Dodatak za praktičnu i seminarsku

nastavu iz Medicinske biohemije za

zimski semestar 2017/2018.godine

Studijski program
MEDICINA
 VJEŽBA 1.
2

ENZIMI

Enzimi su proteini sa katalitičkim osobinama, nazivaju se i biološki katalizatori. Ne

postoji niti jedan oblik žive materije u kome se ne vrše enzimske reakcije. Enzimi
kontrolišu proces probave, energetski metabolizam, fiziološke funkcije, mišićnu
kontrakciju, respiraciju, rast, hormonalne funkcije, nasljede, reprodukciju itd.

Enzimi katalizuju biohemijske reakcije smanjujući energiju aktivacije. Katalitički

efekat enzima je veliki, tako da vrlo mala količina nekog enzima ubrzava pretvaranje
velike kolićine supstrata u proizvod biohemijske reakcije, pri ćemu se sam enzim ne
mijenja.

Enzimi mogu biti:

Protein — enzimi (jednostavni proteini)

izgradeni samo od aminokiselinskih ostataka (npr. digestivni enzimi: tripsin,
himotripsin i elastaza)

Proteid — enzimi (složeni proteini)

uz aminokiselinski ostatak sadrže i neaminokiselinske kofaktore.

Proteid-enzim se naziva holoenzim, a sastoji se od:

apoenzima (proteinski dio) i

kofaktora (neorganski joni) ili koenzima
(kompleksne organske ili metaloorganske molekule)

Primjeri neorganskih jona koji imaju ulogu kofaktora su: Cu2+, Fe ili Fe3 (citohrom
oksidaza), Se (glutation peroksidaza), Zn2+ (karboanhidraza, karbiksipeptidaze A i B)
i Mg2+ (heksokinaza, piruvat kinaza).

Enzimi imaju neke zajedničke osobine sa hemijskim katalizatorima, ali se po nekim

osobinama i bitno razlikuju od njih.

Zajedničke osobine enzima i hemijskih katalizatora:

 ne troše se, niti nestaju tokom reakcije koju

katalizuju,
 ubrzavaju tok reakcije,
 ne mijenjaju konstantu ravnoteže reakcije koju
katalizuju.

Razlike izmedu enzima i hemijskih katalizatora:

3

 enzimi djeluju specifično prema supstratima i prema vrsti hemijske reakcije

koju katalizuju,
 enzimi su aktivni unutar odredenog pH i temperaturnog intervala,
 enzimska aktivnost je regulisana kontrolnim mehanizmima.

NOMENKLATURA I KLASIFIKACIJA ENZIMA

Medjunarodna unija za biohemiju i molekularnu biologiju (IUBMB, International

Union of Biochemistry and Molecular Biology) je definisala klasifikaciju i
nomenklaturu enzima prema kojoj su svi enzimi podijeljeni u šest klasa, koje su
podijeljene u podklase, a svaka od njih je podijeljena u podpodklase u okviru kojih se
nalaze pojedinačni enzimi (Tabela 5).

Tabela 5. Klasifikacija enzima

Enzim dobija naziv tako da se prvo stavlja naziv supstrata na koji enzim djeluje,
a zatim se dodaje tip hemijske reakcije sa suflksom — aza.

Alkohol dehidrogenaza je prema ovoj nomenklaturi alkohol:NAD

oksidoreduktaza, jer katalizuje reakciju oksidoredukcije, pri čemu je donor
elektrona alkohol, a akceptor NAD
Svi enzimi su odredjeni svojim klasifikacionim brojem (EC—inicijali "Enzyme
Commission") sa četiri cifre, pri čemu prva označava klasu, druga podklasu, treća
podpodklasu, a četvrta cifra je individualni broj enzima iza kojeg se ne stavlja tačka:
(EC 2.7.1.2 je klasifikacioni broj za ATP:D-glukoza 6-fosfotransferazu).

METODE ODREDJIVANJA AKTIVNOSTI ENZIMA

Iako danas postoje osjetljive metode za direktno odredivanje koncentracije enzima,

kao proteinske molekule, ipak se, uglavnom, koriste metode u kojima se aktivnost
4

enzima mjeri preko proizvoda enzimski-katalizovane reakcije. Enzim djeluje na svoj

specifični supstrat i nakon toga se mjeri koncentracija nastalog proizvoda reakcije ili
smanjenje koncentracije supstrata. U praksi se obićno mjeri nastali proizvod, jer je
osjetljivost veća.

Enzimi se u biološkom materijalu nalaze u vrlo malim koncentracijama. Mnogo je

lakše i jednostavnije odrediti relativno veliku količinu proizvoda enzimske reakcije.
Tako se odreduje brzina enzimske reakcije odnosno aktivnost enzima ili katalitička
koncentracija.

Katalitička koncentracija enzima predstavlja količinu supstrata koja se u katalizovanoj

reakciji, pod optimalnim uslovima, transformiše u proizvod, u jedinici vremena. Za
svaku pojedinačnu metodu odredivanja enzima preporučeni su optimalni uslovi.

Optimalni uslovi su:

 preporučena temperatura 30 0 C,
 optimalni pH,
 odredena koncentracija supstrata (kako bi se postiglo zasićenje enzima
supstratom),
 prisustvo aktivatora i koenzima pri nekim reakcijama.

U starijim metodama za odredivanje enzimske aktivnosti, biološki materijal koji sadrži

enzim inkubira se odredeno vrijeme sa supstratom, nakon čega se inkubacija prekine
dodatkom reagensa koji inaktivira enzim (deproteinizacija ili radikalne promjene pH)
i izvodi hemijska reakcija, kojom se odreduje koncentracija nastalog proizvoda
enzimske reakcije. Obzirom da se mjerenje vrši jedanput, iza fiksnog vremena
inkubacije, te se metode nazivaju metodama jedne tačke ili metodama dvije tačke, jer
se mjerenje vrši na početku i na kraju inkubacije.

Danas, prednost imaju kinetičke metode, u kojima se vrši kontinuirano mjerenje

apsorpcije svjetlosti od strane nastalog proizvoda, tokom prvih nekoliko minuta
djelovanja enzima. Mjerenja su u tačno odredenim vremenskim intervalima, obično
svakih 30 sekundi.

Prve metode kontinuiranog mjerenja su se temeljile na optičkom testu i služile su za

odredivanje aktivnosti oksidoreduktaza. U ovom testu se koriste apsorpcione osobine
koenzima NAD+ i NADP+, odnosno njihovih redukovanih oblika NADH+H+ i
NADPH+H+. Redukovani koenzimi apsorbuju svjetlost izmedu 300 i 360 nm, dok
njihovi oksidovani oblici NAD+ i NADP , u tom području ne apsorbuju svjetlost.
Maksimum apsorpcije NADH+H+, odnosno NADPH+H je pri 339 nm. Kasnije su
sintetisani razni supstrati, uglavnom spojevi p-nitroanilina i p-nitrofenola, koji svojim
oslobadjanjem iz tih supstrata oboje reakcionu smjesu.
5

JEDINICE ZA IZRAŽAVANJE AKTIVNOSTI ENZIMA

Aktivnosti enzima su ranije izražavane u različitim jedinicama, tako da je svaki autor

uz svoju metodu davao i definiciju jedinice, što je onemogućavalo poredenje nalaza
dobijenih različitim metodama, a nije se mogao dobiti ni uvid u medjusobni odnos
aktivnosti različitih enzima. To su bili razlozi za uvodenje internacionalne jedinice (IU
ili U).

Jedna internacionalna jedinica (U) je aktivnost odredjenog enzima koja u jednoj minuti
katalizuje promjenu jednog mikromola supstrata, pod optimalnim standardnim
uslovima:

Uvodjenjem novog sistema mjera i jedinica, SI, uvedena je nova jedinica za aktivnost
enzima. Ova se jedinica naziva katal.

Jedan katal (kat) odgovara aktivnosti enzima koja u jednoj sekundi katalizuje promjenu
jednog mola supstrata, pod optimalnim standardnim uslovima:

Za preračunavanje U/L u nkat/L vrijedi slijedeći izraz:

Aktivnosti enzima izražene u katalima predstavljaju vrlo male brojeve (koji numerički
ne odgovaraju zahtjevima SI), zato ih treba izražavati u nanokatalima (nkat).
6

Vježba 1.

Katalitička aktivnost i supstratna specifičnost enzima

Enzimi su katalizatori hemijskih reakcija u ćelijama i tjelesnim tečnostima

pa se često nazivaju i bioloski katalizatori. Po strukturi, enzimi su najčešće
proteini, a mogu biti i kataliticke RNK tj. RNK enzimi i ribozimi.

Katalizatori utiču na brzinu odvijanja reakcije tako sto snižavaju potrebnu

energiju aktivacije (Ea).

Katalizatori se ne trose niti stvaraju za vreme odvijanja katalisane reakcije.

Katalizatori samo menjaju brzinu postizanja ravnoteZilog stanja ali ne

menjaju smer reakcije

Enzim i, kao biološki katalizatori, poseduju sve navedene osobine

katalizatora. Za razliku od neorganskih katalizatora, enzimi poseduju veću
katalitičku efikasnost i specifični su prema supstratu. Za svoju akttivnost, enzimi
zahtevaju uslove prisutne u živim organizmima.

Hidroliza skroba amilazom i hidroliza skroba hlorovodoničnom kiselinom

Skrob je polisaharid izgraden od glukoze. Prisutan je u biljkama i sastoji

se od amiloze i amilopektina. Amiloza je nerazgranati deo molekula skroba u
obliku zavojnice ili spirale u kojoj su rnolekuli glukoze povezani α -1 ,4
glukozidnim vezama. Amilopektin je razgranata forma skroba u kojoj se
polimerni lanci glukoze granaju. Na mestima grananja molekuli glukoze su
povezani α-1,6 glukozidnim vezama. Mesto grananja se nalazi na svakih 30 α
-1,4 glukozidnih veza. Hidroliza skroba se odvija pod uticajem i bioloskih i
hemijskih katalizatora.

Enzim koji vrši hidrolizu skroba se naziva α -amilaza. Alfa arnilaza je

enzim koji u toku varenja ima ulogu u razgradnji složenih ugljenih hidrata. U
zavisnosti od toga da Ii je amilaza poreklom iz pljuvačnih (salivatornih) žlezdi
ili pankreasa razlikuju se S i P tip (izoenzima) alfa amilaze. U ustima varenje
otpočinje dejstvom alfa amilaze iz pljuvačnih žlezdi (S - tip) dok se u crevima
nastavlja pod dejstvom alfa amilaze poreklom iz pankreasa (P - tip). Alfa-
amilaza pripada grupi endoglukozidaza jer hidrolizuje α -1,4 glukozidne veze
koje su smeštene u unutrašnjim delovima molekula skroba. Delimičnom
hidrolizom skroba stvaraju se dekstrini. Dekstrini su polisaharidi, kao i skrob,
samo manje molekulske mase. Završni proizvod hidrolize skroba amilazom su
maltoza, izomaltoza i maltotrioza.
7

amilaza

Hlorovodonična kiselina, kao i amilaza, vrši hidrolizu skroba preko dekstrina, kao
intermedijera reakcije. Završni proizvod razgradnje skroba hlorovodoničnom
kiselinom je glukoza.

HCl

Skrob+nH20 → dekstrini + glukoza

Princip: Hidroliza skroba pod uticajem amilaze se prati pomoću Lugolovog

rastvora (alkoholni rastvor moolekularnog joda u KJ). Amiloza sa molekulskim
jodom daje plavo obojeni kompleks. Boja nižih degradacionih proizvoda
hidrolize skroba (dekstrini) zavisi od molekulske mase i varira od ljubičaste
(amilodekstrini), preko crvene (eritrodekstrini) do žućkaste (ahrodekstrini). Žuta
prebojenost hidrolizata skroba je posledica nevezanog molekulskog joda u
rastvoru. Hidroliza skroba se prati i pornoću Felingove reakcije, koja je pozitivna
ukoliko u rastvoru postoje redukujuće supstance (maltoza, izomaltoza).

Reagensi i pribor: Rastvor skroba, 10g/L, rastvor HCI 100g/L, alkoholni

rastvor joda u KJ, Felingov ( Fehling ) reagens.

Felingov reagens: Pomješati rastvore Feling I i Feling II u odnosu 1+1

i zagrijati u vodenom kupatilu na 100°C.

Vodeno kupatilo, termometar, pipete od l ml, epruvete, lijevak,

predmetna stakla, Pasterove pipete.

Materijal: Razblažena pljuvačka. Pljuvačku sakupiti u filter papir kojim

je obložen lijevak, a zatim dodati približno istu kolicinu destilovane vode i
profiltrirati. Dobijeni filtrat pljuvačke koristiti u daljem postupku.

Postupak: U četiri epruvete sipati po 5 ml rastvora skroba. U prvu

epruvetu dodati ml destilovane vode (kontrola), u drugu 1ml razblažene
pljuvačke, a u treću i četvrtu po 1ml rastvora HCI. Prve tri epruvete staviti u
vodeno kupatilo na 38°C, a četvrtu u ključalo vodeno kupatilo (100°C) i
inkubirati 10 minuta. Nakon 10 minuta izvaditi epruvete iz vodenog kupatila
i rashladiti česmenim mlazom. Sadržaj svake epruvete podjeliti na dva dijela.
Sa jednim delom izvesti Lugolovu reakciju, a sa drugim dijelom Felingovu
da bi se odredio konačni proizvod hidrolize skroba.
8

Lugolova reakcija: U epruvetu dodati 1-2 kapi rastvora joda. U prisustvu

skroba jod se ugradjuje u zavojnicu amiloze i uzrokuje pojavu plave boje.
Zapaziti razlike u obojenosti sadržaja u različitim epruvetama i stepenu
hidrolize skroba.
Felingova reakcija: U 1 ml hidrolizata dodati 2 ml Felingovog rastvora i
epruvete zagrevati dodatnih 10 minuta u ključalom vodenom kupatilu. Zapaziti
stvaranje vodenog taloga Cu oksida, koji nastaje zbog prisustva redukujućih
šećera (maltoze i glukoze). Objasniti dobijene rezultate.

Tabela 1. Hidroliza skroba amilazom ili hlorovodoničnom kiselinom

Odredjivanje supstratne specitičnosti ureaze (karbamid aminohidrolaze,

EC 3.5.1.5)

Princip: Ureaza iz sojinog brasna razlaže ureu, pri čemu dolazi

do oslobadanja amonijaka:

Oslobođeni amonijak se otkriva na osnovu specifičnog mirisa ili zapažanjern

promjene boje crvenog lakmus papira u plavu. Pored uree, ureazi se kao
supstrat ponudi i acetamid. Acetamid je strukturno slično jedinjenje urei jer
posjeduje amidnu vezu, dok je urnjesto amino grupe prisutna metil grupa.

Uprkos strukturnoj sličnosti izmedu uree i acetamida, ureaza ne reaguje sa

acetamidom.

Reagensi i pribor.: U rea, 50g/L, acetamid 50g/L; epruvete, Pasterove pipete.

Materijal: Sojino brašno, lakmus papir.

9

U epruvetu sipati 2 ml rastvora uree. U drugu epruvetu dodati istu

Postupak:
zapreminu rastvora acetamida. U obe epruvete dodati po 1 g sojinog
brašna. Na otvor obe epruvete staviti ovlaženi lakmus papir. Reakcionu
smesu ostaviti da stoji neko vreme. Posle 1 0 minuta lakmus papir nad
epruvetom sa ureom poplavi. Lakmus papir nad epruvetom sa acetamidom
ne mjenja boju, što potvrdjuje visoki stepen specifičnosti ureaze.

Tabela 2. Rezultati odredjivanja supstratne specifičnosti ureaze

Odredjivanj e supstratne specifičnosti amilaze (α1-4-glukan-4-

glukanhidrolaze, EC 3.2.1.1)

Princip: Delovanje amilaze se ispituje u prisustvu dva supstrata, skroba i

disaharida, saharoze. U oba supstrata je prisutna glukozidna veza. Medjutim,
nasuprot velikom molekulu skroba u kojem je glukoza povezana α-1,4 i α -1,6
glukozidnim vezama, saharoza je disaharid koji se sastoji od molekula glukoze
i fruktoze, koji su povezani α 1 -β2 glukozidnom vezom. Ni skrob ni saharoza
nemaju slobodne redukcione grupe-tek ako dodje do hidrolize (skrob na
maltozu, saharoza na glukozu i fruktozu) u rastvoru se pojavljuju redukcioni
šećeri (maltoza i glukoza). Efikasnost hidrolize se prati pomoću Felingove
reakcije, koja je pozitivna u prisustvu redukujućih šećera. Hidroliza skroba pod
uticajem amilaze se odvija do maltoze, koja poseduje redukciona svojstva.
Zato je Felingova reakcija pozitivna. Pošto amilaza ne razlaže saharozu, ne
dolazi do stvaranja glukoze i Felingova reakcija je negativna.

Reagensi i pribor: Rastvor skroba, 10g/L, rastvor saharoze, 10g/L,

Felingov reagens; epruvete, Pasterove pipete, vodeno kupatilo.

Materijal: Razblažena pljuvačka.

Postupak: U dve epruvete sipati po 5 kapi pljuvačke. U jednu epruvetu

dodati 10 kapi rastvora skroba, a u drugu 10 kapi saharoze. Sadržaj obe epruvete
dobro promješati, a zatim staviti u vodeno kupatilo na 37°C. Nakon 10 minuta
sa sadržajem obe epruvete izvesti Felingovu reakciju. Dobijene rezultate uporediti.
10

Tabela 3. Rezultati odredjivanja supstratne specifičnosti amilaze

Epruveta Enzim Supstrat Proizvod Felingova
reakcija
1. Amilaza Skrob
' 2. Amilaza Saharoza

Ime i prezime: _________________________________

Datum vježbe:______________________ Ovjera____________________________

11

Vježba 2.

Uticaj temperature, pH, aktivatora i inhibitora enzimske

reakcije na enzimsku aktivnost

Pored koncentracije supstrata i koncentracije enzima na enzimsku

aktivnost utiču i drugi faktori kao što su temperatura, pH vrijednosti sredine,
prisustvo koenzima, aktivatora i inhibitora. Uticaj ovih faktora je uslovljen
enzimskom strukturom. U najvećem broju slučajeva enzimi su proteini pa sve
fizičke i hemijske osobine proteina zapravo važe i za enzime.

Kao i kod hemijskih katalizatora povećanje temperature ubrzava

enzimsku reakciju, a smanjenje temperature usporava. Medjutim, obzirom da
je enzim protein, sa većim povećanjem temperature dolazi do denaturacije
molekula proteina, tj. do trajnog uništavanja njegove sekundarne i tercijarne
strukture. Za enzime ljudskog organizma optimalna temperatura je oko 38°C.
Najveći broj enzima izgubi svoju katalitičku sposobnost već na
temperaturama od 50°C do 70°C. Obzirom da je denaturacija izazvana
visokom temperaturom ireverzibilna, i gubitak katalitičke moći enzima, na
ovaj način, je ireverzibilan. Snižavanjem temperature dolazi do smanjenja
enzimske aktivnosti. Na 0°C i nižim temperaturama većina enzima je potpuno
neaktivna. Smanjenje i gubitak katalitičke aktivnosti enzima na niskim
temperaturama je posljedica smanjenja pokretljivosti čestica i reverzibilan je
proces. Ovo je razlog zbog koga se niske temperature (-20°C) koriste za
čuvanje bioločkog materijala (ćelija i tkiva).
Temperaturni koeficijent (Qlo) predstavlja promjenu brzine enzimske
reakcije za svakih 100 C porasta temperature. Brzina većine bioloških reakcija se
približno udvostruči pri porastu temperature za 100 C (Qo =2), a prepolovi pri
opadanju temperature za 10 0 C.

Kao i optima lna temperatura, za svaki enzim neophodna je i optimalna

vrijednost pH. Optimalna vrijednost pH je ona vrijednost na kojoj je
katalitička moć enzima najveća. Ona se za većinu enzima kreće od pH5 do
pH9. Postoji i manji broj enzima koji pokazuju maksimalnu katalitičku
aktivnost izvan ovog opsega npr. pepsi n čiji je optimalan pH 1,5; arginaza
pri pH 7; alkalna fosfataza pri pH10. Optimalna vrijednost pH sredine je
bitna za očuvanje konformacije enzima. Pri blažoj promjeni pH dolazi do
promjene u naelektrisanju aminokiselina sa bočnim lancima. Što je u rastvoru
više molekula H+ slobodne amino i karboksilne grupe biće pozitivnije
naelektrisane i obrnuto. Aktivni centar, odnosno mjesto na enzimu za koje se
vezuje supstrat i katalitičko mjesto se upravo sastoje od aminokiselina sa
bočnim lancima. Promena naelektrisanja amino i karboksilnih grupa u ovim
aminokiselinarna može dovesti do neprepoznavanja supstrata i smanjivanja
katalitičke rnoći enzima. Velika promjena pH može izazvati trajno uništenje
12

enzima (denaturacija proteina jakim kiselinama i bazama).

Enzimska aktivnost je često regulisana prisustvom brojnih molekula
koje dovode do smanjenja ili ubrzanja enzimske reakcije. Takva jedinjenja se
nazivaju modulatori enzimske aktivnosti i vezuju se za aktivno ili alosterno
rnjesto na enzimu. U zavisnosti od toga da li ubrazvaju iii smanjuju brzinu
enzimske reakcije dijele se na aktivatore i inhibitore. Aktivatori enzimske
aktivnosti su često metalni joni poput Zn2 +, Co2 +, Mg2+ , Mn2+. Inhibitor
reakcije često može biti i proizvod same reakcije. Joni teških metala kao što
2 2
su Hg +, Ag+, Cu + inhibiraju enzime tako što se ireverzibilno vezuju
za aktivno mjesto enzima i dovode do njihove denaturacije.

Uticaj temperature na aktivnost amilaze iz pljuvačke

Princip: Uticaj temperature na katalitičku efikasnost amilaze prati se

odredjivanjem brzine hidrolize skroba na različitim temperaturama.

Reagensi i pribor. Skrob, 10g/L, rastvor joda u KJ (Lugolov rastvor);

epruvete, Pasterove pipete, vodeno kupatilo, plamenik, posuda sa ledom,
staklene pločice, stakleni štapići.

Materijal: Razblažena pljuvačka ( 1:5)

Postupak. Obilježiti tri epruvete brojevima l , 2 i 3. U svaku epruvetu sipati

po 1 mL razblažene pljuvačke. Prvu epruvetu staviti u ledenu vodu, a drugu
epruvetu ostaviti na sobnoj temperaturi. Treću epruvetu staviti u ključalo
vodeno kupati1o najmanje 5 minuta ili zagrijavati isto toliko nad plamenikom
da bi doš1o do denaturacije proteina. Nakon ključanja rashladiti epruvetu do
sobne temperature.

U prvu epruvetu sipati 1 mL rastvora skroba koji je prethodno

rashladjen na ledu. U ostale dvije epruvete dodati po 1 mL rastvora skroba
koji je stajao na sobnoj temperaturi. Iz sve tri epruvete staklenirn štapićem
uzeti po 1-2 kapi inkubacione rnješavine i prenjeti na staklenu pločicu.
Dodati jednu kap Lugolovog rastvora i zapaziti boju. Zatim epruvete
obilježene brojevima 2 i 3 staviti u vodeno kupatilo na 38°C, a epruvetu
obilježenu brojem 1 ostaviti na ledu. Uzorke smjese uzirnati poslije 5, 7 i
10 minuta. Zapaziti razliku u brzini hidrolize skroba na različitim
temperaturama. Posle završene inkubacije od 10 minuta epruvetu broj 1
staviti u vodeno kupatilo na 38°C i pokazati da niska temperatura prolazno
smanjuje enzimsku aktivnost.
13

Tabela 1. Rezultati odredji va nja uticaja temperature na aktivnost amilaze

Uticaj promjene pH na aktivnost α-amilaze

Princip: Brzina hidrolize skroba pod uticajem amilaze se prati u

inkubacionim mješavinama koje imaju različite vrijednosti pH. Stepen
hidrolize skroba se odredjuje pomoću Lugolove reakcije. Kao optimalni pH
za amilazu se uzima ona pH vrednost na kojoj je hidroliza najveća.

Reagensi i pribor: Skrob, 10 g/L; Na2HP04 0,2 mol/L; limunska kiselina,

0,1 mol/L, rastvor joda u KJ (Lugo1ov rastvor); NaCl, 1 0g/L; epruvete,
Pasterove pipete, vodeno kupatilo

Materijal: Razblazena pljuvacka ( 1 :10)

Postupak: Miješanjem Na2HP04 i limunske kiseline u odgovarajućem

odnosu dobijaju se puferi sa pH vrijednostima od 5,6 do 8,0. U 4 obilježene
epruvete otpipetirati po 1mL pufera odgovarajuće pH vrijednosti. U svaku
epruvetu dodati po 1 mL rastvora skroba i po 10 kapi rastvora NaCl i 10
kapi razblažene pljuvačke. Sadržaj epruveta promešati istaviti ih u vodeno
kupatilo da stoje 10 minuta na 38°C. Zatim sadržaju svake epruvete dodati
po 1-2 kapi rastvora joda i promješati. Posmatrati razvijene boje. Odrediti
pH vrijednost na kojoj je amilaza najaktivnija.

Tabela 2. Odredjivanje pH optimuma za α-amilazu

14

Aktivatori i inhibitori α-amilaze

Princip: Brzina hidrolize skroba pod uticajem amilaze se prati u prisustvu jona
Cl- kao aktivatora i jona Cu2+ kao inhibitora amilaze. Stepen hidrolize skroba
se odreduje pomoću Lugolove reakcije .

Reagensi i pribor. Rastvor skroba, 10g/L, rastvor joda u KJ (Lugolov

rastvor), rastvor NaCl 10g/L; rastvor CuSO4 10g/l, epruvete, Pasterove pipete.

Materijal: Razblažena pljuvačka ( 1:5)

Postupak: U tri epruvete sipati po 1 mL razblažene pljuvačke. Prvoj epruveti

dodati po 1 kap rastvora NaCl, drugoj 1 kap rastvora CuS04 i trećoj 1 kap
destilovane vode. U sve tri epruvete sipati po 5 kapi rastvora skroba i ostaviti
ih 5 minuta na sobnoj temperaturi. U sve tri epruvete dodati po 2 kapi
Lugolovog rastvora. Zapaziti boju i prodiskutovati rezultate.

Tabela 3. Rezultati odredjivanja uticaja modulatora na aktivnost amilaze

Lugolova
reakcija

Ime i prezime: _________________________________

Datum vježbe:______________________ Ovjera____________________________

15

Vježba 3.

Odredjivanje katalitičke aktivnosti enzima i Km

Koncentracija enzima

Pri optimalnim uslovima (optimalnoj temperaturi i pH, višku supstrata i eventualnom

prisustvu aktivatora i koenzima) brzina enzimske reakcije direktno je proporcionalna
količini prisutnog enzima. Enzim (E) je reaktant koji se vezuje sa supstratom (S) dajući
enzim-supstrat kompleks (ES), koji se razlaže dajući proizvod (P) i slobodan enzim.

Enzim utiče na brzinu enzimske reakcije, ali ne utiče na konstantu ravnoteže. Brzina
enzimski katalizovane reakcije nije neograničeno proporcionalna koncentraciji
enzima.

Koncentracija supstrata

Brzina enzimske reakcije se povećava sa povećanjem koncentracije supstrata do

postizanja maksimalne brzine reakcije.

Dijagram l . Grafički prikaz zavisnosti brzine enzimske

reakcije od promjene koncentracije supstrata

Dijagramom 1. je prikazano da se pri niskim koncentracijama supstrata, brzina

enzimske reakcije povećava gotovo linearno, a daljim povećanjem koncentracije
supstrata kriva poprima oblik hiperbole, dok ne dostigne plato, maksimalnu brzinu ,
koja se označava sa V ili Vmax. Novo povećanje koncentracije supstrata neće uticati
na promjenu brzine, jer je broj molova supstrata daleko veći od broja molova enzima
i nema slobodnog enzima sposobnog da reaguje. U takvim uslovima jedino dodatkom
nove količine enzima se može postići povećanje brzine enzimske reakcije.
16

Kada je polovina molekula enzima zasićena supstratom brzina enzimske reakcije je

tada jednaka polovini maksimalne brzine (Vmax/2).

Koncentracija supstrata pri kojoj brzina dostiže polovinu svoje maksimalne vrijednosti
označava se kao Km ili Michaelis-Menten-ova konstanta. Ovaj parametar je
konstantna vrijednost za odredjeni enzim i odredjeni supstrat. Ukoliko jedan enzim
djeluje na više supstrata, ima i više različitih Km vrijednosti. Za većinu enzima
vrijednosti Km se kreću od 10-5 do 10-2 mol/L.

U ćelijama, pri fiziološkim uslovima, koncentracija supstrata je najčešće bliska Km

vrijednosti za odredjeni enzim, tako da enzim nije zasićen supstratom, što znači da će
brzina enzimske reakcije u ovakvim okolnostima biti pod uticajem koncentracije
supstrata.

GRAFIČKO ODREDJIVANJE MICHAELLIS-MENTEN-ove KONSTANTE

Prema modelu koji su utvrdili L. Michaellis i M.Menten enzimska reakcija se odvija

tako da u reakciji enzima (E) sa supstratom (S) prvo nastaje kompleks enzim-supstrat
(ES), a zatim proizvod reakcije (P) uz oslobadanje enzima:

Zavisnost početne brzine (v) od koncentracije supstrata (cS) enzimski katalizovane

reakcije pokazali su L. Michaellis i M. Menten u jednačini:

Km je Michaellis-ova konstanta i predstavlja:

Ako je K3 mnogo manja u poredjenju sa Kl i K2, onda se Km približava odnosu K2/ Kl

što predstavlja konstantu disocijacije ES kompleksa, tako da je:

 velika Km— brza disocijacija ES — mali afinitet E za S

 mala Km— spora disocijacija ES— veliki afinitet E za S
17

Km je pokazatelj afiniteta enzima prema supstratu i predstavlja mjeru jačine

kompleksa enzim-supstrat. Veća Michaellis-ova konstanta znači manji afinitet enzima
prema supstratu i slabo vezivanje i obrnuto.

Kinetički parametri, Vmax i Km, nekog enzima mogu se izračunati matematički,

poslije pretvaranja Michaellis-ove jednačine hiperbole u jednačinu prave, što su prvi
uradili Lineweaver i Burk koristeći recipročnu transformaciju jednačine:

Kinetički parametri se mogu direktno očitati iz Lineweaver-Burk-ovog dijagrama, koji

se lako konstruiše nanošenjem recipročnih vrijednosti inicijalne brzine enzimske
reakcije (l/v) izmjerene pri različitim koncentracijama supstrata (8-10, a najmanje 5)
na ordinatu i recipročnih vrijednosti koncentracija supstrata (1/cS) na apscisu
koordinatnog sistema.

Jednačina prave glasi: y = ax+b

Ime i prezime: _________________________________

Datum vježbe:______________________ Ovjera___________________________

18

Vježba 4.

KLINIČKI ZNAČAJ ODREDJIVANJA KATALITIČKIH AKTIVNOSTI

ENZIMA

Klinički značaj odredjivanja katalitičke aktivnosti α-amilaze u urinu

Amilaze predstavljaju enzime iz klase hidrolaza, koje imaju osobinu da razgraduju α-

1,4 glikozidne veze u molekulama skroba i glikogena. Obzirom da li razgraduju α -1,4
glikozidne veze na krajevima ili unutar poliglukanskog lanca, dijele se na:

 β-amilazu (EC 3.2.1.2), koja spada u bakterijske i biljne egzoamilaze i

razgraduje (α -1,4-glikozidne veze samo na terminalnim krajevima
poliglukanskog lanca, svaki put otcjepljujući po jednu maltozu.
 α -amilazu (1,4-a-D glukan 4-glukanohidrolaza, EC 3.2.1.1) koja
predstavlja animalnu endoamilazu, gdje pripadaju i amilaze iz ljudskih
tkiva. One cijepaju α 1,4-glikozidne veze na bilo kojem mjestu unutar
poliglukanskog lanca, razgradujući na taj način velike polisaharidne
molekule do manjih jedinica kao što su dekstrini, maltoza i glukoza.

α -amilaza je enzim relativno male molekulske mase (45 000-50 000 daltona), lako
prolazi glomerularni filter i izlučuje se u urinu. α -amilaza zadržava aktivnost i na
500C, sa pH optimumom 6,7-7,2. Obzirom da su α -amilaze kalcijum metaloenzimi,
za njihov integritet neophodan je kalcijum,a svoju potpunu aktivnost mogu ispoljiti
u prisustvu različitih anjona (hloridi, bromidi, nitrati, holati ili fosfati).

Amilaza se nalazi u velikom broju organa i tkiva ljudskog organizma, a najbogatiji

ovim enzimom je pankreas, gdje se sintetiše amilaza (P-tip), a izlučuje se putem
pankreasnog duktusa u gastrointestinalni trakt, dok se u p!juvačnim žlijezdama
sintetiše amilaza (S-tip) koja započinje hidrolizu skroba u ustima i ezofagusu.
Amilazna aktivnost je pronadjena i u poprečno-prugastim mišićima, plućima,
masnom tkivu, testisima, ovarijumima, spermatozoidima, kolostrumu, suzama i
mlijeku. α -amilaza, koja je fiziološki prisutna u serumu i urinu potiče iz pankreasa i
pljuvačnih žlijezda.

Odredivanje katalitičke aktivnosti α -amilaze ima najveću dijagnostičku vrijednost

za oboljenja pankreasa i pljuvačnih žlijezda.

U akutnom pankreatitisu katalitička aktivnost amilaze u serumu počinje rasti 3-12

časova nakon početka bolesti, a maksimum dostiže poslije 24-36 časova. Nakon toga
katalitička aktivnost počinje opadati i naredna 2-4 dana se može normalizovati. 6-10
časova poslije toga katalitička aktivnost amilaze raste i u urinu, gdje se ponovo
normalizuje nakon 3-4 dana. Kako se amilaza izlučuje urinom uvijek treba analizirati
19

i serum i urin, jer ima slučajeva da je aktivnost amilaze u serumu u referentnom

intervalu, dok je u urinu aktivnost povećana.

Povećana katalitička aktivnost amilaze može biti pankreasnog i nepankreasnog

porijekla. Pankreasnog porijekla je povećanje katalitičke aktivnosti amilaze kod
karcinoma pankreasa, trauma pankreasa i komplikacija akutnog pankreatitisa, dok su
poremećaji nepankreasnog porijekla: renalna insuficijencija, parotitis (zaušnjaci),
cerebralne traume, peritonitis, oboljenja bilijarnog trakta, dijabetička ketoacidaza,
akutni alkoholizam.

U male djece u prvoj godini života i u nekim slučajevima hepatitisa može se naći
smanjena aktivnost amilaze u serumu.

Hidroliza skroba α amilazom iz urina

α -amilaza hidrolotički razlaže skrob preko nižih polisaharida dekstrina, do disaharida maltoze. Hidroliza skroba se može pratiti
i kontrolisati specijalnim indikatorima, prije svega pomoću joda (jodnom reakcijom). Rastvo se boji plavo uslijed sposobnosti
molekula skroba da na svoju površinu adsorbuje molekule joda. Dekstrini daju bojene reakcije sa jodom, a njihova boja zavisi
od veličine molekula. Amilodekstrini sa jodom dąju ljubičastu boju, eritrodekstrini crvenu, a ahrodekstrini sa jodom daju žućkastu
boju. Ako se rastvor u prisustvu joda ne boji, znači da je hidroliza do maltoze završena.

Reagensi i pribor:
l. 0,1% rastvor skroba
2. puferovani rastvor NaC1 (pH 7,3)
3. Lugol-ov astvor
4. 0.9% NaCl, NaOH (pH 8,5)
5. HCl (pH 5)
6. termostat
7. Epruvete
8. Pipete
9. čaše

18 0 C, treću 30 minuta na 500 C, a četvrtu seriju 30 minuta na +40C. Dodatkom Lugolovog rastvora pratiti razlike u aktivnosti
enzima.

Pliprema reagensa:

I 0,1% skrob (Ig skroba staviti u 1000 ml destilovane vode, zagłijavati na umjerenoj temperaturi
uz miješanje dok se skrob ne rastvori)
2 puferovani rastvor NaCl, PH 7,3 (18 g Na astvoriti u 2000 mL destilovane vode i PH podesiti
na 7,3)
3 Lugol-ov rastvor (u destilovanoj void rastvoriti 2g KI i g 12 i dopuniti vodom do 300 mL)
4 NaC1 (1,8 g NaC1 oriti u destilovanoj vodi i dopuniti vodom do 200 m-L)
NaOH, PH 8,5 ( vi se od osnovnog rastvora NaOH, koji se priprema rastvałanje 18 g NaOH
u 200 ml, destilovane vode. Radni rastvor se dobija r Jedenjem 8 mL osnovnog rastvora sa
destilovanom vodom do 100 mL. omoću pH-metra treba podesiti PH na 8,5. Ovaj rastvoł se
pravi posłedno prije vježbe, jer je nestabilan)
HCI, PH 5, 2 mla koncentrovane HCI dopuniti destilovanom vodom do zapremine od 400 ml, Od ovog,
osnovnog rastvora, uzeti 8 mL i razblažiti destilovano vodom do 200 mL Podesiti pomoću pH-metra vrijednost
PH na 5.
20

Klinički značaj odredjivanja katalitičkih aktivnosti alkalnih fosfataza u

serumu

Fosfataze predstavljaju grupno-specifične enzime iz klase hidrolaza, koje djeluju na

monoestre fosfatne kiseline, Alkalne fosfataze (ALP, AP) (ortofosfat-monoester
fosfohidrolaza, alkalni optimum, EC 3.1.3.1) katalizuju alkalnu hidrolizu velikog
broja prirodnih i sintetskih supstrata s optimumom katalitičke aktivnosti u intervalu
PH vrijednosti 9,8-10,5. Relativna molekulska masa alkalne fosfataze iz različitih
tkiva kreće se od 1,50 000 do 220 000 daltona. Zn je sastavni dio molekule i
neophodan je za aktivnost enzima, dok su joni Mg2+, C02+ i Mn2+ aktivatori
fosfataza.

Prema ranijem shvatanju alkalna fosfataza se smatrala jednim enzimom sa više raznih
izoenzima, ali danas se zna, da su njihove razlike takve da se smatraju raznim
enzimima: jetrena, koštana, crijevna, bubrežna i placentarna alkalna fosfataza.
Fiziološki, u serumu odraslih osoba, katalitička aktivnost alkalne fosfataze je
najvećim dijelom jetrenog porijekla, dok je u dječijem uzrastu najvećim dijelom
koštanog porijekla.

U dječijem uzrastu katalitička aktivnost alkalne fosfataze je fiziološki povećana za

2 do 3 puta u odnosu na odrasle, obzirom na veliku osteoblastnu aktivnost u tom
uzrastu. Fiziološko povećenje katalitičke aktivnosti alkalne fosfataze u serumu
prisutno je tokom trudnoće, zbog prisustva placentarne alkalne fosfataze.
Katalitička aktivnost ALP u serumu se blago povećava pri zarastanju koštanih
fraktura i stvaranju kalusa i ukoliko takvo povećanje aktivnosti ALP izostane,
znak je lošeg i smanjenog stvaranja kalusa.

Katalitička aktivnost ALP u serumu, patološki je povećana u oboljenja jetre sa

holestazom i u oboljenjima lokomotornog sistema sa povećanom aktivnošću
osteoblasta. U oboljenjima jetre (hepatitis, tumori, granulomi, infiltracije jetre)
povećanje katalitičke aktivnosti ALP je posljedica povećane proizvodnje enzima u
hepatocitima, a ne smanjene eliminacije iz plazme. U opstruktivnom ikterusu
katalitička aktivnost ALP u serumu je obično povećana za 3 puta, dok je u
infektivnom ikterusu prisutna samo blago povećana katalitièka aktivnost ALP.

U oboljenjima lokomotornog sistema (osteomalacija, rahitis, karcinom kostiju) je

povećana katalitička aktivnost ALP u serumu, kao posljedica povećane osteoblastne
aktivnosti. Za diferencijalnu dijagnozu oboljenje jetre i oboljenja lokomotornog
sistema služi odredjivanje katalitičke aktivnosti 5'-nukleotidaze (5'-NT), čija je
katalitička aktivnost u oboljenjima jetre povećana uz povećanu katalitičku aktivnost
ALP, dok je u oboljenjima lokomotornog sistema katalitička aktivnost 5‘-NT u
referentnom intervalu.
21

Povećana katalitička aktivnost ALP može biti posljedica uzimanja nekih lijekova
kao što su barbiturati, dok se smanjena katalitička aktivnost ALP može naći kod
malnutricije, deficita magnezijuma, hipofosfatemije i zastoja u rastu kostiju.
22

Klinički značaj odredjivanja katalitičke aktivnosti kisele fosfataze u

serumu

Kisela fosfataza (ACP) (ortofosfat-monoester fosfohidrolaza, kiseli optimum, EC

3.1.3,2) ima optimum aktivnosti u pH intervalu ispod 7. ACP je zastupljena u velikom
broju tkiva i organa čovjeka. Najveći klinički značaj u ovoj grupi enzima ima
prostatična ACP sa pH optimumom 5-6. ACP je prisutna i u jetri, slezeni, koštanoj
srži, eritrocitima, trombocitima i mlijeku. Najzastupljeniji oblik ACP u serumu je
rezistentan na tartarat.

Odredivanje katalitičke aktivnosti ACP u serumu ima klinički značaj u oboljenjima

prostate. U serumu zdravih muškaraca prostatična ACP se nalazi samo u tragovima.
Prostata sadrži velike količine ovog enzima zato kod karcinoma prostate dolazi do
izrazitog povećanja katalitičke aktivnosti ACP u serumu, dok kod hipertrofije prostate
i prostatitisa se može naći samo umjereno povećanje katalitićke aktivnosti ACP.
Prolazno povećanje katalitičke aktivnosti ACP u serumu javlja se pri palpaciji
prostate digitorektalnim pregledom, zbog čega je potrebno pričekati 1-2 dana
nakon pregleda da bi se uzela krv za odredivanje ACP.

Aktivnost ACP u serumu je povećana kod karcinoma dojke sa metastazama

u kostima i jetri (ACP iz osteoklasta i jetre), te u Pagetovoj bolesti.

Metoda po Kingu i Armstrongu se zasniva na djelovanju fos aza na dinatrijummonofenil fosfat pri čemu se oslobada
neorganski fosfat i nol. Nakon hidrolize se odreduje oslobodeni fenol sa reagensom po Foli - •ocalteu (sadrži litijumove i
natrijumove soli fosfomolibdenske kiseline). Ova' agens služi za taloženje proteina i za razvijanje boje. Fenol redukuje
reagens pri alnoj reakciji, stvarajući jedinjenje plave boje. Folin-Ciocalteu-ov reagens je specifièan (redukuju ga i tirozin,
mliječna, pirogroždana i mokraćna kiselin 1 zato se u slijepoj probi posebno mora odrediti kolièina izmijenjenog fenola.
zlika izmedu nalaza prije i poslije inkubacije, mjera je aktivnosti alkalne i kisele fataze Reagensi i pribor:

1. rastvor atrijum-monofenil fosfata , 0,01 mol/L100

Klinicki značaj odredjivanja katalitičke aktivnosti aspartat

aminotransferaze u serumu

Aminotransferaza u ljudskom organizmu katalizuju reverzibilni prenos amino grupe

izmedu aminokiseline i 2-okso-buterne kiseline (α-keto kiseline). Ovom reakcijom
transaminacije povezan je metabolizam ugljenih hidrata i azotnih jedinjenja. Aspartat
aminotransferaza (AST, L-aspartat-2-oksoglutarat-aminotransferaza, EC
2,6.1.1) je ranije imala naziv glutamat-oksalacetat-transaminaza (GOT). AST
katalizuje reverzibilnu reakciju prenosa amino grupe izmedu L-aspartata i 2-
oksoglutarat. AST je prisutna u različitim tkivima i organima, a procentualno
najzastupljenija u jetri, miokardu i skeletnim mišićima. Ovaj enzim se nalazi u
tjelesnim tečnostima: krvi, likvoru, žuči, pljuvački, dok je u urinu prisutan samo kod
oštećenja bubrega. Razlikuju se 2 vrste izoenzima AST: citoplazmatski, AST1, čija je
katalitička aktivnost povećana u akutnom hepatitisu i mitohondrijalni, AST2, čija je
katalitička aktivnost povećana u cirozi jetre i infarktu miokarda.
23

Odredivanje katalitičke aktivnosti AST u serumu je klinički značajno u oboljenjima

srca i jetre. U 97% bolesnika sa svježim infarktom miokarda katalitička aktivnost
AST u serumu naglo raste (najčešće 4-5 puta u odnosu na referentni interval) 6-8
časova nakon infarkta i dostiže maksimum nakon 18-48 časova, nakon čega aktivnost
opada i vraća se na normalu u roku od 3-5 dana. Kod angine pektoris ne dolazi do
povećanja katalitičke aktivnosti AST u serumu što je značajno za diferencijalnu
dijagnozu infarkta miokarda. Pri reinfarktu se registruje ponovni porast aktivnosti
aminotransferaza.

Odnos katalitičkih aktivnosti AST/ALT predstavlja De Ritisov koeficijent, koji je u

zdravih ljudi i u većini oboljenja jednak ili veći od 1. Medjutim, u infektivnom
hepatitisu i upalnim stanjima jetre dolazi do inverzije De Ritisovog koeficijenta, gdje
katalitička aktivnost AST raste 50-70 puta u odnosu na referentni interval uz još veći
porast katalitičke aktivnosti ALT, tako da je De Ritisov koeficijent manji od 1.
Katalitičke aktivnosti AST i ALT, pri oštećenju jetre alkoholom su umjereno
povećane, ali postoji značajan porast aktivnosti gama-glutamiltransferaze.
Katalitička aktivnost AST u serumu se povećava kod progresivne mišićne distrofije
(Duchenne-ov tip) i dermatomiozitisa (sistemske bolesti vezivnog tkiva).

Klinički značaj odredjivanja katalitičke aktivnosti alanin

aminotransferaze u serumu

ALT (L-alanin-2-oksoglutarat-aminotransferaza, EC 2.6.1.2) je ranije imala

naziv glutamat-piruvat-transaminaza (GPT). ALT katalizuje reverzibilnu
transaminaciju izmedu L-alanina i 2-oksoglutarne kiseline. ALT ima značajnu ulogu
u metabolizmu ugljenih hidrata, aminokiselina i proteina. Enzim je lokalizovan u
citosolu ćelije, a najzastupljeniji je u jetri, skeletnim mišićima, srcu, bubrezima,
pankreasu, eritrocitima, dok u kostima i zubima nije uopšte prisutan. Jetra sadrži nešto
više AST u odnosu na ALT.

ALT se smatra specifičnijim enzimom jetre u odnosu na AST, jer se povećanje

njegove katalitičke aktivnosti rijetko dešava u drugim stanjima osim u oboljenjima
jetrenog parenhima. Obzirom da je ALT citosolni enzim, do povećanja njegove
aktivnosti dolazi i pri manjim oštećenjima izazvanim oboljenjima hepatobilijarnog
trakta. U akutnom infektivnom hepatitisu dolazi do povećanja katalitičke aktivnosti
ALT i do tri nedjelje prije ostalih kliničkih i laboratorijskih znakova, pri čemu De
Ritisov koeficijent opada i do 0,65.
U hroničnom hepatitisu katalitička aktivnost ALT je u referentnom intervalu ili
sasvim neznatno povišena. Pri infarktu miokarda i u mišićnoj distrofiji, najčešće ne
dolazi do povećanja katalitičke aktivnosti ALT u serurmu.

U akutnom, hroničnom pankreatitis i karcinomu pankreasa dolazi do povećanja

katalitičke aktivnosti ALT u serumu.
24

Princip metode

AST katalizuje prenos amino-grupe asparaginske kiseline na okso- pu 2-oksoglutarne kiseline, pri čemu kao proizvod
transaminacije, nastaju glut Inska i oksalacetatna kiselina, Dalje se oksalacetatna kiselina dekarboksiliše u piro roždanu kiselinu
koja sa dinitrofenilhidrazinom stvara hidrazon, koji u baznoj sredini aje smedu boju.
ALT katalizuje prenos amino-grupe alanina na okso- pu 2-oksoglutarne kiseline, pri čemu kao proizvod transaminacije nastaju
glut inska i pirogroždana kiselina, a pirogroždana kiselina s dinitrofenilhidrazinom PH) stvara hidrazon, koji u baznoj sredini
daje smedu boju
Reagensi i pribor:

1 supstrat AST (fosfatni pufer 1 mmol/L, pH 7,4

2 DL-asparaginska kiselina 2 mmol/L

3 2-oksoglutarna kiselina 2 01/L

4 supstrat ALT (fosfatni ufer 100 mmol/L, pH 7,4

5, alanin 200 mmol/L
6 2-oksoglutarna k' elina 2 mmol/L
7. dinifrofenilhidr in rastvor 1 mmol/L

8 standard (na jum piruvat 2 mm01/L)

9 NaOH 40 mol/L

Ime i prezime: _________________________________

Datum vježbe:______________________ Ovjera___________________________

25

Vježba 5.

BIOLOŠKI MATERIJAL
U kliničko-biohemijskoj laboratoriji, najčešće se odredjuju parametri u uzorcima krvi
(pune krvi, krvnog seruma ili plazme) i urinu. Analiziraju se i druge tjelesne tečnosti,
kao što su cerebrospinalna tečnost (likvor), amnionska tečnost, pleuralna ili
perikardijalna tečnost, peritonealna tečnost, sinovijalna i seminalna tečnost, a mogu
se analizirati i feces, bubrežni i žučni kamenci, hemolizat humanih eritrocita, uzorci
tkiva itd.

UZIMANJE I OBRADA KRVI

Kako ne bi dolazilo do pogrešne interpretacije rezultata i kako bi se dobili ispravni
rezultati potrebno je da se biološki materijal za analizu uzima pravilno, a neophodno
je i da se zna koji će se parametar odredjivati i kada. Posebno je značajno poznavanje
faktora koji mogu da utiču na krajnji rezultat analize (in vivo ili in vitro). Tako npr. na
katalitičke aktivnosti enzima kreatin kinaze, laktat dehidrogenaze i aspartat
aminotransferaze utiče prethodna fizička aktivnost i zato da bi rezultat bio valjan,
preporučuje se da pacijent prije uzimanja materijala, izbjegava fizičku aktivnost tri
dana. Na vrijednosti pojedinih parametara utiču lijekovi, konzumiranje alkohola,
pušenje itd.

Biohemijski parametri se najčešće odreduju u uzorcima krvi, koja predstavlja

suspenziju ćelija u proteinsko-sonom matriksu. Nećelijski dio krvi označava se kao
krvna plazma. Ukoliko se dozvoli da se izvrši kompletna koagulacija krvi i poslije
toga izdvoji necelularna tečnost dobija se serum. Za laboratorijska ispitivanja se
uzimaju venska i kapilarna krv. Arterijska krv se uzima samo pod izuzetnim
uslovima, za analizu gasova u krvi, ili za praćenje arterijsko-venskih razlika, npr. u
analizi vrijednosti glukoze u krvi. Kapilarna krv se najćešće koristi za hematološka
ispitivanja.

Krv se uzima natašte, odnosno 10 časova poslije uzimanja hrane (postapsorpciono),

a ne smije se uzimati poslije obroka (postprandijalno). Krv se uzima ubodom sterilne
igle za injekcije (špricevi se sve češće zamjenjuju vakutajnerima-specijalnim
epruvetama za sakupljanje krvi), ili lancetom iz jagodice prsta, ušne školjke, a u male
djece iz palca na nozi, ili iz pete. Venska krv se uzima najčešće iz vene u lakatnom
pregibu, ili na dorzalnoj strani ruke.

Potrebno je uzeti što manju količinu krvi, samo onoliko koliko je neophodno za
analizu. Krv ne smije stajati suviše dugo, jer se uslijed glikolize smanjuje sadržaj
glukoze, a stajanjem na vazduhu dolazi do „pomjeranja" elektrolita. Vrijeme od
uzimanja krvi do prijema u laboratoriju ne smije da bude duže od 45 minuta. Krv se
normalno koaguliše za 20 do 60 minuta i to brže ukoliko se u krvi nalazi aktivator
koagulacije, a sporije, ako se uzorak nalazi na ledu. Prilikom uzimanja krvi, pa sve
26

dok se serum ne izdvoji, mora se voditi računa da se umanji mogućnost hemolize.

Hemoliza može nastati uslijed korištenja suviše velike ili male igle, snažnog
miješanja krvi, ili pri procesima presipanja i razdvajanja. Plazma i serum ne smiju
biti hemolizovani i takvi uzorci se ne mogu koristiti za biohemij ske analize.
Preporučuje se da se nakon uzimanja krvi odmah izdvoji plazma, odnosno nakon
završene koagulacije serum.

Serum predstavlja defibrinisanu krv, odnosno krv bez fibrinogena i krvnih

elemenata. Dobija se odvajanjem koaguluma centrifugiranjem (pri brzini 2000-
3000 ob/min) nakon koagulacije krvi. U toku centrifugiranja, fibrinska mreža sa
krvnim ćelijama (koagulum) se izdvaja na dnu epruvete, a iznad njih ostaje serum,
koji normalno ima izgled bistre, žućkaste tečnosti. Serum se koristi prilikom
odredivanja većine biohemijskih parametara, iako se najčešće može koristiti i
plazma umjesto seruma (za odredjivanje enzima preporučuje se serum).

Plazma je krv bez celularnih elemenata, a razlikuje se od seruma po tome što sadrži
fibrinogen. Prednost plazme nad serumom je u brzom izdvajanju iz pune krvi, kao
i u količini plazme u odnosu na serum. U plazmi izvjesni parametri, kao što su
kalijum, fosfat, LDH i kisela fosfataza, imaju niže koncentracije nego u serumu, jer
je izbjegnut proces koagulacije u toku koga se ovi parametri oslobadaju iz eritrocita
i trombocita. Plazmu možemo odmah odvojiti centrifugiranjem, pri čemu je
hemoliza uvijek manja nego u serumu (količina hemoglobina u plazmi je do 0,03
g/L, a u serumu i do 0,3 g/L), u kojem u toku koagulacije izlaze enzimi i druge
komponente iz eritrocita. Da bi se dobila plazma potrebno je u epruvetu za uzimanje
krvi staviti neko antikoagulantno sredstvo. Danas su u upotrebi epruvete, koje već
fabrički sadrže odgovarajući antikoagulans za odredenu biohemijsku pretragu, a
razlikuju se prema boji čepa i postupku miješanja, nakon stavljanja uzorka u
epruvetu (Slika 13.). Izbor antikoagulansa zavisi od vrste analize koja će se vršiti.
Za dobijanje plazme se koristi slijedeća antikoagulantna sredstva:

 Litijum, kalijum i natrijum oksalat sprečavaju koagulaciju vezivanjem

kalcijuma (0,01 mL 20% rastvora na mL krvi). Oksalat se ne smije koristiti
kao antikoagulans pri odredivanju kalcijuma u plazmi, kalijum- i natrijum-
oksalat pri odredjivanju azota.
 Natrijum-citrat se koristi kao antikoagulans u koncentraciji 5 mg/mL krvi, a
citratna plazma se koristi za odredjivanje kalcijuma, sedimentacije eritrocita,
fibrinogena i protrombinskog vremena.
 EDTA vezuje kalcijum, stvarajući helate sa kalcijumovim jonima i tako
sprečava koagulaciju krvi (1mg EDTA na mL krvi).
 Heparin je fiziološki antikoagulans prisutan u krvi u malim količinama.
Njegovo antikoagulantno dejstvo se zasniva na inhibiciji aktivacije
protrombina u trombin, koji dovodi do prevodenja fibrinogena u fibrin.
Heparin ima antilipemičke osobine i stabilizator je trombocita. Heparin je
najbolje, ali nažalost, istovremeno najskuplje antikoagulantno sredstvo. U
27

heparinizovanoj plazmi nije jedino moguće odredivati amonijak i kiselu

fosfatazu, čije se dejstvo inhibira već i u slabo baznim rastvorima.
 Fluorid vezuje kalcijum i inhibira metabolizam eritrocita i bakterija, zbog čega
se više koristi kao konzervans nego kao antikoagulantno sredstvo (odredjivanje
glukoze). Natrijum-fluorid se koristi u koncentraciji 10 mg/mL krvi.

Slika 13. Preporučeni postupak miješanje epruveta sa uzorkom u zavisnosti

od biohemijske pretrage, koja će biti izvršena, a boje čepa znaće slijedeće:

Greške nastale kao posljedica nepravilnog uzimanja

biološkog materijala

In vitro (egzogene interferencije) obuhvataju različite vanjske uticaje koji ometaju

odredjivanje biohemijskih parametara u uzorku, a nisu posljedica fiziološkog procesa
u organizmu.
28

Egzogeni interferirajući faktori su:

 hemoliza, lipemičan serum ili plazma, ikteričan

serum ili plazma
 antikoagulansi i konzervansi
 lijekovi i njihovi metaboliti
 infuzioni rastvori
 egzogena kontaminacija (bakterije, ostaci
deterdženata)
 antitijela i dr.

Hemoliza se može definisati kao prelazak konstituenata krvnih ćelija u plazmu,

odnosno serum. U serumu ili plazmi, uočava se kada koncentracija hemoglobina
dostigne 0,2 g/. Hemoliza može dovesti do tri tipa grešaka:

1. U plazmi se zbog hemolize može povećati koncentracija supstanci, koje se

fiziološki nalaze u eritrocitima u većim koncentracijama nego u plazmi
(npr laktat-dehidrogenaza, kisela fosfataza, transaminaze, kalijum, kreatinin).

2. Greške se mogu javiti pri kolorimetrijskom odredjivanju u oblasti 400-500

nm (vidljivi spektar). Već neznatne količine hemoglobina znatno
povećavaju izmjerenu ekstinkciju (apsorpciju) u ovoj oblasti
(npr. kod odredivanja bilirubina, ukupnih proteina, kreatinina I dr.)

3. Hemoglobin u hemolizovanom serumu može ometati specifične hemijske

reakcije (inhibicija aktivnosti lipaze).

Lipemičan serum ili plazma su mutni i bjeličasti. Stepen zamućenja seruma ili plazme,
ne zavisi samo od triglicerida, već i od prisustva lipoproteina.

Slika 14. Krvna plazma

Lipemija ukazuje na povećanu koncentraciju hilomikrona, lipoproteina veoma male

gustine (VLDL) ili obe pomenute klase lipoproteina. Lipemija je vidljiva golim
okom, ukoliko je koncentracija triglicerida u uzorku veća od 4,56 mmol/L. Poslije
centrifugiranja, ili čuvanja seruma, trigliceridi mogu da se izdvoje na površinu
29

seruma, ili mogu da „pomjere” vodu u gornju fazu uzorka, što utiče na prividno nižu
koncentraciju komponenti (elektroliti i metaboliti) u donjem sloju. Lipemija dovodi
do optičke interferencije na skoro svim talasnim dužinama, jer lipoproteinske čestice
prouzrokuju rasipanje svjetlosti. Na ovaj način lipemija naročito interferira pri
odredjivanju: bilirubina, ukupnih proteina, željeza, magnezijuma i aktivnosti kisele
fosfataze. Lipoproteini u uzorku mogu da inkorporiraju lipofilna jedinjenja, što
smanjuje njihovu pristupačnost za antitijela (pri imunohemijskim odredivanjima).
Isto tako lipoproteini ometaju elektroforetske i hromatografske procedure. U
lipemičnim uzorcima snižava se aktivnost amilaze, pošto lipoproteinske čestice
sadrže inhibitore amilaze. Korekcija navedenih problema, samo se djelimično može
ublažiti boljom deproteinizacijom i ekstrakcijom lipida.

Ikteričan serum ili plazma imaju karakterističnu žutu boju (uslijed povišene
koncentracije bilirubina), koja može da utiče na mjerenja u vidljivom dijelu spektra.
Bilirubin u povišenim koncentracijama, pored optičke, može da dovede i do
hemijske interferencije. Tako, pri odredjivanju kreatinina Jaffe-ovom metodom,
lažno negativni rezultati nastaju zbog oksidacije bilirubina s alkalijama i stvaranja
bezbojnih proizvoda. Greške prouzrokovane ikteričnim uzorkom mogu se korigovati
primjenom slijepe probe analize.

Serum je pogodan za brojna biohemijska odredivanja, ali i plazma, dobijena s

odgovarajućim antikoagulansom, može da bude jednako vrijedan uzorak.

Konzervansi koji se dodaju urinu, da bi se smanjio razvoj bakterija, mogu da

ometaju analitičke postupke. Brojni lijekovi i njihovi metaboliti dovode do
značajnih endogenih uticaja, a mogu da djeluju kao egzogeni interferirajući faktori.
Tako askorbinska kiselina, zbog svojih redukujućih osobina, jako interferira u
reakcijama gdje se mjeri oksidisani, ili redukovani oblik obojenog jedinjenja.
Lažno smanjene vrijednosti glukoze, holesterola, triglicerida i mokraćne kiseline
nastaje pri odredivanju PAP metodama.

Neodgovarajuće uzorkovanje krvi kod pacijenata, koji primaju infuzione rastvore

može izazvati dilucioni efekat i kontaminirati uzorke sastojcima infuzije. Uzorak
se može kontaminirati bakterijama i ostacima deterdženata, uslijed neadekvatnog
čišćenja epruveta i laboratorijskog pribora. Antitijela iz uzorka mogu da
interferiraju sa imunohemijskim, biohemijskim i hematološkim odredivanjima.

Čuvanje biološkog materijala

Punu krv ne treba čuvati duže vrijeme, čak ni na 40C. Ukoliko se analiza mora
odgoditi duže od 4 sata, najbolje je kao antikoagulantno sredstvo dodati amoniium-
heparinat.
30

Prilikom čuvanja plazme i seruma u dužem vremenskom periodu treba voditi računa
o slijedećem:

 da u toku 4 sata na sobnoj temperaturi ne dolazi do promjena u sadržaju

metabolita i aktivnosti enzima
 da se serum ili plazma mogu čuvati 24 sata na 40C bez značajnih promjena
 kada se serum ili plazma zamrzavaju ili liofilizuju, potrebno ih je razdjeliti
u manje porcije, koje se po potrebi odmrzavaju i koriste samo jedanput

SAKUPLJANJE URINA

Pri normalnoj ishrani i umjerenom unošenju tečnosti odrastao čovjek dnevno izluči
1000 do 1500 mL urina. Idealno bi bilo da se u svakog pacijenta može pratiti dnevna
diureza, tj. ukupna količina urina koju pacijent dnevno izluči, ali se pokazalo da je
uzimanje urina veći problem nego uzimanje krvi, zbog nediscipline pacijenata. Pri
sakupljanju urina pacijentu treba davati odgovarajuća uputstva o načinu sakupljanja,
kao i o načinu ishrane i uzimanja lijekova, obzirom da različiti sastojci mogu
interferirati sa analitičkim postupcima. Urin se sakuplja i čuva u hemijski čistim
staklenim sudovima.

Za ispitivanje urina sakupljaju se 3 vrste uzorka:

 prvi jutarnji urin

 dnevni i noćni uzorak
 24-časovni urin

Slika 1.5„ Za sakupljanje urina

neophodno je pacijentu dati
detaljna uputstva

Prvi jutarnji urin je najkoncentrovaniji i koristi se za kvalitativno ispitivanje.

Kvalitativne analize treba vršiti sa svježim uzorkom bez dodataka, ali se u nekim
slučajevima mogu, kao konzervans, dodati toluol ili mertiolat.

Za ispitivanja bubrežnih bolesti koristi se jutarnji ili večernji urin. Za ispitivanje

alimentarne glukozurije koristi se urin uzet prije i poslije jela. Medjutim, za
31

ispitivanje nekih oboljenja potrebno je posebno sakupiti dnevni i noćni uzorak urina.
Dnevni urin se sakuplja od 8 sati ujutro od 20 sati uveče, a noćni se sakuplja od 20
sati uveče do 8 sati narednog jutra.

Za kvantitativnu analizu urina se koristi 24-časovni urin, koji se sakuplja tako da se

prvi jutarnji urin baci, a zatim se sakupljaju sve dnevne porcije urina zaključno sa
prvim jutarnjim urinom narednog dana. Izmjeri se diureza i napiše na uputnici za
laboratoriju. Prije početka kvantitativne analize ovakav urin je potrebno promiješati.
Nakon odredjivanja koncentracije ispitivane supstance, izračunava se dnevna
ekskrecija te supstance (količina supstance prisutne u cjelokupnoj količini izlučenog
urina), tako što se pomnoži dobijena koncentracija supstance sa zapreminom 24-
časovnog urina. Primjer: ako se ispituje ekskrecija proteina, te se odredjivanjem
proteina u 24-časovnom urinu zapremine 1,80 L, utvrdi da koncentracija proteina
iznosi 2 g/L, dnevna ekskrecija proteina će iznositi:
2 g/L X 1,80 L/d = 3,60 g/d

Ukoliko se urin čuva duži vremenski period dolazi do razmnožavanja bakterija i

raspadanja mnogih sastojaka pod dejstvom enzima. To je razlog što se urinu dodaje
neki konzervans, koji ne smije uticati na biohemijsko ispitivanje. Konzervisan urin
treba čuvati na 40 C. Kao konzervansi se koriste: toluol, formalin, timol, borna
kiselina, ksilol, hloroform, benzojeva kiselina, natrijum-benzoat i kamfor. Za
izvodenje nekih analiza nije dozvoljena upotreba konzervanasa i u tom slučaju, urin
se može zaštititi od rasta bakterija i promjene sastava zamrzavanjem (npr. pri
određivanju osmolalnosti urina, cistina ili aldosterona).

Za ispitivanje sedimenta urina moraju biti ispunjeni slijedeći uslovi:

 urin mora biti svjež

 urin mora biti koncentrovan (specifična težina veća od 1,010)
 urin mora biti kiseo sa pH manjim od 6,0

Kako bi svi ovi uslovi bili ispunjeni najbolje je koristiti prvi jutarnji urin, a da bi se
sačuvale morfološke osobine sedimenta dodaje se 1 mL 40% formaldehida na 10 mL
urina.

PREANALITIČKE VARIJACIJE

Ukoliko se odredjena analiza u jednom uzorku ponavlja više puta, dobijeni rezultati
neće biti u potpunosti identični, uslijed odredene nepreciznosti primjenjene analitičke
metode i ovaj tip varijacije rezultata se naziva analitička varijacija. Ukoliko je
preciznost metode manja, utoliko će se rezultati ponovljenih odredivanja više
razlikovati, iako je stvarna koncentracija odredjivane supstance ista.

Različite bolesti mogu dovesti do karakterističnih promjena koncentracija odredjenih

sastojaka biološkog materijala (npr. povećanje koncentracije glukoze u dibetes
32

mellitusu), ali i u zdravih osoba postoje brojni faktori, koji utiču na koncentraciju
pojedinih sastojaka tjelesnih tečnosti in vivo. Ovi faktori, zajedno sa faktorima, koji
djeluju u samom postupku uzimanja biološkog materijala, utiču na stvarnu
koncentraciju ispitivane supstance u uzorku i predstavljaju izvore preanalitičke
varijacije.

Fiziološki faktori, koji imaju uticaj na sastav tjelesnih tečnosti mogu biti:

 faktori sa dugoročnim efektom (najčešće se ne mogu

kontrolisati)
 faktori sa kratkoročnim efektom (mogu se kontrolisati)

Faktore sa dugoročnim efektom moramo poznavati i uzeti ih u obzir pri interpretaciji

dobijenih rezultata. U faktore sa dugoročnim efektom se ubrajaju:

starost (koncentracije većine sastojaka tjelesnih tečnosti su različite za

novorodenčad, djecu, odrasle i stare osobe)
genetski faktori (pol, rasa i dr.)
faktori sredine (klima, nadmorska visina i dr.)
dugoročne ciklične promjene (uticaj godišnjih doba ili menstrualnog ciklusa u
žena)
tjelesna težina (npr. prosječna koncentracija triglicerida u plazmi raste sa
povećanjem tjelesne težine)
način ishrane (npr. ishrana sa visokim sadržajem masti remeti parametre
lipidnog statusa; vegetarijanska ishrana može dovesti do deficita pojedinih
vitamina; duže gladovanje može dovesti do povećanja ketonskih tijela u krvi
i urinu)

Faktore sa kratkoročnim efektom možemo kontrolisati adekvatnom pripremom

pacijenata prije i u toku uzimanja biološkog materijala. U njih se ubrajaju:

 Položaj tijela pri uzimanju krvi - položaj tijela utiče na preraspodjelu vode
izmedu intra- i ekstravaskularnog prostora: zapremina krvi odrasle osobe je za
oko 600-700 mL manja u stojećem, nego u ležećem stavu. To je razlog, što je
sadržaj proteina plazme, kao i svih supstanci vezanih za proteine, veći u
stojećem nego u ležećem položaju
 Vrijeme posljednjeg obroka - utiče na koncentraciju brojnih sastojaka krvi,
zbog čega se, u pravilu, krv uzima natašte, najmanje 10 sati od posljednjeg
obroka.
 Cirkadijalni ritam - koncentracije nekih sastojaka krvi podložne su
promjenama u toku dana (npr. koncentracije hormona; koncentracija Fe u
serumu je najveća ujutro, a uveče se smanjuje za 30%), što je razlog uzimanja
biološkog materijala u tačno odredjeno vrijeme.
33

 Imobilizacija i hospitalizacija dovode do odredjenih promjena (npr. smanjenje

zapremine plazme, povećanje hematokrita)o
 Vježbanje - efekti zavise od trajanja i intenziteta fizičke aktivnosti, kraće
vrijeme prije uzimanja biološkog materijala.
 Konzumiranje cigareta, alkohola ili terapije lijekovima (interferencije lijekova
i biohemijskih pretraga).

Ime I prezime: _________________________________

Datum vježbe:______________________ Ovjera__________________________

34

KVANTITATIVNA ANALIZA

Uloga kliničko-biohemij ske laboratorije je izvodenje kvalitativnih i kvantitativnih

analiza humanih tečnosti kao što su krv, urin i likvor, kao i analiza fecesa, tkiva,
konkremenata (kamenaca) i drugih materijala„ Da bi rezultati bili pouzdani i korisni
u postavljanju dijagnoze i liječenju, moraju da se koriste provjerene analitičke
metode i odgovarajući instrumenti. U osnovi svih standarda analitičkog kvaliteta rada
nalaze se utvrdeni principi i procedure, koji moraju da se poštuju. Osnovni faktori su
èistoća rastvora reagensa i rastvaraèa, kvalitet i čisoća laboratorijskog posuda, kao i
pouzdanost i kvalitet mjerne opreme i odabranih metoda. Neophodno je razumjeti
hemijske reakcije svakog testa i uticaja fizièkih parametara na procedure.

ANALITIČKE TEHNIKE
U KLINIČKO-BIOHEMIJSKOJ LABORATORIJI

Za mjerenje koncentracije konstituenata biološkog humanog materijala, u

kliničkobiohemijskoj laboratoriji, koriste se brojne tehnike. Ovdje će biti opisane i
korištene najjednostavnije tehnike, primjerene uslovima u kojima se rade
laboratorijske vježbe.

APSORPCIONE OPTIČKE METODE

Mnoga odredjivanja u kliničko-biohemijskim laboratorijama su zasnovana na

mjerenju energije zračenja koja može da bude emitovana, propuštena, apsorbovana
ili reflektovana pod kontrolisanim uslovima.

Mjerenje intenziteta elektromagnetnog zračenja i ućinka tog zračenja obuhvata

izuzetno važne analitičke metode za kvalitativnu i kvantitativnu analizu supstanci.
Fotometrija i spektrofotometrija se baziraju na interakciji odredenog jedinjenja sa
elektromagnetskim radijacijama, usljed èega dolazi do apsorpcije svjetlosti odredene
talasne dužine. Metode su jednostavne, ne zahtijevaju izolovanje jedinjenja iz
biološkog materijala i kao takve se vrlo često koriste u kliničko-biohemijskim
laboratorijama. Dodatni razlozi zbog kojih se danas, spektrofotometrijske metode
tako često upotrebljavaju su i dostupnost mjernog instrumenta svim kliničko-
biohemijskim laboratorijama, povoljne cijene reagensa koji se koriste, mogućnosti
automatizacije, itd.

Dodatkom nekog reagensa u pripremlj eni biološki uzorak nastaje obojeni kompleks,
koji apsorbuje svjetlost odredene talasne dužine. Obojeni rastvori apsorbuju svjetlo
proporcionalno intenzitetu boje, a intenzitet boje zavisi od količine jedinjenja u
rastvoru. Ovaj princip korišten je u vizuelnim, a zatim fotoelektriènim
kolorimetrima„ Kolorimetrija je metoda kojom se odreduje koncentracija nekog
35

rastvora poredenjem sa bojom rastvora poznate koncentracije. Vizuelni kolorimetri

se oslanjaju na ljudsko oko, koje komparira boju rastvora sa obojenim diskovimae
Dobijeni rezultati su subjektivni i 57

često netačni, što je usłovilo da se vizuelni kolorimetri više ne koriste. U

fotoelektričnom kolorimetru fotoćelija je zamijenila Ijudsko oko, što je usłovilo da
dobijeni rezultati budu mnogo objektivniji. Pri fotometrijskim mjerenjima potrebno
je monohromatsko svjetlo.

Propustljivost obojenih rastvora za svjetlo je utoliko manja (a apsorpcija veća)

ukoliko je njihova koncentracija veća, tj. intenzitez boje veći. Sposobnost obojenih
rastvora da u manjoj, ili većoj mjeri, propuštaju svjetlost naziva se transmisija ili
transparencija (T). Transparencija predstavlja odnos izmedu količine svjetla koju
rastvor propusti (I) i količine svjetla koje pada na rastvor (10).

I/I0

I .je uvijek manje od I0. Transparencija je mjerilo propustljivosti apsorbera za dati

snop monohromatskih talasa, a zavisi od dužine puła kroz rastvor. Ovo formuliše
Lambert-ov zakon koji glasi: Kada zrak monohromatske syjetlosti prolazi kroz
medijum (rastvor) koji ga apsorbuje, intenzitet zraka (svjetlosti) opada
eksponencijalno sa porastom dužine puta. Beer-ov zakon na sličan način povezuje
transparenciju sa koncentracijom nekog obojenog jedinjenja u rastvoru: Kada zrak
monohromatske svjetlosti prolazi kroz sredinu koja ga apsorbuje, njegov intenzitet
opada eksponencijalno sa porastom koncentracije jedinjenja koja ga apsorbuie. Ova
dva zakona se kombinuju u Lambert-Beer-ov zakon :

Povećanjem koncentracije jedinjenja (supstance koju mjerimo) u rastvoru

transparencija varira obrnuto srazmjerno i logaritamski s koncentracijom. Iz ovoga se
može izvesti novi termin apsorpcija (A), ili ekstinkcija (E), koja je direktno
proporcionalna koncentraciji„

A =— log T A=

Konstanta proporcionalnosti a definisana kao apsorptivnost (A/bc; c u g/L) ne zavisi

od koncentracije rastvora, već od prirode rastvorene supstance, talasne dužine i
temperature. b je put svjetlosti izražen u cm i c je koncentracija komponente koja
apsorbuje svjetlost, a izražava se u mol/dm3
36

Kada je b 1 cm, a c izraženo u mol/L, konstantu a mijenja ε (epsilon) i označava se

kao molarna apsorpcija.

Grafički prikaz zavisnosti apsorpcije (A) i koncentracije po Lambert-Beer-ovom

zakonu daje pravu liniju, koja prolazi kroz koordinatni početak. Ukoliko izmjerimo
apsorpcije (A) za više različitih koncentracija iste supstance i grafički prikažemo
dobili smo standardnu krivu. Uz pomoć te standardne krive, nepoznata koncentracija
istog jedinjenja u rastvoru može da se odredi iz dobijene apsorpcije (A).

Direktna proporcionalnost izmedu apsorpcije i koncentracije se mora da utvrdi

eksperimentalno za dati instrument pri odredjenim uslovima. Često postoji lineaıan
odnos do odredene koncentracije ili apsorpcije. Za ovakve rastvore se kaze da se
pokoravaju Lambert-Beer-ovom zakonu. Uz ova ograničenja iz formule ,
može da se izvede kalibraciona konstanta K i koristiti za izračunavanje koncentracije
nepoznatog uzoıka uporedujući ga sa standardnim rastvorom.

Prema tome slijedi:

C=A/ab = A • l/ab

Apsorptivnost (a) i put svjetlosti (b) ostaju konstante u datoj metodi analize; zato se
l/ab može da zamijeni kalibracionom konstantom K.

C= A • K

Vrijednost konstante K (K=c/A) se dobija mjerenjem apsorpcije (A) standarda poznate

koncentracije (c). Konstanta se ne smije koristiti kada standard ili nepoznata očitavanja
prelaze linearni dio kalibracione krive (tj. ako kriva više ne podliježe Lamber-Beer-
ovom zakonu).

Dakle, koncentracija neke supstance u rastvoru (na pr. uzorku bioloğkog materijala)
moZe da se dobije iz očitane apsorpcjje (A) bilo iz kalibracione krive, ili računskim
putem koriğtenjem kalibracione konstante.

Lambert-Beer-ov zakon vrijedi samo za monohromatsku svjetlost pod uslovom da sa

promjenom koncentracije ne dolazi do promjene u jonizaciji, asocijaciji i disocijaciji
rastvorenog jedinjenja.

Osnovni dijelovi instrumenta koji mjeri apsorpciju zračenja su: izvor zračenja,
monohromator ili filter, kiveta za uzorak i detektor. Instrument može da ima i druge
dijelove kao npr. uredjaj za cijepanje zrake (duble beam), motor za pokretanje
monohromatora i dr. U spekrofotometru je izvor zračenja (svjetla) lampa u kojoj se
nalazi gas nekog elementa pod odredenim pritiskom. Dovodenjem energije
37

(električne struje) gasu, ili parama metala, pobuduju se elektroni koji emituju
odredene kvante energije ultraljubičastog i/ili vidljivog zračenja. Najčeğče lampe su:
Zivina, volframova, deuterijeva i kombinacije. Električna struja je izvor energije za
lampu.

Sistem za izolovanje zračne energije željene talasne duiine, isključuju druge talasne
dužine, naziva se monohromator. Izolovanje spektra se može postići na više načina
uključujuči upotrebu filtra, prizmi ili difrakcionih rešetki. Kombinacija sočiva i
otvora može se postaviti ispred, ili iza monohromatora, da bi svjetlosne zrake
usmjerio paralelno, ili da bi izolovao uske dijelove svjetlosnog maka. Različiti otvori
se mogu koristiti da bi čitavu zračnu ener gjju usmjerili ka fotoâeliji.

Najjednostavniji tip filtera je tanko obojeno staklo. Izvjesni metalni kompleksi ili
soli rastvoreni ili suspendovani u staklu apsorbuju pojedinačne talasne dužine i
propuštaju samo svjetlost odabrane talasne dužine kroz filtere. Jedinica za mjerenje
talasne dužine je nm (10-9 m).

Stakleni filter nije pravi monohromator, pošto propušta syjetlost relativno širokog
opsega talasnih dužina. Spektralna čistoća filtera, ili nekog drugog monohromatora,
obično se opisuje terminima spektralnih linija. Definiše se kao širina u nm spektralne
transmisione krive na tački koja je jednaka polovini vrha transmisije. Najčešće
korišteni stakleni filteri imaju spektralnu liniju Oko 50 nm i potpuno su adekvatni za
brojne namjene. Nazivaju se i širokolinijski filteri, a praktičnu primjenu su našli u
kolorimetrima.

Uskolinijski filteri su konstruisani od dielektričnog materijala kontrolisane debljine,

stavljenog izmedu dva tanka posrebrena komada stakla. Debljina sloja odreduje
talasnu dužinu transmitovane energije. Imaju usku spektralnu širinu, obično od 5-10
nm i nazivaju se interferentni filtri.

Prizme i refrakcione rešetke se široko primjenjuju kao monohromatori, jer proizvode

kompletne spektre umjesto pojedinačnih talasnih dužina„ Izbor tipa monohromatora
zavisi od svrhe analiziranja.

Uzorak koji mjerimo nalazi se u kiveti mjernog instrumenta. Kivete se nazivaju i

apsorpcione ćelije, a mogu da budu okrugle, četvrtaste, ili pravougaone, napravljene
od stakla, kvarcnog stakla, ili plastike. U rutinskom kolorimetrijskom radu obično se
koriste okrugle staklene kivete„ Četvrtaste ili pravougaone kivete imaju optičke
površine sa konstantnim svjetlosnim putem. Najčešće korištene imaju dužinu puta
svjetlosti 1 cm.

Dva najčešće korištena detektora za mjerenje intenziteta svjetla u ultravioletnom i

vidljivom dijelu spektra su fotoćelije i fotomultiplikatorske cijevi. Fotoćelije se
koriste u jeftinijim instrumentima (npr. kolorimetrima), a fotomultiplikatorske cijevi
u skupljim i kvalitetnijim (većina spektrofotometara).
38

Apsorpciju (A) na kolorimetra očitavamo na skali, dok spektrofotometri imaju

digitalni displej za očitane vrijednosti apsorpcije (A), a često i pisač kao dodatak.

Mnoga biohemijska jedinjenja posjeduju karakteristične apsorpcione spektre u

ultravioletnom ili u vidljivom dijelu spektra. Poznavanje till spektara omogućava
njihovu identifikaciju i odredivanje količine u nekom biološkom uzorku. Zato je prije
analize nekog biohemijskog parametra neophodno podesiti odgovarajuću talasnu
dužinu na spektrofotometru ili izabrati odgovarajući filter na kolorimetru (Tabela 3.).
Primjer: Hemoglobin maksimalno apsorbuje svjetlost na talasnim dužinama 555 i
430 nm. Oksihemoglobin ima apsorpcioni spektar na 577, 541 i 413 nm. To
uslovljava boju krvi koja se mijenja od tamno crvene (venska krv) do svijetlo crvene
(arterijska krv). Karboksihemoglobin ima apsorpcioni spektar na 577, 535 i 418 nm.
Lako malo pomjeranje apsorpcionog spektra karboksihemoglobina u odnosu na
oksihemoglobin, dovoljno je da se otkrije prisustvo karboksihemoglobina u krvi. Ovo
ima veliki sudskomedicinski značaj u slučaju smrti usljed trovanja ugljen
monoksidom.

Tabela 3. Obimi apsorbancija za odgovarajuću komplementarnu boju filtera

39

Vježba 6.

KVANTITATIVNA ANALIZA UGLJENIH HIDRATA

KLINIČKI ZNAČAJ ODREDJIVNJA KONCENTRACIJE GLUKOZE U

KRVI

Od glukoze počinju ili se sa njom završavaju glavni metabolički putevi ugljenih

hidrata. U zavisnosti od trenutnih potreba organizma, metabolizam glukoze može biti
usmjeren na:

 razlaganje glukoze do C02 i H20 uz nastanak energije,

 stvaranje rezervi u obliku glikogena u jetri ili lipida u
masnom tkivu
 pretvaranje u keto kiseline, aminokiseline ili proteine.

Nakon dolaska glukoze iz cirkulacije u ćeliju, dolazi do njene fosforilacije u glukoza-

6 fosfat koji se može razgraditi preko piruvata, pohraniti kao glikogen ili prevesti u
riboza -5-fosfat.

Glikemija predstavlja fiziološku koncentraciju glukoze u krvi i kreće se u referentnom

intervalu 3,85-5,85 mmoL/L, imajući u vidu da poslije obroka koncentracija glukoze
u krvi na trenutak poraste na 8 do 10 mmol/L. Glikemiju je najbolje odredjivati
enzimskom metodom sa glukoza oksidazom, pri čemu je važno znati da li se određuje
u punoj krvi ili u plazmi, jer su u punoj krvi vrijednosti koncentracije glukoze manje
za 15%. Postoji razlika i izmedu pune kapilarne i venske krvi, tako da je vrijednost
glikemije u kapilarnoj punoj krvi ista kao u plazmi venske krvi. Regulacija glikemije
je jedan od najbolje regulisanih homeostatskih mehanizama u ljudskom organizmu,
gdje ključnu ulogu imaju jetra, bubrezi i hormoni (insulin, glukagon, adrenalin,
kortizol, hormon rasta). U stresnim situacijama, pri reakcijama straha ili u slučaju
teškog napora, zbog lučenja adrenalina dolazi do fiziološki laganog povećanja
koncentracije glukoze u krvi. Nasuprot tome u trudnoći i u toku prve godine života
koncentracija glukoze je fiziološki smanjena.

Hiperglikemija, povećana koncentracija glukoze u krvi, se javlja u diabetes mellitus-

u, pituitarnom diabetesu, adrenalnom diabetesu, Bazedovljevoj bolesti, teškim
opekotinama i cerebralnim traumama (podražaj centra u produženoj moždini), kao i
kod feohromocitoma (tumor srži nadbubrega).

Diabetes mellitus predstavlja hronično i doživotno oboljenje, u čijoj kliničkoj slici

dominiraju simptomi izazvani hroničnom hiperglikemijom i poremećajima
metabolizama ugljenih hidrata, lipida i proteina, bez obzira da li su oni posljedice
deficita insulina ili njegovog neadekvatnog djelovanja. Insulin omogućava da se nakon
ulaska u ćeliju, 50% glukoze iskoristi za dobijanje energije putem glikolize, 30-40%
40

za sintezu lipida, a oko 10 % za sintezu glikogena. Uslijed deficita insulina glukoza

neće biti dobro iskorištena, a istovremeno višak glukagona će povećati stvaranje
glukoze u jetri i dovesti do inhibicije glikolize i stimulacije glukoneogeneze i sve će
rezultirati nastanakom hiperglikemije. Kada se glikemija toliko poveća da predje prag
tubularne reapsorpcije glukoze (10 mmol/L) javlja se poliurija (polyuria- izlučivanje
velike količine urina) i glukozurija (prisustvo glukoze u urinu), što dovodi do pojačane
žedi, sklonosti ka dehidrataciji i posljedično do polidipsije (polydipsia- unošenje velike
količine tečnosti u organizam). Javlja se i polifagija (polyfagia- pojačan osjećaj gladi),
međutim, iako bolesnik uzima veću količinu hrane, ipak stalno gubi u tjelesnoj težini.
Kao posljedica nedovoljnog iskorištavanja ugljenih hidrata, u diabetes mellitusu dołazi
do razlaganja lipida i proteina, a zbog nedostatka insulina dołazi do smanjenja
lipogeneze i povećanja lipolize triglicerida iz adipocita, što za posljedicu ima gubitak
tjelesne težine. Zbog povećane lipolize, povećano je dopremanje słobodnih masnih
kiselina u tkiva, što uzrokuje nastanak velike količine acetil-CoA u procesu β-
oksidacije masnih kiselina. Tako nastała velika količina acetil-CoA ne može se u
potpunosti iskoristiti u citratnom ciklusu i za posljedicu ima pojačanu sintezu ketonskih
tijela i razvoj ketoacidoze, kao akutne komplikacije diabetes mellitusa.

Hipoglikemija, smanjena koncentracija glukoze u krvi (ispod 3 mmol/L), je rjedja, a

susreće se u hipotireozi, Addison-ovoj bolesti (hipofunkcija nadbubrega),
hipopituitarizmu (Simmondsova bolest), nakon uzimanja velikih doza insulina,kao i u
sindromu hipoglikemije (Syndroma hypoglycaemiae). U sindromu hipoglikemije
javljaju se dvije grupe simptoma, koji nastaju usljed nedovoljnog snabdjevanja mozga
glukozom (neuroglikopenija) ili kompenzatornog aktiviranja simpatičkog nervnog
sistema (adrenergička aktivacija). U prvu grupu simptoma spadaju: glavobolja,
ošamućenost, nejasan vid, poremećaji finih motornih radnji, konfuzija, poremećaji
ponašanja, konvulzije i u najtežem obliku gubitak svijesti. U drugu grupu simptoma
spadaju: znojenje, tremor, tahikardija, anksioznost i gład.

METODE ODREDJIVANJA KONCENTRACIJE GLUKOZE U KRVI

Metode koje se koriste za rutinsko odredjivanje glukoze u krvi se dijele u 3 grupe:

1. Redukcione metode se temelje na redukcionim sposobnostima šećera (metoda

po Hagedor-Jansen-u), nisu specifične samo za glukozu, već i za druge
redukujuće šećere i supstance kao što su kreatinin, kreatin, askorbinska
kiselina, urea i glutation.

2. Hemijske metode su zasnovane na reakciji glukoze sa fenolima i aminima u

kiseloj sredini i ove metode su specifične samo za ugljene hidrate. Uz glukozu
se istovremeno odreduje galaktoza, glukuronska kiselina itd. Glukoza i druge
aldoze se kondenzuju i sa aromatičnim aminima (anilin, benzidin i sł.) u
vrućem rastvoru sirćetne kiseline. U ovoj reakciji nastaju glukozamini. Od
41

ovih reaktanata najbolji je O-toludin u glacijalnoj sirćetnoj kiselini, a kako se

ostałe aldoze u krvi, izuzev glukoze, nalaze samo u tragovima, ove metode su
dosta specifične za glukozu.

3. Enzimske metode su veoma specifične za odredjivanje glukoze i zbog toga

imaju prednost nad ostalim metodama. Danas postoje 3 vrste enzimskih
metoda za odredivanje glukoze:

 Metoda sa heksokinazom
 Metoda sa glukoza-dehidrogenazom
 Metoda sa glukoza-oksidazom i
peroksidazom

U metodi sa heksokinazom koristi se fosforilacija glukoze pomoću ADP, na šta se

nadovezuje oksidacija nastalog glukoza-6-fosfata pomoću glukoza-6-
fosfatdehidrogenaze. Pri tome NADP prelazi u NADPH2 koji se mjeri.

Metoda je strogo specifična, jer iako u reakciji sa heksokinazom mogu reagovati i

druge heksoze, u drugoj reakciji glukoza-6-fosfat-dehidrogenaza (G-6-PDH) oksidiše
samo glukoza-6-fosfat, dok na fosforne estre fruktoze ne djeluje. Zato se ova metoda
uzima kao referentna metoda za odredjivanje koncentracije glukoze jer je ne samo
specifična već i osjetljiva, brza i tačna. Neki lijekovi (Baralgin) koji interferiraju pri
odredjivanju glukoze sa glukoza-oksidazom ne smetaju u heksokinaznoj metodi.

Metoda sa glukoza-dehidrogenazom

Odredivanje glukoze ovom metodom je specifično, jer enzim glukoza-dehidrogenaza

katalizuje samo prelaz ß-D-glukoze u lakton. Medutim, u reakcionoj smjesi 36%
glukoze se nalazi u obliku α-D-glukoze, zato se dodaje enzim mutarotaza koji prevodi
α u ß izomer.

Princip metode je da mutarotaza izomeruje α-D-glukozu u ß-D-glukozu, a ova pod

djelovanjem glukoza-dehidrogenaze u prisustvu NAD+ prelazi u D-glukono-lakton,
pri čemu iz NAD nastaje NADH2, koji se mjeri pri 339 ili 334 odnosno 365 mn (optički
test).
42

Metoda odredivanja glukoze u krvi sa glukoza-oksidazom i peroksidazom

(GOD-PAP metoda - enzimski kolorimetrijski test)

Princip metode:

Enzim glukoza-oksidaza (GOD) katalizuje oksidaciju glukoze u glukonsku kiselinu

pri čemu nastaje vodonik peroksid (H2O2). Dodatkom enzima peroksidaze (POD)
dolazi do oksidativnog kuplovanja p-aminofenazona (PAP) sa fenolom. Intenzitet
boje nastalog 4(p-benzokvinon-mono-imino) fenazona mjeri se na 510 nm.

Reagensi i pribor:
1. rastvor pufera (tris-fosfatni pufer 180 mmol/L, pH 7,8)
2. reagens trake
3. standard u glukoze 5,55 mmol/L
4. serum ilí plazma (heparin, fluorid, EDTA)
5. spektrofotometar, termostat
6. epruvete; pipete 0,04 mL i 5 rnL

Postupak: Paralelno se radi slijepa proba, proba i

standard. U tri epruvete otpipetirati:

Izračunavanje:
43

Referentne vrijednosti za glukozu u krvnom serumu: 3,85-

5,85mmol/l

Priprema rastvora reagensa:

Zaroniti 1 reagens traku u bocu sa rastvorom pufera, promiješati sadržaj boce 5-10 sekundi.
Ostaviti bocu da stoji 5 minuta i ponovo promiješati 10 sekundi. Odstraniti reagens traku i koristiti
rastvor kako je propisano. Koncentracija reagensa u rastvoru je: tris-fosfat pufer 180 mmol/L, fenol 11
mmol/L, 3,4-dihlorfenol 2, 1 mmol/L, masni alkohol-poliglikol etar 0,24%, p-aminofenazon 0,8
mm01/L, peroksidaza
(POD) > 0, 9 U/mL, glukoza oksidaza (GOD) > 15 U/mL

Ime I prezime: _________________________________

Datum vježbe:______________________ Ovjera___________________________

44

Vježba 7.

KVANTITATIVNA ANALIZA PROTEINA

Proteini imaju značajnu ulogu u nizu bioloških procesa:

 katalizi
 transportu
 ekscitabilnosti
 diferenciranju i kontroli rasta i dr.

Do danas je izolovano nekoliko hiljada proteina u biološki aktivnom obliku na

osnovu veličine molekula, rastvorljivosti, naelektrisanja i sposobnosti specifičnog
vezivanja drugih molekula.
Najvažniji postupci za izolaciju proteina su:
 hromatografija
 elektroforeza
 ultracentrifugiranje

ELEKTROFOREZA PROTEINA KRVNOG SERUMA

Elektroforeza proteina moguća je zahvaljujući njihovoj osobini da su amfoterni,

obzirom da naelektrisanje aminokiselina, od kojih su proteini sastavljeni, zavisi od
pH sredine. U jako kiseloj sredini aminogrupa dobija pozitivno naelektrisanje, dok
se u alkalnoj sredini karboksilna grupa naelektrise negativno. Samo kod jednog
odredjenog pH molekula proteina ima isti broj pozitivnih i negativnih naelektrisanja,
tj. nalazi se u obliku ,,Zwitterion-a". pH pri kome se proteini nalaze kao ,,Zwitterion-
i" naziva se izoelektriena tacka (pI) dotičnog proteina. Pri pH nižem od pI
aminokiselina ima pozitivno naelektrisanje i putuje u električnom polju prema
katodi. Obnuto, pri alkalnijem pH od izoelektrične tačke aminokiselina zbog
negativnog naelektrisanja putuje prema anodi. Kod pH koji je jednak pI molekule
aminokiselina su električki neutralne i ne putuju.

Za elektroforezu serumskih proteina koriste se različiti potporni medijumi, kao što

su papir, celuloza acetat, skrobni gel, poliakrilamidni gel i agaroza gel. Za
razdvajanje se obično koristi krvni serum, a ukoliko se koristi krvna plazma
izdvaja fibrinogen, kao dodatna frakcija u βγ regionu.

Serum se elektroforetski razdvaja (primjenom veronalnog pufera, jonske jacine 0,05

i pH 8,6 u pet jasno odvojenih frakcija. To su: albumin, α1- globulin, α2-globulin,
β-globulin i γ-globulin. Nakon završenog elektroforetskog razdvajanja vrši se
denaturacija proteina, sirćetnom kiselinom, da bi se izbjegla njihova difuzija unutar
45

potpornog medijuma na kome je vršena elektroforeza. Frakcije na elferogramu

postaju vidljive nakon bojenja (često Ponceau S-crvenim, i1i Commassie brilijant
plavim). Kvantitativna analiza, kao što je ranije objašnjeno, obavlja se sa
denzitometrom. Svaki pik na elferogramu predstavlja jednu elektroforetsku frakciju
proteina, a svaki pik može predstavljati veliki broj različitih proteina (koji pod datim
uslovima pH imaju istu brzinu migracije).

Prilikom elektroforetsko razdvajanja svježeg krvnog seruma i ako pufer sadrži

Cu (II) jone uočava se i šesta traka (β2, komponenta C3 komplementa). Drugi
individualni proteini se nalaze u suviše niskim koncentracijama da bi mogli da se
pri ovakvom elektroforetskom razdvajanju identifikuju nakon bojenja, ili su
,,prekriveni" drugim proteinima koji imaju više koncentracije, a imaju istu
elektroforetsku pokretljivost. Tako je npr. ceruloplazmin maskiran sa
haptoglobinom i α2-globulinom. Izvjesni proteini se loše boje zbog toga sto sadrže
visoki sadržaj lipida (lipoproteini), ili ugljenih hidtata (α 1-kiseli glikoprotein).
Tabelom 7. prikazan je referentni interval za elektroforezu serumskih proteina.

Tabela 7.: Interval referentnih vrijednosti serumskih proteina

46

Slika 16. Elektroforetsko razdvajanje serumskih proteina

Na elferogramu krvnog seruma (Slika16.) zdravog ispitanika (fiziološko stanje)

albumin se pojavljuje kao jedan protein, koji je najuočljviji. α 1- globulin se
uglavnom sastoji iz α1- antitripsina. α2-globulin se uglavnom sastoji iz α2-
makroglobulina i haptoglobina. β-globulin se,kao sto je navedeno, razdvaja u dvije
trake: P1-traka sadrzi uglavnom transferin, uz LDL (lipoproteini niske gustine),
a P2-traka je C3 frakcija komplementa. γ-globulini su imunoglobulini.
Izvjesni imunoglobulini su i u oblastima α2- i β-regiona.
Koncentracija proteina u slučaju oboljenja može da se mijenja usljed primrnog
efekta u metabolizmu proteina, kao posljedica dehidratacije, ili prekomjeme
hidratacije. Odredjivanje koncentracije ukupnih proteina u krvnom serumu ima mali
dijagnosticki značaj. Nivo ukupnih proteina značajno se mijenja samo ako dode do
promjene glavnih konstituenata, kao što su albumin i imunoglobulini. Do sniženja
ukupnih proteina dolazi usljed: razblaživanja (npr. ako je krv uzeta u blizini mjesta
intravenske infuzije), hipoalbuminemije i produženog deficita imunoglobulina.
Nivo ukupnih proteina raste kod gubitka tečnosti koja ne sadrzi proteine, pojačane
staze za vrijeme venepunkcije, ili značajnog povećanja jednog ili više
imunoglobulina.
Koncentracija ukupnih proteina može da bude unutar referentnih vrijednosti
ukoliko su istovremeno snižen albumin, a povećani imunoglobulini. Ovakva
kombinacija je česta i ukazuje da odredjivanje samo ukupnih proteina nema
dijagnostički značaj. Drugi proteini, osim albumina, imaju mali udio u nivou ukupnih
proteina, tako da njihova promjena neće dovoditi do značajne izmjene u nivou
ukupnih proteina.
Na Slici 17. prikazani su pored fizioloskog elferograma (a) i tri patološka
elektroforetska profila (b,c i d). Osim na slici opisanih elektroforetskih profila u
zavisnosti od vrste oboljenja u oblasima od alfa do gama regiona elfelograma mogu
se javiti uske, oštre trake, koje ukazuju na prisustvo monoklonalnih imunoglobulina
(paraproteina), zatim višestruke trake iii izostanak pojedinih traka na elfelogramu,
47

a sve je rezultat odgovarajućeg patološkog procesa. Tako kod nefrotskog sindroma

dolazi do selektivnog gubitka proteina krvne plazme putem bubrega. Gube se proteini
koji imaju manju molekulsku masu, na elfelogramu je snižena frakcija albumina.

Slika 17. Krivulje elektroforeze proteina seruma. Grckim slovom γ (gama) i strelicom oznacen je dio
u krvivulji gdje se najčešće pojavljuju imunoglobulini (tzv. gama globulini): a) fiziološki nalaz, b)
smanjenje γ -frakcije kod urodjenih i stečenih deficita imunoglobulina, c) poliklonska
hipergamaglobulinemija (povećana količina svih gamaglobulina) u bolesnika s cirozom jetre, d)
monoklonski protein (M komponenta) IgGκ u bolesnika s multiplim mijelomom.

UKUPNI PROTEINI

Ukupne proteine je moguće odredjivati u različitim uzorcima: u krvi, urinu, likvoru,

amnionskoj tečnosti, salivi, fecesu, peritonealnoj i pleuralnoj tečnosti. Metode za
odredjivanje ukupnih proteina mogu biti:
 kvantitativno mjerenje ukupnih proteina i albumina
 razdvajanje elektroforezom, pri cemu je moguće semikvantitativno
odredivanje glavnih klasa proteina
 imunohemijsko odredivanje specifičnih proteina pomoću specifičnih
antiseruma, pri cemu se mjeri Ag-At kompleks: nefelometrijski,
turbidimetrijski, radijalnom imunodifuzijom (RID), elektroimunodifuzijom
(EID) ili ukoliko su prisutni u vrlo malim koncentracijama, radioimunoesejem
(RIA) i enzimskim imunoesejem (EIA). Detekcija i identifikacija abnormalnih
proteina vrsi se RID, imunoelektroforezom (IEP) i imunofiksacionom
48

elektroforezom (IFE).

Odredjivanje ukupnih proteina u serumu i plazmi

Proteini predstavljaju najzastupljenije organske sastojke krvne plazme sa
koncentracijom u odraslih osoba 65-80 g/L, a zavisi od sinteze u jetri i izlučivanja
bubrezima.

Hiperproteinemija (povećana koncentracija ukupnih proteina u serumu) nastaje kao

posljedica:
 hemokoncentracije (smanjen volumen plazmatske vode), koja dovodi do
relativne hiperproteinemije (koncentracije svih individualnih proteina
plazme biće podjednako povećane)
 dehidratacije (povećan gubitak tečnosti i1i smanjen unos; uslijed diareje,
Addison-ove bolesti, dijabetiene acidoze)
 povećane koncentracije specifičnih proteina, npr. povećanje proteina akutne
faze, poliklonalnih imunoglobulina kao rezultata infekcije
 povećane koncentracije monoklonalnih imunoglobulina (multipli mijelom i
druge maligne paraproteinemij e)

Hipoproteinemija (smanjena koncentracija ukupnih proteina u serumu) nastaje kao

posljedica:
 hemodilucije (povećanje volumena plazmatske vode), koja izaziva relativnu
hipoproteinemiju (koncentracije svih individualnih proteina plazme biće
podjednako smanjene)
 hemodilucije, koja je izazvana intoksikacijom vode, pri povećanoj retenciji
soli, pri masovnoj intravenskoj infuziji
 smanjenja koncentracije albumina
 bolesti jetre, bolesti bubrega (glomerulonefritis, nefrotski sindrom,
proksimalne tubularne bolesti), u kojima je povećano izlučivanje proteina, a
ukoliko se koncentracija proteina smanji ispod 40 g/L dolazi do stvaranja
edema.

METODE ZA ODREDIVANJE UKUPNIH PROTEINA U SERUMU I

PLAZMI:

BIURET-ska METODA

Biuret-ska metoda je najčešće korištena metoda u rutinskim laboratorijama. Zavisna

je od prisustva peptidne veze u proteinima. Rastvor proteina u reakciji sa Cu(II)
jonima u alkalnoj sredini, stvara obojeni helat izmedu Cu(II) jona, kiseonika karbonil
grupe (CO) i azota iz amidske grupe (=NH) peptidne veze. Slična reakcija se
ostvaruje i izmedu Cu(II) jona i organske komponente biureta, pa je metoda dobila
49

ime po ovoj reakciji. Reakcija se ostvaruje ukoliko jedinjenje ima najmanje dvije
peptidne veze. Jedan Cu(II) jon se vezuje koordinativnim vezama sa šest susjednih
peptidnih veza. Amino kiseline i dipeptidi ne reaguju, ali tri-, oligo- i polipeptidi
daju od purpurne do tamno ljubičaste boje. Intezitet boje je proporcionalan broju
peptidnih veza koje reaguju, a samim tim i broju molekula proteina u reakcionom
sistemu.
Metoda je jednostavna, što omogućava njenu primjenu na automatima i dovoljno
je precizna za kliničku upoterbu. Hiperbilirubinemija, lipemija i blaga hemoliza se
koriguju upotrebom slijepe probe analize sa bijelirn biuretom. U suprotnom,
hemoliza izaziva povećanje vrijednosti proteina za 3% na svakih lg/L
hemoglobina u uzorku. Amonijum jon interferira, ali ne u koncentraciji koja je
prisutna u serumu.
Kao uzorak se koriste serum, plazma i eksudati. Koncentracija ukupnih proteina
u plazmi, zbog prisustva fibrinogena, j e veća za 2-4 g/L u odnosu na serum.
Proteini u serumu i plazmi su stabilni 7 dana na sobnoj temperaturi, 1 mjesec u
frižideru i 2 mjeseca na -20° C.

Princip metode:

Jedinjenja sa najmanje dvije peptidne veze reaguju sa bakarnim solima u alkalnoj

sredini dajući plavo-ljubičasto obojenje. Intenzitet plavo-ljubičaste boje je
proporcionalan koncentraciji proteina i kolorimetrijski se mjeri pri 546 nm, prema
slijepoj probi.

Postupak:

Slijepa proba
Proba (ml) Standard (ml)
(ml)

0,9% NaCl - - 0,05

Serum 0,05 - -

Standard - 0,05 -

Biuret reagens 3,00 3,00 3,00

Promješati i mjeriti ekstinkcije probe i sandarda nakon 30 minuta pri 546

nm, prema slijepoj probi
50

Izračunavanje:

ALBUMIN

Albumin (globularni protein, molekulame mase oko 66 000 D), kao glavna
proteinska komponenta humanog seruma ima ulogu u održanju koloido-osmotskog
pritiska, u transportu različitih jona, kiselina, hormona. Može da veže hidrofobne
supstance kao sto su bilirubin, masne kiseline i brojne lijekove i tako učestvuje u
njihovom transportu.
Hiperalbuminemija (povećana koncentracija albumina u serumu) nastaje kao
posljedica hemokoncentracije ili dehidratacije, dok hipoalbuminemija (smanjena
koncentracija albumina u serumu) nastaje kao posljedica hemodilucije, koja može biti
izazvana disbalansom elektrolita (ukoliko je sinteza manja od gubitka u slučajevima
malnutricije i malapsorpcije i u bolestima kada je veliki gubitak albumina).

METODA ZA ODREDJIVANJE ALBUMINA U SERUMU

Metoda sa BKG izvodi se na pH 4,2-4,5 koju obezbjeduje sukcinatni pufer, a nastala

boja se mjeri pri 620-630 nm (628 nm). Kao standardi mogu da se koriste humani
serumski albumin ili govedji serumski albumin. Specifičnost BKG je dobra kada se
analizira serum zdravih osoba. Bilirubin, slaba do umjerena lipemija i salicilati ne
pokazuju interferenciju sa ovom metodom. Hemoglobin smanjuje vrijednost
albumina za 1 g/L na svakih dodatih 100g/L. Slijepa proba ne koriguje ovu
interferenciju. Koeficijent varijacije je oko 2% za koncentracije od 45 g/L.
Modifikacije:
 α-globulini stvaraju za oko 1/3, globulini za oko 1/9 i fibrinogen za oko 1/5
intezivniju boju, a hemoglobin isti intezitet boje, kao i ekvivalentna težina
produkta humanog serumskog albumina. Da bi se eliminisala ova
interferencija dodaje se NaCl u koncentraciju od 0,8mol/L, smanjuje se
reakciona temperatura sa 45 °C na sobnu temperaturu, i smanjuje se
koncentracija deterdženta .
 Mjerenje inteziteta boje odmah nakon reakcije povećava specifičnost
eseja. Albumin pomjera apsorpcioni maksimim BKG na talasnu dužinu od
629 nm u roku od jednog minuta, a proteini akutne faze, kao što su
ceruloplazmin i orosomukoid, to isto rade nakon 5 minuta. Zato se
51

preporučuje mjerenje nakon 10-30 sekundi.

Princip metode: Albumin se svojim aminogrupama veže sa indikatorom

bromkrezol-zelenim (BKG), pri čemu se boja indikatora promjeni u
zelenoplavkastu. Ova promjena boje se naziva "greškom indikatora", jer se boja
mijenja na isti način u kiseloj i u baznoj -sredini. Reakcija indikatora sa
aminogrupama albumina nije specifična, jer vremenom reaguju i globulini,
ali sporije. Zato je neophodno da se kolorimetrijsko mjerenje izvrši što brže
pošto se serum doda reagensu, a najkasnije u roku od 1 minute. Vrijednosti
albumina mogu biti "lažno" povećane u prisustvu ampicilina, fenazopiridina i
hemoglobina, a smanjene uz aspirin.

Postupak:

Slijepa proba
Proba (ml) Standard (ml)
(ml)

Puferovani
2,50 2,50 2,50
BKG

Serum 0,02 - -

Standard - 0,02 -

Destilovana
- - 0,02
voda

Promješati i mjeriti ekstinkcije probe i sandarda nakon 30 minuta pri 628 nm,
prema slijepoj probi
52

Izračunavanje:

Ime i prezime:__________________________________

Datum vježbe:____________________ Ovjera:______________