelije
ćerke dobijaju odredjen broj plazmida, ali i pored toga što je
mala verovatnoća nastajanja ćelija bez plazmida i iznosi
1:1000000 deljenja, kada se uzme u obzir da u bioreaktoru ima
jako mnogo ćelija može se računski proceniti da će ipak nastati
odredjen broj ćelija koje nemaju plazmide (napr. u bioreaktoru
zapremine 1000 l sa 109 ćelija/ml ima ukupno1015 ćelija, u
svakoj generaciji se stvara 109 ćelija bez plazmida).
 Na segregacioni gubitak plazmida mogu uticati razni faktori
okoline, kao napr. koncentracija rastvorenog kiseonika,
temperatura, sastav hranjive podloge, brzina razblaženja u
protočnom reaktoru.
 Mnogi plazmidi će stvarati multimere, koji predstavljaju
višestruke kopije istog plazmida koji su slepljeni jedan za drugi i
stvaraju agregat tj. prostu jedinicu. Dimer je replikativna
jedinica kod koje su dva plazmida spojena, trimer sa tri
plazmida spojena, a tetramer je jedinica koja se sastoji od četiri
zasebna monomera koja su spojena zajedno.
 Slučajna raspodela plazmida
Verovatnoće (P) da će se formirati ćelije bez plazmida je:
1  Z 
P  2
gde je:
Z broj replikativnih jedinica plazmida
Za Z=40 verovatnoća je P=1,810-12 to jest da će se
stvoriti pri deljenju 1,810-12 ćelija bez plazmida.

Ukoliko plazmidi stvaraju agregate, tj. dimere, trimere ili

tetramere, tada je broj replikativnih jedinica manji i
verovatnoća nastajanja ćelija bez plazmida je veća.
 Strukturna nestabilnost plazmida
 Pored problema koji se javljaju kao posledica segregacione
nestabilnosti plazmida, kod nekih ćelija se dešava da one
zadržavaju plazmide ali menjaju njihovu strukturu da bi smanjile
negativne efekte koje oni mogu imati na ćeliju. Ova pojava se
naziva strukturna nestabilnost plazmida.
 Tako na primer, plazmidi mogu nositi dve osobine: rezistenciju na
antibiotike i sposobnost stvaranja stranih proteina. Aktivnost
stvaranja stranih proteina oduzima ćelijama sposobnost rasta i
energiju ćelije usmerava ka stvaranju proizvoda. Ukoliko se u
podlogu doda antibiotik, ćelijama će pomoći da prežive to što imaju
prisutan gen za rezistentnost na antibiotik. Zato će u ćelijama doći
do strukturne izmene plazmida tako da se zadrže one osobine koje
su u tom trenutku od značaja, a to je rezistencija na antibiotik. Pri
tom će se smanjiti sposobnost plazmida da kodiraju sintezu
rekombinantnih proteina.
 Takodje, u ovakvim uslovima, može doći će i do integrisanja gena
za rezistenciju na antibiotik u hromozom. Ćelije koje sadrže
strukturno promenjene plazmide mogu rasti mnogo brže od ćelija sa
originalnim plazmidom. Ovakva kultura kod koje je došlo do
promene plazmida je preživela tzv. strukturnu nestabilnost.
 Mutacije ćelija domaćina
 U ćeliji se mogu javiti takve mutacije koje će
delovati u pravcu smanjenja stvaranja proteina i
povećanja brzine rasta ćelija.
 Osnovna karakteristika ove vrste genetičke
nestabilnosti je to da se usled mutacije ćelije
domaćina, ćelijama vraća sposobnost
normalnog rasta, tako da će ćelije mutanti vrlo
brzo postati dominantne u kulturi.
 U ovom slučaju mutirane ćelije će sadržati
neizmenjene plazmide, ali će njihova
sposobnost da stvaraju rekombinantne proteine
biti smanjena.
 Nestabilnost uslovljena većom brzinom rasta

Genetička nestabilnost

Log ćelijskog Log ćelijskog Log ćelijskog

broja broja broja

 +1 -
 +2

Vreme Vreme Vreme

P P P
P P
P PP P
P
P P P

Ćelije koje sadrže Ćelije bez

plazmide plazmida

Ćelije koje sadrže plazmide (O) su one koje aktivno stvaraju protein (P). Ove ćelije
usmeravaju manje energije ka rastu, pa je zbog toga njihov rast sporiji od ćelija koje ne
sadrže plazmide ( +1 +2 -).
NESTABILNOST USLOVLJENA VEĆOM BRZINOM RASTA
 Značaj svih dosada navedenih faktora genetičke nestabilnosti (segregacioni
gubici, strukturna nestabilnost, regulatorne mutacije ćelija domaćina) zavisi
od razlike u brzini rasta izmenjenih ćelija koje nose plazmide i originalnih
(neizemenjenih) ćelija.
 Brzina rasta se može delimično podešavati izborom podloge (korišćenjem
selektivnih komponenti za usporavanje rasta izmenjenih ćelija ili dodatkom
antibiotika koji će ubijati ćelije koje su izgubile plazmide) ili korišćenjem
takvog proizvodnog sistema ćelija domaćin-vektor u kome se u većem delu
perioda gajenja kulture neće dozvoliti proizvodnja rekombinantnog proteina.
 Ovo je moguće izvesti ugradnjom inducibilnog promotora koji će se aktivirati
nakon dodatka induktora. Dodatak induktora se vrši tek pri kraju šaržnog
ciklusa kulture, u periodu kada je preostalo svega jedan ili dva vremena
udvostručenja ćelija. Pre dodatka induktora, pošto još nije počela sinteza
rekombinantnog proteina, odnos brzine rasta genetski izmenjenih i
neizmenjenih ćelija biće blizak jedinici. U ovom slučaju se primenjuje
modifikovani šaržni sistem ili dvostepena fermentacija korišćenjem
dvofaznog hemostata) gde će se u prvoj fazi će se optimizovati proizvodnja
ćelija koje nose plazmide, a u drugoj fazi će se indukovati sinteza proteina.
 Problem genetičke nestabilnosti je više izražen u komercijalnom postupku
nego u laboratorijskim uslovima jer u industrijskoj proizvodnji kultura mora
proći kroz veliki broj generacija da bi se postigla potrebna ćelijska gustina.
 PREDVIDJANJE INTERAKCIJA ĆELIJA
DOMAĆINA I VEKTORA I GENETIČKE
NESTABILNOSTI
 Predvidjanje interakcija koje će se desiti izmedju ćelija
domaćina i vektora i predvidjanje pojave genetičke
nestabilnosti se može vršiti pomoću matematičkih
modela.
 Tako se mogu postaviti modeli plazmidne replikacije koji
polaze od matematičkih izraza koji su izvedeni za ćelijski
rast.
 U njih se uključuju i komponente koje opisuju plazmidnu
replikaciju. Modeli mogu biti različitog stepena
složenosti.
 Složeniji modeli su struktuirani i segregirani i u njih se
ubacuju jednačine koje opisuju distribuciju plazmida u
okviru populacije i uticaj stvaranja multimera na
genetsku stabilnost.
 Medjutim oni su suviše složeni za nivo koji se izučava u
ovom kursu.