Dijagnostika leptospiroze

Uzorci: Žive životinje – krv, urin, CSF, uterusna tečnost, placentalni kotiledoni (mleko je destruktivno za μo)
Leševi (i pobačeni fetusi) – bubrezi; uginuće usled septikemije: jetra, slezina, bubrezi, pluća, mozak, oči.

Upotreba, interpretacija i vrednost laboratorijskih dijagnostičkih procedura za leptospirozu zavise od:

kliničke slike, trajanja infekcije i serovara koji je prouzrokovao infekciju.

Klinička sumnja na akutnu leptospirozu → iznenadna agalakcija, ikterus i hemoglobinurija (pogotovo mlada
slika: grla), meningitis; akutna insuficijencija bubrega (depresija, inapetenca, povraćanje, često oligurija,
bolni bubrezi; povećanje BUN i kreatinina, proteinurija) ili žutica kod pasa
sumnja na hroničnu leptospirozu → abortus, rađenje mrtve ili avitalne mladunčadi; sterilitet; HBI
(hronična depresija, inapetenca, povraćanje, pad TM, PU/PD, mali/normalni bubrezi, povišen BUN i
kreatinin, proteinurija) ili hronični aktivni hepatitis kod pasa; periodična oftalmija kod konja

Posledice hronične leptospiroze je lokalizacija i perzistencija bakterija u: - bubrezima
- genitalnom traktu

1. Izolacija i identifikacija uzročnika

Dokazivanje leptospira u krvi i mleku životinja koje manifestuju kliničke simptome ukazuje na akutnu leptospirozu.
Problemi: - infekcija često protiče subkliničkim tokom
- izolacija iz krvi je teška (bakterijemija je prolazna, psi su često tretirani antibioticima)
Dokazivanje leptospira u tkivima ante-/postmortem, takođe se smatra korisnim. Problemi su:
- životinja je dugo živela sa infekcijom (mali broj, lokalizovanih μo)
- primena Ab
Dokaz uzročnika u genitalnom traktu, bubrezima, ili urinu, interpretira se uzimajući u obzir kliničku sliku i serološke
rezultate jer prisustvo leptospira može da ukaže na stanje kliconoštva, a ne i da je ova bakterija prouzrokovala go-
re navedene simptome.

* Tokom leptospiremije, μo se replikuje u jetri, slezini, bubrezima, reproduktivnom traktu, očima i CNS-u.
 Akutna leptospiroza – intersticijalni nefritis (bubreg psa). Radijalne ble- Hronična leptospiroza – (bubreg psa). Blede linije i fokusi u
de linije su nastale usled kortikalne tubularne nekroze i akutne intersti- korteksu nastaju uglavnom usled intersticijalne limfoplazmo-
cijalne infiltracije. Hilarno masno tkivo i medula, žuti su ules ikterusa. citne infiltracije.

Bakteriemija kratko traje i razvija se leptospirurija. Uzročnik se može dokazati u urinu, međutim negativna urino-
kultura ne isključuje infekciju. Problem kod izolacije je: intermitentno izlučivanje ili izlučivanje malog broja μo.
* davanje diuretika (furosemid) pre uzorkovanja povećava verovatnoću izolacije

Mikroskopija u tamnom polju: (jer su bakterije jako uske pa se ne mogu uočiti pod svetlosnim mikroskopom)
za ID leptospira u (mid stream) urinu – je brz ali nesenzitivan i nespecifičan test. Izvodi se redovno kod sumnje na
leptospirozu. Potrebno je prisustvo oko 105 μo /ml urina da bi se detektovali. Direktna vizuelizacija je teška jer u
urinu i telesnim tečnostima postoje artefakti koji se teško razlikuju od μo. Centrifugovanje (9750 rcf; 10 min) ukla-
nja većinu artefakata ali ne dovodi do sedimentacije μo. Brzo dolazi do autolize (kisela sredina) pa je potrebno do-
dati formalin radi prezervacije, ali to uništava pokretljivost.
za ID leptospira u krvi – heparisana krvi (akutno obolele) životinje se centrifuguje (mali br. obtaja). Ćelije se od-
stranjuju, a pregleda se plazma nakon ponovnog centrifugovanja (9750 rcf; 10 min). Korisno kod jake bakteriemije.
Retko se primenjuje.
za ID leptospira u tkivu – uzima se mali unutrašnji deo bubrega, macerira sa malo destilovane vode, pravi se 10%
rastvor u 1% BSA. Kap uzorka se stavlja na pločicu i pokriva pokrovnicom.
* Leptospirurija je kontinuirana ili intermitentna, a koncentracija bakterija u urinu može biti i 108/ml. Leptospire ne podnose kiseo urin, a
dugo su vitalne u alkalnom urinu (preživari i životinje na dijeti koja dovodi do alkalizovanja urina su važnije kliconoše).

Leptospire izolovane iz telesnih tečnosti ili organa (bubrezi, jetra, mozak, pluća, nadbubreg) pobačenih ili mrtvo-
rođenih plodova ukazuje na akutnu/hroničnu leptospirozu majke (zavisno od serovara), i akutnu infekciju fetusa.
Kultura – krvi, urina (inokuliše se nekoliko min nakon pažljivog uzorkovanja) ili tkivnih (homogenizovanih) uzoraka
(jetra, bubreg). Krv se kao uzorak uzima u prvim danima kliničkog toka oboljenja kao i pre Ab terapije. Koristi se
polučvrsta podloga koja sadrži BSA (Bovine Serum Albumine) ili bujon. Kontaminacija se kontroliše dodavanjem Ab
u podlogu. Kap kulture se pregleda mikroskopijom u tamnom polju. Problemi su:
- Ab mogu smanjiti verovatnoću izolacije kada je u uzorku prisutan mali broj vitalnih leptospira, a neki
sojevi uopšte ne rastu na selektivnim podlogama
- Inkubacija (na 29 ± 1°C) traje min 16 nedelja (opt. 26 ned)(zavisi od broja bakterija i serovara u uzorku)
* dodavanje seruma kunića (0.4-1%) povećava šanse za izolovanje osetljivih serovarova
Kap kulture se svakih 1-2 nedelje, tokom sledećih 16 (26) nedelja pregleda mikroskopijim u tamnom polju.

Animalna inokulacija – hrčku ili zamorcu se intraperitonealno inokuliše 0.5-1ml neutralisanog urina, nezgrušane krvi ili 10% rastvora
tkivnog homogenata. Kada dođe do porasta TT ili 5., 8., 10. i 14. dana nakon inokulacie, aseptično se uzima krv iz srca. 2-3 kapi sveže krvi se
inokuliše u podlogu. Nakon 21. dana od inokulacije, životinja se žrtvuje, a krv se uzima za serologiju.

Imunohemijske tehnike – leptospire se mogu dokazati upotrebom imununoflorescencije ili različitim IHH tehnika-
ma. Ove metode se koriste kad se dokazuje uzročnik u patohistološkom preparatu (biopsija, obdukcija, pobačeni
fetus), i kad je potrebno brzo identifikovati uzročnika. IFA tehnika se koristi i za ID leptospira u sedimentu urina.
- Nije pogodno za Dg hronične leptospiroze gde je broj μo mali ili su lokalizovani u tkivu
- Leptospire se ne boje dobro anilinskim bojama (eozin), a bojenje srebrom nema dovoljnu senzitivnost
ni specifičnost, mada mogu da se koriste kao dodatna tehnika.
* običnim bojenjem, μo se ne mogu videti, ali se u bubrezima (ne i jetri) uočavaju karakteristične promene.

Akutna tubularna nekroza – koagulaciona nekroza i krvarenje (go- Leptospiroza krava – brojne leptospire (strelica) prisutne su u
re levo). U ovoj ranoj fazi u potpunosti nedostaju inflamatorne ćel, lumenu tubula. Kolonizacija epitelnih ćelija tubula je karakteristično
ali u subakutnoj fazi postoje intersticijalni infiltrati Ly i Pc (H&E). za ovu bakteriju. (Warthin Starry silver stain)

PCR – uglavnom postoje prajmeri koji su zajednički za genus Leptospira, i koriste se za ID patogenih leptospira, a
ne za ID serovara koji je prouzrokovao infekciju. Identifikacija izolata je posao kojim se bave referentne laborato-
rije kombinujući nekoliko procedura (rezistentnost prema azaguaninu, temperaturna i dr tolerancija, PCR, Mab itd)

* Glavni problem u ID i tipizaciji sojeva Leptospira je činjenica da fenotipski testovi (npr.

fermentacija šrećera) upotrebljivni nkod dr. bakteriskih vrsta ne mogu razlikovati vrste
Leptospira, a kamoli serogrupe ili serovarove. ID se pre zasnivala na napornoj i često ne-
pouzdanoj (ukrštenoj) aglutinaciji, a sada je zamenjena robusnim modernim metodama.
2. Serološke metode
Indirektne metode se češće koriste u Dg leptospiroze nego direktne dijagnostičke tehnike. Dva testa se koriste u
veterinarskoj dijagnostici: MAT i ELISA. Problemi su:
- grla mogu biti seronegativna na početku infekcije (uzorkovanje pre sinteze značajnog titira At)
- „signifikantni titar“ ili četvorostruko povećanje titra mogu da izostanu zbog rane primene Ab
- titar At može pasti na nivo na kome se ne može otkriti, a leptospirurija i dalje postoji

a) MAT (Microscopic Agglutination Test aka agglutination-lysis test) – zlatni standard

MAT je najčešće korišteni serološki test. Predstavlja referentni test (na osnovu koga se procenjuju drugi
serološki testovi). Za postizanje optimuma senzitivnosti treba koristiti Ag koji reprezentuju poznate serogrupe u
određenom regionu. Za poboljšanje senzitivnosti, osim referentnih serovarova, mogu se koristiti i lokalni izolati.
Specifičnost je dobra – nema ukrštene reakcije sa dr. bakterijama. Čak je specifičan za serovarove ili pak
serogrupe mada postoji ukrštena reakcija između serogrupa, pa se ovim testom ne može sa sigurnošću ID serovar
koji je prouzrokovao infekciju (za to je potrebno izvesti izolaciju). Lažno pozitivna reakcija može da se dobije ako
uzorak potiče od vakcinisane životinje. Stoga je bitno poznavati vakcinalni status životinje i vreme vakcinacije.
Sojevi koji se izaberu za test (rasli na tečnoj podlozi, na 29 ± 1°C) treba da budu min 4, a max 8 dana stari.
Koncentracija živih leptospira treba da iznosi 2x108/ml (određuje se pomoću komorice za brojanje bakterija i mi-
kroskopijom u tamnom polju, ili pomoću spektrofotometra ili nefelometra).
Počinje se sa razređenjima seruma od 1/50. Isti volumen Ag se doda serumu tako da se dobija razređenje
od 1/100. Mikrotitar ploče se potom inkubiraju na 29 ± 1°C tokom 2-4h. Ploče se pregledaju mikroskopijom u tam-
nom polju. Ako su pozitivne pri tom razređenju, vrši se titracija za sve serovarove koji su dali pozitivnu reakciju ka-
ko bi se odredio titar za svaki srerovar. Izveštaj sadrži titre At protiv svih serovarova na koje je serum testiran.
Rezultat testa je titar At koji predstavlja najveće razređenje seruma koji daje ≥50% aglutinacije živih lepto-
spira, ostavljajući 50% slobodnih μo u odnosu na kontrolu (kultura rastvorena u PBS).
Idealno pre svakog izvođenja testa, a bar 2x/god, treba izvršiti identifikaciju Ag koji se koriste u MAT. Za ID
se koristi hiperimuni serum kunića, Mat, molekularne metode. „Čistoća“ Ag korištenih u MAT se redovno provera-
va izvođenjem kulture na krvnom agaru.
Kao individualni test, MAT je veoma koristan za Dg akutne infekcije. Problematična je Dg hronične infekcije
(abortus) i ID renalnih/genitalnih kliconoša, pogotovo ako se radi o adaptiranim serovarovima. Test je pozitivan:

ako se dokaže četvorostruko povećanje titra u parnim serumima.

ako postoji visok titar (granični titar je ≥400) i odgovarajuča klinička slika (ako se ne koriste parni serumi).
* dijagnoza leptospiroze pasa se može doneti na osnovu kliničke slike, titra ≥800 i činjenice da je Vcc izvedena pre
više od 6 meseci (uz 4-struko povećanje titra ako se testira konvalescentni serum – u medicini 4-struko povećanje
je definitivni kriterijum pa se drugi uzorak uzima obavezno).
* infekcija pasa sa Canicola serovarom i izlučivanje μo postoji uz titar At <1:100 (nizak titar ne isključuje infekciju)
Leptospiroza je problem zapata i MAT ima mnogo veću vrednost kao test stada. Predlaže se uzorkovanje
min 10 grla ili 10% stada (koje god je veće).
Kada se donosi Dg na osnovu serološkog testa, ipak treba ID serovar, a u obzir teba uzeti kliničku sliku i
vakcinalni status. Tako npr. kod:

Pomona abortusa kod Bo – postoji visok titar At u vreme pobačaja (nastaje relativno brzo nakon infekcije)

Hardjo indukovan pobačaj – je posledica hronične infekcije, a u vreme pobačaja neke životinje mogu biti serone-
gativne, a druge opet pokazuju visok titar At

odgovor psa na Vcc – je u vidu niskog titra agg-At (1:100-1:400) i ona perzistiraju do 3 meseca. Ipak neki psi stvo-
re visoke titre (1/3200), a At iako padaju vremenom, mogu se otkriti duže od 6 meseci.

b) ELISA
ELISA je senzitivan test. Ima manju specifičnost od MAT. Postoji ELISA koja detektuje IgM i IgG pasa. IgM se mogu
otkriti već 7 dPI, pre nego što su sintetisnana agg-At. IgG pasa se mogu otkriti početkom druge nedelje PI i mogu
perzistirati dugo vremena. Psi koji su Vcc ili su ranije imali infekciju, imaju visoke titre AgG, i niske titre IgM.