Genska terapija

Genska terapija
 Smatra se vrlo perspektivnom tehnologijom
 Za sada je svege nekoliko biofarmaceutika na bazi DNK odobreno za
medicinsko korišćenje, ili je u fazi licenciranja
 Smatra se da ima veliki potencijal u lečenju genetskih bolesti,
odnosno onih kod kojih je došlo zbog urođenih greški u metabolizmu,
ili drugih manifestacija, zbog prisustva defektne kopije specifičnog
gena ili nekoliko gena.
 Prvi eksperiment lečenja genskom terapijom je izveden u Americi
1990. g. Od tada je u celom svetu izvedeno, ili je u toku, preko 400
različitih kliničkih studija koje uključuju više od 6000 pacijenata.
Međutim, i pored početnog entuzijazma, do sada je svega nekoliko
studija pokazalo pozitivne terapeutske rezultate kod pacijenta, a
trajno izlečenje nije još zabeleženo.
 Generalno, genska terepija se može izvoditi prenosom gena u dve
vrste ćelija: somatske (telesne ćelije) ili reproduktivne (obično jajna
ćelija ili embrione ćelije). Pri tome se danas u praksi kod ljudi
primenjuje prenos gena u somatske ćelije. Osnovna razlika je u tome
što se prilikom ubacivanja gena u somatske ćelije osobina ne prenosi
na sledeće generacije dok se u drugom slučaju ovo može postići.
Osnova genske terapije
 Geni predstavljaju deo DNK, sastoje se od
specifičnih baznih sekvenci i kodiraju sintezu
proteina
 Genska terapija podrazumeva uvođenje određenog
gena u ćelije, tako da se ekspresijom tog gena u
ćeliji domaćina (pacijenta) ostvaruje terapeutsko
dejstvo
 Genska terapija ima potencijal u lečenju bolesti:
 Genetičkih oboljenja
 Kancera
 AIDS-a
 Bolesti koje imaju potencijal lečenja genskom
terapijom
Bolesti za koje se vrše klinička ispitivanja lečenja genskom terapijom

Kancer – razne vrste Hemofilija

Cistična fibroza Bolest teškog kombinovanog

(nasledna sklonost bakterijskim
infekcijama)
Porodična hiperholesterolemia
(defekt receptora na ćelijama za
vezivanje i degradaciju β-lipoproteina)
Gošeova bolest
(poremećaj u stvaranju enzima
Glukocelebrozidaze)
poremećaja imuniteta -TIK (SCID).
(Nedostatak zrelih T i NK ćelija, češće
muškarci (nasledjivanje preko X hrom.
majke))
Hronična granulomatozna bolest
(HGB)-bolest imunog sistema- fagocitnih
ćelija češće muškarci (X hrom)
α – antitripsin deficit
(α – antitripsin štiti tkiva od proteolize,
stvara se u jetri)

Nedostatak purin nukleozid Bolest perifernih krvnih sudova

fosforilaze (PNP)

AIDS Reumatoidni artritis

Simptomi Gošeove bolesti (nedostatak enizma
glukocelebrozidaze za lipide)

Mikroskopski prikaz tipične Gošeove (Gaucherove) ćelije.

Prekomerno nakupljanje glukocerebrozida u ćelijama jetre,
slezine i koštane srži
Uzrok nastanka ove bolesti predstavlja nedostatak enzima
glukocerebrozidaze koji se nasledjuje autozomno-recesivno,
što znači da je potrebno dve kopije ovih gena da bi se bolest
ispoljila.
Osobe muškog pola obolevaju podjednako kao i osobe
ženskog pola.

Učestalost:1:40.000 do 1:100.000

Simptomi Gošeove bolesti

 PODELA GENSKE TERAPIJE
PREMA CILJANIM ĆELIJAMA

 somatska genska terapija, gde ciljane ćelije mogu biti sve ćelije
organizma, osim polnih,
 reproduktivna genska terapija, kod koje se genetski materijal unosi
u jajnu ćeliju ili u embrione ćelije. Ovakva genska terapija još nije
odobrena.
Danas se u praksi kod ljudi primenjuje prenos gena u somatske
ćelije. Osnovna razlika je u tome što se prilikom ubacivanja gena u
somatske ćelije osobina ne prenosi na sledeće generacije dok se u
drugom slučaju ovo može postići.

PREMA NAČINU PRIMENE

 in vitro genska terapija – obavlja se u laboratorijskim uslovima na
ćelijama koje se kasnije vrate u organizam bolesnika,

 in vivo genska terapija – genetski materijal se unosi direktno u

bolesnika, posredstvom vektora.
 Uprošćena šema osnove genske terapije
Nukleus
Vektor

Gen koji se želi

preneti
(a)
Ciljana ćelijska
DNK

Inracelularni
efekat

ili
(c) (b)
Ekstracelularni
efekat

Genetski materijal koji je potrebno preneti se prvo pakuje u neku formu vektora koji se
koristi za prenos DNK u ciljanu ćeliju. (a) Ulaz terapeutske DNK – obično zajedno sa svojim
vektorom-u citoplazmu ćelije; (b) Prenos DNK u nukleus ćelije recipijenta; ovo je obično,
mada ne uvek, praćeno integrisanjem stranog genetskog materijala u ćelijsku DNK; (c)
Strani gen (bilo da je integrisan ili ne) se ekspresira, što rezultira u sintezi željenog
proteinskog proizvoda. Regulatorni elementi unete DNK se koncipiraju tako da proteinski
proizvod ostane u ćeliji, ili pak da se izbacuje iz ćelije
IN VITRO GENSKA TERAPIJA

Geni se ubacuju u
Matične ćelije
Krvne ćelije
Epitelne ćelije
Ćelije jetre
IN VIVO GENSKA TERAPIJA
 In vivo metoda je
jednostavnija, ali je manje
precizna od in vitro metode

 In vivo metoda je jedina

moguća opcija kod ćelija
koje ne mogu da se uzgajaju
in vitro uslovima

 Problem je ciljano uvesti

DNK sa vektorom u željene
ćelije (napr. strategije
vezivanja vektora sa DNK za
monoklonkska antitela ili za
hormon, vezivanje preko
antigena ili receptora)
 Strategija genske terapije
Strategija genske terapije zavisi od konkretnog
slučaja, odnosno od toga šta se želi postići
genskom terapijom. Uključuje sledeće:
 Izbor ciljane ćelije i vektora za prenos DNK zavisi
od bolesti koja se leči
I. Izbor ciljane ćelije
 Hiperholesterolemija - ćelije jetre (hepatocite),
 Hemofilija - bilo koje ćelije koje proteine izlučuju
u krv.
 Izbor protokola
 Dužina trajanja ekspresije gena
 Kod genetičkih defekata - duga ekspresija gena,
 Kod kancera - kratkotrajna ekspresija gena.
VEKTORI KOJI SE KORISTE U GENSKOJ
TERAPIJI
 Vektori su nosači koji se koriste prilikom ubacivanja
genetskog materijala u ćeliju.

 Koriste se:
– virusni vektori (retrovirusi, adenovirusi itd. ),
– nevirusni vektori (lipozomi, molekulski konjugati i
"gola" DNK)
 Virusi se modifikuju:
– bezbedni za čoveka (imunološki sistem bolesnika
može reagovati na unošenje virusa, pa virus potpuno
eliminisati),
– povećava se sposobnost da se geni uspešno ubace u
ciljane ćelije domaćina.
 Vektorski sistemi
Vektorski sistemi na Nevirusni vektorski
bazi virusa sistemi
Retrovirusi Nukleinske kiseline u
lipozomima

Adenovirusi Molekularni konjugati

Združeni adenovirus Direktno ubacivanje DNK

Herpes virus Taloženje sa CaPO4

Polio virus Elektroporacija

Virus vakcine Brze čestice

 RETROVIRUSI
Genom im se sastoji od jednostruke RNK (5-8kb), koja se kopira do
DNK.
U 80% slučajeva genske terapije se koriste retrovirusi kao vektori.

Prednosti retrovirusa:
 Lako ulaze u različite ćelijske vrste
 Lako i stabilno integrišu svoj genom u genom ćelije domaćina
 Dobro su proučeni
 Visok nivo ekspresije koja dugo traje
 Ubacuju svoju DNK samo u ćelije koji se aktivno repliciraju
 Efikasnost prenosa gena u najosetljivije ćelijske vrste je visoka
 Deljenjem ćelije se kompletna virusna DNK prenosi na ćerke
ćelije
 Mogu se proizvesti velike koncentracije retrovirusa koji se ne
mogu replicirati (radi bezbednosti)
 RETROVIRUSI
Nedostaci retrovirusa:
 Napadaju smo ćelije koje se dele (ne napadaju moždane, pluća,
jetru, mišićne ćelije)
 Napašće samo ćelije koje na svojoj površini imaju receptore za ove
viruse. Pošto je na sadašnjem nivou razvoja nauke identitet
mnogih virusnih receptora još uvek nepoznat, može doći do
integracije i ekspresije gena koji nose virusi u druge ćelije, koje
nisu ciljane ćelije domaćina i do fizioloških komplikacija u
organizmu.
 Ubačeni geni se integrišu u hromozom ćelije domaćina prema
slučajnom uzorku pa ukoliko se ubačeni gen integriše u hromozom
u sredinu gena čiji proizvod ima ključnu ulogu u ćeliji, to može
nepovratno da ošteti ćelijske funkcije, ili čak može izazvati smrt
ćelije ako se spreči ili omete proizvodnja nekog ključnog
metaboličkog enzima.
 Ukoliko se provirusne nukleinske kiseline integrišu na mesto koje
je blizu mesta gde su smešteni ćelijski onkogeni, može doći do
njihove aktivacije
 Sprečavanje dejstva tumor supresor gena
 Labilna priroda –laki su za gajenje i umnožavanje ali se mogu
oštetiti u toku faze prečišćavanja i koncentrisanja
Adenovirusi, struktura čestica:

 •Čestice nisu
obavijene
 Sastoje se od
linearne dvostruke
DNK
 Ne integrišu se u
genom domaćina
 Repliciraju se kao
zasebni elementi u
jedru
 ADENOVIRUSI
 Adenovirusi poseduju dvostruku DNK (35kb)
 Nakon infekcije, virus svoju DNK ubacuje u jedro ali se DNK virusa ne integriše
u DNK domaćina.

Prednosti adenovirusa:
Prenos gena u ćelije koje se ne dele,
Lako se umnožavaju,
Obično se ostvaruju visoke ekspresija gena,
Relativno su stabilni virusi
Mogu se koristiti i za in vivo i in vitro terapiju
Nedostatak adenovirusa:
Izazivaju snažan imuni odgovor pacijenta
(Jessie Gessinger mladi pacijent volonter umro
1999g od snažnog imunog odgovora)
Vreme trajanja ekspresije ubačenih gena
može varirati, obično ne traje dugo, (obično 5-
10 dana nakon infekcije)
Mogu inficirati širok spektar vrsta ćelija.
Združeni adenovirusi (AAV)

Jednostruka DNK (ssDNK), sastoji se samo od dva gena (cap i

rep, oba se zamenjuju ciljanim genom), mali virus
Ne izaziva bolest kod čoveka,nije patogen
Ne može samostalno da se replicira,
Primena u genskoj terapiji – samo mali geni (manji od 4.7 kb),
Ubacuju gen u ćelije koje se ne dele,
Ekspresija gena je dugotrajna,
Gen se integriše u genom ćelije domaćina, kod čoveka u 19
hromozom.

Herpes simpleks virus (HSV)

U fazi ispitivanja i ne koriste se praktično,
Neurotrofan virus (može prenositi gene u neurone centralnog i
perifernog nervnog sistema),
Teško se dobijaju čestice virusa koje su efikasne i nezavisne od
replikacije ćelija domaćina.
Proizvodnja virusnih vektora
Kultura pakovanih ćelija
(reaktor za animalne ćelije)
Zasejavanje sa
vektorom

Propagacija vektora
(u pakovanim ćelijama)

Izdvajanje proizvedenog
vektora

Koncentrisanje vektora

Preščišćavanje virusnih
vektora

Formulisanje virusnih
vektora (punjenje)
 NEVIRUSNI VEKTORI
20-25% klinickih ispitivanja

„Gola" DNK – najjednostavniji način ugradnje DNK

u ciljanu ćeliju. U ćeliju se unosi
– mehaničkim metodama (direktna injekcija u
tkivo) ili
– bombardovanjem tkiva velikom brzinom sa
DNK koja je vezana na čestice zlata.

Lipozomi – DNK se smešta u kružne plazmide,a

onda se smešta u membranu od fosfolipida

Konjugati – DNK se smešta u kružne plazmide,a

onda se smešta u membranu od polilizina, koji se
kombinuju sa PEG da bi stabilizovao.
 NEVIRUSNI VEKTORI
Prednosti :
Mali ili zanemarljiv imuni odgovor,
Ne dolazi do integacije gena u hromozom domaćina.

Nedostaci:
Nukleaze u krvi razgrađuju DNK,
Nespecifične reakcije sa ćelijama i proteinima seruma,
Teško pronalaze ciljane ćelije
Ulazak u ćelije i prenos genetskog materijala (1 od 104-
105 plazmida koji se unesu u ćeliju endocitozom ulazi u
jedro i geni tog plazmida budu ekspresirani, yahtevaju
velike količine genetskog materijala)
Intramuskularna injekcija je efikasnija od intravenozne
(sadržaj endonukleaza je veći u krv. serumu nego u
mišićima)
 KARAKTERISTIKE RAZLIČITIH SISTEMA
Združeni
Retrovirus Adenovirus Gola DNK Lipozomi
adenovirus
DNK ili
Transfer genoma RNK DNK DNK DNK
RNK
Titar virusa 106-109/ml 1011-1017/ml 1010/ml - -
Prečišćavanje Teško Da Da Da Da

Max veličina gena 8 kb 7,5 kb 5 kb >50 kb >50 kb

In vivo korišćenje Ne Da Da Da Da

Integracija Da Ne Da Slaba Slaba

Efikasnost Visoka Vrlo visoka Srednja Srednja Niska
Inserciona
Bezbednost Imune reakcije Nepoznata Nepoznata Nepoznata
mutageneza
Ćelije koje se ne
Ne Da Da Verovatno Verovatno
dele
Potrebna Kratkotrajna Proizvodnja je Niska Niska
Ograničenja
deoba ćelija korekcija složena efikasnost efikasnost
GENSKA TERAPIJA U LEČENJU KANCERA

 Kancer - zajednički naziv za grupu bolesti kod kojih se

abnormalne ćelije dele bez kontrole i napadaju druga
tkiva.

 DNK ćelije može da se ošteti ili da se promeni, pa

dolazi do mutacija koje utiču na rast i deljenje ćelije.

 Kada se DNK ošteti, ćelije ne umiru kada bi trebale i

sve više ćelija se proizvodi iako u organizmu nisu
potrebne. Od ovog viška ćelija može da se razvije
masa tkiva koja se naziva tumor.
 GENSKA TERAPIJA U LEČENJU
KANCERA
 Najveći broj istraživanja i eksperimenata je do sada izvršeno u
oblasti primene genske terapije za lečenje kancera
 Rak je jedna od najrasprostranjenijih bolesti.
 Oko 1,4 miliona slučajeva trenutno boluje u SAD, a procenat
preživljanja korišćenjem konvencionalnih tehnika je oko 50 %.
 Prvi eksperimenti primene genske terapije za lečenje kancera su
izvršeni 1991. godine.
 Iako postoje obećavajući rezultati, zasada se još uvek ne postiže
potpuno izlečenje kancera metodama genske terapije zbog brojnih
faktora koji uključuju:
 nedostatak efikasnih specifičnih vektora;
 potrebu rasvetljavanja mehanizma kako ćelije kancera
izbegavaju normalni imuni odgovor;
 mnogi pacijenti do sada tretirani su iz etičkih razloga bili u kasnim
fazama razvoja bolesti i sa vrlo malom ili potpuno nikakvom
verovatnoćom preživljavanja.
 GENSKA TERAPIJA U LEČENJU
KANCERA

Strategije:

1) Gen koji je nestao ili se modifikovao menja sa zdravim

genom (tumor supresor gen p53)

2) Stimuliše se imuni odgovor organizma pacijenta, tako da

imune ćelije pacijenta same napadaju ćelije kancera

3) Ubacuju se geni u kancerogene ćelije, tako da izmenjene

kancerogene ćelije postanu osetljivije na zračenje,
hemoterapiju i druge tretmane
 GENSKA TERAPIJA U LEČENJU
KANCERA
4) U matične ćelije se ubace geni koji ove ćelije
čine otpornijim na sporedne efekte visokih
doza antikancerogenih lekova i zatim se vrate u
telo pacijenta, na taj način koštana srž je
zaštićenija tokom hemoterapije

5) U ćelije raka ubacuju se geni koji ubijaju ćelije

kancera -ubice. Neaktivan oblik toksičnih
lekova se daje pacijentu, on se aktivira u
ćelijama raka gde dolazi do uništenja tih ćelija
(slucaj D).
 Šematski prikaz imunoterapije kod
kancera

Slučaj A prikazuje imunoterapiju sa promenjenim ćelijama kancera. Slučaj B

prikazuje imunoterapiju sa genima in vivo. Slučaj C prikazuje imunoterapiju sa
promenjenim ćelijama imuno sistema
 Šematski prikaz antikancerogene terapije pomoću
inženjerizovanih virusa

Slučaj D) Virusi su inženjerizovani tako da selektivno ubijaju ćelije

kancera. Neki mogu biti vezani za citostatik i nose gene za aktivaciju
citostatika. Gen je neaktivan sve dok ne dodje do ćelije gde se aktivira.
 GENSKA TERAPIJA U LEČENJU GENETIČKIH
BOLESTI
Genetičke bolesti nastaju kada gen mutira, tako da se ne
proizvodi protein.

Cilj je da se defektan gen zameni normalnim genom, tako da

se protein sintetiše.

Problemi koji se javljaju:

Za mnoge bolesti se ne zna koji je gen odgovoran za
njeno nastajanje,
Mnoge bolesti su složene, gen se mora ubaciti u više
različitih ćelija,
Vektori koji se koriste za prenos gena nisu zadovoljavajući
i komplikovana je regulacija ekspresije tih gena,
Više pažnje se posvećuje genskim terapijama za lečenje
kancera.
Primeri genetičkih bolesti za koje je identifikovan defektan gen
Bolest Defektan proizvod gena
Hemofilija A Faktor VIII
Hemofilija B Faktor IX
Talasemija β-globin
Porodična holesterolemija Protein receptor male gustina
SCID Adenozin deaminaza, purin nukleotid
Teška kombinovana imunodeficijencija fosforilaza
Gošeova bolest Glukocerebrozidaza
Cistična fibroza Transmembranski regulator cistične fibroze
Mutacija na hromozomu 7 (pluća)
Fenilketonurija Fenilalanin hidroksilaza
(mentalna retardacija, ne metaboliše se Fenilalanin
Tirozinemija tip I (bolest jetre) Fumarilacetoacetat hidrolaza
Defekt skladištenja glikogena Glukoza -6-fosfat
(nagomilavanja glik. u jetri, mišićima, tkivima)
Galaktozemija Galaktoza-1-fosfat uridil transferaza
Nemogućnost metabolisanja galaktoze
 GENSKA TERAPIJA U LEČENJU GENETIČKIH BOLESTI
 Prva primena genske terapije bila je lečenje teškog kombinovanog poremećaja imuniteta (TKI -
SCID) 1992. godine
 je redak oblik primarne imunodeficijencije kod koga postoji kombinovani nedostatak funkcije T
i B limfocita (a kod mnogih slučajeva i odsustvo funkcije NK limfocita ili prirodnih ubica
mikroorganizama). Manifestacije i poremećaji mogu biti razni :Nedostatak Adenozin Deaminaze,
Purin Nukleotid Fosforilaza ili drugih enzima ili biološki aktivnih proteina.
 Ona dovode do ekstremne osetljivosti organizma na mikroorganizme (antigene) i veoma
ozbiljnih infekcija.

Problemi su se javili
(2005) deca koja su
učestvovala u
eksperimentalnim
tretmanima dobila
leukemiju od
retrovirusa koji je
korišćen u terapiji.
ADA gen- adenozin
deaminaza, koja
nedostaje kod SCID.
GENSKA TERAPIJA U LEČENJU GENETIČKIH
BOLESTI

Aktuelna su i istraživanja za primenu genske terapije u

lečenju:

 Cistična fibroza;
 Familijarna hiperholesterolemija;
 Hemoglobinopatija (poremećaj u sintezi hemoglobina –
Talasemija ili u strukturi hemoglobina sintetisanog
hemoglobina, dosta česta u Mediteranskim zemljama,
potrebna 2 hromozoma od oca i majke da bi se razvila
bolest)
GENSKA TERAPIJA U LEČENJU HIV-A

 Ubacivanje gena koji kodira proizvodnju izmenjenog,

disfunkcionalanog proteina HIV-a;

 Istraživači su napravili i rekombinantnu ćeliju koja može

da proizvodi virusni receptor - CD4 antigen, tako da se
virusne čestice vežu za ovaj receptor, a ne za druge
ćelije u organizmu koje su osetljive na virus;
 Genska vakcina kojom bi se u organizam čoveka
ubacivali vektori koji sadrže gen za sintezu površinskog
proteina antigena HIV virusa.
 TEHNIKA BESMISLENIH GENA

 Koristi se kada je povećana ili neodgovarajuća sinteza

proteina

 Kraći, jednostruki lanci DNK ili RNK se vezuju za

specifična mesta na DNK ili na mRNK

 Oligonukleotidi se sastoje od 17 ili više nukleotida

Prednosti
– Visoka specifičnost
– Minimalna toksičnost
– Jednostavna sinteza in vitro

Nedostaci
– Osetljivost na nukleaze
– Malo vreme poluživota u krvnom serumu
– Slabo prihvatanje od strane ćelije
 ZAKLJUČAK

 Mogućnosti genske terapije su ogromne, ali su

ograničene lošim performansama trenutno dostupnih
vektorskih sistema (danas se razvija mnogo sistema za
prenos gena i to će u isto vreme potpomoći trenutne
strategije i omogućiti razvoj novih).

 Genska terapija je još uvek u fazama razvoja, ali se

veruje da će biti u rutinskoj praksi za desetak godina.