Purelink Rna Micro Kit Man - En.hr

Sadržaj
Sadržaj i pohrana kompleta.................................................................................................v Dodatni proizvodi
vi
Uvod.............................................................................................................................. 1
Pregled.................................................................................................................................1
Metode...........................................................................................................................................4
Opće smjernice..................................................................................................... 4
Priprema pufera i parametri.............................................................................. 9
Pročišćavanje RNK iz životinjskih stanica...............................................................................11
Pročišćavanje RNK iz životinjskih tkiva.......................................................................16
Pročišćavanje RNK iz uzoraka mikrodisekcije laserskim hvatanjem.......................21
Korištenje TRIzola ® Reagens s PureLinkom ™ RNAMicro Kit...................... 24
TRIzol ® Plus ukupna izolacija transkriptoma.............................................................29
Pročišćavanje tekućih uzoraka za čišćenje i koncentraciju RNA...................34
Analiza prinosa i kvalitete RNA........................................................................ 37
Očekivani rezultati...........................................................................................................39
Rješavanje problema..................................................................................................................40
Dodatak.......................................................................................................................................43
Tehnička podrška............................................................................................................. 43
Obavijest kupca................................................................................................. 45
Reference........................................................................................................................... 46
ii
i
iv
Sadržaj i pohrana kompleta
Dostava i Sav sadržaj PureLinka ™ RNAMicro Kit isporučuju se na sobnoj temperaturi.

Skladištenje
Po primitku pohranite PureLink ™ DNaza / nosač RNA kutija na 4 ° C.

Preostale dijelove kompleta čuvajte na sobnoj temperaturi.
Sadržaj kompleta stabilan je do šest mjeseci ako se pravilno čuva.
Sadržaj kompleta Komponente uključene u PureLink ™ Komplet RNAMicro nalazi se u dva

okvira, opisana u nastavku. Osigurano je dovoljno reagensa za izvođenje
50 priprema.
PureLink ™ Sadržaj RNAMicro kompleta (okvir 1) Količina
Pufer za lizu 125 ml
Usisavač za pranje I 50 ml
Usisavač za pranje II 15 ml
Voda bez RNaze 15,5 ml
PureLink ™ Stubovi Micro Kit (s cijevima za Po 50

sakupljanje)
Sabirne cijevi Po 50
Cijevi za oporavak Po 50
PureLink ™ DNK-DNaza / nosač (RNA 2) Količina
PureLink ™ DNaza (liofilizirana) 1500 jedinica
PureLink ™ Voda na stupcu DNaza 2X pufer Voda bez 1 ml
RNaze 1 ml
PureLink ™ RNA nositeljica (liofilizirana) 300 μg
v
Dodatni proizvodi
Dodatni Sljedeći proizvodi također su dostupni od Invitrogena.

Proizvodi Za više detalja posjetite našu web stranicu na www.invitrogen.com
ili kontakt Tehnička podrška ( stranica 43).
RT-PCR i qRT-PCR proizvodi
Proizvod Količina Kataloški broj

PureLink ™ DNaza 50 priprema 12185–010
SuperScript ® III Sustav za sintezu prvog lanca za RT-PCR 50 reakcija 18080–051
SuperScript ® III Prva smjesa za sintezu SuperMix 50 reakcija 18080–400
SuperScript ® III Prvolančana sinteza SuperMix za qRT-PCR 50 reakcija 11752–50

250 reakcija 11752–250
Platina ® PCR SuperMix 100 reakcija 11306–016
Platina ® Kvantitativni PCR SuperMix-UDG 100 reakcija 11730–017

500 reakcija 11730–025
SuperScript ™ III platina ® Komplet qRT-PCR u dva koraka 100 reakcija 11734–050
Drugi proizvodi
Proizvod Količina Kataloški broj

Homogenizator 50 pakiranja 12183–026
RNase DALEKO ® 250 ml 10328–011
TRIzol ® Reagens 100 ml 15596–026
200 ml 11596–018
TRIzol ® LS reagens 100 ml 10296–010
200 ml 10296–028
TRIzol ® Plus sustav za pročišćavanje RNA 50 priprema 12183–555
0,1–2 Kb RNA ljestve UltraPure ™ Voda 75 μg 15623–100
tretirana DEPC-om 1L 750023
UltraPure ™ Destilirana voda bez DNaze / RNaze Quant-iT ™ Komplet za 500 ml 10977–015
ispitivanje RNA 1 komplet Q33140
vi
Uvod
Pregled
Uvod PureLink ™ RNAMicro Kit pruža jednostavnu, pouzdanu i brzu metodu za

izoliranje visokokvalitetne ukupne RNA iz različitih malih uzoraka u malim
količinama elucije. Ukupna RNA može se pročistiti iz uzoraka, uključujući
životinjske stanice i tkiva, te uzorke za lasersko hvatanje mikrodesekcije i
pogodna je za upotrebu u raznim nizvodnim aplikacijama (vidi dolje).
Sustav Ovaj priručnik pruža protokole specifične za uzorak kako bi se izolirala ukupna
Pregled RNA iz niza malih uzoraka u malim količinama elucije.
Općenito, uzorci se liziraju, a zatim homogeniziraju u prisutnosti gvanidinij

izotiocijanata, kaotropne soli koja je sposobna zaštititi RNA od endogenih
RNaza (Chirgwin i sur., 1979). Etanol se dodaje nakon homogenizacije, a
uzorak se zatim obrađuje putem PureLinka ™ Stupac Micro Kit koji sadrži
bistru membranu na bazi silicija na koju se veže RNA. Sve nečistoće
učinkovito se uklanjaju naknadnim pranjem (Vogelstein & Gillespie,
1979). Pročišćena ukupna RNA se zatim eluira u vodi bez RNaze (može
se upotrijebiti i Tris pufer, pH 7,5) i prikladna je za upotrebu u niz daljnjih
aplikacija, opisanih u nastavku.
Nizvodno Pročišćena ukupna RNA eluirana je pomoću PureLinka ™ RNA Micro Kit
Prijave prikladan je za upotrebu u raznim primjenama, uključujući:
• Pojačanje RNA za analizu mikromreža
• Priprema knjižnice cDNA nakon poli (A) + odabira
• Pojačanje RNA za analizu mikromreža
• PCR u stvarnom vremenu (RT-PCR)
• Kvantitativna PCR u stvarnom vremenu (qRT – PCR)
• Sjeverno mrljanje
• Analize zaštite nukleaze
Nastavak na sljedećoj stranici

1
Pregled, Nastavak
Prednosti PureLink ™ RNAMicro Kit nudi sljedeće prednosti:

Komplet
• Izolacija RNA iz različitih tipova uzoraka s vrlo malim količinama polaznog

materijala
• Minimalno onečišćenje genomske DNA pročišćene RNA digestijom DNaze na

stupcu
• Brzi i prikladni postupci pročišćavanja u koloni
• Pouzdane performanse visokokvalitetne pročišćene ukupne RNA u nizvodnim

aplikacijama
Polazeći Razne vrste uzoraka i količine koje se mogu obraditi pomoću PureLinka ™ RNAMicro
Materijal Kit navedeni su u donjoj tablici:
Tip uzorka Uzorak Iznos Stranica
Životinjske stanice ≤5 × 10 5 Stanice 11
Životinjsko tkivo ≤5 mg * 16
Snimanje laserom - 21
Uzorci za mikrosekciju
* Bilješka: Ako koristite TRIzol, može se preraditi do 10 mg životinjskog tkiva ® Reagens za lizu.
Kit Početna količina: Razlikuje se od vrste uzorka (vidi

Tehnički podaci gornju tablicu)
Kapacitet vezanja stupaca: > 100 μg RNA
Kapacitet spremnika stupa: 700 μl
Kompatibilnost centrifuge: Sposoban za centrifugiranje

na ≥12.000 × g
Volumen elucije: ≤12 μl
Prinos RNA: > 85%
2
Pregled, Nastavak
Tijek rada Dijagram toka u nastavku ilustrira osnovne korake za izoliranje ukupne RNA iz
životinjskih stanica i tkiva pomoću PureLinka ™
RNAMicro Kit.
& "#
'( ')
! "#
!
% !
)(
$ +,
$ %%
)(
"# - $
% ! )
"#
3
Metode
Opće smjernice
Uvod Pregledajte informacije u ovom odjeljku prije početak.
U ovom su odjeljku date smjernice za rukovanje RNA i prikupljanje

uzoraka.
Smjernice za Slijedite dolje navedene smjernice kako biste spriječili

Rukovanje RNA kontaminaciju RNazom i povećali prinos RNA.
• Koristite sterilnu, jednokratnu i pojedinačno zamotanu plastičnu posudu.
• Koristiti samo sterilni vrhovi pipeta za jednokratnu upotrebu bez RNaze i epruvete za
mikrocentrifugu.
• Nosite jednokratne rukavice dok rukujete reagensima i uzorcima RNA

kako biste spriječili kontaminaciju RNazom s površine kože. Često mijenjajte
rukavice, posebno kako protokol prelazi iz sirovih ekstrakata u pročišćeniji
materijal ( npr fromWash Buffer I to Wash Buffer II).
• Uvijek upotrebljavajte odgovarajuće mikrobiološke aseptičke tehnike kada

radite s RNA.
• Koristite RNase DALEKO ® Reagens (stranica vi) za uklanjanje onečišćenja RNazom s

radnih površina i predmeta koji se ne mogu jednokratno koristiti, poput centrifuga i cijevi,
koji će se koristiti tijekom pročišćavanja.
4
Opće smjernice, Nastavak
Smjernice za Kada prikupljate uzorke, slijedite dolje navedene smjernice kako biste
Uzorak smanjili razgradnju RNA i povećali prinos RNA.
Kolekcija • Uvijek nosite rukavice za jednokratnu upotrebu dok rukujete uzorcima i reagensima
kako biste spriječili kontaminaciju RNazom.
• Radite brzo tijekom uzimanja uzoraka i koristite alate i spremnike za

disekciju bez RNaze (skalpeli, posuđe, cijevi itd.).
• Koristite RNase DALEKO ® Reagens (stranica vi) za uklanjanje onečišćenja

RNase s radnih površina.
• Kad pročišćavate ukupnu RNA od svježih uzoraka, svježe uzorke stanica i

tkiva držite na ledu odmah nakon berbe; brzo prijeđite na uzorak Liza i homogenizacija.
• Kad pročišćavate ukupnu RNK iz smrznutih uzoraka, zamrznite uzorke odmah

nakon sakupljanja u tekućem dušiku ili na suhom ledu. Držite smrznute uzorke na –80 ° C ili u tekućem dušiku dok
ne nastavite s uzorkovanjem Liza i homogenizacija.
• I pufer za lizu i pufer za pranje I sadrže gvanidin izotiocijanat

(nadražujuće sredstvo). Ova je kemikalija štetna u dodiru s kožom ili kada se udiše ili guta.
• Nemoj dodajte izbjeljivače ili kisele otopine izravno u otopine ili otpad od
pripreme uzoraka koji sadrži gvanidinij hidroklorid, jer nastaju reaktivni spojevi i otrovni plinovi.
• Etanol se dodaje u pufer za pranje II. Otopine koje sadrže etanol smatraju se
zapaljivima. Koristite odgovarajuće mjere predostrožnosti kada koristite ovu kemikaliju.
Za vašu zaštitu, prilikom rukovanja ovim kemikalijama uvijek nosite

laboratorijski kaput, rukavice i zaštitne naočale. Odbojnike i
kemikalije odložite u odgovarajuće spremnike za otpad.
5
TRIzol ® Da bi se RNA izolirala iz uzoraka koji se teško liziraju ( npr. vlaknasto ili masno životinjsko
Reagens tkivo), ili za pročišćavanje ultračiste ukupne RNA za osjetljive nizvodne aplikacije, možete
koristiti TRIzol ® Reagens (stranica vi), nakon čega slijedi pročišćavanje pomoću PureLink-
a ™ RNAMicro Kit (za detalje pogledajte stranicu 24).
Mikrocentrifuga Pestluzi mikrocentrifuge bez RNaze omogućuju ometanje i lizu uzoraka tkiva u cijevi za
Tučak mikrocentrifugu. Obično su izrađeni od teflona, polietilena ili nehrđajućeg čelika i
dizajnirani su da odgovaraju standardnim veličinama cijevi za mikrocentrifugu ( npr
Konusne epruvete od 1,5 ml ili epruvete s okruglim dnom od 2 ml).
Da biste koristili tučak za mikrocentrifugu:
1. Hladite cijev mikrocentrifuge na ledu.
2. Prenesite uzorak tkiva u epruvetu za mikrocentrifugu.
3. Dodajte pufer za lizu i upotrijebite pokrete prema gore i dolje da poremete

uzorak između stijenke cijevi i tučka.
4. Nakon lize, homogenizirajte uzorak kako je navedeno u vašem protokolu

specifičnom za uzorak.
6
Homogenizator Homogenizator (stranica vi) namijenjen je homogenizaciji lizata stanica ili

tkiva centrifugiranjem, prije pročišćavanja nukleinske kiseline.
Homogenizator se sastoji od patrone sa specijaliziranom membranom koja
stane unutar sabirne cijevi koja sadrži lizat. Sabirna cijev se stavi u
mikrocentrifugu, a homogenizator homogenizira lizat centrifugalnom silom
(≥12 000 × g tijekom 2 minute).
Homogenizator daje vrlo konzistentne rezultate i prikladniji je od ostalih

metoda homogenizacije.
Za više detalja posjetite našu web stranicu na www.invitrogen.com
ili kontakt Tehnička podrška ( stranica 43).
Rotor-Stator Homogenizatori rotor-stator omogućavaju istodobnu lizu i homogenizaciju

Homogenizator uzoraka tkiva ili staničnih lizata posmičnom silom brzo rotirajuće sonde.
Da biste koristili rotor-stator:
1. Prenesite svoj uzorak u epruvetu za mikrocentrifugu od 1,5 ml i dodajte

odgovarajući volumen pufera za lizu (pogledajte protokol specifičan za vaš
uzorak da biste odredili potrebnu količinu pufera za lizu).
2. Umetnite vrh sonde rotor-stator u uzorak i homogenizirajte 5–90 sekundi,

ovisno o žilavosti uzorka.
Bilješka: Izbjegavajte pjenjenje uzorka držeći vrh sonde potopljenim u otopini za lizu držeći vrh na
zidu cijevi. Za više informacija pogledajte priručnik isporučen uz vaš rotor-stator. Statori rotora
dostupni su u raznim veličinama. Uobičajeni modeli uključuju ULTRA-TURRAX ® ( IKAWorks, Inc.)
i Polytron ® Homogenizator (Kinematica, Brinkmann Instruments).
7
Uzorak lize Upotrijebite donje tablice i na sljedećoj stranici kako biste odredili najbolju metodu
i liziranja i homogeniziranja vaših specifičnosti
Homogenizacija tip uzorka.
Vrsta uzorka Mogućnosti lize Homogenizacija Komentari

Opcije
Životinjske stanice Pufer za lizu, • Homogenizator

vrtlog
• Šprica i
igla
• Rotor-stator
Tkivo životinja: Tučka s • Homogenizator --
Smrznuto ili cijev za mikrocentrifugu •

Šprica i
Svježa vlaknasta
igla
Žbuka i tučak u tekućem • Homogenizator --
dušiku
• Šprica i
igla
Rotor-stator
Tkivo životinja: Tučka s • Homogenizator --
Svježe mekano mikrocentrifuga

• Šprica i
cijev
igla
Rotor-stator Rotor-statorske lize

i homogenizira
istovremeno
i može se koristiti
svim tkivom
iznosi.
Snimanje laserom Pufer za lizu plus vrtlog

Mikrodisekcija
8
Priprema pufera i parametri
Priprema lize Pripremite svježu količinu pufera za lizu koja sadrži

Pufer sa 1% 2-merkaptoetanola za svaki postupak pročišćavanja. Dodati
2-merkaptoetanol 10 μl 2-merkaptoetanola za svaki 1 ml pufera za lizu.
Pogledajte protokol specifičan za uzorak kako biste pronašli ispravnu

količinu pufera za lizu s 2-merkaptoetanolom.
Ditiotreitol (DTT) se može koristiti kao alternativno sredstvo za redukciju

umjesto 2-merkaptoetanola u puferu za lizu.
Za svaki postupak pročišćavanja pripremite svježu količinu pufera za lizu

koji sadrži 40 mM DTT. Dodajte 20 μl 2 MDTT za svaki 1 ml pufera za lizu
L3.
Pripremite svježu otopinu DTT, resuspendiranjem 308,5 mg DTT (Invitrogen

Cat. No. 15508-013) u 1 ml vode bez RNAze.
Priprema Prije prvi put koristeći Wash Buffer II:

Usisavač za pranje II
1. Dodajte 60 ml 96–100% etanola izravno u bocu.
s etanolom
2. Označite okvir na naljepnici Wash Buffer II kako biste naznačili da je dodan
etanol.
3. Čuvajte pufer za pranje II etanolom na sobnoj temperaturi.
PureLink ™ PureLink ™ DNaza je optimizirana za uporabu s PureLinkom ™

DNaza RNAMicro Kit. Dizajniran je za posebnu uporabu za probavu DNA na
stupcu tijekom kritičnih postupaka pročišćavanja RNA za nizvodne
aplikacije koje zahtijevaju ukupnu RNA bez DNA.
Resuspendiranje Resuspendirajte PureLink ™ DNaza otapanjem liofilizirane DNaze u 550 μl

PureLink ™ vode bez RNaze (isporučuje se s kompletom).
DNaza
Čuvati na 4 ° C za kratkotrajno skladištenje. Otopljene zalihe DNaze mogu se čuvati na 4
° C do tri mjeseca. Za dugotrajno skladištenje pripremite alikvote DNaze i čuvajte na –20
° C. Izbjegavajte ponavljano zamrzavanje i odmrzavanje.
9
Priprema pufera i parametri, Nastavak
PureLink ™ PureLink ™ RNAMicro Kit isporučuje se s 300 μg liofiliziranog PureLinka ™ Nositelj

RNA nositelj RNA za pomoć u izoliranju RNA iz uzoraka s malim količinama RNA (≤5000 stanica
ili ≤10 μg tkiva) koje bi se inače izgubile zbog nespecifične apsorpcije.
Priprema Pripremite osnovnu otopinu resuspendiranjem liofiliziranog PureLinka ™ Nosite RNA

PureLink ™ u 600 μl vode bez RNaze za konačnu koncentraciju od 500 ng / μl.
RNA nositelj
Čuvajte zalihe RNA Carrier na 4 ° C do tri mjeseca. Za dugotrajno skladištenje
pripremite alikvote nosioca RNA i čuvajte na –20 ° C. Izbjegavajte ponavljano
zamrzavanje i odmrzavanje.
Da biste koristili PureLink ™ RNA nositelj tijekom lize, pripremite a 1:

100 razrjeđenje nosioca RNA kako slijedi:
Za normalnu lizu:
1. Dodajte 5 μl zalihe RNA nosača (vidi gore) u 495 μl pufera za lizu L3 za konačnu
koncentraciju od 5 ng / μl.
2. Dodajte 5 μl razrijeđene Carrier RNA iz koraka 1 na 350 μl pripremljene otopine za

lizu RNA (ili po volumenu lize) koja se koristi za jednu reakciju (25 ng / 350 μl).
Za lizu s TRIzolom ®:
1. Dodajte 5 μl zalihe RNA nosača (vidi gore) u 495 μl vode bez RNaze za konačnu
koncentraciju od 5 ng / μl.
2. Dodajte 5 μl razrijeđene Carrier RNA iz koraka 1 na 350 μl pripremljene otopine za

lizu RNA (ili po volumenu lize) koja se koristi za jednu reakciju (25 ng / 350 μl).
Reagens za eluciju
RNA se može izlučiti iz PureLinka ™ Stupac mikro kompleta koji koristi vodu
Elucija
bez RNase (uključen u komplet). Za eluiranje RNA možete upotrijebiti Tris
Parametri pufer (10 mM Tris-HCl), pH 7,5 u vodi bez RNaze.
Volumen elucije
Prinos RNA ovisi o vrsti uzorka, veličini i kvaliteti. Ovisno o vašem očekivanom
prinosu RNA, te vašem uzorku izvora i početnoj količini, koristite između 12 μl
– 22 μl vode bez RNaze (ili Tris-pufera) za svako ispiranje. Primjeri prinosa za
različite vrste i količine uzoraka navedeni su na stranici 39.
Mrtvi volumen patrone je ~ 2 μl. Volumen elucije od 12 μl rezultirat će

konačnim volumenom eluata od 10 μl.
10
Pročišćavanje RNK iz životinjskih stanica
Uvod Ovaj odjeljak sadrži upute za pročišćavanje ukupne RNA od ≤5 × 10 5 životinjske

stanice. Odvojeni su protokoli za stanice u suspenziji i jednoslojne.
Materijali Uz komponente kompleta trebat će vam sljedeće stavke:

Potrebno
• 2-merkaptoetanol
• 70% etanola (u vodi bez RNaze)
• Mikrocentrifuga sposobna za centrifugiranje ≥12 000 × g
• 1,5 ml epruvete za mikrocentrifugu bez RNaze
• Savjeti za pipetu bez RNase
• PureLink ™ DNaza (pripremljeno kako je opisano na stranici 9)
• PureLink ™ RNA nositelj (neobavezna, ako koristi <5.000 stanica)
• Jedan sljedećeg za homogenizaciju: Homogenizator

(vidi stranicu vi i stranicu 7) ili,
Šprica bez RNaze (1 ml) s iglom mjere 18–21 ili,
Homogenizator rotor-stator (stranica 7)
Za uzorke koji se teško liziraju možete upotrijebiti TRIzol ®

Reagens nakon čega slijedi pročišćavanje pomoću PureLink-a ™ RNA Micro Kit, (vidi
stranicu 24).
11
Pročišćavanje RNK iz životinjskih stanica, Nastavak
Liza i Prije početka, pripremiti sve pufere i otopine

Homogenizacija prema protokolu na stranicama 9–10.
≤5 × 10 5 Slijedite korake u nastavku za pripremu lizata ≤5 × 10 5
Suspenzija suspenzijske stanice:
Stanice 1. Prebacite stanice u epruvetu bez RNaze odgovarajuće veličine i centrifugirajte

na 2000 × g tijekom 5 minuta na 4 ° C do peleta. Odbacite medij za rast iz epruvete.
2. U svoj uzorak dodajte 350 μl pufera za lizu pripremljenog s 2-merkaptoetanolom

(stranica 9).
Bilješka: Ako obrađujete manje od 5000 stanica, dodajte 5 μl razrijeđenog PureLinka ™ RNA
nositelj (25 ng / 350 μl, pripremljeno kako je opisano na stranici 10).
3. Vrtložite velikom brzinom sve dok se stanična kuglica potpuno ne rasprši i dok stanice
ne postanu lizirane.
Bilješka: Ako koristite rotor-stator, možete preskočiti ovaj korak.
4. Nastaviti s jedan sljedećih mogućnosti homogenizacije na sobnoj

temperaturi:
• Prenesite lizat u homogenizator (stranica vi) umetnut u sabirnu cijev i

centrifugu na ≥12 000 × g tijekom 2 minute. Uklonite homogenizator kad završite, ili
• Provucite lizat 5-10 puta kroz iglu kalibra 18-21 pričvršćenu na

štrcaljku bez RNaze, ili
• Prenesite lizat u odgovarajuću veličinu epruvete bez RNaze i

homogenizirajte pomoću homogenizatora rotora-statora pri maksimalnoj brzini najmanje 45 sekundi.
Nastavite do Vezanje, pranje i ispiranje, stranica 14.
12

≤5 × 10 5 Slijedite korake u nastavku za pripremu lizata ≤5 × 10 5
Jednoslojne stanice jednoslojne stanice:
1. Uklonite medij za rast sa stanica.
2. Dodajte ravnomjerno 350 μl pufera za lizu pripremljenog s

2-merkaptoetanolom (stranica 9) preko vašeg jednoslojnog sloja.
Bilješka: Ako obrađujete manje od 5000 stanica, dodajte 5 μl razrijeđenog PureLinka ™ RNA
nositelj (25 ng / 350 μl, pripremljeno kako je opisano na stranici 10).
3. Pipetirajte stanice gore-dolje dok se ne pojave lizirane.

temperaturi:
• Prenesite lizat u homogenizator (stranica vi) umetnut u sabirnu cijev i

centrifugu na ≥12 000 × g tijekom 2 minute. Uklonite homogenizator kad završite, ili
• Prenesite lizat u epruvetu bez RNaze od 1,5 ml i provucite 5–10 puta

kroz iglu mjere 18–21 pričvršćenu na štrcaljku bez RNaze, ili
• Prenesite lizat u odgovarajuću veličinu epruvete bez RNaze i

homogenizirajte pomoću homogenizatora rotora-statora pri maksimalnoj brzini najmanje 45 sekundi.
Nastavite do Vezanje, pranje i ispiranje, sljedeća stranica.
13
Uvez, Prije početka, pripremite sve pufere i otopine prema protokolu na

Pranje i stranicama 9-10.
Elucija Slijedite korake u nastavku za vezanje, pranje i eluiranje RNA iz uzorka
stanice:
1. U svaki volumen pripremljenog staničnog homogenata dodajte 350 μl (ili ekvivalentni

volumen) 70% etanola.
Bilješka: Ako je dio uzorka izgubljen tijekom homogenizacije, prilagodite volumen

etanola u skladu s tim.
2. Vrtlog temeljito promiješati i raspršiti sve vidljive taloge koji mogu nastati
nakon dodavanja etanola.
3. Prenesite do 700 μl uzorka (uključujući preostali talog) u PureLink ™ Stupac

Micro Kit (s kolekcijskom cijevi).
4. Centrifuga na ≥12 000 × g 1 minutu na sobnoj temperaturi. Odbacite protok i

ponovo umetnite stupac u istu cijev za sakupljanje.
5. Ponoviti Koraci 3-4 dok se ne obradi cijeli uzorak.
6. U stupac dodajte 350 μl pufera za pranje I.
Bilješka: Ako se DNaza na stupcu ne provodi, povećajte količinu pufera za ispiranje I na

600 μl. Centrifuga na ≥12 000 ×
g tijekom 15 sekundi na sobnoj temperaturi. Odbacite protok i stavite stupac u a novi Sabirna
cijev i prijeđite na korak 13.
7. Centrifugirajte na ≥12.000 × g tijekom 1 minute na sobnoj temperaturi.

Odbacite protok i sabirna cijev. Umetnite stupac u a novi
Zbirka cijev.
8. Dodajte 10 μl rekonstituiranog PureLinka ™ DNaza (stranica 9) do 10 μl 2X DNase

pufera za ukupno 20 μl. Pomiješajte laganim pipetiranjem nekoliko puta gore-dolje.
9. Otpipetirajte svih 20 μl smjese DNaze na središte membrane kolone.
10. Inkubirajte na sobnoj temperaturi 15 minuta.
Postupak je nastavljen na sljedećoj stranici
14
Uvez, Postupak je nastavljen s prethodne stranice
Pranje i 11. Dodajte 350 μl pufera za pranje I u stupac.

Elucija,
12. Centrifuga na ≥12 000 × g 15 sekundi u sobi temperatura. Odbacite protok.
nastavio
13. Dodajte 500 μl pufera za pranje II s etanolom (stranica 9) u PureLink ™ Stupac
Micro Kit.
14. Centrifuga na ≥12 000 × g 15 sekundi na sobnoj temperaturi. Odbacite protok.
15. Ponovite korake 13–14 jednom.
16. Centrifugirajte stupac na ≥12 000 × g 1 minutu da se membrana osuši s

pričvršćenom RNA. Odbaciti protok i sabirnu cijev i umetnite PureLink ™ Mikro Kit komplet u cijev za
oporavak.
17. Dodajte 12–22 μl vode bez RNaze u središte PureLinka ™ Stupac

Micro Kit (vidi Parametri ispiranja,
stranica 10).
18. Inkubirajte na sobnoj temperaturi 1 minutu.
19. Centrifugirajte stupac tijekom 2 minute na ≥12 000 × g na sobnoj temperaturi

za eluiranje RNK iz membrane u cijev za oporavak.
Bilješka: Mrtvi volumen PureLinka ™ Stupac Micro Kit je ~ 2 μl. Volumen elucije od 12 μl
rezultirat će konačnim volumenom eluata od 10 μl.
20. Spremite pročišćenu RNA ili prijeđite na Analizirajući RNA

Prinos i kvaliteta ( stranica 37).
Pohrana Čuvajte svoju pročišćenu RNA na ledu ako ćete je upotrijebiti u roku od nekoliko
Pročišćena RNA sati. Za dugotrajno skladištenje, svoju pročišćenu RNA čuvajte na –80 ° C.
15
Pročišćavanje RNK iz životinjskih tkiva
Uvod Ovaj odjeljak pruža protokole za pročišćavanje ukupne RNA od ≤5 mg

svježeg ili smrznutog životinjskog tkiva.
Za uzorke koji su teški za liziranje ili pročišćavanje ultračiste ukupne RNA za

nizvodne aplikacije, možete koristiti TRIzol ®
Reagens nakon čega slijedi pročišćavanje pomoću PureLink-a ™ RNA Micro Kit,
(stranica 24).
• Smrznuto tkivo mora ostati smrznuto na –80 ° C prije lize. Hladite epruvete bez
RNaze na suhom ledu prije nego što u njih stavite smrznuto tkivo. Odmrzavanje
%
smrznutog tkiva prije lize može rezultirati razgradnjom RNA i smanjenim prinosom
RNA.
• Brzo i potpuno razbijanje tkiva tijekom lize važno je kako bi se spriječila

razgradnja RNA.
Sažetak Sljedeća tablica daje sažetak metoda lize na temelju vrste i veličine
Metode lize uzorka.
Vrsta tkiva Dostupne metode lize
Smrznuto ili • Tučak za mikrocentrifugu

Svježa vlaknasta
• Rotor-stator
Svježe mekano • Tučak za mikrocentrifugu
• Rotor-stator

16
Pročišćavanje RNK iz životinjskih tkiva, Nastavak

Potrebno
• 70% etanola (u vodi bez RNaze)
• 96–100% etanola
• PureLink ™ RNA-nositelj (neobavezna ako je ≤10 μg tkiva)
• Epruvete bez RNaze od 1,5 ml
• Staklo bez RNase, teflon, ili plastični tučak
• Jedan sljedećeg za homogenizaciju: igla kalibra 18–20 s štrcaljkom bez

RNaze ili
Homogenizator (stranica vi i stranica 7)

ili Homogenizator rotor-stator (stranica 7)
Za uzorke koji se teško liziraju možete upotrijebiti TRIzol ®

Reagens nakon čega slijedi pročišćavanje pomoću PureLink-a ™ RNA Micro Kit, (vidi
stranicu 24).
17
Liza i Prije početka, pripremite sve pufere i otopine prema protokolu na stranicama 9-
Homogenizacija 10.
≤5 mg Smrznuto ili Koristiti jedan sljedećih protokola (tučak za mikrocentrifugu ili rotor-stator) za
Svježe tkivo pripremu smrznutog ili svježeg vlaknastog tkiva.
Protokol mikrocentrifuge s tučkom
1. Prenesite do 5 mg uzorka tkiva u odgovarajuću veličinu cijevi za

mikrocentrifugu.
2. Odmah dodajte u svoj uzorak 350 μl pufera za lizu pripremljenog s 2-
merkaptoetanolom (stranica 9).
Bilješka: Ako obrađujete ≤10 μg tkiva, dodajte 5 μl razrijeđenog PureLinka ™ RNA nositelj
(25 ng / 350 μl, pripremljeno kako je opisano na stranici 10).
3. Usitnite tkivo tučkom odgovarajuće veličine bez RNaze. Koristite pokrete

gore-dolje i uvijanje u cijevi dok se tkivo temeljito ne poremeti i ne lizira.
4. Centrifugirajte na ≥12.000 × g tijekom 2 minute u sobi

temperatura. Prebacite supernatant u novu epruvetu za mikrocentrifugu bez
RNaze.
temperaturi:
• Prenesite lizat u homogenizator (stranica vi) umetnut u RNase-ree

cijev i centrifugu na ≥12 000 × g tijekom 2 minute. Uklonite homogenizator kad završite, ili
• Provucite lizat 5-10 puta kroz iglu dimenzija 18-21 pričvršćenu na
štrcaljku bez RNaze, a zatim centrifugirajte na ≥12000 g tijekom 2 minute. Prebacite supernatant u novu
epruvetu bez RNaze.
Nastavite do Vezanje, pranje i ispiranje ( sljedeća stranica).
Protokol rotor-stator:
1. Prenesite svoj uzorak tkiva u mikrocentrifugu odgovarajuće veličine.

2. Odmah dodajte 350 μl pufera za lizu pripremljenog s
2-merkaptoetanolom (vidi stranicu 9) u svoj uzorak pomoću vrhova pipeta
bez RNaze.
3. Brzo homogenizirajte svoj uzorak pomoću rotora-statora na maksimalnoj

brzini najmanje 45 sekundi.
4. Centrifugirajte na ≥12.000 × g tijekom 2 minute na sobnoj temperaturi.
5. Pažljivo premjestite supernatant u novu epruvetu.

Bilješka: Neizvršenje koraka 4-5 dovest će do začepljenja stupaca
Nastavite do Vezanje, pranje i ispiranje ( sljedeća stranica).
18
Uvez, Slijedite korake u nastavku za vezanje, pranje i eluiranje RNA iz uzorka

Pranje i vašeg tkiva:
Elucija 1. Dodajte 350 μl (ili ekvivalentni volumen) 70% etanola u svaki volumen
homogenata tkiva.
Bilješka: Ako je dio uzorka izgubljen tijekom homogenizacije, prilagodite volumen

etanola u skladu s tim.
2. Temeljito promiješajte miješanjem ili vrtloženjem kako bi se rastvorio vidljivi

talog koji može nastati nakon dodavanja etanola.
3. Prenesite do 700 μl uzorka (uključujući preostali talog) u PureLink ™

Stupac Micro Kit (s kolekcijskom cijevi).
4. Centrifuga na ≥12 000 × g 1 minutu na sobnoj temperaturi. Odbacite

protok i ponovno umetnite PureLink ™ Stupac Micro Kit u istoj zbirci cijevi.
6. Dodajte 350 μl pufera za pranje I u uložak za centrifugiranje.
Bilješka: Ako se ne izvodi korak DNaze na stupcu, povećajte količinu pufera za

pranje I na 600ul. Centrifuga na
≥12.000 × g 30 sekundi na sobnoj temperaturi. Bacite protok i sabirnu cijev i prijeđite na

korak 13.
7. Centrifuga na ≥12 000 × g 1 minutu na sobnoj temperaturi. Odbaciti

protok i sabirnu cijev i stavite stupac u novi
Zbirka cijev.
8. Dodajte 10 μl rekonstituiranog PureLinka ™ DNaza na 10 μl 2x pufer DNaze da

se dobije smjesa od 20 μl. Lagano miješajte pipetiranjem gore-dolje nekoliko puta.
9. Smjesu od 20 μl DNaze dodajte u središte stupca.
11. Dodajte 350 μl pufera za pranje I u središte kolone.
12. Centrifuga za ≥12.000 × g tijekom 15 sekundi na sobnoj temperaturi.
19
Pranje i
13. U stupac dodajte 500 μl pufera za pranje II, pripremljenog s etanolom (stranica 9).
Elucija,
nastavio 14. Centrifuga na ≥12 000 × g 15 sekundi na sobnoj temperaturi. Odbacite
protok.
15. Ponovite korake 13–14, jednom.
16. Centrifugirajte PureLink ™ Stupac mikro kompleta na ≥12.000 × g 1

minutu na sobnoj temperaturi da se membrana osuši s vezanom RNA. Odbaciti sabirnu cijev i umetnite
PureLink ™ Mikro Kit komplet u cijev za oporavak.

Micro Kit (vidi Parametri ispiranja,
stranica 10).
19. Centrifuga tijekom 1 minute pri ≥12 000 × g na sobnoj temperaturi.
rezultirat će konačnim volumenom eluata od 10 μl (vidi Parametri ispiranja, stranica 10).

20
Pročišćavanje RNK iz uzoraka mikrodisekcije
laserskim hvatanjem
Uvod Ovaj odjeljak pruža protokol za pročišćavanje ukupne RNA iz uzoraka

laserskog hvatanja (LCM).

Potrebno
• 1,5 - ml epruvete za mikrocentrifugu bez RNaze
• PureLink ™ DNaza (pripremljeno kako je opisano na stranici 9))
• PureLink ™ RNA nositelj (pripremljen kako je opisano na stranici 10)

LCM uzoraka Koristite sljedeći protokol za pripremu LCM uzoraka.
1. Dodati 350 μl pufera za lizu pripremljenog s 2-merkaptoetanolom.
2. Dodajte 5 μl razrijeđenog PureLinka ™ RNA nositelj (25 ng / 350 μl, pripremljeno kako
je opisano na stranici 10).
3. Vrtlog za liziranje i homogenizaciju uzorka.
4. Prilagodite glasnoću u epruveti na 350 μl dodavanjem dodatnog pufera za lizu,

ako je potrebno.
Važno: Ako vaša epruveta s uzorkom ne može primiti 350 ul, prenesite homogenizirani lizat
u novih 1,5 ml bez RNaze
mikrocentrifuge i podesite volumen uzorka na 350 ul dodavanjem pufera za lizu.
Nastavite do Vezanje, pranje i ispiranje ( ispod).
21
Pročišćavanje RNK iz uzoraka za lasersko
hvatanje mikrodesekcije, Nastavak
Uvez, Slijedite korake u nastavku da biste povezali, isprali i eluirali svoju RNA.
Pranje i 1. U svaki volumen homogenata uzorka dodajte 350 μl (ili ekvivalentni

Elucija volumen) 70% etanola.
2. Temeljito promiješajte vorteksom da se rasprši svaki vidljivi talog koji može

nastati nakon dodavanja etanola.
3. Prenesite do 700 μl uzorka (uključujući preostali talog) na PureLink ™

Stupac Micro Kit (s sabirnom cijevi).
4. Centrifuga na ≥12 000 × g 1 minutu na sobnoj temperaturi. Odbacite

protok i ponovno umetnite PureLink ™ Stupac Micro Kit u istoj zbirci cijevi.


korak 13.
7. Centrifuga na ≥12 000 × g 1 minutu na sobnoj temperaturi. Bacite

protok i sabirnu cijev. Umetnite stupac u a novi Zbirka cijev.
8. Dodajte 10 μl rekonstituiranog PureLinka ™ DNaza na 10 μl 2x pufer DNaze

da se dobije smjesa od 20 μl. Lagano miješajte pipetiranjem gore-dolje nekoliko puta.


22
Pročišćavanje RNK iz uzoraka za lasersko
hvatanje mikrodesekcije, Nastavak
Pranje i 13. Dodajte 500 μl pufera za pranje II s etanolom (stranica 9) u PureLink ™ Stupac
Elucija, Micro Kit.
nastavio
14. Centrifuga na ≥12 000 × g 15 sekundi na sobnoj temperaturi. Odbacite protok
i ponovno umetnite PureLink ™ Stupac Micro Kit u istoj zbirci cijevi.
16. Centrifugirajte stupac sa sabirnom cijevi na ≥12 000 × g 1 minutu na sobnoj

temperaturi da se membrana osuši s vezanom RNA. Bacite sabirnu cijev i umetnite
PureLink ™ Mikro Kit komplet u cijev za oporavak.
17. Dodajte 12–22 μl vode bez RNaze u središte PureLinka ™ Stupac Micro Kit,
(vidi Parametri ispiranja,
stranica 10).
19. Centrifugirajte PureLink ™ Mikro komplet za 1 minutu na ≥12 000 × g na

sobnoj temperaturi.

Čuvajte svoju pročišćenu RNA na ledu ako ćete je upotrijebiti u roku od nekoliko
Pohrana sati. Za dugotrajno skladištenje, svoju pročišćenu RNA čuvajte na –80 ° C.
Pročišćena RNA
23
Korištenje TRIzola ® Reagens s PureLinkom ™ RNA Micro Kit
Uvod Ovaj odjeljak sadrži upute za uporabu TRIzola ® Reagens (stranica vi) u sprezi s
PureLinkom ™ RNAMicro Kit za izoliranje ukupne RNA iz uzoraka koji se teško
liziraju ( npr. vlaknasta tkiva). Ovaj kombinirani protokol također vam
omogućuje pročišćavanje ultračiste ukupne RNA za osjetljive nizvodne
aplikacije kao što su qPCR ili analiza mikrosreća.
Da biste dobili visokokvalitetnu ukupnu RNA, svakako slijedite

Smjernice za rukovanje RNK ( stranica 4).
Materijali Trebat će vam sljedeće stavke:

Potrebno
• TRIzol ® Reagens (stranica vi)
• Kloroform
• PureLink ™ RNA nositelj (nije obavezna za ≤10 μg tkiva)
• 96–100% etanola ili 70% etanola (u vodi bez RNaze), ovisno o korištenoj
opciji protokola
• 1,5 ml epruvete za mikrocentrifugu bez RNaze Vrhovi
• pipeta bez RNaze
• Homogenizator rotor-stator ili Homogenizator tkiva
24
Korištenje TRIzola ® Reagens s PureLinkom ™ RNA mikro komplet, Nastavak
TRIzol ® Reagens sadrži fenol (toksičan i nagrizajući) i gvanidin izotiocijanat

(nadražujuće sredstvo) i može se štetiti zdravlju ako se s njim ne postupa pravilno.
Izbjegavajte izravan kontakt s TRIzolom ® Reagens, kao izravni kontakt kože,
očiju ili dišnih putova s TRIzolom ® Reagens može uzrokovati kemijske opekline
na izloženom području.
Kada radite s TRIzolom ® Reagens, stalno radite u nape, i uvijek nosite

laboratorijski kaput, rukavice i zaštitne naočale. Pogledajte TRIzol ® Uložak
reagens proizvoda za više detalja.
Obratite se odjelu za zaštitu okoliša i zaštitu okoliša (EH&S) radi

pravilnog rada i smjernica za odlaganje.
Lizat Prije početka, pripremite sve pufere i otopine prema protokolu na

Priprema stranicama 9-10.
s TRIzolom ® Koristite TRIzol ® Reagens za pripremu lizata iz različitih vrsta uzoraka kako je dolje
Reagens opisano. Pogledajte TRIzol ® Priručnik za reagense za više informacija.
* Važno: Ako obrađujete ≤5000 stanica ili ≤10 μg tkiva, dodajte 5 μl razrijeđenog PureLinka ™ Nosite RNA (25
ng / 350 μl, pripremljeno kako je opisano na stranici 10) na vaš uzorak nakon dodavanja TRIzola ®
a prije homogenizacije.
Tkiva
Homogenizirajte do 10 mg tkiva u 1 ml TRIzola ® Reagens pomoću

homogenizatora rotor-stator. *
Pridržane stanice
Lizirajte stanice izravno u posudi za uzgoj dodavanjem 1 ml TRIzola ®

Reagens u posudu i propušta stanični lizat nekoliko puta kroz vrh pipete bez
RNaze. Količina TRIzola ®
Potrebni reagens temelji se na površini posude za uzgoj (1 ml na 10 cm 2) a ne

na broj prisutnih stanica. *
Suspenzijske stanice
Berite stanice i pelete centrifugiranjem. Upotrijebite 1 ml TRIzola ®

Reagens po 1 × 10 6 životinjske stanice. Lyze stanice ponavljajućim
pipetiranjem gore-dolje. *
25
Faza Nakon lize stanica ili tkiva, kako je gore opisano, izvedite sljedeće korake za
Odvajanje izoliranje uzorka.
s TRIzolom ® 1. Inkubirajte lizat s TRIzolom ® ( prethodna stranica) na sobnoj temperaturi tijekom 5
Reagens minuta kako bi se omogućila potpuna disocijacija nukleoproteinskih kompleksa.
2. Dodajte 0,2 ml kloroforma po 1 ml TRIzola ® Upotrijebljeni reagens

Stresite cijev rukom snažno 15 sekundi.
Bilješka: Vrtloženje može povećati onečišćenje DNA vašeg uzorka RNA. Izbjegavajte
vrtloženje ako je vaša daljnja aplikacija osjetljiva na prisutnost DNA.
3. Inkubirajte na sobnoj temperaturi 2-3 minute.
4. Centrifugirajte uzorak na ≥12 000 × g tijekom 15 minuta

na 4 ° C.
Bilješka: Nakon centrifugiranja, smjesa se odvaja u donju, crvenu fazu fenol-kloroform,

interfazu i bezbojnu gornju vodenu fazu koja sadrži RNA. Volumen vodene gornje faze je
~ 600 μl.
5. Prenesite bezbojnu gornju fazu koja sadrži RNA u novu epruvetu bez RNaze.
6. Dodajte jednaki volumen 70% etanola da se dobije konačna koncentracija

etanola od 35%. Vrtlog da se dobro promiješa.
7. Preokrenite epruvetu da rastvori vidljivi talog koji može nastati nakon dodavanja
etanola.
26
Uvez, Slijedite korake u nastavku da biste povezali, isprali i eluirali RNA iz uzorka.
Pranje i
Elucija 1. Prenesite do 700 μl uzorka (pripremljenog kako je opisano na prethodnoj stranici) na
PureLink ™ Stupac Micro Kit (s sabirnom cijevi).
2. Centrifuga na ≥12 000 × g 1 minutu na sobnoj temperaturi. Odbacite protok.


korak 10.
4. Centrifuga na ≥12 000 × g 1 minutu na sobnoj temperaturi. Odbacite protok i

sabirna cijev. Umetnite stupac u a novi
Zbirka cijev.
5. Dodajte 10 μl rekonstituiranog PureLinka ™ DNaza na 10 μl 2x pufer DNaze da se

dobije smjesa od 20 μl. Lagano miješajte pipetiranjem gore-dolje nekoliko puta.

10. U stupac dodajte 500 μl pufera za pranje II s etanolom (stranica 9).
11. Centrifuga na ≥12 000 × g 15 sekundi na sobnoj temperaturi. Odbacite protok.
27
Pranje i 13. Centrifugirajte stupac sa sabirnom cijevi na ≥12 000 × g 1 minutu na sobnoj
Elucija temperaturi da se membrana osuši s vezanom RNA. Odbaciti protok i sabirnu cijev i
umetnite PureLink ™ Mikro Kit komplet u cijev za oporavak.

Micro Kit, (vidi Parametri ispiranja,
stranica 10).
16. Centrifugirajte PureLink ™ Mikro komplet za 1 minutu na ≥12 000 × g na sobnoj

temperaturi.

Pročišćena RNA
28
TRIzol ® Plus ukupna izolacija transkriptoma
Uvod Ovaj odjeljak sadrži upute za uporabu TRIzola ® Reagens (stranica vi) u sprezi s
PureLinkom ™ RNAMicro Kit za izoliranje ukupne transkriptomske RNA,
ukupne RNA, uključujući male RNA poput miRNA iz ≤10 mg svježeg ili
smrznutog tkiva. Ovaj kombinirani protokol također vam omogućuje
pročišćavanje ultračiste ukupne RNA za osjetljive nizvodne aplikacije kao što su
qPCR ili analiza mikrosreća.
Da biste dobili visokokvalitetnu ukupnu RNA, svakako slijedite

Smjernice za rukovanje RNK ( stranica 4).
Materijali Trebat će vam sljedeće stavke:

Potrebno
• TRIzol ® Reagens (stranica vi)
• Kloroform
• 100% etanol
• PureLink ™ RNA nositelj (neobavezna, ako koristite ≤5000 stanica ili ≤10
μg tkiva)
• 1,5 ml epruvete za mikrocentrifugu bez RNaze Vrhovi
• pipeta bez RNaze
• Homogenizator rotor-stator ili Homogenizator tkiva
29
TRIzol ® Plus ukupna izolacija transkriptoma
Nastavak
TRIzol ® Reagens sadrži fenol (toksičan i nagrizajući) i gvanidin izotiocijanat

(nadražujuće sredstvo) i može se štetiti zdravlju ako se s njim ne postupa pravilno.
Izbjegavajte izravan kontakt s TRIzolom ® Reagens, kao izravni kontakt kože,
očiju ili dišnih putova s TRIzolom ® Reagens može uzrokovati kemijske opekline na
izloženom području.
Kada radite s TRIzolom ® Reagens, stalno radite u nape, i uvijek nosite

laboratorijski kaput, rukavice i zaštitne naočale. Pogledajte TRIzol ® Uložak
reagens proizvoda za više detalja.
Obratite se odjelu za zaštitu okoliša i zaštitu okoliša (EH&S) radi

pravilnog rada i smjernica za odlaganje.
Lizat Prije početka, pripremite sve pufere i otopine prema protokolu na

Priprema stranicama 9-10.
s TRIzolom ® Koristite TRIzol ® Reagens za pripremu lizata iz različitih vrsta uzoraka kako je dolje
Reagens opisano. Pogledajte TRIzol ® Priručnik za reagense za više informacija.
* Važno: Ako obrađujete ≤5000 stanica ili ≤10 μg tkiva, dodajte 5 μl razrijeđenog PureLinka ™ Nosite
RNA (25 ng / 350 μl, pripremljeno kako je opisano na stranici 10) na vaš uzorak nakon dodavanja
TRIzola ®
a prije homogenizacije.
Tkiva
Homogenizirajte do 10 mg tkiva u 1 ml TRIzola ® Reagens pomoću

homogenizatora rotor-stator. *
Pridržane stanice
Lizirajte stanice izravno u posudi za uzgoj dodavanjem 1 ml TRIzola ®

Reagens u posudu i propušta stanični lizat nekoliko puta kroz vrh pipete bez
RNaze. Količina TRIzola ®
Potrebni reagens temelji se na površini posude za uzgoj (1 ml na 10 cm 2) a ne

na broj prisutnih stanica. *
Suspenzijske stanice
Berite stanice i pelete centrifugiranjem. Upotrijebite 1 ml TRIzola ®

Reagens po 1 × 10 6 životinjske stanice. Lyze stanice ponavljajućim
pipetiranjem gore-dolje. *
30
TRIzol ® Plus ukupna izolacija transkriptoma,
Nastavak
Faza Nakon lize stanica ili tkiva, kako je gore opisano, izvedite sljedeće korake za
Odvajanje izoliranje uzorka.
s TRIzolom ® 1. Inkubirajte lizat s TRIzolom ® ( prethodna stranica) na sobne temperature 5
Reagens minuta kako bi se omogućila potpuna disocijacija nukleoproteinskih kompleksa.
2. Dodajte 0,2 ml kloroforma po 1 ml TRIzola ® Upotrijebljeni reagens Zatvorite i

rukom snažno protresite epruvetu 15 sekundi.
Bilješka: Vrtloženje može povećati onečišćenje DNA vašeg uzorka RNA. Izbjegavajte
vrtloženje ako je vaša daljnja aplikacija osjetljiva na prisutnost DNA.
3. Inkubirajte na sobnoj temperaturi 2-3 minute.
4. Centrifugirajte uzorak na ≥12 000 × g tijekom 15 minuta

na 4 ° C.
Bilješka: Nakon centrifugiranja, smjesa se odvaja u donju, crvenu fazu fenol-kloroform,

interfazu i bezbojnu gornju vodenu fazu koja sadrži RNA. Volumen vodene gornje faze je
~ 600 μl.
5. Prenesite bezbojnu gornju fazu koja sadrži RNA u novu epruvetu bez
RNaze.
6. Dodajte jednaki volumen 100% etanola da se dobije konačna koncentracija

etanola od 50%. Vrtlog da se dobro promiješa.
7. Preokrenite epruvetu da rastvori vidljivi talog koji može nastati nakon

dodavanja etanola.
31
Nastavak
Uvez, Slijedite korake u nastavku da biste povezali, isprali i eluirali RNA iz uzorka.
Pranje i
Elucija Bilješka: Ukupni protokol Transcriptome ne sadrži isprani pufer I korak.
1. Prenesite do 700 μl uzorka (pripremljenog kako je opisano na prethodnoj

stranici) na PureLink ™ Stupac Micro Kit (s sabirnom cijevi).
2. Centrifuga na ≥12 000 × g 1 minutu na sobnoj temperaturi. Odbaciti

protok.
3. Prenesite preostali uzorak u stupac i

ponoviti Korak 2, jednom, odbaciti protok i sabirnu cijev i
umetnite stupac u a novi
Zbirka cijev.
4. Dodajte 500 μl pufera za pranje II s etanolom (stranica 9) u središte

PureLinka ™ Stupac Micro Kit.
5. Centrifuga na ≥12 000 × g 15 sekundi na sobnoj temperaturi. Odbaciti

protok.
6. Ponovite korake 4-5 jednom.
7. Centrifuga na ≥12 000 × g 1 minutu na sobnoj temperaturi da se

membrana osuši s vezanom RNA. Odbacite protok i sabirnu cijev i umetnite PureLink ™ Mikro Kit komplet
u cijev za oporavak.
32
Nastavak
Pranje i
8. Dodajte 12–22 μl vode bez RNaze u središte PureLinka ™ Stupac Micro Kit
Elucija (vidi Parametri ispiranja,
stranica 10).
10. Centrifugirajte PureLink ™ Stupac Micro Kit s cijevi za oporavak tijekom

2 minute na ≥12 000 × g na sobnoj temperaturi.

33
Pročišćavanje tekućih uzoraka za čišćenje i koncentraciju RNA
Uvod Ovaj odjeljak sadrži upute za pročišćavanje ≥50 μg tekućeg uzorka za

čišćenje RNA ( npr enzimske reakcije) ili za koncentriranje ≥50 μg
razrijeđenih uzoraka RNA.
Uzorak tekućine Vrste tekućeg uzorka koje podržava ovaj komplet uključuju enzimatske
Vrste reakcije (probava DNaze, obilježavanje RNA), ekstrakte citoplazmatske
RNA iz stanica sisavaca i
in vitro transkripcijske reakcije (Sambrook i sur., 1989.). Ovaj se komplet također
može koristiti za čišćenje uzoraka tekuće RNA.

Potrebno
• Ispušni pufer II (pripremljen s etanolom, stranica 9)
• Voda bez RNase (isporučuje se s kompletom)
• 1,5 ml epruvete za mikrocentrifugu bez RNaze
34
Pročišćavanje tekućih uzoraka za čišćenje i koncentraciju RNA, Nastavak
Pročišćavanje RNA Koristite sljedeći protokol za pročišćavanje ukupne RNA iz tekućih uzoraka:
iz tekućine
Uzorci 1.Jednom volumenu tekućeg uzorka (≤1,2 ml) dodajte jedan volumen pufera za lizu
pripremljen s 2-merkaptoetanolom (stranica 9), a zatim isti volumen
96–100% etanola ( npr. u 1 ml uzorka, dodajte 1 ml pufera za lizu, a
zatim 1 ml etanola).
2. Pomiješajte vrtloženjem ili pipetiranjem gore-dolje 5 puta (koristite vrhove pipete bez RNaze).
3. Prenesite do 700 μl uzorka na PureLink ™ Stupac Micro Kit (s sabirnom cijevi).
4. Centrifuga na ≥12 000 × g 15 sekundi na sobnoj temperaturi. Odbaciti protok.
5. Ponoviti Koraci 3-4, dok se ne obradi cijeli uzorak.
6. Dodajte 500 μl pufera za pranje II s etanolom (stranica 9) u PureLink ™ Stupac Micro

Kit.
7. Centrifuga na ≥12 000 × g 15 sekundi na sobnoj temperaturi. Odbaciti protočni.
35
Pročišćavanje tekućih uzoraka za čišćenje i koncentraciju RNA, Nastavak
Pročišćavanje RNA Postupak je nastavljen s prethodne stranice
iz tekućine
9. Centrifugirajte stupac na ≥12 000 × g 1 minutu na sobnoj temperaturi da se
Uzorci, membrana osuši s vezanom RNA. Odbacite protok i sabirnu cijev i umetnite PureLink ™
nastavio Mikro Kit komplet u cijev za oporavak.
10. Dodajte 12–22 μl vode bez RNaze u središte PureLinka ™ Stupac Micro
Kit (vidi Parametri ispiranja,
stranica 10).
12. Centrifugirajte stupac 1 minutu na ≥12 000 × g na sobna temperatura.

Pročišćena RNA
36
Analiza prinosa i kvalitete RNA
Uvod Nakon što ste pročistili ukupnu RNA, odredite količinu i kvalitetu
kako je opisano u ovom odjeljku.
Prinos RNA Ukupna RNA lako se kvantificira pomoću Quant-iT-a ™

RiboGreen ® Komplet za ispitivanje RNA ili UV apsorpcija na 260 nm.
Quant-iT ™ RiboGreen ® Komplet za ispitivanje RNA
Quant-iT ™ Komplet za ispitivanje RNA (stranica vi) pruža brzu, osjetljivu i

specifičnu metodu za kvantifikaciju RNA uz minimalne smetnje od DNA,
proteina ili drugih uobičajenih onečišćenja koja utječu na očitanja UV
apsorpcije.
Komplet sadrži vrhunski kvantitativni reagens i prethodno razrijeđene

standarde za standardnu krivulju. Ispitivanje se izvodi u formatu
mikrotitarske ploče i dizajnirano je za čitanje u standardnim
fluorescentnim čitačima mikroploča.
UV apsorpcija
Da biste odredili količinu pomoću UV apsorpcije:
1. Razrijedite alikvot ukupnog uzorka RNA u 10 mM Tris-HCl, pH 7,5. Dobro

izmiješajte. Prebacite u kivetu (duljina puta od 1 cm).
Bilješka: RNA mora biti u neutralnom pH puferu kako bi se točno izmjerila

apsorbancija UV zraka.
2. Odredite OD 260 otopine pomoću a

spektrofotometar slijepo na 10 mM Tris-HCl, pH 7,5.
Izračunajte količinu ukupne RNA koristeći sljedeću formulu:
Ukupna RNA (μg) = OD260 × [40 μg / (1 OD260 × 1 ml)] × faktor

razrjeđenja × ukupni volumen uzorka (ml)
Primjer:
Ukupna RNA eluirana je u vodi u ukupnom volumenu od 150 μl. Alikvot 40-μl
eluata razrijeđen je na 500 μl u 10 mM Tris-HCl, pH 7,5. OD 260 dobiveno je 0,188.
Količina RNA u uzorku određuje se kao što je prikazano u nastavku:
Ukupna RNA (μg) =
0,188 × [40 μg / (1 OD 260 × 1 ml)] × 12,5 × 0,15 = 14,1 μg
37
Analizirajući prinos i kvalitetu RNA, Nastavak
Kvaliteta RNA Tipično, ukupna RNA izolirana pomoću PureLinka ™ RNAMicro Kit ima OD 260/280 od>
1,8 kada se uzorci razrijede u Tris-
HCl (pH 7,5). OD 260/280 od> 1,8 ukazuje da je RNA razumno čista od proteina i
drugih UV kromofora koji bi mogli ometati daljnje primjene ili negativno utjecati
na stabilnost pohranjene RNA.
Elektroforeza u agaroznom gelu RNA izolirana pomoću PureLinka ™ RNAMicro

Kit pokazuje da je omjer opsega 28S do 18S> 1,5. Ocjenjuje se da je RNA
netaknuta ako se opaze diskretne 28S i 18S ribosomske RNA trake.
Bioanalizator Kvaliteta pročišćene ukupne RNA također se može analizirati korištenjem

Analiza od bioanalizatora kao što je bioanalizator Agilent 2100 s RNA LabChip ®. U donjim
Kvaliteta RNA primjerima bioanalizator je korišten za pokazivanje prisutnosti 18S i 28S rRNA, kao i
malih vrsta RNA u ukupnoj RNA pročišćenoj pomoću PureLinka ™ RNAMicro Kit.
Ukupna RNA pročišćena je iz stanica HEK293, jetre štakora i bubrega miša

koristeći protokole opisane u ovom priručniku. Alikvoti od 2% konačnih
količina eluiranja podvrgnuti su bioanalizi korištenjem bioanalizatora Agilent
2100.
Stanice HEK293
Jetra štakora
28S
18S 18S
28S
Miš
Bubreg
28S
18S
38
očekivani rezultati
Očekivano Sljedeća tablica navodi prosječne prinose ukupne RNA dobivene iz

Prinosi različitih uzoraka korištenjem PureLinka ™ RNA Micro Kit.
Kvantifikacija RNA izvedena je upotrebom UV apsorpcije na 260 nm.
Tip uzorka Uzorak Iznos Prosječno

Prinos
Životinjske stanice HeLa 5 × 10 5 7,5 μg
HEK293 5 × 10 5 10 μg
Tkivo životinja Jetra štakora 5 mg 17 μg
Mozak štakora 5 mg 2 μg
Slezena štakora 5 mg 13,1 μg
Srce štakora 5 mg 1,8 μg
Testisi pacova 5 mg 7,1 μg
39
Rješavanje problema
Uvod Pogledajte tablicu u nastavku kako biste riješili probleme s kojima se možete
susresti s PureLinkom ™ RNAMicro Kit.
Problem Uzrok Riješenje
Začepljen Jako viskozna Homogenizirajte uzorak homogenizatorom rotor –

Homogenizator lizat ( npr. tele stator.
timus)
Začepljen Nepotpun Slijedite smjernice protokola za svaku vrstu i količinu

RNK homogenizacija ili uzorka.
PureLink ™ raspršivanje
Pročistite homogenat i uklonite sve čestice
Micro Kit talog nakon
ili viskozne materijale centrifugiranjem i
Stupac dodavanje etanola
koristite samo
supernatant za naknadno učitavanje na RNA
PureLink ™ Stupac Micro Kit.
Potpuno raspršite bilo koji talog koji nastane nakon

dodavanja etanola homogenatu.
Niska RNA Nepotpuna liza Osigurajte da je dodano 10 μl 2-merkaptoetanola po 1

prinos i ml pufera za lizu.
homogenizacija
Sve korake izvodite na sobnoj temperaturi, ako nije
drugačije propisano.
Smanjite količinu korištenog početnog materijala ili

povećajte količinu pufera za lizu.
Koristite odgovarajuće metode homogenizacije u

skladu s preporukama u protokolima specifičnim za
uzorak.
Izrežite uzorke tkiva na manje komade i osigurajte da

je tkivo potpuno uronjeno u pufer za lizu kako bi se
postigla optimalna liza.
Loša kvaliteta Prinos i kvaliteta izolirane RNA ovise o vrsti i starosti

polazni materijal početnog materijala.
Obavezno upotrijebite svježi uzorak i preradite ga

odmah nakon sakupljanja ili zamrznite uzorak na –80
° C ili u tekućem dušiku neposredno nakon berbe.
40
Rješavanje problema, Nastavak
Niska RNA Etanol nije dodan Obavezno dodajte etanol u pufer za pranje II prema
prinos, za pranje pufera II uputama na stranici 9.
nastavio
Neispravno ispiranje Dodati vodu bez RNaze i provesti inkubaciju
Uvjeti 1 minutu prije centrifugiranja.
Slijedite preporuke pod

Parametri ispiranja ( stranica 10).
Da biste povratili više RNA, izvedite drugi korak

eluiranja.
RNK RNK kontaminirana Koristite vrhove pipeta bez RNaze s aerosolnim barijerama.
degradiran s RNase
Često mijenjajte rukavice.
Prijeđite automatskim pipetama RNase AWAY ™ otopina

nakon pranja PureLinka ™ Micro Kit stupac s
puferom za pranje I.
Nepravilno rukovanje Ako se odmah ne obradi, brzo zamrznite tkivo odmah

uzorka iz nakon branja i čuvajte na –80 ° C ili u tekućem
berba do lize dušiku.
Smrznuti uzorci moraju ostati smrznuti dok se ne

doda pufer za lizu.
Izvršite lizu brzo nakon dodavanja pufera za

lizu.
Tkivo vrlo bogato RNases RNA izolirana iz tkiva bogatog RNazama može
( npr. štakor zahtijevati dodavanje inhibitora / inaktivatora RNaze
gušterača) kako bi se RNA zaštitila od razgradnje ili koristiti veći
volumen pufera za lizu.
Uzorci eluiranja u 100% formamidu. Ako se RNA

koristi za izolaciju mRNA sjevernih mrlja, eluirati u
0,1% SDS-u.

41
Rješavanje problema, Nastavak
DNK Nepotpun Slijedite smjernice protokola za svaku vrstu i

onečišćenje homogenizacija ili količinu uzorka.
nepotpuno rasipanje
taloga nakon
dodavanje etanola
Inhibicija Prisutnost etanola Tragovi etanola iz pufera za ispiranje II mogu

nizvodno u pročišćenoj RNA inhibirati enzimske reakcije nizvodno. Bacite pufer
enzimski za pranje II. Postavite PureLink ™ Micro Kit stup u
reakcije cijev za pranje i centrifugirajte PureLink ™ Micro Kit
stup na maksimalnoj brzini 2-3 minute da se
uložak potpuno osuši.
Prisutnost soli u Koristite ispravan redoslijed pufera za pranje.

pročišćenoj RNA Uvijek operite uložak puferom za pranje nakon
kojeg sam uslijedio
pranje puferom za pranje II.
Niska A 260/280 Uzorak je razrijeđen Upotrijebite 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) za razrjeđivanje

omjer u vodi; ne- uzorka za OD mjerenja.
puferirana voda ima
promjenjivi pH
(Wilfinger i sur.,
1997)
42
dodatak
Tehnička podrška
mreža Posjetite web stranicu Invitrogen na www.invitrogen.com za:
Resursi
• Tehnički izvori, uključujući priručnike, vektorske karte i nizove, napomene o
aplikacijama, MSDS-ove, često postavljana pitanja, formulacije, citate,
priručnike itd.
• Potpune kontaktne informacije o tehničkoj podršci Pristup
• mrežnom katalogu Invitrogen
• Dodatne informacije o proizvodu i posebne ponude
Kontaktirajte nas Za više informacija ili tehničku pomoć nazovite, napišite, pošaljite faks ili e-poštom.
Dodatni međunarodni uredi navedeni su na našoj web stranici ( www.invitrogen.com ).
Sjedište tvrtke: Japansko sjedište: Europsko sjedište:

Invitrogen Corporation Invitrogen Japan Invitrogen Ltd
5791 Van Allen Way Carlsbad, CA LOOP-X st. Bldg. 6F Poslovni park Inchinnan
92008 SAD 3-9-15, Kaigan 3 pogon fontane
Minato-ku, Tokio 108-0022 Paisley PA4 9RF, Velika Britanija
Tel: 1 760 603 7200
Tel: 81 3 5730 6509 Faks: Tel: +44 (0) 141 814 6100
Tel (besplatno): 1 800 955 6288
81 3 5730 6519 Tehnički faks: +44 (0) 141 814 6117
Faks: 1 760 602 6500
E-mail: E-mail: E-mail:
tech_support@invitrogen.com jpinfo@invitrogen.com eurotech@invitrogen.com
MSDS MSDS (Sigurnosno-tehnički listovi) dostupni su na našem web mjestu www.invitrogen.co
Certifikat Potvrda o analizi (CofA) pruža detaljne informacije o kontroli kvalitete za

Analiza svaki proizvod. CofA je dostupan na našoj web stranici na www.invitrogen.com/cofa
, a može se pretraživati po broju serije proizvoda koji je otisnut na svakoj
kutiji.
43
Tehnička podrška, Nastavak
Ograničena Invitrogen se zalaže za pružanje kupaca visokokvalitetne robe i usluga. Cilj

Jamstvo nam je osigurati da svaki kupac bude 100% zadovoljan našim proizvodima i
našom uslugom. Ako imate bilo kakvih pitanja ili nedoumica u vezi s
proizvodom ili uslugom Invitrogen, kontaktirajte naše predstavnike tehničke
podrške.
Invitrogen jamči da će svi njegovi proizvodi raditi u skladu sa

specifikacijama navedenim u potvrdi o analizi. Tvrtka će besplatno
zamijeniti bilo koji proizvod koji ne udovoljava tim specifikacijama. Ovaj
jamstvo ograničava odgovornost tvrtke Invitrogen Corporation samo prema

trošku proizvoda. Ne daje se jamstvo za proizvode nakon navedenog datuma
isteka. Nijedno jamstvo nije primjenjivo ako se sve komponente proizvoda ne
pohranjuju u skladu s uputama. Invitrogen zadržava pravo odabrati metode za
analizu proizvoda, osim ako Invitrogen pismeno ne pristane na određenu
metodu prije prihvaćanja narudžbe.
Invitrogen čini sve napore kako bi osigurao točnost svojih publikacija, ali
shvaća da je povremena tiskarska ili druga pogreška neizbježna. Stoga
Invitrogen ne daje nikakva jamstva u vezi sa sadržajem bilo kojih
publikacija ili dokumentacije. Ako otkrijete pogrešku u bilo kojoj od naših
publikacija, prijavite je našim predstavnicima tehničke podrške.
Invitrogen ne preuzima nikakvu odgovornost za bilo kakav poseban,

slučajan, neizravan ili posljedičan gubitak ili štetu. Gore navedeno
ograničeno jamstvo jedino je i isključivo. Ne daje se nikakvo drugo
jamstvo, bilo izričito ili implicirano, uključujući bilo kakvo jamstvo
prodajnosti ili podobnosti za određenu svrhu.
44
Obavijest kupca
Ograničena upotreba Kupnja ovog proizvoda prenosi kupcu neprenosivo pravo korištenja kupljene količine proizvoda i komponenata proizvoda u
Dozvola za oznaku: istraživanju koje je proveo kupac (bez obzira je li kupac akademska ili profitna organizacija). Kupac ne može prodati ili na
Broj 5 drugi način prenijeti (a) ovaj proizvod (b) njegove komponente ili (c) materijale izrađene pomoću ovog proizvoda ili njegovih
komponenata trećoj strani ili na drugi način koristiti ovaj proizvod ili njegove dijelove ili materijale izrađene pomoću ovog
proizvoda ili njegovih komponenata u komercijalne svrhe. Kupac može podatke ili materijale nastale korištenjem ovog
proizvoda prenijeti znanstvenom suradniku, pod uvjetom da takav prijenos nije u bilo koju komercijalnu svrhu i ako se takav
suradnik pismeno složi (a) da takav materijal neće prenijeti bilo kojoj trećoj strani, i (b) koristiti takve prenesene materijale i /
ili informacije isključivo za istraživanje, a ne u komercijalne svrhe. Komercijalne svrhe označavaju bilo koju aktivnost
stranke na razmatranje i mogu uključivati, ali nisu ograničene na: (1) uporabu proizvoda ili njegovih komponenata u
proizvodnji; (2) uporaba proizvoda ili njegovih komponenata za pružanje usluge, informacija ili podataka; (3) upotreba
proizvoda ili njegovih komponenata u terapeutske, dijagnostičke ili profilaktičke svrhe; ili (4) preprodaja proizvoda ili
njegovih dijelova, bez obzira jesu li takav proizvod ili njegovi dijelovi preprodani za uporabu u istraživanjima. Invitrogen
Corporation neće podnijeti zahtjev protiv kupca zbog kršenja patenata u vlasništvu ili pod nadzorom Invitrogen Corporation
koji pokrivaju ovaj proizvod temeljen na proizvodnji, upotrebi ili prodaji terapijske, kliničke dijagnostike, cjepivo ili
profilaktički proizvod koji je kupac razvio u istraživanju u kojem je ovaj proizvod ili njegove komponente korišten, pod
uvjetom da niti ovaj proizvod niti bilo koja od njegovih komponenata nije korišten u proizvodnji takvog proizvoda. Ako
kupac nije spreman prihvatiti ograničenja ove izjave o ograničenoj upotrebi, Invitrogen je spreman prihvatiti povrat
proizvoda uz puni povrat novca. Za informacije o kupnji licence za ovaj proizvod u druge svrhe, osim u istraživačke svrhe,
obratite se Odjelu za licenciranje, Invitrogen Corporation, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, California 92008. Telefon (760)
603-7200. Faks (760) 602-6500. E-mail: Ako kupac nije spreman prihvatiti ograničenja ove izjave o ograničenoj upotrebi,
Invitrogen je voljan prihvatiti povrat proizvoda uz puni povrat novca. Za informacije o kupnji licence za ovaj proizvod u
druge svrhe, osim u istraživačke svrhe, obratite se Odjelu za licenciranje, Invitrogen Corporation, 5791 Van Allen Way,
Carlsbad, California 92008. Telefon (760) 603-7200. Faks (760) 602-6500. E-mail: Ako kupac nije spreman prihvatiti
ograničenja ove izjave o ograničenoj upotrebi, Invitrogen je spreman prihvatiti povrat proizvoda uz puni povrat novca. Za
informacije o kupnji licence za ovaj proizvod u druge svrhe, osim u istraživačke svrhe, obratite se Odjelu za licenciranje,
Invitrogen
Corporation, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, California 92008. Telefon (760) 603-7200. Faks (760) 602-6500. E-mail: outlicensing@invitr
Zaštitni znakovi tvrtke TRIzol ® je registrirani zaštitni znak tvrtke Molecular Research Center, Inc. Zymolyase ™ je zaštitni
Ostalo znak tvrtke Zymo Research. ULTRA-TURRAX ® je registrirani zaštitni znak tvrtke IKAWorks, Inc.
Tvrtke Polytron ® je registrirani zaštitni znak Kinematice.
45
Reference
Chirgwin, JM, Przybyla, AE, MacDonald, RJ i Rutter, WZ (1979) Izolacija

Biološki aktivna ribonukleinska kiselina iz izvora obogaćenih ribonukleazama. Biochem. 18, 5294-5299
Sambrook, J., Fritsch, EF i Maniatis, T. (1989) Molekularno kloniranje: Laboratorijski priručnik,

Drugo izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York
Vogelstein, B. i Gillespie, D. (1979) Pripremno i analitičko pročišćavanje DNA iz

agaroza. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 76, 615-619
Wilfinger, WW, Mackey, K. i Chomczynski, P. (1997) Učinak pH i ionske snage

o spektrofotometrijskoj procjeni čistoće nukleinske kiseline. Biotehnike 22,
474-476, 478-481
© 2008 Invitrogen Corporation. Sva prava pridržana.

Samo za istraživanje. Nije namijenjeno za terapijsku ili dijagnostičku uporabu životinja ili ljudi.
46
Bilješke
Bilješke
Sjedište tvrtke
Invitrogen Corporation
5791 Van Allen Way
Carlsbad, CA 92008
T: 1 760 603 7200 F: 1
760 602 6500
E: tech_support@invitrogen.com
Za kontaktne podatke specifične za zemlju posjetite našu web stranicu na www.invitrogen.com

Purelink Rna Micro Kit Man - En.hr

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Purelink Rna Micro Kit Man - En.hr

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Sadržaj

Sadržaj i pohrana kompleta.................................................................................................v Dodatni proizvodi

Priprema pufera i parametri.............................................................................. 9

Pročišćavanje RNK iz životinjskih stanica...............................................................................11

Pročišćavanje RNK iz životinjskih tkiva.......................................................................16

Pročišćavanje RNK iz uzoraka mikrodisekcije laserskim hvatanjem.......................21

Korištenje TRIzola ® Reagens s PureLinkom ™ RNAMicro Kit...................... 24

TRIzol ® Plus ukupna izolacija transkriptoma.............................................................29

Pročišćavanje tekućih uzoraka za čišćenje i koncentraciju RNA...................34

Analiza prinosa i kvalitete RNA........................................................................ 37

Dostava i Sav sadržaj PureLinka ™ RNAMicro Kit isporučuju se na sobnoj temperaturi.

Po primitku pohranite PureLink ™ DNaza / nosač RNA kutija na 4 ° C.

Sadržaj kompleta stabilan je do šest mjeseci ako se pravilno čuva.

Sadržaj kompleta Komponente uključene u PureLink ™ Komplet RNAMicro nalazi se u dva

PureLink ™ Sadržaj RNAMicro kompleta (okvir 1) Količina

Pufer za lizu 125 ml

Voda bez RNaze 15,5 ml

PureLink ™ Stubovi Micro Kit (s cijevima za Po 50

PureLink ™ DNK-DNaza / nosač (RNA 2) Količina

PureLink ™ DNaza (liofilizirana) 1500 jedinica

PureLink ™ Voda na stupcu DNaza 2X pufer Voda bez 1 ml

PureLink ™ RNA nositeljica (liofilizirana) 300 μg

Dodatni Sljedeći proizvodi također su dostupni od Invitrogena.

ili kontakt Tehnička podrška ( stranica 43).

RT-PCR i qRT-PCR proizvodi

Proizvod Količina Kataloški broj

SuperScript ® III Sustav za sintezu prvog lanca za RT-PCR 50 reakcija 18080–051

SuperScript ® III Prva smjesa za sintezu SuperMix 50 reakcija 18080–400

SuperScript ® III Prvolančana sinteza SuperMix za qRT-PCR 50 reakcija 11752–50

Platina ® PCR SuperMix 100 reakcija 11306–016

Platina ® Kvantitativni PCR SuperMix-UDG 100 reakcija 11730–017

Proizvod Količina Kataloški broj

RNase DALEKO ® 250 ml 10328–011

TRIzol ® Reagens 100 ml 15596–026

TRIzol ® LS reagens 100 ml 10296–010

TRIzol ® Plus sustav za pročišćavanje RNA 50 priprema 12183–555

0,1–2 Kb RNA ljestve UltraPure ™ Voda 75 μg 15623–100

tretirana DEPC-om 1L 750023

ispitivanje RNA 1 komplet Q33140

Uvod PureLink ™ RNAMicro Kit pruža jednostavnu, pouzdanu i brzu metodu za

Općenito, uzorci se liziraju, a zatim homogeniziraju u prisutnosti gvanidinij

• Pojačanje RNA za analizu mikromreža

• Priprema knjižnice cDNA nakon poli (A) + odabira

• Pojačanje RNA za analizu mikromreža

• PCR u stvarnom vremenu (RT-PCR)

• Kvantitativna PCR u stvarnom vremenu (qRT – PCR)

• Analize zaštite nukleaze

Nastavak na sljedećoj stranici

Prednosti PureLink ™ RNAMicro Kit nudi sljedeće prednosti:

• Izolacija RNA iz različitih tipova uzoraka s vrlo malim količinama polaznog

• Minimalno onečišćenje genomske DNA pročišćene RNA digestijom DNaze na

• Pouzdane performanse visokokvalitetne pročišćene ukupne RNA u nizvodnim

Tip uzorka Uzorak Iznos Stranica

Životinjske stanice ≤5 × 10 5 Stanice 11

Kit Početna količina: Razlikuje se od vrste uzorka (vidi

Kapacitet spremnika stupa: 700 μl

Kompatibilnost centrifuge: Sposoban za centrifugiranje

Volumen elucije: ≤12 μl

Prinos RNA: > 85%

Nastavak na sljedećoj stranici

Uvod Pregledajte informacije u ovom odjeljku prije početak.

U ovom su odjeljku date smjernice za rukovanje RNA i prikupljanje

Smjernice za Slijedite dolje navedene smjernice kako biste spriječili