เอกสารประกอบการสอน

MT2317 เคมีคลินิกทั่วไป
(General Clinical Chemistry)
(ภาคปฏิบัติ)

ภาคการศึกษาที่ 2 ปีการศึกษา 2557

สาขาวิชาเคมีคลินิก
คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยเวสเทิร์น
 คานา

เคมีคลินิกทั่วไป (MT2317 เคมีคลินิกทั่วไป: General Clinical Chemistry) เป็นวิชาหลักวิชาหนึ่งใน

สาขาเทคนิคการแพทย์ คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยเวสเทิร์น เนื่องจากปฏิกิริยาทางเคมีในร่างกายนั้น
เกิดขึ้นอย่างต่อเนื่องตลอดเวลา เพื่อทาให้ระบบต่างของร่างกายทางานได้อย่างเป็นปกติและมีประสิทธิภาพ
มากที่สุด นอกจากนี้การเกิดความผิดปกติแม้เพียงเล็กน้อยในระบบต่างๆ หรือความผิดปกติทางเคมีในร่างกาย
เกิดขึ้น ย่อมส่งผลเสียตามมาได้แก่ การเกิดโรคและพยาธิสภาพของโรค ทาให้ร่างกายเกิดความเจ็บปวด ทุกข์
ทรมานและอาจถึงแก่ชีวิตได้ ดังนั้น ทางคณาจารย์ของภาควิชาเคมีคลินิก คณะเทคนิคการแพทย์
มหาวิทยาลัยเวสเทิร์น จึงได้จัดทาตาราเรียนวิชาเคมีคลินิกทั่วไปขึ้นมา สาหรับนิสิตและนักศึกษาคณะเทคนิค
การแพทย์ในการเรียนรู้และความเข้าใจในระบบต่างๆของร่างกาย กลไกการทางานและการเกิดพยาธิสภาพ
เพื่อนาไปใช้เป็นแหล่งความรู้พื้นฐาน และแหล่งอ้างอิงสาหรับการนาไปตรวจวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการต่อไป
เนื้อหาของวิชาเคมีคลินิกทั่วไปเล่มนี้ ได้ทาการปรับปรุงเพื่อให้มีเนื้อหาสาระ ที่มีความสอดคล้องและ
เหมาะสมกับการเรียนของนิสิตและนักศึกษา รวมทั้งยังได้มีการใส่เนื้อหาที่เป็นปัจจุบันลงไปในแต่ละหัวข้อ
เพื่อที่นิสิตและนักศึกษา จะสามารถเข้าใจและนาไปใช้ให้เกิดประโยชน์มากที่สุด เนื่องจากเนื้อหาในตาราเคมี
คลินิกทั่วไปเล่มนี้ เป็นการให้รายละเอียดที่เป็นพื้นฐาน ดังนั้นบุคคลภายนอก หรือนิสิตและนักศึกษาจาก
สาขาวิชาอื่นๆ ก็สามารถนาไปอ่านเพื่อเป็นความรู้ได้เช่นเดียวกัน เช่น กลไกการทางานของตับและตับอ่อน
กลไกการทางานของเอนไซม์ที่สามารถนามาวินิจฉัยการเกิดโรคได้ หรือระบบการควบคุมน้าตาลและไขมันใน
ร่างกาย เป็นต้น
ขอขอบคุณคณาจารย์จากภาควิชาอื่นๆและผู้ทรงคุณวุฒิภายนอก ที่มาร่วมสอนในรายวิชานี้ เพื่อให้
รายวิชานี้เป็นประโยชน์แก่ตัวนิสิตและนักศึกษามากที่สุด

คณะผู้จัดทา
 สารบัญ
หัวข้อ หน้ า
1 เค้าโครงรายวิชา 1
2 การสร้างกราฟควบคุมคุณภาพ 6
3 การตรวจ Glucose 8
4 การตรวจ HbA1c 12
5 การตรวจไขมัน 17
6 การตรวจ Total creatine kinase 34
7 การตรวจโปรตีนรวมและ Albumin 39
8 การตรวจ BUN, creatinine และ uric acid 42
9 การตรวจ Electrolyte และ Anion gap 46
10 การตรวจเอนไซม์ AST และ ALT 53
11 การตรวจ Bilirubin 57
12 การตรวจแคลเซียมและเหล็ก 61
13 ก๊าซในกระแสเลือด 79
14 สารบ่งชีม้ ะเร็ง 96
15 ความสัมพันธ์ทางคลินิก 98
16 กรณีศกึ ษา 99
 ภาคการศึกษาที่ 2/2557

หลักสูตร วิทยาศาสตร์บัณฑิต สาขาเทคนิคการแพทย์

รหัสวิชา MT2317
ชื่อวิชา เคมีคลินิกทั่วไป
General Clinical Chemistry
หน่วยกิต 3 (2-3-5) บรรยาย 2 ชั่วโมง ปฏิบัติ 3 ชั่วโมง ศึกษาด้วยตนเอง 5 ชั่วโมง
วิชาบังคับก่อน ไม่มี
กลุ่มผู้เรียน นิสิตเทคนิคการแพทย์ชั้นปีที่ 2
วันที่เรียน วันศุกร์ เวลา 09.00-11.00 น. และ 13.00-16.00 น.
สถานทีเ่ รียน ห้องเรียน MT5410 ตึกคณะเทคนิคการแพทย์
ผู้รับผิดชอบรายวิชา ดร.ทนพ.วรวุฒิ สมศักดิ์
อาจารย์ผู้สอน ดร.ทนพ.วรวุฒิ สมศักดิ์ ดร.ทนพ.พลาธิป ชูท้วม
อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล ดร.ทนพญ.นงลักษณ์ อยูน่ ิ่ม
อ.ทนพ.ชาติชาย คล้ายสุวรรณ

คาอธิบายรายวิชา
หลักการทดสอบ อาการสาคัญทางคลินิกของโรค และการแปลผลของการทดสอบชุดต่างๆ ได้แก่ เบาหวาน การ
ทดสอบการทาหน้าที่ของไต การทดสอบชุดไขมัน การทดสอบเกี่ยวกับหัวใจ การทดสอบการทาหน้าที่ของตับและภาวะ
โภชนาการ การตรวจเอนไซม์ต่างๆ เพื่อทดสอบการทาหน้าที่ของตับอ่อน กระดูก ต่อมลูกหมาก การตรวจอิเล็กโทรไลต์ ค่าก๊าซ
ในเลือดและภาวะกรดด่าง และฝึกปฏิบัติในห้องทดลองที่สอดคล้องกับทฤษฎี

วัตถุประสงค์ : หลังเรียนจบวิชานี้แล้วผู้เรียนสามารถ
1. มีความรู้และเข้าใจเกี่ยวกับพื้นฐานของสารชีวโมเลกุลต่างๆได้
2. มีความรู้และเข้าใจเกี่ยวกับความผิดปกติของสารชีวโมเลกุลที่เกี่ยวกับโรคต่างๆได้
3. มีความรู้และเข้าใจเกี่ยวกับความสัมพันธ์ของสารชีวโมเลกุลและโรคที่เกิดขึ้นได้
4. มีทักษะในการตรวจทางห้องปฏิบัติการ การควบคุมคุณภาพ และการรายงานผลการตรวจได้
5. มีความรู้และเข้าใจในการแปลผลการตรวจได้

จานวนชั่วโมงที่ใช้ในการเรียนการสอน/ภาคการศึกษา
บรรยาย ปฏิบัติการ ศึกษาด้วยตนเอง
15x2 = 30 ชั่วโมง 15x3 = 45 ชั่วโมง 15x5 = 75 ชั่วโมง

แผนการสอนบรรยายทฤษฎีและฝึกปฏิบัติ
วดป. รายการ ชั่วโมง ผู้สอน
บรรยาย 01 : การควบคุมคุณภาพในห้องปฏิบัติการ 2 ดร.วรวุฒิ
09-01-15 o ความสาคัญและหลักการควบคุมคุณภาพในห้องปฏิบัติการ
o การสร้างกราฟควบคุมคุณภาพ OCV และ RCV

1
 o การแปลผลและประเมินผลจากกราฟ OCV และ RCV
o การนากราฟ RCV ไปใช้งาน
ปฏิบัติการ 01 : การสร้างกราฟควบคุมคุณภาพ 3 ดร.วรวุฒิ และ
o การทากราฟ OCV และ RCV คณาจารย์
o การแปลผลที่ได้จากการทากราฟ OCV และ RCV
บรรยาย 02 : คาร์โบไฮเดรตและโรคที่เกี่ยวข้อง 1 2 ดร.วรวุฒิ
o ความสาคัญของคาร์โบไฮเดรตในร่างกาย
o โครงสร้างของคาร์โบไฮเดรตและหน้าที่
o กลไกการทางานและความผิดปกติของคาร์โบไฮเดรต
16-01-15 o เบาหวานและโรคแทรกซ้อนที่เกี่ยวข้อง
ปฏิบัติการ 02 : การตรวจ Glucose 3 ดร.วรวุฒิ และ
o การตรวจ Fasting blood glucose คณาจารย์
o การควบคุมคุณภาพ
o การแปลผลที่ได้จากการตรวจ Glucose
บรรยาย 03 : คาร์โบไฮเดรตและโรคที่เกี่ยวข้อง 2 2 ดร.วรวุฒิ
o โครงสร้างของ HbA1c
o ความสาคัญและการตรวจติดตามการรักษาด้วย HbA1c
ปฏิบัติการ 03 : การตรวจ HbA1c 3 ดร.วรวุฒิ และ
23-01-15
o การเตรียมสิ่งส่งตรวจสาหรับการตรวจ HbA1c คณาจารย์
o การตรวจ HbA1c
o การควบคุมคุณภาพ
o การแปลผลที่ได้จากการตรวจ HbA1c
บรรยาย 04 : ไขมันและโรคที่เกี่ยวข้อง 1 2 อ.สุวิทย์
o ชนิด โครงสร้างและหน้าที่ของไขมันในร่างกาย
o ชนิด โครงสร้างและหน้าที่ของไขมันในกระแสเลือด
o ความผิดปกติของระดับไขมันในกระแสเลือด
o กลไกการเกิด Atherosclerosis
30-01-15
ปฏิบัติการ 04 : การตรวจไขมัน 3 อ.สุวิทย์ และ
o การตรวจ Total cholesterol, triglyceride และ HDL คณาจารย์
o การคานวณหาค่า LDL
o การควบคุมคุณภาพ
o การแปลผลที่ได้จากการตรวจ HbA1c
บรรยาย 05 : ไขมันและโรคที่เกี่ยวข้อง 2 2 อ.สุวิทย์
o ไขมันและความผิดปกติเกี่ยวกับหัวใจ
o Myocardial infarction
06-02-15 ปฏิบัติการ 05 : การตรวจ Total creatine kinase 3 อ.สุวิทย์ และ
o การตรวจ Total CK activity คณาจารย์
o การควบคุมคุณภาพ
o การแปลผลที่ได้จากการตรวจ Total CK activity
สอบครั้งที่ 1 บรรยาย 01-05 เวลา 09:00-11:00 น.
13-02-15
ปฏิบัติการ 01-05 เวลา 13:00-16:00 น.
บรรยาย 06 : โปรตีนและโรคที่เกี่ยวข้อง 2 ดร.วรวุฒิ
20-02-15
o โครงสร้าง ชนิดและบทบาทของโปรตีนในร่างกาย

2
 o Albumin และ Globulin
o ความผิดปกติของระดับโปรตีนในร่างกาย
ปฏิบัติการ 06 : การตรวจโปรตีนรวมและ Albumin 3 ดร.วรวุฒิ และ
o การตรวจระดับ Total protein และ albumin คณาจารย์
o การควบคุมคุณภาพ
o การแปลผลที่ได้จากการตรวจ Total protein และ
albumin
บรรยาย 07 : ไตและโรคที่เกี่ยวข้อง 1 2 ดร.พลาธิป
o ลักษณะทางกายภาพของไต
o หน้าที่และหารทางานของไต
o ความผิดปกติที่เกิดขึ้นกับไตและโรคที่เกี่ยวข้อง
o การตรวจการทางานของไตทางห้องปฏิบัติการ
27-02-15
ปฏิบัติการ 07 : การตรวจ BUN, creatinine และ uric acid 3 ดร.พลาธิป และ
o การตรวจ BUN, creatinine และ uric acid คณาจารย์
o การควบคุมคุณภาพ
o การแปลผลที่ได้จากการตรวจ BUN, creatinine และ uric
acid
บรรยาย 08 : ไตและโรคที่เกี่ยวข้อง 2 2 ดร.พลาธิป
o บทบาท หน้าที่และความสาคัญของ Electrolytes
o การควบคุมสมดุลของ Electrolytes
o ความผิดปกติที่เกิดขึ้นเกี่ยวกับ Electrolyte
o Metabolic acidosis และ alkalosis
06-03-15
ปฏิบัติการ 08 : การตรวจ Electrolytes และ anion gap 3 ดร.พลาธิป และ
o บรรยายหลักการและวิธีการตรวจ Electrolytes คณาจารย์
o บรรยายการคานวณหา Anion gap
o บรรยายการแปลผลที่ได้จาก Electrolytes และ anion
gap
บรรยาย 09 : ตับและโรคที่เกี่ยวข้อง 1 2 ดร.พลาธิป
o ลักษณะ บทบาท หน้าที่และความสาคัญของตับ
o การควบคุมสมดุล Metabolism ของตับ
o ความผิดปกติที่เกิดขึ้นเกี่ยวกับตับ
o Hepatitis และ Cirrhosis
13-03-15 o การตรวจ Liver function
ปฏิบัติการ 09 : การตรวจเอนไซม์ AST และ ALT 3 ดร.พลาธิป และ
o การตรวจการทางานของเอนไซม์ AST และ ALT คณาจารย์
o การควบคุมคุณภาพ
o การแปลผลที่ได้จากการตรวจการทางานของเอนไซม์ AST
และ ALT
บรรยาย 10 : ตับและโรคที่เกี่ยวข้อง 2 2 ดร.พลาธิป
o Bilirubin ชนิด การเกิดและบทบาทที่มีต่อร่างกาย
20-03-15 o ภาวะดีซ่านและชนิดต่างๆของดีซ่านในร่างกาย
o การตรวจภาวะดีซ่านในร่างกาย
ปฏิบัติการ 10 : การตรวจ Bilirubin 3

3
 o การตรวจ Total และ Direct bilirubin ดร.พลาธิป และ
o การคานวณหา Indirect bilirubin คณาจารย์
o การควบคุมคุณภาพ
o การแปลผลที่ได้จากการตรวจ Total และ Direct bilirubin
สอบครั้งที่ 2 บรรยาย 06-10 เวลา 09:00-11:00 น.
27-03-15
ปฏิบัติการ 06-10 เวลา 13:00-16:00 น.
บรรยาย 11 : แคลเซียมและสมดุลเหล็ก 2 อ.สุวิทย์
o ความสาคัญของแคลเซียมและเหล็กในร่างกาย
o การควบคุมสมดุลแคลเซียมและเหล็กในร่างกาย
o ภาวะผิดปกติของระดับแคลเซียมและเหล็กในร่างกาย
03-04-15 o การตรวจระดับแคลเซียมและเหล็กในกระแสเลือด
ปฏิบัติการ 11 : Calcium and iron measurement 3 อ.สุวิทย์ และ
o การตรวจระดับ Ca และ Fe ในกระแสเลือด คณาจารย์
o การควบคุมคุณภาพ
o การแปลผลที่ได้จากการตรวจ Ca และ Fe ในกระแสเลือด
บรรยาย 12 : ก๊าซในกระแสเลือด 2 อ.สุวิทย์
o ความสาคัญและบทบาทของ Blood gas ในร่างกาย
o Metabolic และ Respiratory acidosis
10-04-15
o Metabolic และ Respiratory alkalosis
ปฏิบัติการ 12 : ก๊าซในกระแสเลือด 3 อ.สุวิทย์ และ
o บรรยาย Blood gas และการแปลที่ได้จากการตรวจ คณาจารย์
บรรยาย 13 : สารบ่งชี้มะเร็ง 2 ดร.วรวุฒิ
o ความหมายและการเกิดมะเร็ง
o ชนิดของสารบ่งชี้มะเร็ง
17-04-15
o การแปลผลการตรวจสารบ่งชี้มะเร็ง
ปฏิบัติการ 13 : สารบ่งชี้มะเร็ง 3 ดร.วรวุฒิ และ
o การแปลผลการตรวจสารบ่งชี้มะเร็ง คณาจารย์
บรรยาย 14 : ความสัมพันธ์ทางคลินิก 2 ดร.วรวุฒิ
o Integration of metabolism
o ความสัมพันธ์ของสารชีวโมเลกุลกับการเกิดโรค
24-04-15 o ความสัมพันธ์ของโรคที่เกี่ยวข้องกัน
ปฏิบัติการ 14 : ความสัมพันธ์ทางคลินิก 3 ดร.วรวุฒิ และ
o การแปลผลและการอธิบายความสัมพันธ์ทางคลินิกในงาน คณาจารย์
เคมีคลินิก
บรรยาย 15 : กรณีศึกษา 2 ดร.วรวุฒิ
o อ่านและทาความเข้าใจเกี่ยวกับกรณีศึกษาต่างๆ
01-05-15 o นาเสนอกรณีศึกษา
ปฏิบัติการ 15 : กรณีศึกษา 3 ดร.วรวุฒิ และ
o นาเสนอกรณีศึกษา คณาจารย์
สอบครั้งที่ 3 บรรยาย 11-14 เวลา 09:00-11:00 น.
08-05-15
ปฏิบัติการ 11-14 เวลา 13:00-16:00 น.

4
 กิจกรรมการเรียนการสอน
บรรยาย/ อภิปราย/ สาธิต/ รายงาน /ทดลองในห้องปฏิบัติการ /ศึกษาค้นคว้าด้วยตนเอง

สื่อการเรียนการสอน
คอมพิวเตอร์/ เครื่อง Projector/ เอกสารประกอบการสอน/ คู่มือปฏิบัติการ/ สื่อภาพประกอบการสอน/ วีดีทัศน์

แผนการประเมินผลการเรียนรู้
การประเมิน งานที่จะใช้ประเมินผลผู้เรียน กาหนดการ สัดส่วนของการประเมินผล
1 ภาคทฤษฎี (บรรยายและปฏิบัติการ) 45%
- สอบครั้งที่ 1 บรรยาย1-5 13 ก.พ. 58 09.00-12.00 น. 15%
ปฏิบัติการ 1-5
- สอบครั้งที่ 2 บรรยาย 6-10 27 มี.ค. 58 09.00-12.00 น. 15%
ปฏิบัติการ 6-10
- สอบครั้งที่ 3 บรรยาย 11-14 08 พ.ค. 58 09.00-12.00 น. 15%
ปฏิบัติการ 11-14
2 ภาคปฏิบัติ 30%
- สอบครั้งที่ 1 ปฏิบัติการ 1-5 13 ก.พ. 58 13.00-16.00 น. 10%
- สอบครั้งที่ 2 ปฏิบัติการ 6-10 27 มี.ค. 58 13.00-16.00 น. 10%
- สอบครั้งที่ 3 ปฏิบัติการ 11-14 08 พ.ค. 58 13.00-16.00 น. 10%
3 กรณีศึกษา 01 พ.ค. 58 09.00-16.00 น. 15%
4 รายงาน ตลอดภาคการศึกษา 5%
5 เข้าชั้นเรียน ตลอดภาคการศึกษา 5%
รวม 100%

เกณฑ์การประเมิน
ระดับผลการเรียน คะแนนร้อยละ ระดับผลการเรียน คะแนนร้อยละ
A 80-100 B+ 75-79
B 70-74 C+ 65-69
C 60-64 D+ 55-59
D 50-54 F 0-49
หากไม่สามารถประเมินคะแนนตามเกณฑ์ จะพิจารณาแบบอิงกลุ่มตามความเห็นของวิชาการคณะเทคนิคการแพทย์
(หากนิสิตเข้าเรียนไม่ถึง 80% หรือทุจริตให้ระดับผลการเรียนเป็น F)

หนังสือ/ตารา/เอกสารอ้างอิง
1. Bishop LM, Fody PE., Schoeff, EF. Clinical chemistry: principle, procedures, correlation. 5th edition.
Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkin, 2005
2. Anderson, CS., Cockayne, S. Clinical chemistry: Concepts and applications. Revised Edition. Illinois:
Waveland Press, 2007
3. Kaplan, AL., Pesce, JA.,Kazmierczak, CS. Clinical chemistry: theory, analysis, correlation. 4th edition.
Missouri: Mosby, 2003

5
ชื่อ........................................................ รหัส......................................................

ปฏิบัติการรายวิชา MT2317 เคมีคลินิกทั่วไป (General Clinical Chemistry) 2-2557

เรื่อง การควบคุมคุณภาพ (Quality control)
สำหรับนิสิตคณะเทคนิคการแพทย์ ชั้นปีที่ 2 มหาวิทยาลัยเวสเทิร์น
—————————————————————————————————————————
โดย อ.ดร. วรวุฒิ สมศักดิ์
จงสร้างกราฟควบคุมคุณภาพ OCV และ RCV จากข้อมูลต่อไปนี้
OCV (Optimal condition varient)
1 100 Mean
2 120 SD
3 70 2SD
4 200 3SD
5 80 Mean + SD
6 110 Mean -SD
7 100 Mean + 2SD
8 130 Mean - 2SD
9 150 Mean + 3SD
10 110 Mean - 3SD
11 90
12 100
13 110
14 130
15 180
16 70
17 80
18 200
19 150
20 120

6
ชื่อ........................................................ รหัส......................................................

จงแปลผลความผิดปกติจากกราฟ RCV ต่อไปนี้

……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

7
ชื่อ........................................................ รหัส.................................................. 1

ปฏิบัติการรายวิชา MT2317 เคมีคลินิกทั่วไป (General Clinical Chemistry) 2-2557

เรื่อง การตรวจวัดระดับกลูโคสในพลาสมา
สำหรับนิสิตคณะเทคนิคการแพทย์ ชั้นปีที่ 2 มหาวิทยาลัยเวสเทิร์น

โดย อ.ดร. วรวุฒิ สมศักดิ์

วัตถุประสงค์ เพื่อให้นิสิตสามารถ
1. อธิบายหลักการเตรียมผู้ป่วยสำหรับการตรวจวัดระดับกลูโคสในพลาสมาได้
2. อธิบายการเลือกใช้สารกันเลือดแข็งสำหรับการตรวจวัดระดับกลูโคสในพลาสมาได้
3. อธิบายหลักการตรวจวัดระดับกลูโคสในพลาสมาด้วยวิธี Glucose oxidase test ได้
4. เข้าใจหลักการปฏิบัติสำหรับการตรวจวัดระดับกลูโคสในพลาสมาและการควบคุมคุณภาพได้
5. เข้าใจข้อควรระวังสำหรับการตรวจวัดระดับกลูโคสในพลาสมาได้
6. แปลผลการตรวจวัดระดับกลูโคสในพลาสมาได้โดยเปรียบเทียบกับค่าปกติ
7. อธิบายความสัมพันธ์ของโรคกับผลการตรวจวัดระดับกลูโคสในพลาสมาได้

ระดับกลูโคสในพลาสมาและความสัมพันธ์ทางคลินิก
กลูโคสในพลาสมาจะถูกร่างกายควบคุมให้มีระดับที่สมดุลอยู่เสมอ โ ดยอาศัยกลไกของเซลต่างๆที่ทำงานร่วม
กันและระบบฮอร์โมนจากตับอ่อนที่ช่วยให้เกิดการทำงานร่วมกันได้อย่างสมบูรณ์ โ ดยฮอร์โมนของตับอ่อนที่สำคัญที่
ช่วยควบคุมระดับของกลูโคสในพลาสมาคือ Insulin โดย Insulin จะทำหน้าที่นำกลูโคสในพลาสมากลับเข้าสู่เซลต่าง
ๆของร่างกาย เพื่อให้กลูโคสในพลาสมาลดลงจนกลับสู่ระดับที่ปกติ ดังนั้นหากการทำงานของ Insulin เสียไปหรือตับ
อ่อนไม่สามารถสร้าง Insulin ออกมาได้ จะทำให้ระดับกลูโคสในพลาสมาสูงขึ้น เราเรียกภาวะนี้ว่า เบาหวาน
(Diabetes mellitus: DM) เบาหวานสามารถแบ่งออกเป็นชนิดใหญ่ๆ คือ เบาหวานชนิดที่ 1 เป็นภาวะที่ร่างกายไม่มี
การสร้าง Insulin ออกมาเลย และเบาหวานชนิดที่ 2 ร่างกายสามารถสร้าง Insulin ไ ด้แต่ไม่สามารถทำงานได้ตาม
ปกติ ดังนั้นการตรวจวัดระดับกลูโคสในพลาสมาจึงสามารถช่วยในการติดตามและวินิจฉัยเบื้องต้นได้ว่าร่างกายใน
สภาวะนั้นมีระดับกลูโคสสูงกว่าปกติหรือไม่ (Hyperglycemia) และมีความเสี่ยงต่อการเป็นเบาหวานหรือไม่ อีกทั้งยัง
เป็นการช่วยตรวจติดตามว่าหากเกิดการรักษาแล้วระดับของกลูโคสในพลาสมามีการลดลงหรือไม่ ตอบสนองต่อยา
และการรักษาเป็นอย่างไร แต่อย่างไรก็ตามการตรวจระดับกลูโคสในพลาสมานั้นไม่สามารถช่วยในการวินิจฉัยการเป็น
โรคเบาหวานได้โดยตรงและไม่สามารถแยกชนิดของเบาหวานได้

8
ชื่อ........................................................ รหัส.................................................. 2

สิ่งส่งตรวจ
ผู้ป่วยที่ต้องการจะตรวจวัดกลูโคสในพลาสมานั้นจะต้องทำการอดอาหาร (fasting) อย่างน้อย 6-8 ชั่วโมง
ก่อนการเจาะเลือดเพื่อไม่ให้กลูโคสจากอาหารรบกวนค่าที่วัดได้จริง จากนั้นควรให้ผู้ป่วยมีการพักก่อนทำการเจาะ
เลือดเพื่อไม่ให้ร่างกายเกิดการใช้น้ำตาลจากกิจกรรมต่างๆ การเก็บสิ่งส่งตรวจนั้นมักจะทำการเจาะเลือดจากหลอด
เลือดดำบริเวณข้อพับแขน โ ดยจะใช้เลือดปริมาณ 3-5 มิลลิลิตรและใช้หลอดเก็บเลือดที่มีการใช้สาร NaF (Sodium
fluoride) เพื่อเป็นการป้องกันไม่ให้เม็ดเลือดแดงใช้กลูโคส โ ดยจะไปขัดขวางการทำงานของเอนไซม์ Enolase ใ น
กระบวนการ Glycolysis ของเซล จากนั้นจจะนำเลือดที่เก็บได้มาปั่นเหวี่ยงที่ความเร็วรอบ 3,000 rpm เป็นเวลานาน
ประมาณ 5 นาที และเก็บพลาสมาในหลอดที่สะอาดเพื่อใช้ในการตรวจวัดกลูโคสในพลาสมาต่อไป หากไม่มีหลอด
NaF tube เราสามารถใช้เป็น Clotted blood หรือ Heparin tube ไ ด้แต่ต้องรีบนำส่งห้องปฏิบัติการเพื่อทำการ
ตรวจวัดกลูโคสภายในเวลา 2 ชั่วโมง

การตรวจวัดกลูโคสด้วยวิธี Glucose oxidase test (ชุดตรวจสำเร็จรูปจากบริษัท BioSystems)

กลูโคสในพลาสมาจะถูกเร่งปฏิกิริยาด้วยเอนไซม์ Glucose oxidase เกิดเป็นสารตัวกลางและไฮโดรเจนเปอร์
ออกไซด์ (H2O2: hydrogen peroxide) จากนั้น H2O2 จะทำปฏิกิริยาต่อกับสารที่ทำให้เกิดสี (Pre-color
substance) โดยอาศัยการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ Peroxidase เกิดเป็นสารผลิตผลและสารที่มีสีที่สามารถวัดค่าการ
ดูดกลืนแสงได้ที่ความยาวคลืนสูงสุด 500 nm

น้ำยาสารเคมี
1. Reagent A พร้อมใช้งาน
2. Glucose standard พร้อมใช้งาน
น้ำยาทั้งสองชนิดสามารถเก็บไว้ที่ 4oC จนกระทั่งหมดอายุ หรือสามารถตรวจสอบเบื้องต้นว่าน้ำยายังคง
สภาพพร้อมใช้งานหรือไม่ โ ดยสังเกตว่าหากมีความขุ่นเกิดขึ้นแสดงว่าน้ำยามีการปนเปื้อนและไม่ควรนำมาใช้ หรือนำ
น้ำยาไปวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 500 nm หากมีค่าเกินกว่า 0.15 แสดงว่าน้ำยาเสื่อมสภาพ

ขั้นตอนการตรวจวัด
1. นำน้ำยาไปอุ่นที่อุณหภูมิ 37oC เป็นเวลา 10 นาที
2. ทำตามขั้นตอนดังแสดงในตาราง
Reagents (ul) Blank Standard Unknown
Reagent A 1000 1000 1000
น้ำกลั่น 10 - -
Glucose standard - 10 -
Unknown plasma - - 10

9
ชื่อ........................................................ รหัส.................................................. 3
3. ผสมให้เข้ากันด้วย Vortex และนำไปอุ่นที่อุณหภูมิ 37oC เป็นเวลา 30 นาที
4. นำไปวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลืน 500 nm โดยใช้หลอด Blank ปรับ 0
5. นำไปคำนวณความเข้มข้นของกลูโคสในพลาสมาของ Unknown
Cu = Au x Cs
As
เมื่อ Au = ค่าการดูดกลืนแสงของ Unknown plasma
As = ค่าการดูดกลืนแสงของ Glucose standard
Cu = ความเข้มข้นกลูโคสของ Unknown plasma (mg/dl)
Cs = ความเข้มข้นกลูโคสของ Glucose standard (mg/dl)

ค่าปกติ 70-100 mg/dl

สิ่งรบกวนการตรวจวัดกลูโคสในพลาสมา
1. Hemoglobin (>3g/dl)
2. Lipemia (Triglyceride >1.25 g/dl)
3. Icterus (Bilirubin 10 mg/dl)

Sensitivity : 0.23 mg/dl

Linearity : 500 mg/dl

10
ชื่อ........................................................ รหัส.................................................. 4
การรายงานผลการตรวจวัดกลูโคสในพลาสมา
Unknown plasma no…………………………………. ค่าที่วัดได้
Control range
Au
As
Cs
Cu

แปลผลการตรวจกลูโคสในพลาสมา
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

11
ชื่อ........................................................ รหัส.................................................. 1

ปฏิบัติการรายวิชา MT2317 เคมีคลินิกทั่วไป (General Clinical Chemistry) 2-2557

เรื่อง การตรวจ OGTT และ HbA1c
สำหรับนิสิตคณะเทคนิคการแพทย์ ชั้นปีที่ 2 มหาวิทยาลัยเวสเทิร์น

โดย อ.ดร. วรวุฒิ สมศักดิ์

วัตถุประสงค์ เพื่อให้นิสิตสามารถ
1. อธิบายหลักการเตรียมผู้ป่วยสำหรับการตรวจ OGTT และ HbA1c ได้
2. อธิบายหลักการตรวจ OGTT และ HbA1c ได้
3. เข้าใจหลักการปฏิบัติสำหรับการตรวจ OGTT และ HbA1c และการควบคุมคุณภาพได้
4. แปลผลการตรวจ OGTT และ HbA1c ได้
5. อธิบายความสัมพันธ์ของโรคกับผลการตรวจ OGTT และ HbA1c ได้

Oral Glucose Tolerance Test (OGTT)

เป็นการตรวจระดับกลูโคสในพลาสมาโดยดูการทำงานของอินซูลินเป็นสำคัญ เมื่อร่างกายได้รับกลูโคสเข้าสู่
ร่างกายนั้น ภายใน 1 ชั่วโมงแรกนั้นระดับของกลูโคสในกระแสเลือดจะเพิ่มสูงมากขึ้น ใ นสภาวะที่กลูโคสสูงเช่นนี้จะ
เป็นการไปกระตุ้นให้ตับอ่อนสร้างและหลั่งอินซูลินออกมาเพื่อทำหน้าที่ในการไปจับกับตัวรับที่ตำเพาะบนผิวเซลล์เพื่อ
กระตุ้นการเปิดออกของช่องทางเข้าของกลูโคส (Glucose transporter: GLUT) และนำกลูโคสเข้าสู่เซลล์จนกระทั่ง
ระดับกลูโคสในกระแสเลือดกลับสู่ระดับปกติภายใน 2-3 ชั่วโมง ดังนั้นการตรวจ OGTT จึงสามารถดูการทำงานของ
อินซูลินได้ เพื่อช่วยในการวินิจฉัยว่าผู้ป่วยที่มีระดับกลูโคสสูงในกระแสเลือด (Hyperglycemia) นั้นเป็นเบาหวานหรือ
ไม่ แต่อย่างไรก็ตามการตรวจ OGTT ไม่สามารถบอกชนิดของเบาหวานได้

สิ่งส่งตรวจ
ผู้ป่วยที่ต้องการจะตรวจวัดกลูโคสในพลาสมานั้นจะต้องทำการอดอาหาร (fasting) อย่างน้อย 6-8 ชั่วโมง
ก่อนการเจาะเลือดเพื่อไม่ให้กลูโคสจากอาหารรบกวนค่าที่วัดได้จริง จากนั้นควรให้ผู้ป่วยมีการพักก่อนทำการเจาะ
เลือดเพื่อไม่ให้ร่างกายเกิดการใช้น้ำตาลจากกิจกรรมต่างๆ การเก็บสิ่งส่งตรวจนั้นมักจะทำการเจาะเลือดจากหลอด
เลือดดำบริเวณข้อพับแขน โ ดยจะใช้เลือดปริมาณ 3-5 มิลลิลิตรและใช้หลอดเก็บเลือดที่มีการใช้สาร NaF (Sodium
fluoride) เพื่อเป็นการป้องกันไม่ให้เม็ดเลือดแดงใช้กลูโคส โ ดยจะไปขัดขวางการทำงานของเอนไซม์ Enolase ใ น

12
ชื่อ........................................................ รหัส.................................................. 2
กระบวนการ Glycolysis ของเซล จากนั้นจจะนำเลือดที่เก็บได้มาปั่นเหวี่ยงที่ความเร็วรอบ 3,000 rpm เป็นเวลานาน
ประมาณ 5 นาที และเก็บพลาสมาในหลอดที่สะอาดเพื่อใช้ในการตรวจวัดกลูโคสในพลาสมาต่อไป หากไม่มีหลอด
NaF tube เราสามารถใช้เป็น Clotted blood หรือ Heparin tube ไ ด้แต่ต้องรีบนำส่งห้องปฏิบัติการเพื่อทำการ
ตรวจวัดกลูโคสภายในเวลา 2 ชั่วโมง
จากนั้นผู้ป่วยจะได้รับสารละลายกลูโคส (75 g/250 ml) จากนั้นจะทำการเจาะเก็บเลือดเพื่อนำไปตรวจวัด
ระดับกลูโคสเป็นทุกๆ 30 นาทีหรือทุกๆ 1 ชั่วโมงเป็นเวลา 2-3 ชั่วโมง แล้วนำผลที่ตรวจวัดได้มาวิเคราะห์การทำงาน
ของอินซูลิน

การตรวจวัดกลูโคสด้วยวิธี Glucose oxidase test (ชุดตรวจสำเร็จรูปจากบริษัท BioSystems)

กลูโคสในพลาสมาจะถูกเร่งปฏิกิริยาด้วยเอนไซม์ Glucose oxidase เกิดเป็นสารตัวกลางและไฮโดรเจนเปอร์
ออกไซด์ (H2O2: hydrogen peroxide) จากนั้น H2O2 จะทำปฏิกิริยาต่อกับสารที่ทำให้เกิดสี (Pre-color
substance) โดยอาศัยการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ Peroxidase เกิดเป็นสารผลิตผลและสารที่มีสีที่สามารถวัดค่าการ
ดูดกลืนแสงได้ที่ความยาวคลืนสูงสุด 500 nm

น้ำยาสารเคมี
1. Reagent A พร้อมใช้งาน
2. Glucose standard พร้อมใช้งาน
น้ำยาทั้งสองชนิดสามารถเก็บไว้ที่ 4oC จนกระทั่งหมดอายุ หรือสามารถตรวจสอบเบื้องต้นว่าน้ำยายังคง
สภาพพร้อมใช้งานหรือไม่ โ ดยสังเกตว่าหากมีความขุ่นเกิดขึ้นแสดงว่าน้ำยามีการปนเปื้อนและไม่ควรนำมาใช้ หรือนำ
น้ำยาไปวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 500 nm หากมีค่าเกินกว่า 0.15 แสดงว่าน้ำยาเสื่อมสภาพ

ขั้นตอนการตรวจวัด
1. นำน้ำยาไปอุ่นที่อุณหภูมิ 37oC เป็นเวลา 10 นาที
2. ทำตามขั้นตอนดังแสดงในตาราง
Reagents (ul) Blank Standard Unknown
Reagent A 1000 1000 1000
น้ำกลั่น 10 - -
Glucose standard - 10 -
Unknown plasma - - 10
3. ผสมให้เข้ากันด้วย Vortex และนำไปอุ่นที่อุณหภูมิ 37oC เป็นเวลา 30 นาที
4. นำไปวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลืน 500 nm โดยใช้หลอด Blank ปรับ 0
5. นำไปคำนวณความเข้มข้นของกลูโคสในพลาสมาของ Unknown
Cu = Au x Cs
13
ชื่อ........................................................ รหัส.................................................. 3
As
เมื่อ Au = ค่าการดูดกลืนแสงของ Unknown plasma
As = ค่าการดูดกลืนแสงของ Glucose standard
Cu = ความเข้มข้นกลูโคสของ Unknown plasma (mg/dl)
Cs = ความเข้มข้นกลูโคสของ Glucose standard (mg/dl)

ค่าปกติ FBG 70-100 mg/dl

2h OGTT < 140 mg/dl

สิ่งรบกวนการตรวจวัดกลูโคสในพลาสมา
1. Hemoglobin (>3g/dl)
2. Lipemia (Triglyceride >1.25 g/dl)
3. Icterus (Bilirubin 10 mg/dl)

Sensitivity : 0.23 mg/dl

Linearity : 500 mg/dl

Hemoglobin A1c
HbA1c หรือ Glycohemoglobin, Glycated hemoglobin หรือ Glycosylated hemoglobin เป็นภาวะ
ที่ฮีโมโกลบินในเม็ดเลือดแดงถูกจับด้วยกลูโคสในกระแสเลือด ซึ่งการจับกันนี้เป็นการจับกันแบบถาวรโดยไม่ต้องอาศัย
ปฏิกิริยาเอนไซม์ในการจับกัน ภาวะที่ร่างกายใรน้ำตาลกลูโคสสูงในกระแสเลือด เช่น เบาหวานที่มีกลูโคสสูงตลอด
เวลานั้น จะทำให้กลูโคสสามารถเข้าไปในเม็ดเลือดแดงในกระแสเลือดและจับกับฮีโมโกลบินได้ ซึ่งจะจับอยู่ในนาน
เท่ากับอายุของเม็ดเลือดแดง ประมาณ 100-120 วัน การจับกันนั้นจะเป็นการจับที่บริเวณ N-terminal ของสาย
โปรตีน Beta-chain ของฮีโมโกลบิน ดังนั้นการตรวจวัดระดับ HbA1c นั้นจึงเป็นการตรวจติดตามผลการรักษาหรือ
การดูแลตัวเองของผู้ป่วยได้เป็นอย่างดี เพราะระดับของ HbA1c จะลดต่ำลงถ้าผู้ป่วยเบาหวานมีการดูแลรักษาและรับ
ประทานยาตามแพทย์สั่งอย่างสม่ำเสมอ การตรวจติดตามนี้จะใช้ตรวจในระยะเวลาประมาณ 2-3 เดือนต่อครั้ง ระดับ
ปกติของ HbA1c ต้องไม่เกิน 6% หากมีระดับที่สูงกว่านี้แสดงว่าในกระแสเลือดนั้นมีกลูโคสสูงมากเป็นระยะเวลานาน
หรือเป็นเบาหวานที่ไม่ได้รับการรักษา แต่หากผู้ป่วยเบาหวานได้รับการรักษาระดับของ HbA1c ควรจะไม่เกิน 7%

14
ชื่อ........................................................ รหัส.................................................. 4
การรายงานผลการตรวจวัดกลูโคสในพลาสมา
Unknown plasma no…………………………………. ค่าที่วัดได้
Control range
Au (FBG)
Au (1h)
Au (2h)
As
Cs
Cu

จงวาดกราฟแสดงระดับของกลูโคสจากการตรวจ OGTT นี้

แปลผลการตรวจ OGTT
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

15
ชื่อ........................................................ รหัส.................................................. 5
จงอธิบายหลังการตรวจวัดระดับ HbA1c
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
จงแปลผลการตรวจต่อไปนี้
FBG = 140 mg/dl 2h OGTT = 180 mg/dl HbA1c = 10%
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
จงแปลผลการตรวจต่อไปนี้
FBG = 120 mg/dl 2h OGTT = 80 mg/dl HbA1c = 5%
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
จงแปลผลการตรวจต่อไปนี้
FBG = 160 mg/dl 2h OGTT = 200 mg/dl HbA1c = 7%
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

16
 การตรวจวิเคราะห์ระดับไขมันในเลือด

อ. ทนพ. สุวิทย์ คล่องทะเล

สาขาวิชาเคมีคลินิก
คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยเวสเทิร์น

บทนา
ไขมัน (lipid) เป็นสารมหโมเลกุลสาคัญในร่างกาย แตกต่างจากสารมหโมเลกุลชนิดอื่น ๆ โดยเฉพาะในแง่โครงสร้างที่
มิได้เกิดจากการนาหน่วยย่อยมาเชื่อมต่อกันเป็นโมเลกุลใหญ่ ไขมันมีโครงสร้างที่มีคุณสมบัติเป็น hydrophobic จึงไม่ค่อยละลาย
ในพลาสม่า จาเป็นต้องจับอยู่กับโปรตีนเกิดเป็นสารมหโมเลกุลเชิงซ้อนที่เรียกว่า lipoproteins เพื่อให้หมุนเวียนอยู่ในพลาสม่าได้
ในแง่ของโภชนาการ อาหารไขมัน 1 กรัม ให้พลังงานคิดเป็น 9 กิโลแคลอรี ซึ่งถือว่ามากกว่า สารอาหารให้พลังงานประเภทอื่น ๆ
ดังนั้น ปริมาณอาหารไขมันที่ควรแก่การรับประทานจึงต้องมีการกาหนดให้เหมาะสม มิฉะนั้นร่างกายอาจเสียสมดุลพลังงาน เป็น
ผลให้มีการเก็บสารองพลังงานไว้มากเกินไป อันจะนาไปสู่ภาวะเจ็บป่วยของร่างกายต่อไปได้
การตรวจวัดระดับไขมันในเลือด จัดเป็นรายการตรวจสาหรับงานประจาวัน (routine laboratory) ประกอบด้วย การ
ตรวจวัดระดับไตรกลีเซอไรด์ (triglyceride; TG), โคเลสเตอรอลรวม (total cholesterol; TC), High-density lipoprotein
(HDL) และ low-density lipoprotein (LDL) เรียกรวมว่าเป็น lipid profile ทั้ง นี้ National Cholesterol Education
Program (NCEP) แนะนาให้เริ่มตรวจตั้งแต่อายุ 20 ปีขึ้นไป และควรตรวจทุก ๆ 5 ปี

การเตรียมตัวผู้ป่วยและการเจาะเก็บเลือด
ก่อนการเจาะเลือดผู้ป่วยเพื่อตรวจวัดระดับไขมัน จาเป็นอย่างยิ่งที่ผู้ป่วยจะต้องมีการเตรียมตัวและนักเทคนิคการแพทย์
และบุคลากรห้องปฏิบัติการเวชศาสตร์ชันสูตร จะต้องมีความรู้ในการเก็บสิ่งส่งตรวจ เพื่อให้ผลการตรวจสอดคล้องกับสภาพจริง
ของผู้ป่วย ซึ่งมีหลักการดังต่อไปนี้
1. อาหารและเครื่องดื่ม
ผู้ป่วยที่ได้รับการตรวจหาระดับไขมันในเลือด โดยทั่วไป จาเป็นต้องมีการงดอาหาร (fasting) ก่อนการเจาะเก็บเลือดเป็น
เวลา 12-14 ชั่วโมง ยกเว้น น้าเปล่า แต่ในกรณีที่ไม่สามารถงดได้ถึง 12 ชั่วโมง NCEP Adult Treatment Panel III (ATP III)
แนะนาว่าให้งดอาหารเป็นเวลาอย่างน้อย 9 ชั่วโมง การงดอาหารนี้มีความสาคัญยิ่งโดยเฉพาะการตรวจวัดไตรกลีเซอไรด์ และ LDL
มิฉะนั้นผลการตรวจวัดจะมีระดับสูงขึ้นจากไตรกลีเซอไรด์ที่ผู้ป่วยได้รับจากการรับประทานอาหาร (dietary triglyceride) ซึ่งอยู่ใน
รูปของ chylomicrons ความเข้มข้นของ LDL และ HDL จะลดต่าลงชั่วคราวภายหลังรับประทานอาหาร อันเป็นผลมาจากการ
เปลี่ ย นแปลงองค์ ป ระกอบโดย Cholesteryl ester transfer protein (CETP) ที่ เ กิ ด ขึ้ นในขณะมี catabolism ของ
chylomicrons การตรวจวัดไตรกลีเซอไรด์และ LDL จึงมีความจาเป็นที่จะต้องงดอาหาร ส่วนการตรวจวัด total cholesterol
และ HDL สามารถกระทาได้ในผู้ป่วยที่ไม่ได้งดอาหาร ทั้งนี้ ผู้ป่วยควรรับประทานอาหารเป็นปกติในช่วง 2-3 สัปดาห์ก่อนการ
ตรวจ ยาบางชนิด เช่น steroids, oral contraceptives อาจมีผลทาให้การตรวจวัดระดับไขมันในเลือดเปลี่ยนแปลงไปจากสภาพ
จริงของผู้ป่วย จึงมีข้อแนะนาให้ผู้ป่วยงดยานี้ อย่างน้อย 3 วันก่อนการเจาะเลือดเพื่อตรวจวัดไขมัน อย่างไรก็ ตาม หากผู้ป่วยงดยา
ไม่ได้ ก็ควรเขียนระบุชื่อยาไว้ เพื่อที่แพทย์จะได้นามาประกอบการแปลผล

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 17 1
 2. หลักการเจาะเก็บเลือด
นักเทคนิคการแพทย์ หรือบุคลากรในห้องปฏิบัติการเวชศาสตร์ชันสูตรที่ทาหน้าที่เจาะเก็บเลือด จะต้องคานึงถึงวิธีการให้
แน่ชัด เนื่องจาก ปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับการเจาะเก็บเลือดมีผลต่อการตรวจวัดระดับไขมันในเลือด โดยทั่วไป นิยมเจาะเลือดผู้ป่วยใน
สภาพนั่ง ยกเว้นในกรณีที่ผู้ป่วยไม่สามารถนั่งได้ ก็ให้เจาะในท่านอน ในขณะที่ผู้ป่วยอยู่ในท่ายืน แล้วค่อย ๆ นอนลง น้าภายนอก
เซลล์ (extravascular water) จะเคลื่ อนเข้ าสู่ร ะบบเลื อด (vascular system) และเจื อจางสารที่ ไ ม่ ล ะลายในพลาสม่ า
(hemodilution) จากการศึ กษา พบว่ า ระดับของ TC, LDL, HDL, apoA-I และ apoB จะลดลงร้ อยละ 10 เมื่อนอนลง
(recumbence) เป็นเวลา 20 นาที ส่วน TG ลดลงมากกว่าร้ อยละ 50 จึงเชื่ อกันว่า น่าจะมีปั จจัย อย่างอื่นนอกเหนื อจาก
hemodilution ที่ทาให้เกิดลักษณะนี้ ปัจจุบัน NCEP guidelines แนะนาว่า ผู้ป่วยควรนั่งรอเป็นเวลา 5 นาทีก่อนทาการเจาะ
เก็บเลือด เพื่อป้องกัน hemoconcentrations นอกจากนี้ ไม่ควรรัด tourniquet นานเกิน 1-2 นาที เพราะจะทาให้ระดับไขมัน
สูงขึ้นกว่าจริง
การตรวจวัดไขมัน ใช้ได้ทั้งพลาสม่าและซีรัมในกรณีที่ตรวจเพียง TC, TG และ HDL และคานวณหา LDL จากค่าทั้ง 3 นี้
แต่หากต้องการตรวจวิเคราะห์ lipoproteins ด้วยวิธี ultracentrifugation หรือ electrophoresis เลือดที่นิยมใช้ในการตรวจ คือ
พลาสม่าเนื่องจาก สามารถเก็บที่ 4C ได้ทันที สารต้านการแข็งตัวของเลือดที่ใช้ก็มีความสาคัญเช่นกัน เนื่องจากมีผลต่อระดับ
ไขมันที่ ตรวจวั ด เช่ น citrate, oxalate และ fluoride ทาให้เ กิด osmotic effect มาก ส่ งผลให้ plasma lipid และ
lipoproteins มีความเข้มข้นลดลงกว่าจริง heparin มีผลเพียงเล็กน้อยต่อปริมาตรเลือด แต่จะทาให้รูปแบบการเคลื่อนที่ของ
lipoprotein ในการตรวจวิเคราะห์ ด้วยวิ ธี electrophoresis เปลี่ ยนแปลงได้ สารต้านการแข็ง ตัวของเลื อดที่นิยมใช้ คื อ
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) แม้จะมีผลทาให้ระดับของ TC และ TG น้อยกว่าซีรัมร้อยละ 3 การใช้ EDTA มี
ข้อดีในแง่ของการช่วยคงสภาพของไขมัน เนื่องจาก EDTA เป็น chelating agent สามารถไปจับกับโลหะหนัก ทาให้โลหะหนัก ไม่
สามารถทาหน้าที่เป็นตัวเร่งปฏิกิริยา auto-oxidation ของไขมันได้ การเปลี่ยนแปลงของระดับไขมันจึงเกิดได้ช้าลง รูปแบบ EDTA
ที่แนะนาให้ใช้เป็นแบบผงแห้ง เนื่องจากไม่ทาให้ plasma เกิดเจือจาง

ปัจจัยที่ส่งผลต่อการตรวจวิเคราะห์ไขมันในเลือด
การตรวจไขมันและ lipoprotein อาจมีการเปลี่ยนแปลงไปจากค่าจริงด้วยอิทธิพลต่าง ๆ ดังนี้
1. ความผันแปรทางชีวภาพ (biologic variation)
ปัจจั ย ทางชี วภาพที่ ส่ ง ผลต่ อค่ าการวิ เ คราะห์ไ ขมั น ได้ แ ก่ อายุ เพศ ฤดูกาล พฤติ กรรมของแต่ ล ะบุ คคล เช่ น การ
รับประทานอาหาร ยารักษาโรค สภาวะทางสุขภาพ การออกกาลังกาย การสูบบุหรี่ เป็นต้น
ความผันแปรทางสรีรวิทยา ระดับของ cholesterol, TG และ lipoproteins สามารถเปลี่ยนแปลงได้ แม้จะ
ตรวจจากคนเดียวกันก็ตาม จากการศึกษาในตัวอย่างตรวจที่เจาะเป็นช่วงเวลาของคนเดียวกันสาหรับตรวจ cholesterol พบว่า
ประมาณร้อยละ 95 ของคนทั้งหมด มีค่าเปลี่ยนแปลงไปในทางมากขึ้นหรือน้อยลงถึงร้อยละ 13 กล่าวได้ว่า ความผันแปรทาง
สรีรวิทยามีผลต่อการตรวจวัดปริมาณไขมันมากกว่าความผิดพลาดที่เกิดจากกระบวนการวิเคราะห์ (analytic error) ดังนั้น จึง
ควรเจาะเก็บเลือดหลายครั้ง ห่างกันอย่างน้อยครั้งละ 1 สัปดาห์
เพศ ระดับของไขมันในเพศหญิงและชายมีความแตกต่างกัน โดยเฉพาะค่า TG ที่ในเพศชายมีค่าสูงกว่าเพศ
หญิง แต่ความแตกต่างนี้ จะลดลงเมื่อมีอายุมากขึ้น ส่วนระดับ cholesterol ไม่ค่อยแตกต่างกันนัก ยกเว้นในระยะหนุ่มสาวที่เพศ
ชายจะมีระดับ cholesterol สูงกว่าหญิงอย่างมีนัยสาคัญ แต่ในช่วงวัยเด็กและหลังจากอายุ 50 ปีไปแล้ว เพศหญิงจะมีระดับ
cholesterol สูงกว่าชาย
อายุ ระดับไขมั นในเลือดเป็นปฏิภาคโดยตรงกั บอายุ โดยเลื อดที่ได้จากสายสะดือของเด็กทารกมีระดับของ
ไขมันต่ามาก แต่เมื่ออายุมากขึ้นเข้าสู่ช่วงวัยเด็ก ไขมันจะเพิ่มขึ้นเร็วมาก และจะค่อยเพิ่มทีละน้อย เมื่อเข้าสู่วัยผู้ใหญ่
ฤดูกาล ในฤดูหนาวระดับ cholesterol สูงกว่าฤดูอื่นเล็กน้อย
อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 18 2
 พฤติกรรมการรับประทานอาหาร ลักษณะการบริโภคอาหารจะส่งผลต่อค่าของไขมันในกระแสเลือด ในผู้ที่
รับประทานอาหารไขมันอิ่มตัว จะมีผลกระทบต่อระดับไขมันอย่างมีนัยสาคัญ ผลจากการเปลี่ยนแปลงรับประทานอาหาร จะเห็น
ได้ชัดเมื่อผ่านไปหลายสัปดาห์แล้ว ดังนั้น ก่อนการตรวจหา cholesterol ในเลือด ผู้ป่วยควรรับประทานอาหารให้เป็นปกติก่อนมา
ตรวจอย่างน้อย 2 สัปดาห์ และต้องไม่ทาให้น้าหนักเพิ่มหรือลด ช่วงเวลาในการรับประทานอาหาร ก็มีผลต่อค่าไขมันในเลือด
พบว่า การรับประทานอาหารในช่วงกลางคืน จะมีผลให้ระดับ TG สูงกว่าการรับประทานอาหารช่วงกลางวัน แต่ระดับของ TC,
HDL และ LDL จะต่ากว่าช่วงกลางวัน
ยารักษาโรค ยาหลายชนิดก็มีผลต่อระดับไขมันในเลือดได้เช่นกัน เช่น ยาคุมกาเนิ ด (oral contraceptive),
postmenopausal estrogens, ยารักษาความดันโลหิตสูงบางชนิด
สภาวะทางสุ ขภาพ ความผิด ปกติ ของร่ างกาย ส่ง ผลให้ มีค วามผิ ด ปกติ ข องไขมั นในเลื อดแบบทุ ติย ภู มิไ ด้
(secondary dyslipoproteinemia) ความผิดปกตินี้ เช่น โรคของต่อมไทรอยด์, ไต, ตับ เป็นต้น (ตารางที่ 1) การจัดการกับภาวะ
ไขมันในเลือดสูงในผู้ป่วยเหล่านี้ คือการรักษาโรคที่เป็นสาเหตุ (underlying disorder) ให้หาย การใช้ชีวิตและปัจจัยทางชีวภาพที่
ทาให้ระดับ ไขมั นในเลื อดเปลี่ย นแปลงชั่วคราว ได้แ ก่ การอดอาหาร, ท่าทาง, venous occlusion, anticoagulant, ภาวะ
กล้ามเนื้อหัวใจตาย (myocardial infarction), stroke, cardiac catheterization, trauma, acute infection และการตั้งครรภ์
ในผู้ป่วยกล้ามเนื้อหัวใจตายเฉียบพลัน จะสามารถตรวจวัดระดับของไขมันในเลือดได้ในช่วง 24 ชั่วโมงแรกเท่านั้น หลังจากนั้น
ระดับของไขมันจะค่อย ๆ ลดลง เป็นเวลาประมาณ 6-8 สัปดาห์ ผู้ป่วยเบาหวานมีความผิดปกติของระดับไขมันในเลือดอย่างมาก
เนื่องจากการมีภาวะ ketosis ผู้ป่วย hypothyroidism มีระดับ ของ TC, HDL และ LDL สู ง แต่ TG สูงเพียงเล็กน้อย มี
ข้อแนะนาว่า การตรวจวัด lipoprotein ไม่ควรกระทาภายในช่วง 8 สัปดาห์หลังจากเกิด trauma หรือการติดเชื้อแบคทีเรียหรือ
ไวรัสแบบเฉียบพลัน

ตารางที่ 1 ปัจจัยที่ส่งผลกระทบต่อไขมันในเลือดและสาเหตุความผิดปกติของไขมันแบบทุติยภูมิ (McPherson, RA et al. 2011)

ชนิดของ lipoprotein สาเหตุทุติยภูมิ ปัจจัยจากการใช้ชีวิต

High TC and high LDL-C Hypothyroidism and nephrotic syndrome Obesity
with or without low Medications such as thiazide diuretics and steroids Excess dietary cholesterol and/or
HDL-C Chronic obstructive liver disease saturated fat
Cholestatic liver disease (primary biliary cirrhosis and related ApoE-4 may increase susceptibility
diseases)
High TGs with normal Medications such as thiazide diuretics, estrogens, Obesity
total and LDL-C with or corticosteroids, retinoids, cyclosporine, and beta-blockers Physical inactivity
without low HDL-C (without intrinsic sympathomimetic) Cigarette smoking
Insulin resistance/diabetes Excess alcohol intake
Chronic renal failure and nephrotic syndrome High-carbohydrate diets
Antipsychotic drugs (clozapine/olanzapine)
High TC and high TG Medications, notably high-dose steroids or cyclosporine Obesity
with or without low Severe hypothyroidism, diabetes/insulin resistance, and HIV antiretroviral drugs
HDL-C nephrotic syndrome
Isolated low HDL-C Medications such as isotretinoin, probucol, anabolic steroids, Physical inactivity
beta blockers, and certain progestogen Increased body weight
High-carbohydrate, low-fat diets
Isolated high HDL-C Medications such as phenytoin, phenobarbital, rifampicin, Alcohol intake
griseofulvin, and estrogens

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 19 3
 2. ชนิดของสิ่งส่งตรวจ
สิ่ง ส่ ง ตรวจที่ ใช้ ส าหรั บ การตรวจวั ด ไขมั น อาจเป็ นได้ทั้ ง เลื อดจากหลอดเลื อดด า (venous) หรื อหลอดเลื อดฝอย
(capillary) หรืออาจเป็นเลือดชนิดพลาสม่า หรือซีรัมก็ได้ แต่สิ่งส่งตรวจต่างชนิดกัน ก็ย่อมให้ผลการตรวจวิเคราะห์ที่แตกต่างกัน
ไป ในกรณีของเลือดจาก capillary และ venous ถึงแม้จะสมมติฐานว่าค่าของไขมันและ lipoproteins จะใกล้เคียงกัน แต่มีบาง
การศึกษาที่เห็นแย้ง กล่าวคือ บางท่านระบุว่า สิ่งส่งตรวจทั้ง 2 ชนิดมีค่า cholesterol สอดคล้องกันประมาณร้อยละ 4 แต่บาง
การศึกษาระบุความแตกต่างของ venous และ capillary ต่อค่า cholesterol ประมาณร้อยละ 8-12 โดยทั่วไป ผลการตรวจ
วิเคราะห์จาก capillary blood มีค่าต่ากว่า venous เล็กน้อย นอกจากนี้ การตรวจเลือดจากปลายนิ้ว มีโอกาสเกิดความผันแปร
ได้มากกว่า venous ที่เวลาดียวกัน ซึ่งอาจเกิดจากความผิดพลาดในกระบวนการก่อนการตรวจวิเคราะห์ (preanalytical error)
ความแตกต่างที่เกิดจากการใช้ plasma และ serum ได้กล่าวไปบ้างแล้วข้างต้น โดยสรุป สามารถใช้ plasma หรือ
serum ในการตรวจหา TC, TG, HDL-C และ LDL-C ได้ แต่กรณีที่ต้องการวิเคราะห์ รูปแบบของ lipoprotein ด้ วยวิ ธี
ultracentrifugation หรือ electrophoresis ควรใช้ plasma จะเหมาะสมกว่า

3. สิ่งรบกวนการตรวจวิเคราะห์
การตรวจวิเคราะห์ไขมันแต่ละชนิด อาจถูกรบกวนได้จากสารรบกวน (Interfering substances) โดยทั่วไป การตรวจ
วิเคราะห์ cholesterol ด้วยวิธีการทางเอนไซม์ มักถูกรบกวนจากสารรบกวนได้น้อยกว่าวิธีการทางเคมี (chemical method)
อย่างไรก็ตาม ในการตรวจวิเคราะห์ด้วย cholesterol oxidase (สมการที่ 12) พบว่า เอนไซม์สามารถทาปฏิกิริยากับ sterols ได้
เช่น plant sterol ที่พบมากในเลือดของผู้ป่วย β-sitosterolemia วิธีการทางเคมีก็ถูกรบกวนได้จากสารนี้เช่นกัน สารรบกวนที่
สาคัญ อี กชนิ ด คื อ ascorbic acid ซึ่ ง มีคุ ณ สมบั ติเ ป็ น reducing agents สามารถไปแย่ งจั บ กับ H2O2 แข่ งกั บ สารเกิ ด สี
(chromogenic substrates) ในสมการที่ 13 ได้ ดังนั้น สิ่งส่งตรวจของผู้ป่วยที่มี ascorbic acid สูง (มากกว่า 30 mg/dL) จะทา
ให้การตรวจวัด cholesterol ต่าลง ผู้ที่ระดับ bilirubin ในเลือดสูง ก็สามารถรบกวนการตรวจวิเคราะห์ได้ เนื่องจาก bilirubin มี
คุณสมบัติดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นเดียวกับปฏิกิริยาตรวจวัด คือ 500 nm ซึ่งดูเหมือนว่า bilirubin ทาให้ค่าการตรวจวิเคราะห์
cholesterol สูงขึ้น แต่ในความเป็นจริง bilirubin ถูก oxidized โดย H2O2 ได้ ทาให้เสียคุณสมบัติการดูดกลืนแสงที่ความยาว
คลื่น 500 nm จึงทาให้ค่าการตรวจ cholesterol ในภาพรวมลดลงกว่าสภาพจริง ทั้งนี้ ปริมาณของ bilirubin ที่มากกว่า 5
mg/dL ทาให้ค่าการตรวจวิเคราะห์ cholesterol ลดลงร้อยละ 5-15 ความขุ่น (turbidity) ของสิ่งส่งตรวจที่เป็นผลมาจาก TG
สูง (hypertriglyceridemia) ก็สามารถรบกวนการตรวจวิเคราะห์ได้ สิ่งส่งตรวจที่มี hemolysis (hemolyzed sample) รบกวน
การตรวจวิเคราะห์ cholesterol ได้จาก hemoglobin (Hb) เนื่องจาก Hb มีคุณสมบัติ pseudo-peroxidase activity สามารถ
ทาปฏิกิริยากับ H2O2 ได้ ซึ่งน่าจะส่งผลให้การตรวจวิเคราะห์ cholesterol ต่าลง แต่ในความเป็นจริง ค่าที่ตรวจได้สูงขึ้น เนื่องจาก
สีของสิ่งส่งตรวจรบกวนการตรวจวิเคราะห์ อย่างไรก็ตาม hemolyzed sample ไม่ได้ทาให้ค่าของ cholesterol เปลี่ยนแปลงไป
อย่างมีนัยสาคัญ ความเป็น linear ของการตรวจวัด ด้วยวิธีเอนไซม์ มักไม่เกิน 600 - 700 mg/dL ของ cholesterol
ในกรณีข องการตรวจวิเคราะห์ TG สารรบกวนก็เ ช่นเดียวกับ การตรวจ cholesterol ได้ แก่ ascorbic acid ซึ่ง มี
คุณสมบัติต้านการเกิดออกซิเดชัน (antioxidant) จึงสามารถรบกวนปฏิกิริยาตรวจวัด TG ที่ใช้ oxidation-reduction reaction
บิลิรูบินรบกวนการตรวจวิเคราะห์ทั้งในแง่การรบกวนการดูดกลืนแสงและสมบัติทางเคมี สิ่งส่งตรวจที่มี hemolysis รบกวนการ
ตรวจวิเคราะห์ TG อย่างมีนัยสาคัญ และอาจทาให้เกิดการเจือจาง lipid ความเป็น linear ของการตรวจวัดด้วยวิธีเอนไซม์ ไม่เกิน
700 mg/dL (7.91 mmol/L) ของระดับ TG นอกจากนี้ เนื่องจาก หลักการตรวจ TG อาศัยการวัด glycerol ซึ่งในภาวะปกติ
glycerol ในเลือดเมื่อเทียบกับ TG มีค่าน้อยกว่า 10 mg/dL จึงไม่มีปัญหาต่อผลการตรวจ แต่ในบางภาวะ เช่น โรคเบาหวาน,
ภาวะเครียดทางอารมณ์ (emotional stress), การฉีดยาหรือสารอาหารที่มี glycerol เป็นองค์ประกอบทางหลอดเลือดดา, การ
ปนเปื้อนของ glycerol ที่อุปกรณ์สาหรับเจาะเก็บเลือด, ไม่เก็บเลือดครบส่วน (whole blood) ในตู้เย็น สามารถทาให้ค่าการ
ตรวจวิเคราะห์ TG ผิดไปจากเดิมอย่างมีนัยสาคัญได้

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 20 4
ข้อควรปฏิบัติโดยสรุปเมื่อตรวจวิเคราะห์ไขมันและ lipoproteins
1. ควรตรวจไขมันและ lipoprotein เมื่อผู้ป่วยอยู่ในสภาวะคงที่ของเมตาบอลิสม (metabolic steady state)
2. ผู้ป่วยควรรักษาการบริโภคอาหารให้เป็นปกติและรักษาน้าหนักให้คงที่เป็นเวลาอย่างน้อย 2 สัปดาห์ก่อนมาตรวจ
3. ควรตรวจวัดหลายครั้งภายใน 2 เดือน อย่างน้อยสัปดห์ละ 1 ครั้ง และควรตรวจก่อนการตัดสินใจทางคลินิก เพื่อการดูแล
ผู้ป่วย
4. ภายใน 24 ชั่วโมงก่อนมาตรวจ ผู้ป่วยไม่ควรทากิจกรรมอย่างหนัก
5. สิ่งส่งตรวจแบบ fasting และ nonfasting สามารถใช้ตรวจ cholesterol และ HDL-C ได้ แต่หากต้องการตรวจ TG
และ lipoprotein อื่น ๆ จาเป็นต้องอดอาหารอย่างน้อย 12 ชั่วโมง
6. ผู้ป่วยควรนั่งพัก 5 นาทีก่อนการเจาะเก็บเลือด
7. ไม่ควรรัด tourniquet นานเกิน 1 นาที
8. ซีรัมหรือพลาสม่า สามารถใช้สาหรับตรวจวิเคราะห์ TC, TG และ HDL-C ได้ เมื่อใช้ EDTA เป็นสารกันเลือดแข็งตัว
พลาสม่าต้องแช่เย็นที่ 2-4C ทันทีเพื่อป้องกันการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างและจะต้องคูณด้วย 1.039
9. สาหรับการตรวจวัด TC ซีรัมควรขนส่งโดยการแช่เย็นที่ 4C หรือ freeze การเก็บสิ่งส่งตรวจสาหรับวัด TC ควรเก็บที่
-20C แต่ถ้าเป็นสิ่งส่งตรวจสาหรับ TG, lipoprotein และ apolipoprotein ควรเก็บที่ -70C หรือต่ากว่า

การตรวจหาระดับไตรกลีเซอไรด์
อาหารไขมันส่วนใหญ่ ประกอบมาจากไตรกลีเซอไรด์ (triglyceride; TG) เป็นหลัก มีเพียงส่วนน้อย คือประมาณร้อยละ
1-2 ที่เป็น cholesterol และไขมันชนิดอื่น ๆ การย่อย TG เริ่มตั้งแต่ในปากและกระเพาะอาหารโดยการทางานของเอนไซม์
lingual lipase และ gastric lipase แต่การย่อยนี้ไม่สาคัญนัก ในทางกลับกัน การย่อยโดยฤทธิ์ของ pancreatic lipase และ
intestinal lipase ในลาไส้เ ล็กมีบ ทบาทมาก เมื่ อ TG ถู กย่ อย จะเกิ ดเป็นผลผลิต คือ กรดไขมั น (fatty acid; FA) และ
monoacylglycerol ซึ่งถูกดูดซึม (absorption) ที่ลาไส้เล็ก แล้วสังเคราะห์ใหม่เป็ น TG ในเซลล์เยื่อบุลาไส้ เพื่อนาไปประกอบ
เป็นมหโมเลกุลเชิงซ้อนร่วมกับ cholesterol และ apolipoprotein B48 (apoB48) เรียกว่า chylomicrons (CM) ลักษณะของ
ซีรัมภายหลังรับประทานอาหารมีสีขาวขุ่นคล้ายน้านม (milky appearance) หรืออาจเรียกว่า lipemia เกิดจาก CM นัน่ เอง
ลักษณะของซีรัมหรือพลาสม่าที่เจาะภายหลังอดอาหาร 12 ชั่วโมง อาจช่วยชี้แนะถึงระดับ TG ได้ กล่าวคือ ลักษณะของ
ซีรัมหรือพลาสม่าที่ใส ระดับของ TG มักน้อยกว่า 200 mg/dL แต่ถ้ามีลักษณะขุ่น (hazy and turbid) ระดับของ TG มักจะ
มากกว่า 300 mg/dL ส่วนลักษณะทึบแสงและขุ่นคล้ายน้านม (จาก CM) ระดับของ TG มักมากกว่า 600 mg/dL
ระดับไตรกลีเซอไรด์ในเลือดมีความสาคัญอย่างยิ่งในการวินิจฉัยแยกภาวะไขมันเลือดสูง และมีความสัมพันธ์อย่างเป็น
อิสระ (independent factor) กับการเกิดภาวะหลอดเลือดแดงแข็ง (atherosclerosis) โดยทั่วไป สามารถประมาณค่าไตรกลีเซอ
ไรด์ทางอ้อมจากไขมันชนิดอื่น ๆ ดังนี้

Triglyceride = Total lipid - phospholipid - cholesterol - cholesterol ester

อย่ างไรก็ ตาม การหาโดยวิธีดั ง กล่ าว อาจไม่ ค่ อยแม่ นยาและเสี ย เวลา เนื่ องจาก ต้ องหาปริ มาณของ total lipid,
phospholipid, cholesterol และ cholesterol ester ด้วย gravimetric method ก่อน และยังคงมีไขมันชนิดอื่น ๆ ที่มิได้
ตรวจวัดอีก จึงทาให้ค่า TG ที่ได้ไม่ถูกต้องนัก ปัจจุบัน จึงเลิกใช้การวัดด้วยวิธีทางอ้อม แต่หันมาใช้การตรวจวัดโดยตรง ซึ่ง ให้ความ
แม่นยากว่า ได้แก่ การวัดด้วยวิธีการทางเอนไซม์ (enzymatic method), colorimetric method และ fluorometric method
ทั้ง 3 วิธีนี้ ใช้หลักการตรวจวัด glycerol ที่ได้มาจากย่อยสลายโมเลกุล TG ดังสมการข้างล่าง

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 21 5
 Triglyceride + 3 H2O → Glycerol + 3 Fatty acid ……………….. (1)

สมการข้างต้นเป็นการ hydrolysis ของ TG ด้วยเอนไซม์ lipase ส่วนวิธี colorimetric ใช้ปฏิกิริยา saponification

(สมการที่ 2) หรือ transesterification

Triglyceride + 3 NaOH → Glycerol + 3 Fatty acid salt (Soap) ……………….. (2)

วิธี colorimetric มีขั้นตอนการทาคร่าว ๆ ดังนี้

1) สกัด TG ด้วยตัวทาละลาย (organic solvent)
2) กาจัด phospholipid ซึ่งมี glycerol อยู่ด้วย และกาจัด chromogens ออกไป อาจใช้วิธี selective adsorption
หรือ direct partition ด้วยสารละลายของ nonane, isopropanol และ diluted H2SO4 เพื่อให้แยก TG ออกจากสารรบกวน
ชนิดอื่น ๆ
3) ใช้ปฏิกิริยา saponification หรือ transesterification เพื่อย่อย TG ให้ได้ glycerol ออกมา
4) วิเคราะห์หาปริมาณ glycerol โดยการ oxidize ให้กลายเป็น formaldehyde และ formic acid
วิธีการของ Van Handel และ Zilversmit ใช้ periodic acid ไป oxidize glycerol ให้กลายเป็น formaldehyde
แล้วทาปฏิกิริยาต่อกับ chromotropic acid (4, 5-dihydroxy-2, 7 naphthalenedisulfonic acid) ในสารละลาย H2SO4 เกิด
เป็นสารประกอบเชิงซ้อนสีชมพู
วิธี Hantzsch condensation reaction เป็นอีกวิธีที่ทาให้เกิดสีด้วยการใส่ ammonium ion และ acetylacetone
รวมตั วกั บ formaldehyde เกิด เป็ นสารประกอบสี เหลื องของ diacetyl lutidine สารประกอบที่เ กิด ขึ้นเป็นอนุ พันธ์ข อง
lutidine ซึ่ง มีคุณ สมบัติ เรืองแสงได้ สามารถนามาประยุกต์ใช้ใ นการตรวจวัดระดับ ด้วยวิ ธี fluorometry ในเครื่องวิเคราะห์
อัตโนมัติได้
วิธีการทางเคมีที่ยังคงใช้อยู่ในปัจจุบัน เป็นวิธีอ้างอิงของ Centers for Disease Control and Prevention (CDC) โดย
ใช้การสกัดด้วยคลอโรฟอร์ม (chloroform) แล้วแยก TG ด้วย silicic acid chromatography ตามด้วยการ hydrolysis ด้วยเบส
(saponification) ปล่อย glycerol ออกมา แล้วถูก oxidized ต่อด้วย sodium periodate ดังสมการที่ 3

Glycerol +NaIO4 → Formaldehyde + Formic acid ……………….. (3)

ต่อมา วัดสาร formaldehyde ที่เกิดขึ้นตามวิธีการของ Van Handel และ Zilversmit กล่าวคือ ให้ทาปฏิกิริยากับ
chromotropic acid ในสารละลาย H2SO4 เกิด เป็น pink chromophore วิ ธีการนี้ ไม่ค่อยจาเพาะต่อ glycerol เนื่ องจาก
formaldehyde อาจเกิดขึ้นได้จากฟอสโฟลิพิดที่มี glycerol เป็นองค์ประกอบ (glycerol-containing phospholipids) จึงต้อง
มี ก ารขจั ด สารรบกวนเหล่ า นี้ อ อกในขั้ นตอนการสกั ด ด้ ว ย chloroform และดู ด ซั บ (adsorption) ด้ ว ย silicic acid
chromatography
วิธีการตรวจวัดระดับ TG ที่เป็นที่นิยม คือ วิธีการทางเอนไซม์ เนื่องจากมี ความจาเพาะ ความรวดเร็ว และความสะดวก
ในการตรวจวิเคราะห์สู ง ไม่ มีปั ญหาจากสารรบกวนจาพวก phospholipid หรือ glucose หลั กการโดยทั่ วไปของวิธีนี้ คื อ
hydrolysis TG ให้ได้กรดไขมันอิสระ (free fatty acid) และ glycerol ดังสมการที่ 1 แล้วทาปฏิกิริยาต่อโดยใช้เอนไซม์ ดังนี้

Glycerol + ATP → Glycerophosphate (G3P) + ADP ……………….. (4)

ผลิตภัณฑ์ที่เกิดขึ้น คือ glycerol-3-phosphate และ ADP สามารถนาไปใช้ตรวจวัดต่อได้ ดังนี้

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 22 6
 Glycerophosphate + NAD → Dihydroxyacetone phosphate
+ NADH + H+ ……………….. (5)

NADH + Tetrazolium dye → Formazan + NAD+ ……………….. (6)

ปริมาณ NADH ที่เกิดขึ้นในสมการที่ 5 เป็นสัดส่วนโดยตรงกับปริมาณของ glycerol และสามารถวัดโดยตรงโดยวัดการ

ดูดกลืนแสงด้วยเครื่อง spectrophotometer ที่ความยาวคลื่น 340 nm หรืออาจทาปฏิกิริยาตามสมการที่ 6 โดยการวัดการ
ดูดกลืนแสงที่ช่วง 500 - 600 nm
glycerophosphate ที่เกิดในปฏิกิริยาดังสมการที่ 4 อาจนามา oxidize ต่อด้วย glycerophosphate oxidase ดังนี้

Glycerophosphate + O2 → Dihydroxyacetone + H2O2 ……………….. (7)

ไฮโดรเจน เปอร์ออกไซด์ (H2O2) ที่เกิดขึ้น สามารถตรวจวัดได้ด้วยการใช้เอนไซม์ peroxidase ดังนี้

2 H2O2 + Phenol + 4-aminoantipyrine → Quinoneimine dye + 4H2O ……………….. (8)

ปฏิกิริยาข้างต้นเกิดจากการใช้ chromogens คือ phenol และ 4-aminoantipyrine ทาปฏิกิริยาควบคู่กับ H2O2 เกิด

เป็น quinoneimine dye สามารถวัดการดูดกลืนแสงได้ที่ความยาวคลื่น 500 nm
วิธีการตรวจวัดอีกวิธี คือ การใช้ adenosine diphosphate (ADP) จากสมการที่ 4 มาวัด ดังสมการที่ 9

ADP + Phosphoenol pyruvate → Pyruvate + ATP ……………….. (9)

Pyruvate + NADH + H+ → Lactate + NAD+ ……………….. (10)

วิธีข้างต้น เป็นการวัดการหายไปของ NADH ที่ความยาวคลื่น 340 nm

ถึงแม้วิธีการทางเอนไซม์มีข้อได้เปรียบมาก แต่ก็มีข้อควรระวัง คือ ต้องใช้ glycerol-free KOH เท่านั้น และเมื่อน้ายา
หมดอายุ ไม่ควรนามาใช้ในการตรวจวิเคราะห์

บทปฏิบัติการที่ 1: การตรวจวัดระดับไตรกลีเซอไรด์ด้วยวิธี lipase

หลักการ: TG ในตัวอย่างตรวจทาปฏิกิริยาด้วยวิธีการทางเอนไซม์แบบควบคู่ (coupled reactions) โดยเริ่มจาก TG ถูก

hydrolyze ด้วย lipase ได้ glycerol ซึ่งจะถูกเอนไซม์ glycerol kinase เร่งปฏิกิริยา phosphorylation เกิดเป็น glycerol-3-
phosphate แล้วถูกออกซิไดซ์โดยเอนไซม์ glycerolphosphate oxidase ได้เป็น H2O2 ต่อมา ทาให้เกิดสีด้วยปฏิกิริยาของ
Trinder โดยการใช้เอนไซม์ peroxidase เร่งปฏิกิริยา oxidation ของ chlorophenol และ 4-aminoantipyrine ได้เป็นสารมีสี
(quinoneimine dye) ซึ่งสามารถวัดการดูดกลืนแสงได้ที่ 500 nm

Triglycerides + H2O → Glycerol + Fatty acids

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 23 7
 Glycerol + ATP → Glycerol-3-phosphate + ADP

Glycerol-3-phosphate + O2 → Dihydroxyacetone phosphate + H2O2

2 H2O2 + 4-Aminoantipyrine + 4-Chlorophenol → Quinoneimine dye + 4 H2O

น้ายา
1. Triglyceride reagent (A) pH 7.0 ประกอบด้วย
Pipes 45 mmol/L
magnesium chloride 5 mmol/L
4-chlorophenol 6 mmol/L
lipase > 100 U/mL
glycerol kinase > 1.5 U/mL
glycerol-3-phosphate oxidase > 4 U/mL
peroxidase > 0.8 U/mL
4-aminoantipyrine 0.75 mmol/L
ATP 0.9 mmol/L
2. Triglycerides Standard (S) ประกอบด้วย Glycerol equivalent to 200 mg/dL (2.26 mmol/L)

วิธีการวิเคราะห์
1. นา reagent ไปบ่มที่ 37ºC นาน 10 นาที
2. เตรียมหลอดทดลอง และปิเปตต์น้ายาตามตารางข้างล่างนี้

น้ายา หลอด blank หลอด standard หลอด unknown

Triglyceride standard - 10 L -
Sample - - 10 L
Reagent A 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

3. เขย่าผสมให้เป็นเนื้อเดียวกัน และบ่มที่อุณหภูมิ 37ºC นาน 30 นาที

4. วัดค่าการดูดกลืนแสงของ standard และ unknown ที่ความยาวคลื่น 500 nm โดยใช้หลอด blank set zero

วิธีการคานวณ
คานวณความเข้มข้นของ unknown โดยเทียบกับ standard (200 mg/dL)

C unknown (mg/dL) = x C standard (mg/dL)

สารรบกวนการตรวจวิเคราะห์
Significant plasma hemolysis, Bilirubin (2.5 mg/dL), plasma ascorbic acid และสารอื่น ๆ

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 24 8
 พิกัดอ้างอิง
ATP III Classification for Triglyceride Values
<150 mg/dL (1.7 mmol/L) Normal
150–199 mg/dL (1.70-2.25 mmol/L) Borderline-high
200–499 mg/dL (2.26-5.64 mmol/L) High
≥500 mg/dL ( 5.65 mmol/L) Very high

การตรวจหาระดับโคเลสเตอรอล
Cholesterol เป็นไขมันที่พบในสัตว์ คนเราได้รับ cholesterol จากอาหารปริมาณน้อย คิดเป็นประมาณร้อยละ 30-40
ส่วนอีกประมาณร้อยละ 70 มาจากการสังเคราะห์โดยเซลล์ของร่างกาย ซึ่งมีบทบาทสาคัญในการเพิ่มความเสี่ยงต่อการเกิดโรค
หลอดเลือดแดงแข็ ง (atherosclerotic disease) cholesterol มี บทบาทส าคั ญยิ่ งในทางชีวภาพ เนื่องจากทาหน้ าที่ เป็ น
โครงสร้างสาคัญของเยื่อหุ้มเซลล์และอนุภาคย่อยในเซลล์ รวมทั้งเป็นสารตั้งต้นของกรดน้าดีและสเตอรอยด์ฮอร์โมน เช่น ฮอร์โมน
เพศ และฮอร์โมนจากต่อมหมวกไต
ในกระแสเลือด cholesterol พบได้ 2 form คือ unesterified ประมาณร้ อยละ 30-40 และ esterified form
ประมาณร้อยละ 60-70 โดยอัตราส่วนของทั้ง 2 form มีความคงที่ในบุคคลผู้มีสุขภาพดี การตรวจวัดระดับ total cholesterol
และ lipoprotein-cholesterol โดยทั่วไป ไม่จาเป็นต้องแยก form ของ cholesterol โดยหลักในการตรวจวิเคราะห์คือ การทา
ให้ esterified cholesterol เกิด hydrolysis แล้วตรวจหา total free cholesterol ต่อไป
วิธีตรวจ cholesterol เป็นได้ทั้ง colorimetric method, fluorometric method, enzymatic method และวิธี
อื่นๆ เช่น gas chromatography, gravimetric method เป็นต้น วิธีที่เป็นที่นิยมในการตรวจสาหรับงานประจาวันคือ วิธีการทาง
เอนไซม์ แต่อย่างไรก็ตาม วิธีที่จัดเป็น reference method ของการตรวจวัด total cholesterol ของ CDC คือ Abell-Kendall
method ซึ่งเป็น colorimetric method
การตรวจวัดโคเลสเตอรอลด้วยวิธี Abell-Kendall
หลักการ: โคเลเตอรอลเอสเธอร์ในตัวอย่างตรวจจะถูก saponified (hydrolyzed) ด้วย Alcoholic KOH กลายเป็น
unesterified cholesterol ต่อมาถูกสกัดด้วย petroleum ether นาส่วนที่สกัดได้ไประเหยแห้ง ตรวจวัด total cholesterol
ด้วย Liebermann-Burchard reaction
Liebermann-Burchard reaction หรือ acetic anhydride test เป็นวิธีการตรวจหา cholesterol โดยใช้น้ายาที่
ประกอบด้วย acetic anhydride, H2SO4 และ acetic acid หลักการเกิดสีด้วยวิธีนี้ คือ โมเลกุลน้าถูกดึงออกจาก cholesterol
ตาแหน่ง C-3 ให้สารมัธยันต์ ซึ่งจะถูก oxidized ต่อ เกิดเป็น 3,5-cholestadiene มีพันธะคู่ 2 พันธะ แล้วทาปฏิกิริยาต่อเกิดเป็น
สารมีสี คือ cholestapolyene carboniums ions
การตรวจวัดโคเลสเตอรอลด้วยวิธีการทางเอนไซม์
การตรวจวัดโคเลสเตอรอลด้วย enzymatic method เป็นวิธีตรวจวัดโดยตรงไม่จาเป็นต้องสกัดโคเลสเตอรอลก่อน และ
มีความจาเพาะสูง หลักการของวิธีนี้ คือ การทาให้ cholesteryl ester ถูก hydrolyzed แล้วหมู่ 3-OH ถูก oxidized ได้เป็น
H2O2 ผลิตภัณฑ์นี้สามารถนาไปตรวจวัดได้เช่นเดียวกับหลักการตรวจวัดกลูโคสด้วยวิธี glucose oxidase

Cholesteryl ester + H2O → Cholesterol + Fatty acid ……………….. (11)

Cholesterol + ½ O2 + H2O → Cholest-4-en-3-one + H2O2 ……………….. (12)

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 25 9
 2 H2O2 + 4-Aminoantipyrine + Phenol → Quinoneimine + 4 H2O ……………….. (13)

วิธีการหนึ่งในการตรวจวัด cholesterol คือ วัดการใช้ออกซิเจน (oxygen consumption) มีข้อดีในแง่ที่การรบกวนจาก

องค์ประกอบของ plasma หรือ serum มีน้อย แต่การตรวจวัดไม่ค่อยสะดวกต่อการใช้กับเครื่องวิเคราะห์อัตโนมัติและจาเป็นต้อง
ใช้เอนไซม์ cholesterol oxidase ปริมาณมาก จึงไม่เป็นที่นิยม วิธีการอื่น คือ วัดปริมาณของ cholest-4-en-3-one ที่ความยาว
คลื่น 240 nm แต่วิธีการตรวจวัดใช้เวลามาก และยากต่อการทา จึงไม่เหมาะที่จะใช้ในการตรวจในงานประจาวัน
การตรวจวั ด H2O2 ที่ เ กิ ด ขึ้ น ดั ง สมการที่ 12 เป็ นวิ ธีการที่ นิย ม โดยให้ ท าปฏิ กิ ริ ย าออกซิ เ ดที ฟ แบบควบคู่ กั บ
chromogenic substances 2 ชนิด มีเอนไซม์ peroxidase (นิยมใช้ horseradish peroxidase; HRP) เป็นตัวเร่งปฏิกิริยา เกิด
เป็นสารมีสีที่สามารถวัดการดูดกลืนแสงที่ 500 nm ได้ อย่างไรก็ตาม การใช้เอนไซม์ HRP อาจมีการรบกวนจากสารต่าง ๆ ในสิ่ง
ส่งตรวจได้

บทปฏิบัติการที่ 2: การตรวจวัดระดับโคเลสเตอรอลรวมด้วยวิธี cholesterol oxidase

หลัก การ: Cholesterol ester ในตัวอย่างตรวจ ถูก hydrolyzed โดยเอนไซม์ cholesterol esterase ได้ เป็ น
cholesterol อิสระ แล้วทาปฏิกิริยาต่อโดยมีเอนไซม์ cholesterol oxidase ไปเร่งการออกซิไดซ์ cholesterol อิสระ ได้เป็น
H2O2 ออกมา สามารถน าไปตรวจวั ด การเกิ ด สี ไ ด้ โ ดยการใช้ เ อนไซม์ peroxidase ไปเร่ ง ปฏิ กิริ ย า oxidation โดยมี 4-
aminoantipyrine และ phenol วัดการดูดกลืนแสงที่ 500 nm

Cholesterol ester + H2O → Cholesterol + Fatty acid

Cholesterol + ½ O2 + H2O → Cholestenone + H2O2

2 H2O2 + 4-Aminoantipyrine + Phenol → Quinoneimine + 4 H2O

น้ายา
1. Cholesterol reagent (A) pH 7.0 ประกอบด้วย
Pipes 35 mmol/L
sodium cholate 0.5 mmol/L
phenol 28 mmol/L
cholesterol esterase > 0.2 U/mL
cholesterol oxidase > 0.1 U/mL
peroxidase > 0.8 U/mL
4-aminoantipyrine 0.5 mmol/L
2. Cholesterol Standard (S) ประกอบด้วย Cholesterol 200 mg/dL (5.18 mmol/L)

วิธีการวิเคราะห์
1. นา reagent ไปบ่มที่ 37ºC นาน 10 นาที
2. เตรียมหลอดทดลอง และปิเปตต์น้ายาตามตารางต่อไปนี้

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 26 10
 น้ายา หลอด blank หลอด standard หลอด unknown
Cholesterol standard (S) - 10 L -
Sample - - 10 L
Reagent A 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL
3. เขย่าผสมให้เป็นเนื้อเดียวกัน บ่มที่อุณหภูมิ 37ºC นาน 30 นาที
4. วัดค่าการดูดกลืนแสงของ standard และ unknown ที่ความยาวคลื่น 500 nm โดยใช้หลอด blank set
zero

วิธีการคานวณ
คานวณความเข้มข้นของ unknown โดยเทียบกับ standard (200 mg/dL)
C unknown (mg/dL) = x C standard (mg/dL)

สารรบกวนการตรวจวิเคราะห์
Lipemia (triglycerides 10 g/L) does not interfere.
Hemoglobin (>5 g/L), Bilirubin (>10 mg/dL), plasma ascorbic acid และสารอื่น ๆ สามารถรบกวนได้

พิกัดอ้างอิง
ATP III Classification for Total Cholesterol Values
<200 mg/dL (5.2 mmol/L) Desirable
200–239 mg/dL (5.2-6.21 mmol/L) Borderline high
≥240 mg/dL (6.24 mmol/L) High

การตรวจหาระดับเอชดีแอล
HDL เป็น lipoprotein ชนิดหนึ่ง นอกเหนือจาก LDL, VLDL และ IDL โมเลกุลของ HDL มี cholesterol เป็ น
องค์ประกอบคิดเป็นประมาณร้อยละ 20-30 ของ serum cholesterol ปริมาณของ HDL ที่ลดลงมีความสัมพันธ์กับปัจจัยเสี่ยงต่อ
โรคหลอดเลือดหัวใจ แม้ว่าปริมาณโคเลสเตอรอลรวมปกติก็ตาม HDL มีบทบาทหลักในเมตาบอลิสมของไขมันในวิถี reverse
cholesterol transport ซึ่งเป็นการนาเอา cholesterol จากเนื้อเยื่อส่วนปลาย (peripheral tissues) ไปยังตับเพื่อการขับทิ้งใน
รูปของน้าดี เป็นผลให้ลดปริมาณการสะสมของ cholesterol ในผนังหลอดเลือดลง HDL จึงได้รับการขนานนามถึงสรรพคุณว่า
เป็น cardioprotective cholesterol ระดับของ HDL ในเลือดเป็นปฏิภาคผกผันกับความเสี่ยงของหลอดเลือดแดงแข็งและโรค
หลอดเลือดหัวใจ
วิธีอ้างอิงของ CDC สาหรับการตรวจวัด HDL-C ประกอบด้วย 1) การกาจัดเอา lipoprotein ชนิดอื่น ๆ ออกไปด้วยวิธี
ultracentrifugation เหลือแต่เพียง HDL และ LDL 2) ตกตะกอนเอา lipoprotein ที่ประกอบด้วย apolipoprotein B เช่น
LDL, IDL ด้วยวิธีการทางเคมี (chemical precipitation) 3) วัดปริมาณ cholesterol จาก HDL ที่เหลืออยู่ด้วยวิธี Abell and
Kendall แต่ วิธีการตกตะกอนดังกล่ าวนี้ มีความยุ่งยาก เครื่องมือราคาแพง และต้องใช้ตัวอย่างตรวจปริมาณมาก จึงได้มีการ
พัฒนาวิธีการตกตะกอนที่ใช้ 50 kDa dextran sulfate และ Mg2+ ไปตกตะกอนเอา lipoprotein ชนิดอื่น ๆ ออกไป เหลือแต่
เพียง HDL วิธีการนี้จัดเป็น selective precipitation method

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 27 11
 วิธี Ultracentrifugation หรือปั่นเหวี่ยงความเร็วสูงยิ่งยวด นามาใช้แยกชนิดของ lipoproteins ได้โดยอาศัยหลักการ
ที่ว่า lipoproteins มีความหนาแน่นน้อยกว่ามหโมเลกุลอย่างอื่นในพลาสม่า และ lipoproteins ต่างชนิดกัน มีความหนาแน่น
ต่างกัน อัตราส่วนของไขมัน โดยเฉพาะ TG ร่วมกับโปรตีน เป็นตัวบ่งถึงความหนาแน่นของ lipoproteins แต่ละชนิด กล่าวคือ
VLDL และ CM มีปริมาณของไขมันในโมเลกุลมาก (lipid-rich lipoprotein) ทาให้มีความหนาแน่นน้อยกว่า 1.006 kg/L เมื่ออยู่
ใน plasma จะลอยตัวขึ้น กรณีของ LDL มีขนาดเล็กและองค์ประกอบภายในโมเลกุลน้อย จึงทาให้มีความหนาแน่นอยู่ในช่วง
1.006-1.063 kg/L ส่วน HDL นั้น จัดเป็น lipoproteins ที่มีความหนาแน่นมากที่สุด ประมาณ 1.063-1.210 kg/L เมื่อนา
lipoproteins เหล่านี้ไปปั่นเหวี่ยงด้วยความเร็วสูงยิ่งยวด จะเห็นการแยกเป็นชั้นต่าง ๆ ตามความหนาแน่น
วิธีตกตะกอนด้วย Polyanion (Polyanion Precipitation Methods) จัดเป็นวิธีการทางเคมี สาร polyanions เช่น
heparin sulfate, dextran sulfate, phosphotungstate และสารอื่น ๆ สามารถตกตะกอน lipoproteins บางชนิดได้ในภาวะ
ที่มี divalent cations เช่น Ca2+, Mg2+, Mn2+ อยู่ด้วย วิธีนี้สามารถแยกเอา lipoproteins อื่นที่มี apoB อยู่ในโมเลกุลออกจาก
HDL ได้ เนื่องจากมีความแตกต่างกันในด้านความหนาแน่นและองค์ประกอบของไขมันภายในโมเลกุล
การตรวจวัดระดับ HDL-C ตามวิธีของ Burnstein และคณะ มีการใช้ phosphotunstate-Mg2+ เพื่อไปตกตะกอนเอา
lipoproteins ชนิดอื่น ๆ ออกไป อีกวิธี คือ วิธี Lipid Research Clinic Program ของ National Institute of Heart (INH) ใช้
heparin-Mn2+ เป็นตัวตกตะกอนเอา non-HDL ออกไป
ปั จ จุ บั น มี ก ารพั ฒ นาวิ ธี ใ ห้ เ หมาะต่ อ งานประจ าวั น มากขึ้ น โดยการใช้ กับ เครื่ อ งวิ เ คราะห์ อั น โนมั ติ ไ ด้ เรี ย กว่ า
homogeneous assay หรือ direct HDL method วิธีนี้เป็นที่นิยมมาก ไม่จาเป็นต้องตกตะกอนเอา non-HDL ออกไปก่อน ซึ่ง
ทาให้มีความสะดวกในการทดสอบ ลดเวลา และราคาของการทดสอบ หลักการโดยทั่วไป คือ การทาให้น้ายาชนิดแรกจับเป็ น
สารประกอบเชิงซ้อนกับ non-HDL lipoproteins เพื่อป้องกันไม่ให้เข้าไปยุ่งเกี่ยวกับปฏิกิริยาในการตรวจวัด ขั้นต่อไป คือ น้ายา
ชนิดที่สอง ทาปฏิกิริยากับ cholesterol จาก HDL องค์ประกอบของน้ายาสาหรับ block non-HDL ไม่ให้มาทาปฏิกิริยา ได้แก่
สารจาพวก detergents, specific polymers, surfactants หรือ antibody จากการสารวจของ College of American
Pathologists ในปี ค.ศ. 2005 พบว่า วิธีที่เป็นที่นิยมมาก คือ การใช้ synthetic polymer ร่วมกับ polyanion ไปจับกับตาแหน่ง
บนอนุภาค LDL และ VLDL เพื่อ block non-HDL lipoproteins เหล่านี้ แล้วจึงใช้ selective detergent, enzymes และ
substrate เข้าทาปฏิกิริยากับ HDL-C ในตัวอย่างตรวจ วิธีการอย่างอื่น เช่น ใช้ polyethylene glycol-modified enzyme หรือ
immunoinhibition เพื่ อ block non-HDL lipoproteins แล้วจึ งปล่ อยให้ HDL-C ทาปฏิกิริ ยาการตรวจวัด ด้ วยเอนไซม์
antibody ที่นามาใช้ เป็นชนิดที่ต่อต้านกับ apolipoprotein B-100 เพื่อจับกับอนุภาคของ LDL และ VLDL วิธีการเหล่านี้ มักไม่
ค่อยถูกรบกวนจากปริมาณไตรกลีเซอไรด์, บิลิรูบิน และ globulins

บทปฏิบัติการที่ 3: การตรวจวัดระดับ HDL-C โดยวิธีตกตะกอน

หลักการ: VLDL และ LDL ถูกตกตะกอน (precipitate) ด้วย phosphotungstate และ magnesium ions ก่อน ส่วน
น้าใสที่เหลือ (supernatant) มี HDL อยู่ นาไปตรวจต่อด้วยวิธีการเช่นเดียวกับ total cholesterol ดังปฏิกิริยาข้างล่าง

Cholesterol ester + H2O → Cholesterol + Fatty acid

Cholesterol + ½ O2 + H2O → Cholestenone + H2O2

2 H2O2 + 4-Aminoantipyrine + Phenol → Quinoneimine + 4 H2O

น้ายา

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 28 12
 1. HDL-C reagent (A) ประกอบด้วย
Phosphotungstate 0.4 mmol/L
magnesium chloride 20 mmol/L
2. HDL-C Standard (S) ประกอบด้วย Cholesterol 15 mg/dL

วิธีการวิเคราะห์
1. เตรียม centrifuge tube และปิเปตต์น้ายาตามตารางข้างล่างนี้
Sample 0.2 mL
Reagent (A) (Cholesterol HDL kit) 0.5 mL

2. เขย่าผสมให้เป็นเนื้อเดียวกัน และตั้งทิ้งไว้ที่ room temperature นาน 10 นาที

3. นาไปปั่นเหวี่ยงด้วยความเร็ว 4000 rpm เป็นเวลานาน 10 นาที
4. เก็บส่วน supernatant ด้วยความระมัดระวัง
5. นาน้ายาสาหรับตรวจวัด cholesterol ไปไว้ที่อุณหภูมิ 37ºC นาน 10 นาที
6. เตรียมหลอดทดลอง และปิเปตต์น้ายาตามตารางข้างล่าง

น้ายา หลอด blank หลอด standard หลอด unknown

Distilled water 100 L
Cholesterol standard (S) - 100 L -
Sample - - 100 L
Reagent A 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL
7. เขย่าผสมให้เป็นเนื้อเดียวกัน และบ่มที่อุณหภูมิ 37ºC นาน 30 นาที
8. วัดค่าการดูดกลืนแสงของ standard และ unknown ที่ความยาวคลื่น 500 nm โดยใช้หลอด blank set
zero

วิธีการคานวณ
คานวณความเข้มข้นของ unknown โดยเทียบกับ standard (15 mg/dL)
C unknown (mg/dL) = x C standard (mg/dL) x Sample dilution factor

สารรบกวนการตรวจวิเคราะห์
Lipemia (triglycerides 10 g/L) does not interfere
Bilirubin (10 mg/dL) and hemoglobin (5 g/L) may intefere. Other drugs and substances may interfere

พิกัดอ้างอิง
ATP III Classification for HDL Cholesterol Values
<40 mg/dL (5.2 mmol/L) Low
≥60mg/dL (5.2-6.21 mmol/L) High

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 29 13
การตรวจหาระดับแอลดีแอล
LDL-cholesterol ประกอบด้วย cholesterol ประมาณร้อยละ 60 ของ serum cholesterol ระดับของ LDL ที่สูงขึ้น
มีความสัมพันธ์อย่างมากกับปัจจัยเสี่ยงต่อการเกิดภาวะหลอดเลือดแดงแข็ง และจัดเป็น atherogenic lipoproteins หมายถึง
lipoprotein ที่เป็นปัจจัยทาให้เกิดหลอดเลือดแดงแข็ง LDL จึงเป็นเป้าหมายอย่างหนึ่งในการรักษาภาวะไขมันในเลือดสูง ระดับ
LDL ที่สูงขึ้น มีความสัมพันธ์สอดคล้องกับภาวะอ้วน (obesity), การรับประทานอาหารคาร์โบไฮเดรตมาก, โรคเบาหวาน, ขาดการ
ออกกาลังกาย, สูบบุหรี่ และได้รับยาบางชนิด โดยทั่วไป หากระดับ LDL-C มากกว่า 160 mg/dL และไม่มีปัจจัยเสี่ยงอย่างอื่น จะ
ถือว่าเป็นข้อบ่งชี้ในการรักษา แต่ถ้าหากมีปัจจัยเสี่ยงตั้งแต่ 2 อย่างขึ้นไป ระดับ LDL ที่มากกว่า 130 mg/dL จะถือว่าเป็นข้อบ่งชี้
สาหรับการรักษา
การตรวจวัดระดับ LDL มีอยู่ด้วยกันหลายวิธีการ วิธีแรกที่จะกล่าวถึง ถือเป็นวิธีอ้างอิง คือ β-quantification มีหลักการ
คือ แยก VLDL และ CM ออกจากสิ่งส่งตรวจด้วยวิธี ultracentrifugation ก่อนที่ความเร็ว 105 K x g เป็นเวลาอย่างน้อย 18
ชั่วโมง แล้ววิเคราะห์หาปริมาณ cholesterol ในส่วน infranatant ต่อมาตกตะกอนเอา LDL ออกด้วยวิธีอ้างอิงของ CDC ตรวจ
วิเคราะห์หาระดับ HDL-C นามาคานวณหาค่า LDL-C ตามสมการข้างล่าง

[LDL-C] = [Total cholesterol in infranatant] - [HDL-C]

[VLDL-C] = [Total cholesterol in serum] - [Total cholesterol in infranatant]

สาหรับการตรวจในงานประจาวัน มีการใช้ Friedewald formula ซึ่งอธิบายเริ่มแรกโดย Friedewald, Levy และ

Fredrickson เมื่อปี ค.ศ. 1972 มาคานวณเพื่ อหาค่ า LDL-C โดยที่ ความเข้มข้นของแต่ ละค่ามีห น่วยเป็ น mmol/L และ
Triglyceride/2.175 หมายถึง VLDL-C ดังสมการ

[LDL-C] = [Total cholesterol] - [HDL-C] - [Triglyceride]/2.175

ในกรณีที่ความเข้มข้นของแต่ละค่า มีหน่วยเป็น mg/dL สมการจะเปลี่ยนใหม่เป็น

[LDL-C] = [Total cholesterol] - [HDL-C] - [Triglyceride]/5

อย่างไรก็ตาม Friedewald formula มีข้อจากัดที่สาคัญ ได้แก่

1) ไม่สามารถใช้ได้ในกรณีที่ ระดับ TG มากกว่า 400 mg/dL เนื่องจาก เมื่อระดับของ TG ในเลือดสูงขึ้น จะมีผลทาให้
ค่า VLDL-C สูงเกินจริง ระดับของ TG ที่น้อยกว่า 200 mg/dL จะทาให้การคานวณหาค่า LDL-C ใกล้เคียงกับวิธีอ้างอิงมากที่สุด
2) ไม่ สามารถใช้ ได้ในกรณี ที่สิ่งส่ งตรวจนั้นมาจากผู้ป่วยที่มิไ ด้อดอาหารมาก่ อน (nonfasting samples) ผู้ ที่มี CM
ปรากฏในสิ่งส่งตรวจ เนื่องจากใน CM มีอัตราส่วนของ TG/cholesterol มากกว่าใน VLDL การใช้ค่า TG/5 ในสมการ เพื่อให้
หมายถึง non-HDL, non-LDL อาจทาให้ค่า cholesterol ใน VLDL สูงเกินจริง และในที่สุด ทาให้ LDL-C ต่าลงกว่าจริง
3) ไม่สามารถใช้ได้ในกรณีของผู้ป่วย type 3 hyperlipoproteinemia อาจทาให้คานวณหาค่า LDL-C สูงเกินจริง ซึ่งจะ
มีผลต่อการรักษาได้
4) ไม่ควรใช้ในผู้ป่วยที่เป็นเบาหวาน เนื่องจาก ผู้ป่วยกลุ่มนี้มีความผิดปกติในเมตาบอลิสมของ TG ส่งผลต่ออัตราส่วน
ระหว่าง TG/cholesterol ใน VLDL เปลี่ยนแปลงไป
เนื่ องจากข้ อจากั ด ต่าง ๆ ของการวิ เคราะห์ ห าระดับ LDL-C จึ งได้ มีการพั ฒ นาวิ ธีการตรวจโดยตรง (direct LDL
method) ซึ่งทาได้หลายวิธี ได้แก่
1) Immunoseparation (IS) อาศัยการใช้ antibody ที่จาเพาะต่อ antigenic determinant ของ apolipoproteins
บนอนุภาค CM, VLDL, IDL และ HDL (apo A-I และ apo E) ซึ่งจับอยู่กับ polystyrene latex

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 30 14
 2) Homogeneous assay มีหลักการคล้ายกับของ HDL-C จุดเด่นสาคัญ คือ สามารถใช้กับเครื่องวิเคราะห์อัตโนมัติได้
น้ายาประกอบด้ วย detergent และสารเคมีต่างชนิดกั น ซึ่งมีห น้าที่ block หรือ solubilize lipoprotein ชนิดต่าง ๆ แล้ ว
สามารถทาปฏิกิริยาตรวจวัด cholesterol ใน cuvette เดียวกันได้ ตัวอย่างของวิธีตรวจวัด เช่น
2.1 Kyowa Medex: หลักการตรวจวั ดประกอบด้วยน้ายา 2 ชนิด ชนิดแรกประกอบด้วย MgCl2, dye,
buffer (pH 6.75) และ -cyclodextrin sulfate ซึ่งมีประจุลบจานวนมาก สามารถไปปิดบัง cholesterol ใน CM และ VLDL
ในภาวะที่มี Mg2+ ได้ น้ายาชนิดที่ 2 ประกอบด้วย cholesterol oxidase, cholesterol esterase, peroxidase, dye, buffer
(pH 6.75), และ polyoxyethylenepolyoxypropylene block polyether (POE-POP) สาหรับไป block cholesterol
โดยเฉพาะใน HDL

(4-AA = 4-aminoantipyrene; HSDA = N-(2- hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline, sodium salt)

2.2 Daiichi Pure: น้ ายาชนิด ที่ 1 ประกอบด้ วย ascorbic acid, oxidase, 4-aminoantipyrene,
peroxidase, cholesterol oxidase, cholesterol esterase, buffer (pH 6.3) และ detergent ที่สามารถ solubilizes non-
LDL lipoproteins ได้ น้ายาชนิดที่ 2 ประกอบด้วย N,N-bis-(4-sulfobutyl)-mtoluidine disodium salt, buffer (pH 6.3)
และ detergent จาเพาะ ที่สามารถปล่อย cholesterol ออกจากอนุภาค LDL ได้ ปฏิกิริยาการเกิด สี เป็นผลมาจากการท า
ปฏิกิริยาชอง H2O2 กับ N,N’-bis-(4-sulfobutyl)-m-toluidine disodium salt ให้สารที่มีสี วัดการดูดกลืนแสงได้ที่ความยาว
คลื่น 546 nm

การตรวจวิเคราะห์อื่น ๆ
การตรวจวิเคราะห์ส าหรับ ไขมันและ lipoproteins ยังมี อีกเป็นจานวนมาก ในที่นี้ จะได้นาเสนอแต่เพี ยงการสังเกต
ลักษณะของสิ่งส่งตรวจ เพื่อใช้เป็นตัวชี้แนะถึงความผิดปกติของผู้ป่วย การสังเกตุลักษณะของ serum หรือ plasma จาเป็นต้อง
กระทาในวันที่เจาะเก็บเลือด ผู้ป่วยควรปฎิบัติเช่นเดียวกับการตรวจไขมันอย่างอื่น คือ งดอาหารอย่างน้อย 12 ชั่วโมง เมื่อเจาะเก็บ
เลือดแล้ว นาไปปั่นอย่างน้อย 15 นาที แบ่งเลือดใส่หลอดทดลองขนาด 10 x 75 mm ปริมาณ 2 mL ตั้งทิ้งไว้ใน rack ให้ตรงและ
ห้ามกระทบกระเทือน เป็นเวลาประมาณ 18 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 4C เมื่อครบเวลานามาสังเกตลักษณะโดยใช้กระดาษสีดาเป็นพื้น
หลัง โดยพิจารณาตามลักษณะดังต่อไปนี้
1. ซีรัมใส หมายถึง สิ่งส่งตรวจมีระดับไขมันปกติ หรืออาจมี lipoproteins อย่างอื่นเพิ่มขึ้น เช่น β-lipoproteins, -
lipoproteins เป็นต้น
2. ซีรัมด้านล่างใส ด้านบนมีลักษณะขุ่นลอยเป็นฝ้า (floating cream layer) หมายถึง สิ่งส่งตรวจมี chylomicron
3. ซีรัมขุ่นทั้งหลอด หมายถึง มี endogenous TG พบได้ใน type III, IV hyperlipoproteinemia
4. ซีรัมด้านล่างขุ่น ด้านบนมีลักษณะขุ่นลอยเป็นฝ้า หมายถึง มีทั้ง chylomicron และ endogenous triglyceride

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 31 15
 บันทึกผลปฏิบัติการ

ชือ่ -สกุล……………………………………………………………………….. รหัส………………………………………………..

ปฏิบัติการที่ 1: Triglyceride
Standard Unknown ……………… Unknown ………………
Absorbance
Concentration (mg/dL)

ผลการทดลอง
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
วิจารณ์และสรุปผลการทดลอง
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

ปฏิบัติการที่ 2: Total cholesterol

Standard Unknown ……………… Unknown ………………
Absorbance
Concentration (mg/dL)

ผลการทดลอง
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
วิจารณ์และสรุปผลการทดลอง
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 32 16
คาถามท้ายปฏิบัติการ
1. ผู้ป่วยที่เข้ารับการตรวจวัดไขมันจาเป็นต้องอดอาหารอย่างน้อย 12 ชั่วโมง คากล่าวนี้ถูกต้องหรือไม่ จงอธิบายอย่างละเอียด
หากจาเป็นต้องอดอาหาร เป็นเพราะสาเหตุใด หากไม่จาเป็น เป็นเพราะสาเหตุใด
2. สารกันเลือดแข็งชนิดใดที่เป็นที่นิยมในการตรวจ lipid และ lipoprotein เพราะเหตุใด
3. การตรวจวิเคราะห์ triglyceride ด้วยวิธีการทางเอนไซม์ จะไม่ถูกรบกวนจาก glucose หรื phospholipid แต่ถูกรบกวนได้
จาก glycerol ที่มีอยู่แล้วในร่างกาย การรบกวนนี้มีผลทาให้ค่าการตรวจ triglyceride เป็นอย่างไร และจะมีวิธีการแก้ไข
อย่างไร
4. ผลการตรวจ total cholesterol ของผู้ป่วยรายหนึ่งมีค่าเท่ากับ 350 mg/dL, triglyceride เท่ากับ 250 mg/dL และ HDL-
C เท่ากับ 45 mg/dL จงคานวณหา LDL-C และแปลผลการตรวจตามเกณฑ์ของ NCEP ATP III
5. จงบอกประโยชน์ และข้อจากัดของการใช้ Friedewald formula
6. จงบอกหลักการตรวจวัดไขมันและ lipoprotein (TG, TC, HDL-C, LDL-C)
7. จงบอกความสาคัญของการตรวจวัดไขมันและ lipoprotein

บรรณานุกรม
1. ไพโรจน์ ลีฬหกุล, บังอร ณ พัทลุง, บรรณาธิการ. แนวทางการตรวจทางห้องปฏิบัติการเคมีคลินิก สาหรับภาวะผิดปกติของ
ระดั บไขมันในหลอดเลื อด. กรุ งเทพฯ: กรมวิ ทยาศาสตร์การแพทย์ กระทรวงสาธารณสุข และคณะเทคนิ คการแพทย์
มหาวิทยาลัยมหิดล; 2544.
2. พิไลพรรณ ศิริพฤกษ์พงษ์. ชีวเคมีของลิปิดและโรคหลอดเลือดหัวใจ. กรุงเทพฯ: สานักพิมพ์มหาวิทยาลัยธรรมศาสตร์ ; 2556.
3. สุนทรี ตันตระรุ่งโรจน์, ศรีสนิท อินทรมณี, บรรณาธิการ. คู่มือปฏิบัติการเคมีคลินิก 1. กรุงเทพฯ: ภาควิชาเคมีคลินิก คณะ
เทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยมหิดล; 2552.
4. Arneson W, Brickell J, editors. Clinical chemistry: A laboratory perspective. Philadelphia: F. A. Davis; 2007.
5. Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, Sawyer BG, editors. Tietz fundamental of clinical chemistry. 6 th ed. St.
Louis: Saunders Elsevier; 2008.
6. McPherson RA, Pincus MR, editors. Henry’s clinical diagnosis and management by laboratory methods.
22nd ed. Philadelphia, Pa: Elsevier Saunders; 2011.
7. Turgeon ML. Linne & Ringsrud’s clinical laboratory science: the basics and routine techniques. 6th ed.
Maryland Heights, MO: Mosby; 2011.
8. Nauck M, Warnick GR, Rifai N. Methods for measurement of LDL-cholesterol: a critical assessment of direct
measurement by homogeneous assays versus calculation. Clin Chem 2002;48(2):236-54.
9. Yücel D, Dalva K. Effect of in vitro hemolysis on 25 common biochemical tests. Clin Chem 1992;38(4):575-
7.
10. เอกสารประกอบน้ายาของ BioSystems S.A.

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 33 17
 การตรวจวิเคราะห์เครื่องหมายชี้บ่งโรคหัวใจ

อ. ทนพ. สุวิทย์ คล่องทะเล

สาขาวิชาเคมีคลินิก
คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยเวสเทิร์น

บทนา
การวินิจฉัยโรคหัวใจที่ใช้การตรวจทางห้องปฏิบัติการเคมีคลินิกช่วยชี้แนะหรือแยกโรค มักเป็นโรคกล้ามเนื้อหัวใจตาย
จากการขาดเลือด (acute myocardial infarction) และโรคหัวใจล้มเหลว (heart failure) โดยการตรวจเพื่อบ่งชี้ความเสี่ยงของ
โรคเหล่ านี้ คือ การตรวจวิ เคราะห์ระดับไขมันในเลือด ได้แก่ total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low-density
lipoproteins (LDL) และ high-density lipoproteins (HDL) แต่ผลการตรวจมิได้ช่วยวินิจฉัยภาวะที่แท้จริงของโรค เป็นเพียง
การบ่งชี้ถึงความเสี่ยง และอาจมีผลต่อการตัดสินใจทางคลินิก การตรวจเครื่องหมายชี้บ่งโรคหั วใจ หรือ cardiac marker มี
บทบาทมากกว่า lipid profile ในแง่ของการวินิจฉัยโรคหัวใจ และยังช่วยพยากรณ์โรคและติดตามการรักษาได้อีกด้วย

บทปฏิบัติการ: การตรวจวัดระดับครีอะทีนไคเนส

Creatine kinase (CK) เป็นเอนไซม์ที่พบใน cytoplasm และใน mitochondria มีหน้าที่เกี่ยวข้องกับพลังงานที่ใช้ใน

การหดตัวของกล้ามเนื้อ รวมถึงกล้ามเนื้อหัวใจ การเพิ่มขึ้นของ CK ไม่ได้จาเพาะต่อโรคกล้ามเนื้อหัวใจขาดเลือด เนื่องจากพบได้
ในเนื้อเยื่อหลายชนิด จึงมีการตรวจวัด CK isoenzyme เพื่อเพิ่มความจาเพาะให้มากขึ้น
หลั ก การ: เอนไซม์ creatine kinase (CK) เร่ง ปฏิกิริ ยา phosphorylation ของ ADP ในภาวะที่ มี creatine
phosphate ได้ ATP และ creatine เป็นผลิตภัณฑ์ แล้ว phosphorylation glucose โดยใช้ ATP ภายใต้การเร่งปฏิกิริยาของ
hexokinase เกิ ด เป็ น glucose-6-phosphate ถู ก ออกซิ ไ ดซ์ ต่ อ ด้ ว ยการเร่ ง ของเอนไซม์ glucose-6-phosphate
dehydrogenase (G6PD) เกิดเป็น NADPH วัดการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 340 nm ปริมาณของ NADPH ที่เกิดขึ้นเป็น
ปฏิภาคโดยตรงกับ activity ของ creatine phosphate

Creatine phosphate + ADP → Creatine + ATP

ATP + Glucose → ADP + Glucose - 6 - phosphate

Glucose - 6 - phosphate + NADP+ → 6 - Phosphogluconate + NADPH + H+

นายา
1. Reagent A pH 6.7 ประกอบด้วย
Imidazol 125 mmol/L
EDTA 2 mmol/L
magnesium acetate 12.5 mmol/L

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 34 1
 D-glucose 25 mmol/L
N-acetyl cysteine 25 mmol/L
hexokinase 6000 U/L
NADP 2.4 mmol/L
2. Reagent B ประกอบด้วย
Creatine phosphate 250 mmol/L
ADP 15 mmol/L
AMP 25 mmol/L
P1,P5-di(adenosine-5'-)pentaphosphate 102 μmol/L
glucose-6-phosphate dehydrogenase 8000 U/L
3. Working reagent
ผสม reagent A และ reagent B ให้เข้ากันด้วยอัตราส่วน 4:1 ผสมให้เข้ากัน เก็บให้ห่างจากแสง
น้ายายังคงเสถียรอยู่ได้นาน 15 วัน ที่ 2-8ºC

วิธีการวิเคราะห์
1. นา reagent ไปบ่มที่ 37ºC นาน 10 นาที
2. ปิเปตต์ตัวอย่างตรวจ 50 μL ลงในหลอดทดลอง
3. ผสมน้ายา (working reagent) 1 mL ลงในหลอดทดลองที่มีตัวอย่างตรวจ เขย่าให้เข้ากันแล้ววัดการดูดกลืนแสงที่
340 nm ทันที จับเวลา
4. บันทึกการดูดกลืนแสงที่ 3 นาที และทุกๆ 1 นาที หลังจากนี้ เป็นเวลา 3 นาที
5. คานวณหาความแตกต่างของช่วงค่าการดูดกลืนแสง และค่าการดูดกลืนแสงเฉลี่ยต่อนาที (A/min)

วิธีการคานวณ
คานวณความเข้มข้นของ unknown
A/min x = U/L

เมื่อ molar absorbance () ของ NADPH ที่ 340 nm = 6300,

lightpath (l) = 1 cm
total reaction volume (Vt) = 1.05
sample volume (Vs) = 0.05
1 U/L = 16.67 nkat/L

สารรบกวนการตรวจวิเคราะห์
Bilirubin (< 20 mg/dL) and hemoglobin (< 10 g/L) do not interfere.
สิ่งส่งตรวจที่มี hemolysis ทาให้เกิด false positive ได้จากเอนไซม์ adenylate kinase ที่มีอยู่ในเม็ดเลือดแดง ทาให้
ระดับของ ATP ในปฏิกิริยาการตรวจวัดสูงขึ้น นอกจากนี้ hemolysis ยังทาให้การอ่านค่าการดูดกลืนแสงของปฏิกิริยาที่ความยาว
คลื่นในช่วง 300-500 nm ถูกรบกวนให้มีค่ามากขึ้นอีกด้วย

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 35 2
 Lipemia (triglycerides > 5 g/L) interfere.
Other drugs and substances may interfere

พิกัดอ้างอิง
Reaction Men Women
temperature U/L nKat/L U/L nKat/L
25C 10-65 167-1084 7-55 117-917
30C 15-105 250-1750 10-80 167-1334
37C 38-174 633-2900 26-140 433-2334

บทปฏิบัติการ: การตรวจวัดระดับ CK-MB ด้วยวิธี Immunoinhibition

CK-MB หรือ CK-2 เป็น isoenzyme ของ CK ที่พบได้มากที่กล้ามเนื้อหัวใจ และยังพบได้ที่กล้ ามเนื้อลาย เมื่อเกิดการ
ตายของกล้ามเนื้อหัวใจ CK-MB จะถูกหลั่งออกมา และสามารถตรวจวัดได้ CK-MB มี 2 isoform คือ CK-MB1 และ CK-MB2
อัตราส่วนของ isoform นี้ สามารถนามาใช้เป็นตัวบ่งชี้ในระยะเริ่มต้นได้
หลักการ: แอนติบอดีต่อ M subunit สามารถยับยั้งการทางานของ M subunit ใน CK-MM และ CK-MB ได้ เหลือแต่ B
subunit ที่ยังทางานได้ โดยคาดหวังไว้ว่า ไม่มี CK-BB ในสิ่งส่งตรวจ จึงเท่ากับว่า activity ที่เกิดจาก B subunit อ้างไปถึง CK-
MB เท่านั้น activity ของ CK ที่ได้เป็นครึ่งหนึ่งของ CK-MB ตรวจวัดได้จากปฏิกิริยาการสร้าง NADPH (340 nm) ดังเช่นปฏิกิริยา
การตรวจวัดระดับ total CK

Creatine phosphate + ADP → Creatine + ATP

ATP + Glucose → ADP + Glucose - 6 - phosphate

Glucose - 6 - phosphate + NADP+ → 6 - Phosphogluconate + NADPH + H+

นายา
1. Reagent A pH 6.1 ประกอบด้วย
Anti-human-CK-M able to inhibit 2000 U/L of CK-M
Imidazol 125 mmol/L
EDTA 2 mmol/L
magnesium acetate 12.5 mmol/L
D-glucose 25 mmol/L
N-acetyl cysteine 25 mmol/L
hexokinase 6800 U/L
NADP 2.4 mmol/L
2. Reagent B ประกอบด้วย
Creatine phosphate 250 mmol
ADP 15.2 mmol/L

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 36 3
 AMP 25 mmol/L
P1,P5-di(adenosine-5'-) pentaphosphate 103 μmol/L
Glucose-6-phosphate dehydrogenase 8800 U/L
3. Working reagent
ผสม reagent A และ reagent B ให้เข้ากันด้วยอัตราส่วน 4:1 ผสมให้เข้ากัน เก็บให้ห่างจากแสง
น้ายายังคงเสถียรอยู่ได้นาน 15 วัน ที่ 2-8ºC

สิ่งส่งตรวจ
Serum หรือ heparinized plasma ปริมาณของ Total CK ใน sample ต้องน้อยกว่า 1000 U/L หากมากกว่านี้ให้เจือ
จาง serum 1/2 ด้ววย NaCl 150 mmol/L
CK-MB ยังคงเสถียรเป็นเวลา 7 วัน ที่อุณหภูมิ 2-8ºC

วิธีการวิเคราะห์
1. นา reagent ไปบ่มที่ 37ºC นาน 10 นาที
2. ปิเปตต์ตัวอย่างตรวจ 40 μL ลงในหลอดทดลอง
3. ผสมน้ายา (working reagent) 1 mL ลงในหลอดทดลองที่มีตัวอย่างตรวจ เขย่าให้เข้ากันแล้ววัดการดูดกลืนแสงที่
340 nm ทันที จับเวลา
4. บันทึกการดูดกลืนแสงที่ 5 นาที (A5) และ 10 นาที (A10)

วิธีการคานวณ
ระดับของ CK-MB ในสิ่งส่งตรวจ คานวณได้จาก
(A10-A5) x x 2 = U/L

เมื่อ molar absorbance () ของ NADPH ที่ 340 nm = 6300,

lightpath (l) = 1 cm
total reaction volume (Vt) = 1.04
sample volume (Vs) = 0.04
1 U/L = 0.0167 μkat/L

หากใช้สารละลายมาตรฐานด้วย สามารถคานวณระดับของ CK-MB ได้ดังนี้

-
x Cstandard = Csample
-

CK-MB index คานวณได้จาก

x 100 = Percentage

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 37 4
 สารรบกวนการตรวจวิเคราะห์
Hemolysis (hemoglobin >2.5 g/L) สิ่ง ส่ งตรวจที่มี hemolysis ทาให้เ กิด false positive ได้ จากเอนไซม์
adenylate kinase ที่มีอยู่ในเม็ดเลือดแดง ทาให้ระดับของ ATP ในปฏิกิริยาการตรวจวัดสูงขึ้น นอกจากนี้ hemolysis ยังทาให้
การอ่านค่าการดูดกลืนแสงของปฏิกิริยาที่ความยาวคลื่นในช่วง 300-500 nm ถูกรบกวนให้มีค่ามากขึ้นอีกด้วย
Lipemia (triglycerides > 1.25 g/L)
ระดับของ CK-BB หรือ macro-CK type 1 ที่สูงขึ้น สามารถรบกวนการตรวจวัดให้มีค่าสูงขึ้นได้
Bilirubin (< 20 mg/dL) does not interfere.
Other drugs and substances may interfere.

References
1. เอกสารประกอบน้ายาของ BioSystems S.A.

อ.ทนพ.สุวิทย์ คล่องทะเล 38 5
ชื่อ....................................................................... รหัส.....................................................................
MT2317 เคมีคลินิกทั่วไป (General Clinical Chemistry) 2-2557
การตรวจวัดระดับโปรตีนรวมและอัลบูมินในพลาสมา
ดร.ทนพ.วรวุฒิ สมศักดิ์
หัวหน้าสาขาวิชาเคมีคลินิก คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยเวสเทิร์น
การตรวจวัดระดับโปรตีนรวมในพลาสมา
1. จงอธิบายหลักการตรวจวัดระดับโปรตีนรวมในพลาสมา
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
2. จงเขียนส่วนประกอบของ Reagent A ในการตรวจวัดระดับโปรตีนรวมในพลาสมา
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
3. สารกันเลือดแข็งใดนิยมใช้สำหรับการเก็บเลือดเพื่อตรวจวัดระดับโปรตีนรวมในพลาสมา ......................................................................................
4. ความยาวคลื่นสำหรับการตรวจวัดระดับโปรตีนรวมในพลาสมา ..............................................................................................................................
5. จงเขียนวิธีการตรวจวัดระดับโปรตีนรวมในพลาสมา
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
6. ผลการทดลองที่ได้ Unknown no. .........................................................................................................................................................................
Concentration of Total protein standard (Cs) …………………………………………………………………………………………………………………….
Absorbance of Total protein standard (As) ………………………………………………………………………………………………………………………..
Absorbance of Unknown (Au) ……………………………………………………………………………………………………………………………………………..
7. จงคำนวณหาความเข้มข้นโปรตีนรวมในพลาสมาของ Unknown
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
8. ค่าปกติของระดับโปรตีนรวมในพลาสมา .................................................................................................................................................................
9. ช่วงของการตรวจวัดระดับโปรตีนรวมในพลาสมาด้วยวิธีนี้ ……………………………………………………………………………………………………………………….
10. สารรบกวนปฏิกิริยาการตรวจวัดระดับโปรตีนรวมในพลาสมา ………………………………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
1
39
ชื่อ....................................................................... รหัส.....................................................................
การตรวจวัดระดับอัลบูมินในพลาสมา
1. จงอธิบายหลักการตรวจวัดระดับอัลบูมินในพลาสมา
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
2. จงเขียนส่วนประกอบของ Reagent A ในการตรวจวัดระดับอัลบูมินในพลาสมา
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
3. สารกันเลือดแข็งใดนิยมใช้สำหรับการเก็บเลือดเพื่อตรวจวัดระดับอัลบูมินในพลาสมา ......................................................................................
4. ความยาวคลื่นสำหรับการตรวจวัดระดับอัลบูมินในพลาสมา ..............................................................................................................................
5. จงเขียนวิธีการตรวจวัดระดับอัลบูมินในพลาสมา
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
6. ผลการทดลองที่ได้ Unknown no. .........................................................................................................................................................................
Concentration of albumin standard (Cs) …………………………………………………………………………………………………………………….
Absorbance of albumin standard (As) ………………………………………………………………………………………………………………………..
Absorbance of Unknown (Au) ……………………………………………………………………………………………………………………………………………..
7. จงคำนวณหาความเข้มข้นอัลบูมินในพลาสมาของ Unknown
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
8. ค่าปกติของระดับอัลบูมินในพลาสมา .................................................................................................................................................................
9. ช่วงของการตรวจวัดระดับอัลบูมินในพลาสมาด้วยวิธีนี้ ……………………………………………………………………………………………………………………….
10. สารรบกวนปฏิกิริยาการตรวจวัดระดับอัลบูมินในพลาสมา ………………………………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

2
40
ชื่อ....................................................................... รหัส.....................................................................
จงแปลผลของ Unknown ที่ได้รับจากระดับของโปรตีนรวมและอัลบูมินในพลาสมา
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

3
41
 MT2317 เคมีคลินิกทั่วไป
ปฎิบัตกิ าร 7 การตรวจวิเคราะห์ ระดับ BUN creatinine และ Uric acid
อ.ดร.ทนพ. วรวุฒิ สมศักดื
ปฏิบัตกิ ารที่ 1 การตรวจวิเคราะห์ ระดับ Blood urea nitrogen (BUN)
BUN เป็ นของเสียที่เกิดจากการย่อยสลายโปรตีนได้ NH4+ ซึ่งผ่านกระบวนการ Urea cycle ที่ตบ
ั เกิดเป็ น
Urea จากนันจะถู
้ กส่งในกระแสเลือดในรูปของ BUN และถูกขับออกมาพร้ อมกับปั สสาวะที่ไต ดังนัน้ หากร่างกายมีการ
คัง่ ของระดับ BUN มากกว่าค่าปกติ ย่อมสามารถบ่งบอกความผิดปกติที่เกิดขึ ้นกับการกรองของไตได้
หลักการตรวจวิเคราะห์
Urease
Urea ---------------------------------------- NH4+ + CO2

Glutamate dehydrogenase (GLDH)

NH4+ + oxoglutarate (OXGT) + NADH + H+ --------------------------------- Glutamate + NAD+
ส่ วนประกอบ
Reagent 1
Tris, pH 7.8 120 mM 2-oxoglutarate 7 mM
ADP 0.6 mM Urease 60,000 U/L
GLDH 10,000 U/L
Reagent 2
NADH 0.25 mM
Standard BUN 30 mg/dl
การเตรียม working reagent
ใช้ สารละลาย reagent 1 จานวน 5 ส่วนผสมกับสารละลาย reagent 2 จานวน 1 ส่วน ผสมให้ เข้ ากันดีและ
เก็บที่ 4 องศาเซลเซียส มีความคงตัว 2 เดือน
สิ่งส่ งตรวจ
Serum, plasma หรื อ urine เก็บที่อณ
ุ หภูมิ 4 องศาเซลเซียสมีความคงตัว 7 วัน
Linearity; 2-140 mg/dl
สิ่งรบกวน
Ascorbic acid ≤30 mg/dl Bilirubin ≥ 20 mg/dl
Hemoglobin ≥5 g/l Triglyceride ≥ 10 g/l
วิธีการทดสอบ
สาร (ul) standard control unknown
Working reagent 1000 1000 1000
อุ่นที่ 37 องศาเซลเซียสเป็ นเวลา ≥ 15 นาที
ใช้ น ้ากลัน่ ปรับ 0 ที่ความยาวคลื่น 340 nm
BUN standard 10 - -
จับเวลาทันที ผสมให้ เข้ ากันด้ วย vortex และนาใส่ cuvette
อ่านค่าการดูดกลืนแสงที่เวลา 30 วินาที (A1)
อ่านค่าการดูดกลืนแสงที่เวลา 90 วินาที (A2)

Control serum - 10 -

42
 จับเวลาทันที ผสมให้ เข้ ากันด้ วย vortex และนาใส่ cuvette
อ่านค่าการดูดกลืนแสงที่เวลา 30 วินาที (A1)
อ่านค่าการดูดกลืนแสงที่เวลา 90 วินาที (A2)
Unknown - - 10
จับเวลาทันที ผสมให้ เข้ ากันด้ วย vortex และนาใส่ cuvette
อ่านค่าการดูดกลืนแสงที่เวลา 30 วินาที (A1)
อ่านค่าการดูดกลืนแสงที่เวลา 90 วินาที (A2)

การคานวณ
BUN (mg/dl) = [(A1-A2) unk. or cont. x concentration of standard x dilution factor]/ (A1-A2)std.
ค่ าปกติ 7-18 mg/dl

ปฏิบัตกิ ารที่ 2 การตรวจวัดระดับ creatinine

Creatinine เป็ นของเสียที่เกิดจากการย่อยสลายของ creatine phosphate ในกล้ ามเนื ้อเพื่อใช้ เป็ นแหล่ง
พลังงาน และ creatinine จะถูกปล่อยเข้ าสูก่ ระแสเลือดและขับออกทางปั สสาวะ โดย creatinine ในกระแสเลือดจะมี
ค่าคงที่ในแต่ละวันแต่มีความแตกต่างกันในเพศ คือในเพศชายค่า creatinine ในเลือดจะสูงกว่าในเพศหญิง และจาก
การที่ creatinine ถูกขับออกคงที่ ดังนันเมื
้ ่อมีระดับของ Creatinine สูงขึ ้นกว่าระดับปกติในกระแสเลือด จึงเป็ นตัวบ่งชี ้ที่
ดีของการทางานของไตในการขับออก
หลักการตรวจ Alkaline condition
Creatinine + Picric acid ----------------------------------- creatinine-picrate complex
ส่ วนประกอบ
Reagent 1 sodium hydroxide 0.4 mM
Reagent 2 picric acid 25 mM
Standard creatinine 5 mg/dl
การเตรียม working reagent
ใช้ สารละลาย reagent 1 จานวน 1 ส่วนผสมกับสารละลาย reagent 2 จานวน 1 ส่วน ผสมให้ เข้ ากันดีและ
เก็บที่ 4 องศาเซลเซียส มีความคงตัว 1 เดือน
สิ่งส่ งตรวจ
Serum, plasma หรื อ urine เก็บที่อณ
ุ หภูมิ 4 องศาเซลเซียสมีความคงตัว 1 วัน
Linearity; 20 mg/dl
สิ่งรบกวน
Bilirubin > 10 mg/dl Hemoglobin >10 g/l Triglyceride > 2 g/l
วิธีการทดสอบ
สาร (ul) standard control unknown
Working reagent 1000 1000 1000
อุ่นที่ 37 องศาเซลเซียสเป็ นเวลา ≥ 15 นาที
ใช้ น ้ากลัน่ ปรับ 0 ที่ความยาวคลื่น 510 nm
BUN standard 50 - -
จับเวลาทันที ผสมให้ เข้ ากันด้ วย vortex และนาใส่ cuvette

43
 อ่านค่าการดูดกลืนแสงที่เวลา 20 วินาที (A1)
อ่านค่าการดูดกลืนแสงที่เวลา 60 วินาที (A2)

Control serum - 50 -
จับเวลาทันที ผสมให้ เข้ ากันด้ วย vortex และนาใส่ cuvette
อ่านค่าการดูดกลืนแสงที่เวลา 20 วินาที (A1)
อ่านค่าการดูดกลืนแสงที่เวลา 60 วินาที (A2)
Unknown - - 50
จับเวลาทันที ผสมให้ เข้ ากันด้ วย vortex และนาใส่ cuvette
อ่านค่าการดูดกลืนแสงที่เวลา 20 วินาที (A1)
อ่านค่าการดูดกลืนแสงที่เวลา 60 วินาที (A2)

การคานวณ
creatinine (mg/dl)= [(A1-A2) unk. or cont. x concentration of standard x dilution factor]/ (A1-A2)std.
ค่ าปกติ ผู้ชาย 0.9-1.3 mg/dl ผู้หญิง 0.6-1.1 mg/dl

ปฏิบัตกิ ารที่ 3 การตรวจวิเคราะห์ ระดับ Uric acid

Uric acid เป็ นของเสียที่เกิดจากการสลายเบส purine (adenine and guanine) ซึ่งถูกนาส่งในกระแสเลือด
และกรองออกที่ไตเพื่อขับทิ ้งกับปั สสาวะ การเพิม่ สูงขึ ้นของระดับ uric acid สามารถบ่งบอกพยาธิสภาพของไตได้ ทังนี
้ ้
การเพิม่ สูงขึ ้นของ uric acid ในเลือดยังเป็ นตัวบ่งชี ้ความเสี่ยงของการเป็ น gout ได้ อีกด้ วย
หลักการตรวจ
Uricase
Uric acid ------------------------------------------- H2O2 + allantoin
Peroxidase
H2O2 + DCHB + aminoantipyrine ------------------------- quinoneimine

ส่ วนประกอบ
Reagent A
Phosphate 100 mM detergent 1.5 g/l
Dichlorophenolsulfonate (DCHB) 4 mM uricase >0.12 U/ml
Ascobate oxidase > 5U/ml peroxidase >1 U/ml
4-aminoantipyrine 0.5 mg/dl
Standard uric acid 6 mg/ml

สิ่งส่ งตรวจ
Serum, plasma หรื อ urine เก็บที่อณ
ุ หภูมิ 4 องศาเซลเซียสมีความคงตัว 1 สัปดาห์
Linearity; 25 mg/dl
สิ่งรบกวน
Bilirubin > 2.5 mg/dl Hemoglobin >2 g/l Triglyceride > 2 g/l
วิธีการทดสอบ
สาร (ul) Blank Standard Control Unknown

44
 Reagent A 1000 1000 1000 1000
น ้ากลัน่ 25 - - -
UA standard - 25 - -
Control serum - - 25 -
Unknown serum - - - 25
ผสมให้ เข้ ากันด้ วย vortex อุ่นที่ 37 องศาเซลเซียสเป็ นเวลา 15 นาที
ใช้ น ้ากลัน่ ปรับ 0 ที่ความยาวคลื่น 520 nm

การคานวณ
BUN (mg/dl) = A unk. or cont. x concentration of standard x dilution factor]/ A std.
ค่ าปกติ ผู้ชาย 3.5-7.2 mg/dl ผู้หญิง 2.6-6.0 mg/dl

การตรวจวิเคราะห์ การกรองของไต (glomerular filtration rate)

โดยส่วนมากมักใช้ ประกอบการวินิจฉัยภาวะไตวาย (renal failure)

GFR = C clearance = [urine creatinine (mg/dl) x urine volume/min (ml/min)]/ serum creatinine (mg/dl
or = [(140-age) x weight(kg)] for male/ [serum creatinine(mg/dl)] x 72
= [(140-age) x weight(kg)] x 0.85 for female/ [serum creatinine (mg/dl)] x 72
ค่าปกติ GFR
= 97-137 ml/min in male/1.73 m2
= 88-128 ml/min in female/1.73 m2
1.73 m2 is estimate surface area of body

45
 MT2317 เคมีคลินิกทั่วไป

ปฎิบัตกิ ารที่ 8 การตรวจ Electrolytes และ anion gap

พลาธิป ชูท้วม
หลักการ
อิเลกโตรไลต์หรื อเกลือแร่ คือ สารเคมีที่เมื่อละลายน ้าแล้ วสามารถแตกตัวเป็ นประจุหรื อไอไอออน (ion) ได้ สาร
ที่สามารถแตกตัวเป็ นประจุบวกอย่างเช่น sodium, Na+, potassium, K+, calcium, Ca2+, magnesium, Mg2+,
hydrogen, H+ จะเรี ยกว่า cation ส่วนสารที่แตกตัวเป็ นประจุลบ เช่น chloride, Cl-, bicarbonate, HCO3-,
phosphate, PO43-, sulfate, SO42-, protein/amino acid, organic acid จะเรี ยกว่า anion ปริ มาณ cation และ
anion ในน ้าแต่ละส่วนของร่ างกาย (ECF และ ICF) จะมีปริ มาณรวมเท่ากันเพ่อให้ ได้ ประจุสท
ุ ธิ (net charge) เป็ นศูนย์

ทังในน
้ ้านอกเซลล์ (ECF) และน ้าในเซลล์ (ICF) ปริมาณ cation จะเท่ากับ anion โดยในน ้านอกเซลล์ cation
หลักคือ sodium ส่วน anion หลัก คือ chloride รองลงมาคือ bicarbonate ส่วนในนา้ ในเซลล์ cation หลัก คือ
potassium ส่วน anion หลักคือ organic phosphate

ค่ า anion gap
ค่า anion gap คือ ค่าผลต่างระหว่างปริมาณ cation และ anion ในน ้าเลือดที่มีการตรวจวิเคราะห์
(determined)

Anion gap = [Na+] + [K+] – [Cl-] – [HCO3-]

ซึ่งในทางปฏิบตั อิ าจไม่นา potassium มาร่วมคานวณก็ได้ เพราะปริมาณ potassium มีน้อยมากในนา้ เลือด

ผลการคานวณ anion gap จะใช้ บง่ บอกถึงการเพิม่ ขึ ้นของ anion ที่ไม่มีการตรวจวิเคราะห์ (undetermined
anions) โดยเฉพาะ anion ที่เกิดจากการแตกตัวของกรดอินทรี ย์ อย่างเช่น lactate จาก lactic acid, β-bytyrate จาก
ketone, formate จาก methanol และ salicylate จากยา aspirin/acetyl salicylic acid หรื อ จากการแตกตัวของ
กรดอนินทรี ย์ เช่น HCl, H3PO4, H2SO4 การเพิ่มขึ ้น/กว้ างของ anion gap บ่งชี ้การมี undetermined anion ปริมาณ
มากในร่ างกาย ใช้ ในการแยกภาวะ metabolic acidosis ว่าเกิดจากการมีกรดอินทรี ย์เพิ่มขึ ้นในร่างกาย เช่นในภาวะ
ketoacidosis, lactic acidosis หรื อ methanol intoxication ส่วนภาวะ anion gap ต่า/แคบกว่าปกติ จะพบได้ ใน
ภาวะ albumin ในกระแสเลือดต่า

46
ปฎิบัตกิ าร การตรวจ Electrolytes และ anion gap

จงศึกษากรณีศกึ ษา แล้ วตอบคาถาม

กรณีศกึ ษาที่ 1
ผู้ป่วยชายอายุ 50 ปี ซึมและไม่คอ่ ยรู้สกึ ตัวก่อนมาโรงพยาบาล 2 วัน แขนและขาข้ างขวาอ่อนแรงญาติกรอก
น ้าให้ ผ้ ปู ่ วยแต่ดื่มไม่ได้ เพราะสาลัก ตรวจพบอุณหภูมกิ าย 39°ซ หายใจไม่หอบ ความดันเลือด 180/120มม.ปรอท
ความเต่งของผิวหนังปกติ ระดับโซเดียมในซีรัม 150 mEq/ลิตร โปแตสเซียม 4.0 mEq/ลิตร คลอไรด์ 112 mEq/ลิตร
ไบคาร์ บอเนต 24 mEq/ลิตร BUN 35 มก./ดล. Creatinine 2.8 มก./ดล. ฮีมาโตคริต 42% ปั สสาวะในรอบ 24 ชัว่ โมงมี
จานวน 450 มล. ความถ่วงจาเพาะ 1.025 น ้าหนักตัวผู้ป่วยประมาณ 50 กิโลกรัม

1. ผู้ป่วยรายนี ้มีภาวะขาดน ้าหรื อไม่ หากขาดเขาเสียนา้ ไปทางใดได้ บ้างและเสีย น ้าไปวันละเท่าไหร่ ----------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2.ค่า electrolyze ของผู้ป่วยรายนี ้เป็ นอย่างไร สาเหตุความผิดปกติของค่า electrolyze นี ้น่าจะมาจากสาเหตุใด --------

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

3.ณ ภาวะนี ้ ผู้ป่วยน่าจะอยู่ภายใต้ การควบคุมของฮอร์ โมนใด จงอธิบาย ------------------------------------------------------

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------------------------

3.จากค่าการตรวจ RFTs ของคนไข้ รายนี ้เป็ นอย่างไร คนไข้ มีอาการของโรคไตหรื อไม่ และสาเหตุของโรคไตนันมาจาก
้
สาเหตุใด------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

กรณีศกึ ษาที่ 2
ผู้ป่วยชายไทยอายุ 17 ปี เคยถูกรถชนศีรษะกระแทกพื ้น ตาซ้ ายเหล่และมองเห็นภาพซ้ อนทันที ขณะอยู่โรงพยาบาลเริ่ม
ถ่ายปั สสาวะบ่อยมาก(กลางวัน 10 ครัง้ กลางคืน 6 ครัง้ )กระหายน ้าบ่อย เป็ นเช่นนี ้เป็ นเวลานาน 3 ปี ได้ รับการรักษาจน

47
อาการทางตาหายไป แต่ปัสสาวะยังคงออกมากวันละ 6-7 ลิตรทุกวันความดันเลือด 110/80 มม/ปรอท ความ
ถ่วงจาเพาะปั สสาวะ 1.002 และosmolality ปั สสาวะ 70 มิลลิออสโมล/กก. โซเดียมในซีรัม 149 mEq/ลิตร โปแต
สเซียม 4.0 mEq/ลิตร คลอไรด์ 98 mEq/ลิตร ไบคาร์ บอเนต 29 mEq/ลิตร ระดับน ้าตาล, BUN, creatinine,
แคลเซียม และฟอสฟอรัสอยู่ในเกณฑ์ปกติ การตรวจระบบประสาทอยู่ในเกณฑ์ปกติ osmolalityของซีรัม 296 มิลลิ
ออสโมล/กก. เมื่อผู้ป่วยได้ รับ pitressin 5 หน่วย ปั สสาวะลดลงจากนาทีละ 9 มล. เหลือนาทีละ 1.5 มล. และ
osmolalityของปั สสาวะเพิม
่ ขึ ้นเป็ น 387 มิลลิออสโมล/กก.

1.ค่า electrolyze ของผู้ป่วยรายนี ้เป็ นอย่างไร มีคา่ ใดผิดปกติ-----------------------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2.ผู้ป่วยรายนี ้อยู่ในภาวะขาดน ้าหรื อไม่----------------------------------------------------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

3.ผู้ป่วยรายนี ้มีโซเดียมในซีรั่มสูง แต่เหตุใดผู้ป่วยจึงยังคงถ่ายปั สสาวะมาก 6-7 ลิตร ความถ่วงจาเพาะ 1.002

osmolality 70 มิลลิออสโมล/กก. ความผิดปกติของผู้ป่วยรายนี ้น่าจะมาจากความผิดปกติของอวัยวะใด ------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

4.ระดับ Sodium ในเลือดเกี่ยวข้ องกับการควบคุมสมดุลน ้าในร่ างกายอย่างไร จงอธิบาย----------------------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

48
กรณีศกึ ษาที่ 3
ผู้ป่วยหญิงอายุ 54 ปี เป็ นโรคความดันเลือดสูงมา 5 ปี ได้ รับยาขับปั สสาวะเพื่อลดความดันเลือดสม่าเสมอ
ผู้ป่วยก็สบายดีเรื่ อยมา ก่อนมาโรงพยาบาล 5 วันผู้ป่วยถ่ายอุจจาระเหลววันละ 2-3 ครัง้ เป็ นเวลา 2 วัน กระหายน ้ามาก
อ่อนเพลีย และซึมมาก ผู้ป่วยเข้ ารับการรักษาในโรงพยาบาลแห่งหนึ่ง ซึ่งไม่ได้ ให้ ยาลดความดันคงให้ แต่นา้ ละลาย
เดกซโทรส 5%วันละ 1,500 มล. เป็ นเวลา 3 วัน อาการซึมเพิม่ มากขึ ้น ญาติจึงย้ ายโรงพยาบาล ตรวจพบความดันเลือด
120/80 มม.ปรอท ชีพจร 108 ครัง้ /นาที ผู้ป่วยกึ่งหมดสติ( semicoma) รูมา่ นตาเล็กเท่ากันทังสองข้
้ าง reflectไวน้ อย
นอกจากนันไม่
้ พบสิง่ ผิดปกติรวมทังผลการเจาะหลั
้ งด้ วย โซเดียมในซีรัม 110 mEq/ลิตร โปแตสเซียม 2.4 mEq/ลิตร
คลอไรด์ 70 mEq/ลิตร ไบคาร์ บอเนต 35 mEq/ลิตร osmolalityของซีรัม 226 มิลลิออสโมล/กก. Osmolalityของ
ปั สสาวะ 527 มิลลิออสโมล/กก. GFR (โดยวิธี creatinine clearance) 56 มล./นาที

1. ผู้ป่วยรายนี ้มีทงภาวะขาดโซเดี
ั้ ยมและภาวะน ้าเกินอยู่ร่วมกัน ภาวะขาดโซเดียมมาจากสาเหตุใดได้ บ้าง มีหลักฐาน
อะไรสนับสนุนภาวะนี ้ -------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2. ภาวะน ้าเกินของผู้ป่วยรายนี ้ เกิดขึ ้นได้ อย่างไร----------------------------------------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2. การกรองของไตของผู้ป่วยรายนี ้เป็ นอย่างไร ดูได้ จากผลการตรวจทางห้ องปฏิบตั กิ ารใด---------------------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

3. เมื่อผู้ป่วยได้ รับ hypertonic saline จะมีอาการอย่างไร--------------------------------------------------------------------

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

49
กรณีศกึ ษาที่4
ผู้ป่วยชายอายุ 16 ปี ถ่ายอุจจาระเหลวเป็ นน ้า 5 ครัง้ ในเวลา 12 ชัว่ โมง เมื่อผู้ป่วยถ่ายอุจจาระครัง้ ที่ 4 เวลา
ลุกขึ ้นยืนรู้สกึ หน้ ามืดจะเป็ นลมต้ องเกาะฝาผนังพยุงตัวออกจากห้ องส้ วม ผู้ป่วยรู้สกึ กระหายน ้าแต่เมื่อดื่มน ้าจะเป็ น
ตะคริว ตรวจพบความดันเลือด 100/80 มม.ปรอทในท่านอน และ 80/70 มม.ปรอทในท่านัง่ ผิวหนังเหี่ยว ชีพจร 100
ครัง้ /นาที ความดันเลือดดาส่วนกลาง 3 ซม.น ้า ถ่ายปั สสาวะเพียงครัง้ เดียว ฮีมาโตคริต 54% ปั สสาวะมีความเข้ มข้ น
ของโซเดียม 10 mEq/ลิตร และความถ่วงจาเพาะ 1.008 ในซีรัมมีโซเดียม 130 mEq/ลิตร โปแตสเซียม 3.5 mEq/
ลิตร คลอไรด์ 95 mEq/ลิตร ไบคาร์ บอเนต 18 mEq/ลิตร ระดับBUN 54มก./ดล. Creatinine 2.4 มก./ดล.

1.ร่างกายสูญเสียอะไรบ้ างเวลาถ่ายอุจจาระเหลวหลายครัง้ ---------------------------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2. ภาวะท้ องเสียเกี่ยวข้ องอย่างไรกับภาวะ metabolic acidosis--------------------------------------------------------------

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2.ในผู้ป่วยท้ องเสีย เหตุใดค่า BUN และ creatinine จึงเพิม่ สูงขึ ้น-------------------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

กรณีศกึ ษาที่ 5
ผู้ป่วยชายอายุ 30 ปี ประสบอุบตั เิ หตุทางรถยนต์ ไม่ร้ ูสกึ ตัว 1 วัน ได้ รับน ้า 500 มล. และแมนนิทอล 20%
จานวน 300 มล.

การตรวจร่างกาย

อุณหภูมริ ่างกาย 39°ซ. ชีพจร 110 ครัง้ /นาที ความดันเลือด 130/80 มม.ปรอท

สิง่ ที่ตรวจพบทางห้ องปฏิบตั กิ าร

50
 ปั สสาวะในรอบ 24 ชัว่ โมงได้ 1,800 มล. ความถ่วงจาเพาะ 1.035 โปรตีน 1 บวก ไม่มีน ้าตาลในปั สสาวะ
วันรุ่งขึ ้นโซเดียมในซีรัม 155 mEq/ลิตร โปแตสเซียม 4.5 mEq/ลิตร คลอไรด์ 120 mEq/ลิตร ไบคาร์ เนต 27 mEq/
ลิตร BUN 50 มก./ดล. Creatinine 1.8 มก./ดล.

1.ค่า electrolyze ของผู้ป่วยรายนี ้เป็ นอย่างไรบ้ าง-------------------------------------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2. โซเดียมและคลอไรด์สงู ในซีรัม ในผู้ป่วยรายนี ้เกิดจากสาเหตุใดได้ บ้าง------------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

3.เหตุใดผู้ป่วยจึงถ่ายปั สสาวะมากทังๆที
้ ่ขาดน ้า --------------------------------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

4. ผู้ป่วยรายนี ้มีพยาธิสภาพที่ไตหรื อไม่ ทราบได้ อย่างไร-------------------------------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

กรณีศกึ ษาที่ 6
ผู้ป่วยชายอายุ 70 ปี ปั สสาวะเป็ นเลือดเป็ นๆหายๆ เนื่องจากนิ่วในไต 10 ปี 2 สัปดาห์ก่อนมาโรงพยาบาล
ปั สสาวะเป็ นเลือดอีก ปั สสาวะน้ อย คลื่นไส้ อาเจียน 7 วันก่อนอุจจาระเหลว 4-5 ครัง้ ในระยะเวลา 2 วันได้ รับน ้าเกลือ
2 ขวด อาการคลื่นไส้ อาเจียนไม่หายไป ซึมและเป็ นไข้ มา 2 วัน เมื่อแรกรับความดันเลือด 210/100 มม.ปรอท สวน
ปั สสาวะได้ 3 มล. อีก 2 ชัว่ โมงต่อมาผู้ป่วยกระสับกระส่าย เพ้ อ หายใจหอบลึก ความดันเลือด 240/130 มม.ปรอท
CVP 20 ซม. น ้า ไม่ร้ ูสกึ ตัว ปอดปกติ บันทึกคลื่นไฟฟ้าหัวใจแสดงหัวใจเต้ น 60 ครัง้ /นาที nodal rhythm, QRS
complex กว้ าง
และ T wave สูงมาก ในเลือดมีโซเดียม 115 mEq/ลิตร โปแตสเซียม 8.0 mEq/ลิตร คลอไรด์ 89
mEq/ลิตร ไบคาร์ บอเนต 8.0 mEq/ลิตร BUN 140 มก./ดล. Creatinine 28.8 มก./ดล.

1. anion gap ของผู้ป่วยรายนี ้เป็ นอย่างไร บ่งบอกภาวะใด---------------------------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2. สาเหตุที่ทาให้ ระดับโปแตสเซียมในเลือดสูงเนื่องจาก --------------------------------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

51
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

3.ระดับโปแตสเซี่ยมนอกเซลล์ที่สงู มากผิดปกติ ส่งผลกระทบอย่างไรต่อการทางานของหัวใจและความดันเลือดอย่างไร----

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------

4. ผู้ป่วยรายนี ้มีการทางานของไตผิดปกติหรื อไม่ ดูจากค่าการตรวจใด และพยาธิสภาพที่ไตน่าจะมาจากสาเหตุใดได้ บ้าง-

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

กรณีศกึ ษาที่ 7
ผู้ป่วยชายอายุ 30 ปี ถ่ายปั สสาวะน้ อยมา 5 วัน หายใจหอบลึกมา 1 วัน ตรวจพบผู้ป่วยไม่บวม ความดัน
เลือดดาที่คอปกติ ความดันเลือด 120/80 มม.ปรอท ปอดปกติ ระดับไบคาร์ บอเนตในเลือดเท่ากับ 12 mEq/ลิตร โปแต
สเซียม 6.5 mEq/ลิตร คลอไรด์ 95 mEq/ลิตร โซเดียม 135 mEq/ลิตร PCO2 25 มม.ปรอท pH 7.30 BUN 120
มก./ดล. Creatinine 12.5 มก./ดล.

1.ค่า electrolyze ของผู้ป่วยรายนี ้เป็ นอย่างไร----------------------------------------------------------------------------------

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2.ค่า anion gap ของผู้ป่วยรายนี ้เป็ นอย่างไร--------------------------------------------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2.ผู้ป่วยมีสภาวะเป็ นกรดหรื อเป็ นด่าง ทังเป็

้ นกรด หรื อด่างแบบใด โดยพิจารณาจากค่าผลจากห้ องปฏิบตั กิ ารใด-----------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

3. การทางานของไตของผู้ป่วยรายนี ้มีความผิดปกติหรื อไม่ ทราบได้ จากผลห้ องปฏิบตั กิ ารใด-----------------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

52
 MT2317 เคมีคลินิกทั่วไป

ปฎิบัตกิ ารที่ 9 เรื่องการตรวจเอนไซม์ AST และ ALT

วัตถุประสงค์
สามารถนามาใช้ ในการวินิจฉัย และติดตามการรักษาโรคที่เกี่ยวข้ องกับ Hepatitis และ cirrhosis

ปฎิบัตกิ ารที่ 1 การตรวจหาปริมาณเอนไซม์ AST ในพลาสมาหรื อซีรัม

เอนไซม์ Aspatate aminotransferase (AST) เป็ นเอนไซม์ที่ทาหน้ าที่ในการเร่งปฏิกิริยาการโยกย้ ายหมูอ่ ะมิ

โนจากกรดอะมิโนไปยัง alpha-oxoacid หรื อในทางตรงข้ าม พบมากในเซลล์ตบั และเซลล์อื่นๆ เช่น กล้ ามเนือ้ หัวใจ ไต
และเม็ดเลือดแดง การตรวจพบเอนไซม์ AST จึงบ่งบอกถึงการที่เซลล์เหล่านี ้มีการถูกทาลายจนมีการรั่วไหลของเอนไซม์
ออกสูก่ ระแสเลือด

AST สามารถนามาใช้ ประกอบในการวินิจฉัยและติดตามโรคต่างๆได้ ดังนี ้ myocardial infarction (MI),

hepatitis, liver necrosis, cirrhosis และ muscular dystrophy

หลักการ
AST
L-Aspatate + 2-Oxoglutarate --------------- Oxaloacetate + L-Glutamate
MDH
Oxaloacetate + NADH2 ------------- L-Malate + NAD+

สิ่งส่ งตรวจ
Serum collected by standard procedures หรื อ EDTA plasma

นา้ ยา
Reagent 1

Tris, pH 7.8 121 mmol/L L-aspatate 362 mmol/L

Malate dehydrogenase (MDH) >460 U/L lactate dehydrogenase > 660 U/L

Sodium hydroxide 255 mmol/L

Reagent 2

2-oxoglutarate 75 mmol/L NADH 1.9 mmol/L

Sodium hydroxide 148 mmol/L sodium azide 9.5 g/L

การเตรียม working reagent

ผสม reagent 1 4 ส่วนกับ reagent 2 1 ส่วนผสมให้ เข้ ากัน เก็บที่ 2-8 องศาเซลเซียสได้ นาน 2 เดือน

ก่อนใช้ นามาอุ่นที่อณ
ุ หภูมหิ ้ องเป็ นเวลา 30 นาที

53
วิธีการตรวจวิเคราะห์
การตรวจวิเคราะห์สามารถทาได้ ที่อณ
ุ หภูมิ 30 และ 37 องศาเซลเซียส
Reaction temperature 37ºC 30ºC
อุ่นซีรัมหรื อพลาสมาที่ 37 องศาเซลเซียสเป็ นเวลา 10 นาที
Working Reagent 1.0 mL 1.0 mL
Sample 50 uL 100 uL

ผสมให้ เข้ ากัน วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 340 nm ที่นาทีที่ 1 (A1), นาทีที่ 2 (A2), นาทีที่ 3 (A3)
โดยใช้ น ้าเปล่าเป็ น blank

การคานวณ
AST (U/L) = (ΔA/min) x factor

เมื่อ
30oC 37oC

Factor at 340 nm 1,746 3,333

Molar absorbance (Ԑ) of NADH at 340 nm is 6,300

ความคงตัวของสิ่งส่ งตรวจ
คงตัวที่ 2-8 องศาเซลเซียส นาน 7 วัน

สารรบกวนการตรวจวิเคราะห์
Bilirubin >20 mg/dL Triglycerides 2 g/L
Hemolysis

Linearity limit

1.1 U/L - 500 U/L

ค่ าปกติ
AST 10–59 U/L (37°C)

ปฏิบัตกิ ารที่ 2 การตรวจหาปริมาณ Alanine aminotransferase (ALT) ในซีรัมหรื อพลาสมา

Alanine aminotransferase (ALT) เป็ นเอนไซม์ที่พบในเซลล์ตบ

ั มากกว่าอวัยวะอื่น ระดับของ ALT จึงบ่งถึง
การมีพยาธิสภาพที่เซลล์ตบั ได้ ดี เช่น ในโรค viral hepatitis, liver necrosis and cirrhosis พบว่า ALT มีคา่ สูงอย่าง
ชัดเจน

54
หลักการ
ALT
L-Alanine + 2-Oxoglutarate ------------- Pyruvate + L-Glutamate
LDH
Oxaloacetate + NADH2 ----------- L-Malate + NAD+

สิ่งส่ งตรวจ
Serum collected by standard procedures หรื อ EDTA plasma

นา้ ยา
Reagent 1

Tris pH 7.3 150 mmol/L L-alanine 750 mmol/L

Lactate dehydrogenase > 1350 U/L

Reagent 2

NADH 1.3 mmol/L 2-oxoglutarate 75 mmol/L

Sodium hydroxide 148 mmol/L Sodium azide 9.5 g/L

การเตรียมนา้ ยา
ผสม reagent 1 4 ส่วนกับ reagent 2 1 ส่วนผสมให้ เข้ ากัน เก็บที่ 2-8 องศาเซลเซียสได้ นาน 2 เดือน

ก่อนใช้ นามาอุ่นที่อณ
ุ หภูมหิ ้ องเป็ นเวลา 30 นาที

วิธีการตรวจวิเคราะห์
การตรวจวิเคราะห์สามารถทาได้ ที่อณ
ุ หภูมิ 30 และ 37 องศาเซลเซียส
Reaction temperature 37ºC 30ºC
อุ่นซีรัมหรื อพลาสมาที่ 37 องศาเซลเซียสเป็ นเวลา 10 นาที
Working Reagent 1.0 mL 1.0 mL
Sample 50 uL 100 uL

ผสมให้ เข้ ากัน วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 340 nm ที่นาทีที่ 1 (A1), นาทีที่ 2 (A2), นาทีที่ 3 (A3)
โดยใช้ น ้าเปล่าเป็ น blank

การคานวณ
ALT (U/L) = (ΔA/min) x factor เมื่อ

30oC 37oC

Factor at 340 nm 1,746 3,333

Molar absorbance (Ԑ) of NADH at 340 nm is 6,300

55
ความคงตัวของสิ่งส่ งตรวจ
คงตัวที่ 2-8 องศาเซลเซียส นาน 7 วัน

สารรบกวนการตรวจวิเคราะห์
Hemoglobin >10 g/L Bilirubin >20 mg/dL

Triglycerides 2 g/L

Linearity limit

1.6 U/L - 500 U/L

ค่ าปกติ
ALT Male 13–40 U/L (37°C)

Female 10–28 U/L (37°C)

คาถามหลังการทดลอง
1. จงสรุปผลการทดลอง แปรผลและวิจารณ์ผลการทดลอง
2. ปั จจัยใดบ้ างที่มีผลกระทบในการตรวจวิเคราะห์โดยวิธี Enzymatic method
3. จงอธิบายความสาคัญของการตรวจ AST และ ALT ในกรณีการเกิด Hepatitis และ cirrhosis

56
 MT3319 เคมีท่ ัวไป 1

ปฏิบัตกิ ารที่ 10 การตรวจ Bilirubin

วัตถุประสงค์

1. นิสติ สามารถแยกชนิดและอธิบายการเกิดดีซ่านชนิดต่างๆได้
2. สามารถแปรผลการทดสอบดีซ่านทางห้ องปฏิบตั กิ ารเคมีคลินิกได้

บทนา

เมื่อเม็ดเลือดแดงแตกใน RE system จะปลดปล่อย hemoglobin ออกมาซึ่งจะโดนจับกินและย่อยสลายโดย

macrophage ใน spleen หรื อ Kupffer cell ในตับ จากนัน้ Hemoglobin จะโดนสลายได้ haem และ globin จาก
และ haem จะโดนสลายต่อโดยเอนไซม์ Haem oxygenase ได้ Biliverdin และ Iron ส่วน Biliverdin จะโดน
เปลี่ยนเป็ น unconjugated bilirubin โดยเอนไซม์ Biliverdin reductase ซึ่งไม่ละลายน ้า unconjugated bilirubin
จะเคลื่อนที่ในกระแสเลือดโดยอาศัยตัวพาคือ albumin ซึ่งทาหน้ าที่ขนส่ง unconjugated bilirubin ไปที่ตบั ซึ่งจะมี
การเติมสาร glucuronic acid เข้ าในโมเลกุลของ bilirubin (Conjugation) โดยเอนไซม์ Glucuronosyl transferase
ได้ เป็ น Conjugated bilirubin ซึ่งสามารถละลายน ้าได้ ดี ง่ายแก่การขับออกทางน ้าดีออกสูร่ ะบบทางเดินอาหารและ
ระบบขับถ่ายปั สสาวะ

การเพิม่ ขึ ้นของ bilirubin ในกระแสเลือดจนเกิดการสะสมที่เนื ้อเยื่อไขมันเช่น ใต้ ผวิ หนัง เยื่อตา หรื อส่วน body fluid ใน
ร่างกายเรี ยกว่า ภาวะดีซ่าน (Jaundice) ซึ่งสามารถเกิดได้ จากสาเหตุ สามประการคือ

1. มีการทาลายของเม็ดเลือดแดงเพิ่มมากขึ ้น จน bilirubin ถูกสร้ างออกมามากเกินกว่าที่ตบั จะทาการ

conjugated และขับออกได้ ทน
ั ทาให้ unconjugated bilirubin เพิม่ ขึ ้นมากในกระแสเลือด เรี ยกภาวะนี ้ว่า
hemolytic jaundice
2. เกิดพยาธิสภาพที่ตวั ตับทาให้ การทางานในส่วนของการ conjugation ของ bilirubin และการขับทิ ้ง bilirubin
ไม่สามารถทางานได้ ตามปกติ เช่น hepatitis ซึ่งพบว่ามีอาการบวมของเซลล์ตบั ไปเบียดทางเดินน ้าดี ทาให้ ไม่
สามารถขับน ้าดีได้ ตามปกติ ทาให้ conjugated bilirubin ในน ้าดีไม่สามารถขับทิ ้งได้ จึงท้ นเข้ าสูก่ ระแสเลือด
ในภาวะนี ้พบ conjugated bilirubin สูงในกระแสเลือด แต่ในภาวะ cirrhosis ซึ่งเป็ นภาวะที่เซลล์ตบั โดน
ทาลายไปมากจนไม่สามารถทางานได้ ตามปกติจึงไม่สามารถดาเนินกระบวนการ conjugation ได้ ในภาวะนี ้
พบว่า unconjugated bilirubin จะสูงในกระแสเลือด หรื ออาจเกิดจากโรคทางพันธุกรรมเช่น Gilbert’s
disease, Crigler-Najjar syndrome, Dubin-Johnson syndrome ซึ่งระดับของ unconjugated
bilirubin และ conjugated bilirubin ในกระแสเลือดของโรคดังกล่าวนี ้จะแตกต่างกันไปตามลักษณะของโรค
เรี ยกภาวะดีซ่านที่เกิดจากความผิดปกติของตับว่า hepatic jaundice
3. เกิดภาวะอุดตันของท่อทางเดินน ้าดี อันอาจเกิดจาก ภาวะก้ อนนิ่วอดตัน หรื อเนื ้องอกในท่อทางเดินน ้าดี ทาให้
น ้าดีไม่สามารถไหลได้ ตามปกติ ทาให้ conjugated bilirubin ที่อยู่ในน ้าดีไม่สามารถขับทิ ้งได้ จึงท้ นเข้ าสูต่ บั

57
 และกระแสเลือดตามลาดับ เรี ยกภาวะดีซ่านแบบนีว้ า่ post-hepatic jaundice หรื อ obstructive jaundice
ในภาวะนี ้จะพบ conjugated bilirubin สูงในกระแสเลือด

คาสั่ง จากเอกสารประกอบการทดสอบ เรื่ องการทดสอบ Bilirubin (total and direct bilirubin) โดยวิธี Diazotized
sulfanilic จงศึกษา และเติมข้ อมูลข้ างล่างให้ ครบถ้ วนก่อนเริ่ มทาปฏิบตั กิ าร

ปฏิบตั กิ ารที่ 1 การตรวจหา Total bilirubin โดยวิธี Diazotized sulfanilic

1. หลักการตรวจวัด Total bilirubin โดยวิธี Diazotized sulfanili

___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
2. สิง่ ส่งตรวจ และความคงตัวของสิง่ ส่งตรวจ
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
3. การเตรี ยม working reagent
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
4. วิธีการตรวจวิเคราะห์ (ให้ ทา Flowchart)
5. วิธีการคานวณ
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
6. สารรบกวนการตรวจวิเคราะห์
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
7. Linearity limit
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
8. ค่าปกติ
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________

58
ปฏิบตั กิ ารที่ / การตรวจหา Direct bilirubin (conjugated bilirubin) โดยวิธี Diazotized sulfanilic

1. หลักการตรวจวัด Total bilirubin โดยวิธี Diazotized sulfanili

__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
_______________________________________________

2. สิง่ ส่งตรวจ และความคงตัวของสิง่ ส่งตรวจ

__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
_______________________________________________

3. การเตรี ยม working reagent

__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
_______________________________________________

4. วิธีการตรวจวิเคราะห์ (ให้ ทา Flowchart)

5. วิธีการคานวณ
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
_______________________________________________

6. สารรบกวนการตรวจวิเคราะห์
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________

7. Linearity limit
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________

8. ค่าปกติ
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________

59
รายงานผลการทดลอง

1. จงคานวณค่า Indirect bilirubin, แปรผล สรุป และวิจารณ์ผลการตรวจวิเคราะห์

2. จงบอกประโยชน์ของ Cetrimide ในการตรวจวิเคราะห์ Total bilirubin
3. จงบอกถึงสาเหตุที่ทาให้ เกิดการพบค่าของ Total bilirubin และ Direct bilirubin สูง

60
 การตรวจวัดระดับแคลเซียม

อ.ทนพ. สุวิทย์ คล่องทะเล

คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยเวสเทิร์น

บทนา
แคลเซียม (calcium) เป็ นแร่ธาตุท่พี บมากในร่างกาย ผูใ้ หญ่ท่มี สี ุขภาพดีมรี ะดับ calcium ประมาณ 1-1.3 kg
ซึ่งร้อยละ 99 อยู่ในรูป hydroxyapatite ในส่วนกระดูก (skeleton) อีกร้อยละ 1 อยู่ในส่วน extracellular fluid (ECF)
และ soft tissues นอกจากนี้ calcium ในกระดูกประมาณน้อยกว่าร้อยละ 1 ยังมีการแลกเปลี่ยนอย่างเป็ นอิสระกับส่วน
ECF
Calcium ที่ปรากฏอยู่ใน serum แบ่งออกได้เป็ น 3 รูป คือ 1) รูปอิสระ (free หรือ ionized calcium) เป็ นส่วน
ที่ออกฤทธิ์ทางสรีรวิทยา (physiologically active form) มีอยู่ประมาณร้อยละ 50 ของแคลเซียมทัง้ หมดใน serum 2)
รู ปเชิงซ้อน (complexed calcium) เป็ นส่วนที่จบั อย่างแน่นหนากับ anion หลายชนิด ได้แก่ bicarbonate, lactate,
phosphate และ citrate คิดเป็ นร้อยละ 10 ของ total serum calcium ทัง้ ionized calcium และ calcium
complexes ถูกกรองได้ท่ไี ต และ 3) รู ปที่จบั กับโปรตีน (plasma protein-bound calcium) มีอยู่ประมาณร้อย 40
ของ total serum calcium ซึ่งประมาณร้อยละ 80 ของ protein-bound คือ albumin และเนื่องจาก ionized calcium
จับกับส่วนประจุลบของโมเลกุลโปรตีน จึงมีการแย่งจับกับ H+ บน albumin และ calcium-binding proteins อื่น ๆ
กล่าวได้ว่า การจับกันของ calcium กับโปรตีนขึ้นอยู่กบั ค่า pH (pH dependent) ถึงแม ้ว่า ระดับ total serum calcium
ไม่ค่อยเปลีย่ นแปลง แต่สดั ส่วนการกระจายตัวของทัง้ 3 forms นี้มกี ารเปลีย่ นแปลงได้ อันเป็ นผลมาจาก pH ใน ECF มี
ค่าเปลี่ยนไป เช่น ภาวะ alkalosis จะกระตุน้ ให้ calcium จับกับโปรตีนมากขึ้น ทาให้มี free calcium ลดลงในเวลา
ต่อ มา ในขณะที่ภาวะ acidosis จะไปลดการจับกันของ calcium กับโปรตีน เป็ นผลให้มี free calcium เพิ่มขึ้น
นอกจากนี้ ความเข ้มข้นของ plasma protein ก็มผี ลเปลีย่ นแปลงระดับ total calcium ได้

เทคนิคการตรวจวิเคราะห์ระดับแคลเซียม
การตรวจวิเคราะห์แคลเซียมในเลือด สามารถทาได้ทงั้ ที่เป็ น total calcium และ free calcium สาหรับ total
calcium นัน้ จะหมายรวมถึง protein-bound calcium, complexed calcium และ ionized calcium การตรวจวัด
ระดับ total calcium นัน้ ทาได้ง่ายในห้องปฏิบตั ิการเทคนิคการแพทย์โดยทัว่ ไป แต่การแปลผลการตรวจควรพิจารณา
ร่ ว มกับ ข อ้ มูล แวดล อ้ มทางคลินิ ก (clinical context) ร่ ว มด้ว ย เช่ น กรณี ผู ป้ ่ วยเป็ น มะเร็ ง มัก จะมีภ าวะ
hypoalbuminemia ซึ่งมีผลให้ระดับ total calcium ตา่ ลวง (falsely low) ได้ ดังนัน้ การแปลผลจึงต้องมีการปรับให้
เหมาะสม (corrected) ดังสมการด้านล่าง

Corrected Ca2+ (mg/dL) = Total Ca2+ (mg/dL) + 0.8 (Normal albumin - Patient’s albumin [g/dL])
การตรวจวิเคราะห์แคลเซียม 61
1
 Normal albumin ที่ใช้ในสมการ บางตาราระบุให้ใช้ 4.0 ขณะที่บางตาราให้ใช้ 4.4 ทัง้ นี้ ขึ้นอยู่กบั กลุม่ ประชากรที่
ทาการตรวจวิเคราะห์ การ correct ค่า total serum calcium นี้ ก็เพื่อให้สอดคลอ้ งกับระดับ calcium ที่แท้จริง หาก
total calcium ปกติ ก็อนุ มานได้ว่า ionized calcium ย่อมปกติดว้ ย ในบางภาวะ เช่น hypogammaglobulinemia
ระดับของ total calcium อาจเปลี่ยนแปลงได้แต่ไม่มากดังเช่นความผิดปกติ ของ albumin เนื่องจาก protein-bound
form ส่วนใหญ่จบั กับ albumin อย่างไรก็ตาม มีบางปัจจัยที่ทาให้ค่า total calcium และ corrected calcium ไม่
สามารถใช้อนุมานค่าของ ionized calcium ได้ ซึ่งจะต้องตรวจ ionized calcium โดยตรงเท่านัน้ ปัจจัยเหล่านี้แบ่งได้
เป็ น 1) ภาวะที่เปลี่ยนแปลงการจับกับโปรตีน ได้แก่ ความเข ้มข้นระหว่าง albumin และ globulin เปลีย่ นแปลง, โปรตีน
ผิดปกติ, pH, free fatty acid, bilirubin, drugs, temperature และ 2) ปัจจัยที่ทาให้เปลี่ยนแปลง complex
formation ได้แก่ citrate, bicarbonate, lactate, phosphate, sulfate, anion gap, pyruvate และ beta-
hydroxybutyric acid

การตรวจวิ เคราะห์ระดับแคลเซียมรวมในเลือด
วิธีการตรวจวิเคราะห์สาหรับตรวจหา total calcium มีทงั้ ที่เป็ น spectrophotometry, Ion specific electrode
(ISE หรือ indirect potentiometry) และ atomic absorption (reference method) ในปี 2007 มีรายงานของ College
of American Pathologists Comprehensive Survey ระบุว่า ห้องปฏิบตั ิการที่ให้ความร่วมมือในการสารวจ ร้อยละ 75
ใช้วธิ ี spectrophotometry แบ่งออกเป็ น วิธี o-cresolphthalein complexone (CPC) ร้อยละ 44 และวิธี arsenazo III
ร้อยละ 31 อีกร้อยละ 24 ใช้วธิ ี ISEs ในส่วนของการตรวจด้วย ISE นัน้ ตัวอย่างตรวจจะต้องถูก acidified เพื่อเปลี่ยน
protein-bound และ complexed calcium เป็ น free calcium ก่อนการตรวจวัดเสียก่อน
1. วิธี o-cresolphthalein complexone (CPC)
ใน alkaline solution สาร CPC จะจับเป็ นสารประกอบเชิงซ้อนสีแดงกับ calcium ซึ่งสามารถวัดการดูดกลืน
แสงได้ในช่วงความยาวคลืน่ 570-580 nm ตัวอย่างตรวจที่นามาวิเคราะห์ ถูก dilute ด้วยกรดก่อนการตรวจวัด เพื่อปล่อย
calcium ออกจาก protein bound และ complexed calcium ปฏิกิริยาการวิเคราะห์ ถูกรบกวนได้จาก Mg2+ ซี่ง
สามารถลดการรบกวนได้โดย 1) เติม 8-hydroxyquinoline ลงไป 2) buffer ให้ reaction mixture ใกล ้เคียงกับ pH 12
และ 3) วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ใกลก้ บั ความยาวคลื่น 580 nm การเติม sodium acetate ลงไป อาจช่วย improve
linearity ของการตรวจวัดได้ อุณหภูมทิ ่ที าการตรวจวัดต้องควบคุมเนื่องจากปฏิกิริยานี้ไวต่อการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ
นอกจากนี้ CPC และ alkaline reagent ถึงแม ้จะมีความคงตัว แต่เมือ่ นามารวมกัน ความคงตัวจะลดลง
2. วิธี arsenazo III
Arsenazo III จับกับ calcium ที่ pH เป็ นกรดเล็กน้อย (pH ประมาณ 6) ได้ดีกว่า magnesium แลว้ เกิดเป็ น
calcium-indicator complex สีนา้ เงิน วัดการดูดกลืนแสงที่ 650 nm เพื่อลดการรบกวนจาก biological pigments
ตัวอย่างตรวจสาหรับตรวจวิเคราะห์ระดับแคลเซียมรวม
นิยมใช้ serum และ heparinized plasma สาหรับการตรวจวัด total calcium ส่วน citrate, oxalate, EDTA
ไม่เหมาะที่จะใช้ เนื่องจากไปจับตัวเป็ น complex กับ calcium สาหรับตัวอย่างตรวจที่เป็ น 24-hours urine ควรเก็บใน

การตรวจวิเคราะห์แคลเซียม 62
2
20-30 mL ของ 6 M HCl (กรณี random urine กาหนดให้ใช้ประมาณ 1-2 mL) เพื่อไม่ให้เกิดการตกตะกอนของเกลือ
แคลเซียม ส่วนการใส่กรดภายหลังการเก็บปัสสาวะแล้ว อาจไม่สามารถละลายเกลือแคลเซียมได้สมบูรณ์
สารรบกวนการตรวจวิเคราะห์
ตัวอย่างตรวจที่มี hemolysis, icterus, lipemia, paraproteins, magnesium และ gadolinium
chelates ใน contrast agents มีรายงานว่า สามารถรบกวนการตรวจวิเคราะห์ได้ วิธีการตรวจหลายวิธีใช้ bichromatic
analysis หรือ multiwavelength correction หรือ blanking เพื่อลดการรบกวน ถึงแมว้ ่า hemolysis จะทาให้เกิด
negative error เพราะเม็ดเลือดแดงมีป ริ มาณ calcium น้อยกว่า ใน serum แต่ มี significant error ได้จ าก
hemoglobin ไปรบกวนการดู ดกลืนแสง มีการระบุว่า hemoglobin ทาให้เ กิดการรบกวนทัง้ แบบ positive และ
negative ดังนัน้ มีขอ้ แนะนาให้ set blank โดยใช้ ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) หากต้องการตรวจวัด
จาก hemolyzed specimen

การตรวจวิ เคราะห์ระดับแคลเซียมอิ สระในเลือด

วิธี ISE เป็ นวิธีท่นี ามาใช้สาหรับการตรวจวัด free calcium รวมทัง้ electrolyte และ blood gas กันอย่าง
แพร่หลาย calcium ISE ประกอบด้วย calcium-selective membrane ภายในมี reference solution ของ calcium
chloride, saturated AgCl, NaCl และ KCl และมี internal reference electrode โดยที่ reference electrode นี้มกั
เป็ น Ag/AgCl ที่จ่มุ อยู่ใน reference solution
ตัวอย่างตรวจสาหรับตรวจวัดระดับแคลเซียมอิสระ
ตัวอย่างตรวจควรเก็บในสภาวะไร้ออกซิเจน เพื่อลดการเปลี่ยนแปลงค่า pH และ free calcium อัน
เนื่องมาจากสูญเสีย CO2 และ metabolism ของ blood cells ดังได้อธิบายมาแลว้ ว่า pH มีผลต่อการกระจายตัวของ
serum calcium โดยในภาวะที่ pH ของตัวอย่างตรวจสูงขึ้น จะทาให้เพิ่ม ionization และประจุลบบน albumin และ
โปรตีนอื่น ๆ เป็ นผลให้เพิ่ม protein-bound calcium แต่ลดระดับของ free calcium ลง ในภาวะที่ pH ในตัวอย่าง
ตรวจลดลง ionization และประจุลบบน albumin และโปรตีนอื่น ๆ จะลดลงด้วย ทาให้เพิ่มปริมาณของ free calcium
แต่ protein-bound calcium ลดลง มีรายงานว่า เมื่อ pH เปลี่ยนไปทุก ๆ 0.1 หน่วย ทาให้ free calcium เปลี่ยนไป
ร้อยละ 5
Syringe และหลอดเก็บเลือดแบบสุญญากาศ จะต้องเติมเลือดให้เต็มและ seal ให้แน่น เพื่อป้ องกันการ
loss ของ CO2 ในขณะเดียวกัน ก็ตอ้ งป้ องกันมิให้เม็ดเลือดแดงหรือเม็ดเลือดขาวในตัวอย่างตรวจสังเคราะห์กรดแลคติก
ภายใต้สภาวะ anaerobic โดยการใส่ในนา้ แข็งป่ น เพื่อลด anaerobic metabolism ลง
การตรวจวัดระดับแคลเซีย มอิสระ สามารถใช้ตวั อย่า งตรวจที่เ ป็ น heparinized whole blood,
heparinized plasma หรื อ serum ได้ มีขอ้ แนะนาว่า ห้อ งปฏิบ ตั ิก ารส่วนใหญ่ ท่ี ตรวจวัดภายใน 30 นาที ใช้
heparinized whole blood เพราะเวลาที่ใช้ในกระบวนการจัดการตัวอย่างตรวจน้อยและช่วยหลีกเลีย่ งการเปลีย่ นแปลงค่า
pH ที่เป็ นผลมาจากการปัน่ เหวีย่ งที่อุณหภูมอิ ่นื นอกเหนือจาก 37oC หากยังไม่สามารถตรวจวิเคราะห์ตวั อย่างตรวจได้ทนั ที
ควรเก็บในนา้ แข็ง เพื่อลดอัตราการเกิดเมตาบอลิสม แต่ระดับของ K+ จะเพิ่มขึ้นอย่างมีนยั สาคัญ เพราะ Na+-K+ ATPase
ถูกยับยัง้
การตรวจวิเคราะห์แคลเซียม 63
3
 การเตรียมตัวผู้ป่วยและสาเหตุของความผิดพลาดก่อนการตรวจวิเคราะห์
การเตรียมตัวผูป้ ่ วยและการเก็บตัวอย่างตรวจที่มผี ลต่อค่าการตรวจวิเคราะห์ calcium แสดงไว้ในตารางที่ 1
สาเหตุหลักที่ทาให้เกิดขอ้ ผิดพลาดก่อนการตรวจวิเคราะห์ คือ การเพิ่มขึ้นของ total calcium อันเนื่องมาจากการรัด
tourniquet และ venous occlusion ระหว่างเก็บตัวอย่างตรวจ ในขณะที่มกี ารรัด tourniquet จะเกิดการ efflux ของนา้
ออกจากหลอดเลือดทาให้ protein-bound calcium สูงขึ้น ส่งผลให้ค่า total calcium สูงขึ้น 0.5-1.0 mg/dL การรัด
แขนผูป้ ่ วยด้วย tourniquet จึงไม่ควรนานเกิน 1 นาที
ผูป้ ่ วยควรหลีกเลี่ยงการกาหมัดแน่ น (fist clenching) หรือออกกาลังกายบริเวณปลายแขนก่อนมาเจาะเก็บเลือด
เนื่องจากทาให้การสังเคราะห์ lactic acid ซึ่งจะส่งผลต่อค่า free calcium ที่สูงขึ้น
การเปลี่ยนท่ าทางท าให้เกิด fluid shift และเปลี่ยนแปลงความเขม้ ขน้ ของเซลล์และสารมหโมเลกุล ได้แก่
albumin และ total calcium (เป็ นผลจากการเปลีย่ นแปลงส่วน protein-bound) ในหลอดเลือด การเปลีย่ นท่าทางทาให้
ความเข ้มข้นของ albumin และโปรตีนอื่น ๆ เปลีย่ นแปลงประมาณร้อยละ 10 ซึ่งไม่สาคัญมากนัก แต่สาหรับ calcium มี
ความสาคัญ เพราะค่าอ้างอิงแคบ ค่าที่เปลี่ยนเพียงเล็กน้อยจึงอาจทาให้ผูป้ ่ วยที่มแี คลเซียมปกติกลายเป็ นผิดปกติ หรือ
ผูป้ ่ วยที่มแี คลเซียมผิดปกติกลายเป็ นปกติได้ การยืนทาให้นา้ ในหลอดเลือดลดลง เป็ นผลให้เพิ่มระดับของ total calcium
ไปประมาณ 0.2-0.8 mg/dL มีข ้อแนะนาให้เจาะเก็บเลือดในท่านัง่ โดยผูป้ ่ วยควรนัง่ อย่างน้อย 5 นาทีก่อนการเจาะเก็บ
เลือด ผูป้ ่ วยที่นอนราบ (recumbence) จะเกิด hemodilution ทาให้ระดับ total calcium ลดลงจากการที่ albumin
ลดลง ซึ่งพบได้บ่อยในผูป้ ่ วยที่นอนโรงพยาบาล
ตารางที่ 1 ปัจจัยก่อนการตรวจวิเคราะห์ของแคลเซียม
(ทีม่ า: Burtis CA, et al; 2008)
In vivo In vitro
Tourniquet use and venous occlusion Inappropriate anticoagulants
Change in posture: 10-12% increase of total Dilution with liquid heparin
calcium and 5-6% increase of free Interfering levels of heparin
calcium on standing Contamination with calcium
Exercise Corks, glassware, tubes
Hyperventilation Specimen handling
Fist clenching Alteration in pH (free calcium)
Alimentary status Adsorption or precipitation of calcium
Alteration in protein binding Spectrophotometric interference
Alteration in complex formation Hemolysis, icterus, lipemia

ผูป้ ่ วยบางรายที่ไม่เคลื่อนไหวเป็ นเวลานาน (prolonged immobilization) หรือนอนบนเตียงนาน ทาให้ bone

density ลดลง แต่จะเพิ่มระดับของ total และ free calcium ผูป้ ่ วยที่มกี ารหายใจเร็ว (hyperventilation) จะลดระดับ
ของ free calcium แต่ผูป้ ่ วยที่ออกกาลังกายก่อนมาเจาะเก็บเลือด จะมีระดับของ free calcium เพิ่มขึ้น เพราะค่า pH

การตรวจวิเคราะห์แคลเซียม 64
4
เปลีย่ นแปลง มีข ้อแนะนาว่า ผูป้ ่ วยควรนัง่ พักก่อนการเจาะเลือดอย่างน้อย 10 นาทีภายหลังทากิจกรรม ในเวลากลางคืน
ระดับของ serum free calcium และ calcium excretion จะลดลง มีข ้อแนะนาให้ เจาะเลือดในช่วงเวลา 08.00 -10.00
น. เพราะค่า calcium เปลีย่ นแปลงตามช่วงเวลา
การทานอาหารก่อนมาเจาะเก็บเลือด มีรายงานว่าส่วนใหญ่ทาให้ค่า serum calcium สูงขึ้นเล็กน้อย การทานเกลือ
แคลเซียม อาจเพิ่มระดับของ serum calcium ได้ มีขอ้ แนะนาว่า ผูป้ ่ วยควรอดอาหาร (fasting) ก่อนมาเจาะเก็บเลือด
อย่างน้อย 4 ชัว่ โมง

การตรวจวิเคราะห์แคลเซียม 65
5
 ปฏิ บตั ิ การตรวจวัดระดับแคลเซียม
ด้วยวิ ธี o-Cresolphthalein complexone
หลักการตรวจ
Serum calcium จับตัวเป็ นสารประกอบเชิงซ้อนสีแดงกับ o-cresolphthalein ที่ alkaline pH (ประมาณ 10.7)
ในนา้ ยาตรวจมี 8-hydroxyquinoline เพื่อไปจับ (chelate) กับ magnesium ไม่ให้รบกวนปฏิกิริยา
นายาตรวจวัด
1. Reagent A: 1 x 100 mL
o-cresolphthalein 0.18 mmol/L
8-hydroxyquinoline 6.90 mmol/L
HCl 160 mmol/L
Preservatives and stabilizers
2. Reagent B: 1 x 100 mL
2-amino-2-methyl-1-propanol 500 mmol/L
KCN 15.50 mmol/L
Preservatives and stabilizers
3. Standard: 10 mg/dL calcium
Working reagent
ผสม reagent A และ reagent B ในอัตราส่วน 1:1 แล ้วตัง้ ไว้ท่ี RT เป็ นเวลา 5 นาที
ตัวอย่างตรวจ
serum และ ปัสสาวะ
วิธีการตรวจ
1. เตรียมหลอดทดลองและ label แล ้วใส่สารตามตารางต่อไปนี้
Blank Standard Sample
Standard - 10 L -
Sample - - 10 L
Working reagent 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL
2. เขย่าผสมเบา ๆ แล้วตัง้ ทิ้งไว้ท่ี RT เป็ นเวลา 10 นาที
3. วัดค่าการดูดกลืนแสงของแต่ละหลอดที่ความยาวคลื่น 565 nm ใช้ blank set zero โดยต้องทาการ
ตรวจวัดภายในเวลา 30 นาที

การตรวจวิเคราะห์แคลเซียม 66
6
วิธีการคานวณ

Linearity
Up to 20 mg/dL of calcium
ข้อจากัดของการตรวจวัด
Bilirubin มากกว่า 20 mg/dL
Phosphate มากกว่า 40 mg/dL
Anticoagulant ที่เป็ น chelating agent
พิกัดอ้างอิง
Newborn 8.0 - 13.0 mg/dL
Children 8.8 - 12.0 mg/dL
Adults 8.8 - 10.5 mg/dL
Urine 120.0 - 290.0 mg/24 hours

เอกสารอ้างอิ ง
1. Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, editors. Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry. 6th ed. St.
Louis: Saunders Elsevier; 2008
2. Ramakrishnan S, Sulochana KN, editors. Manual of medical laboratory techniques. New Delhi:
Jaypee Brothers Medical Publishers; 2012.
3. Turgeon ML. Linne & Ringsrud’s clinical laboratory science: the basics and routine techniques.
6th ed. China: Elsevier Mosby; 2012.
4. มานะ โรจนวุฒนนท์, บรรณาธิการ. พยาธิวิทยาคลินิก. พิมพ์ครัง้ ที่ 2. กรุงเทพฯ: ภาควิชาพยาธิวิทยา คณะ
แพทยศาสตร์โรงพยาบาลรามาธิบดี มหาวิทยาลัยมหิดล; 2556.
5. เอกสารประกอบนา้ ยาตรวจวิเคราะห์ calcium ของ Biotech; 2010.

การตรวจวิเคราะห์แคลเซียม 67
7
 รายงานปฏิ บตั ิ การ การตรวจวัดระดับแคลเซียม

ชื่อ-สกุล___________________________________ รหัสนิสติ _________________

ตอนที่ 1 บันทึกผลการทดลอง

Standard Unknown ............

OD
Concentration
(mg/dL)

วิจารณ์ผลการทดลอง
............................................................................................................................. ..........................................................
.......................................................................................................................................................................................
............................................................................................................................. ..........................................................
............................................................................................................................. ..........................................................

ตอนที่ 2 ตอบคาถามต่อไปนี้
1. จงอธิบายหลักการตรวจวัด serum calcium
............................................................................................................................. ..........................................................
.......................................................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................................................
2. หากผู ้ป่ วยมีระดับ albumin ลดลงจะส่งผลต่อค่า total calcium และ free calcium อย่างไร จงบอกวิธีแก้ปญั หา
.......................................................................................................................................................................................
............................................................................................................................. ..........................................................
............................................................................................................................. ..........................................................
3. หากผู ้ป่ วยมีภาวะ acidosis จะส่งผลต่อค่า total calcium และ free calcium อย่างไร
............................................................................................................................. ..........................................................
........................................................................................................................................................... ...........................

ตอนที่ 3 ทาเครื่องหมาย  หน้าข้อที่ถกู ต้อง และเครื่องหมาย  หน้าข้อที่ผิด

................. 1. การตรวจวัดระดับ calcium ไม่จาเป็ นต้องอดอาหาร
................. 2. ผูป้ ่ วยที่มี HCO3-/H2CO3 ratio มากกว่า 20 จะมีค่า free calcium น้อยลง

การตรวจวิเคราะห์แคลเซียม 68
8
 การตรวจวัดระดับธาตุเหล็ก

อ.ทนพ. สุวิทย์ คล่องทะเล

คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยเวสเทิร์น

บทนา
ธาตุเหล็ก (iron) เป็ นแร่ธาตุท่พี บมากสุดเป็ นลาดับที่ 4 ในแผ่นเปลือกโลก (earth’s crust) แต่ในร่างกายมนุ ษย์
กลับถูกจาแนกเป็ นแร่ธาตุท่พี บน้อย (trace element) ซึ่งในผูใ้ หญ่มอี ยู่ประมาณ 40-50 mg/Kg ส่วนในทารกแรกเกิด
ประมาณ 75 mg/kg ธาตุเหล็กประมาณร้อยละ 70-75 มีบทบาทสาคัญในการเจรืญเติบโตและการหายใจระดับเซลล์ อีก
ประมาณร้อยละ 25-30 เป็ นส่วนสารอง (storage pool) เพื่อเก็บไว้ใช้ยามที่ร่างกายต้องการ
ธาตุเหล็กมีหน้าที่หลักสาคัญ คือ
1) ทาหน้าที่ขนส่งออกซิเจนและเป็ นองค์ประกอบของเอนไซม์ในกระบวนการหายใจระดับเซลล์
2) เป็ นองค์ประกอบของเอนไซม์ท่ที าหน้าที่เกี่ยวกับเมตาบอลิสมของยาหรือสาร
3) มีส่วนเกี่ยวข ้องกับการสังเคราะห์สารสื่อประสาท (neurotransmitter)
4) เกี่ยวข ้องกับระบบภูมคิ มุ ้ กัน ในผูท้ ่ขี าดธาตุเหล็ก จะมี IL-1 และ IL-2 ของ T cell ลดลง
อย่างไรก็ตาม ธาตุเหล็กที่เป็ น free iron ions ในร่างกาย สามารถก่อให้เกิดภยันตรายต่อเซลล์หรือเนื้อเยื่อได้จาก
การเร่งสร้างอนุมลู อิสระนัน่ เอง
การกระจายตัวของธาตุเหล็ก
ธาตุเหล็กในร่างกายมีอยู่ 2 รูป คือ ferrous (Fe2+) และ ferric (Fe3+) แบ่งกระจายอยู่ตามส่วนต่าง ๆ ของร่างกาย
ดังนี้
1. Intracellular ferrous ion มักอยู่เป็ นส่วนประกอบของ heme มีหน้าเกี่ยวกับ oxidative metabolism
ได้แก่
1) Hemoglobin (Hb) เป็ นองค์ประกอบสาคัญในเม็ดเลือดแดง ประกอบด้วย polypeptide 4 สายและ
มี heme 1 โมเลกุล ซึ่งประกอบด้วยเหล็ก 1 อะตอม โดยเฉลี่ยเม็ดเลือดแดง 1 mL มีเหล็กประมาณ 1 mg ในผูช้ าย
นา้ หนัก 70 Kg มี RBC mass ประมาณ 2 L จึงเท่ากับว่ามีเหล็กใน Hb ประมาณ 2 g หรือคิดเป็ นร้อยละ 67 ของธาตุ
เหล็กทัง้ หมดของร่างกาย
2) Myoglobin เป็ น oxygen carrier ที่พบในกลา้ มเนื้อ ประกอบด้วย polypeptide 1 สาย และ
heme 1 โมเลกุล มีธาตุเหล็กประมาณร้อยละ 3.5 ของธาตุเหล็กในร่างกาย
3) Cytochromes เป็ นเอนไซม์ใน electron transport chain ของการหายใจระดับเซลล์ พบบริเวณ
mitochondrial membrane และ cellular membrane อื่น ๆ ทาหน้าที่สาคัญในร่างกาย เช่น cytochrome C มี globin
1 สาย รวมกับ heme 1 โมเลกุล

การตรวจวิเคราะห์ธาตุเหล็ก 69
1
 4) Heme enzyme ต่าง ๆ เช่น catalase และ peroxidase
2. Intracellular ferric ion เป็ นรูปของเหล็กที่สะสมในร่างกาย (storage ion) มีอยู่ประมาณร้อยละ 27 ของ
ธาตุเหล็กทัง้ หมดของร่างกาย อวัยวะที่มธี าตุเหล็กสะสมมาก ได้แก่ ไขกระดูก, ม ้าม และตับ แบ่งรูปของการสะสมออกเป็ น
2 ชนิด คือ
1) Ferritin ประกอบด้วย apoferritin ซึ่งมีรูปร่างเป็ นสี่เหลี่ยมลูกบาศก์ค่อนไปทางกลม ภายนอกมี
เปลือก 6 ด้าน มีช่องว่างให้ธาตุเหล็กผ่านเขา้ ไปรวมตัวอยู่ท่ี แกนกลาง (iron core) ในลักษณะเป็ นผลึกขนาดเล็กของ
hydrous ferric complex พบได้เกือบทุกเซลล์ของร่างกาย ferritin ในเซลล์ตบั และ macrophage ทาหน้าที่เป็ นแหล่งให้
ธาตุเหล็กในการสังเคราะห์ Hb และ heme proteins อื่น ๆ การสะสมในลักษณะนี้จะป้ องกันมิให้ธาตุเหล็กทาให้เกิด
oxidative damage
2) Hemosiderin เป็ น partially deproteinized ferritin หมายถึง ferritin ที่หลุดออกจาก
apoferritin protein shell และเกาะรวมกันเป็ นผลึกของ ferric ซึ่งมีคุณสมบัติต่างกับ ferritin ตรงที่ไม่สามารถละลายนา้
ได้ พบมากในตับ, ม ้ามและไขกระดูกเช่นเดียวกับ ferritin
3. Extracellular ferric ion รวมอยู่กบั transferrin ซึ่งเป็ น glycoprotein ที่ทาหน้าที่นาธาตุเหล็กจากลาไส้
และ reticuloendothelial cells ไปที่ไขกระดูกเพื่อใช้ในการสังเคราะห์เม็ดเลือดแดงหรือนาไปเก็บไว้ใน storage pool
transferrin ที่จบั กับธาตุเหล็กเรียกว่า saturated transferrin ในภาวะปกติ มีประมาณ 100 g/L ซึ่งเท่า ๆ กับ serum
iron

กระบวนการดูดซึมและขนส่งธาตุเหล็ก
ธาตุเหล็กจากอาหาร (dietary iron) ถูกดูดซึมได้ท่ลี าไส้เล็กประมาณร้อยละ 10 โดยธาตุเหล็กในอาหารมี 2 รู ป
คือ 1) heme iron พบใน Hb, myoglobin และเอนไซม์บางชนิด สามารถดูดซึมได้ดีในร่างกาย 2) nonheme iron พบ
เป็ นส่วนใหญ่ในอาหารประเภทพืช อาจพบได้บา้ งในอาหารประเภทสัตว์บางชนิด ดูดซึมได้ไม่ค่อยดี อาหารส่วนใหญ่มธี าตุ
เหล็กที่เป็ น Fe3+ เป็ นองค์ประกอบ แต่ลาไส้จะดูดซึมในสภาพ Fe2+ เป็ นหลัก ดังนัน้ จึงต้องมีกระบวนการเปลี่ยนให้เป็ น
Fe2+ ก่อน โดยใช้กรด HCI ใน gastric secretion
บริเวณ brush border ของลาไส้เล็กมี divalent metal transporter 1 (DMT1) ทาหน้าที่ขนส่งธาตุเหล็กในรู ป
ferrous จากทางเดินอาหารเข ้ามาภายในเซลล์ลาไส้เล็ก ferric iron ถูก reduce ด้วยเอนไซม์ ferric reductase ที่บริเวณ
brush border เพื่อช่วยในการดูดซึม กระบวนการดู ดซึมมีการควบคุมเป็ นอย่างดี เพื่อให้เป็ นไปตามความต้องการของ
ร่างกายอย่างแท้จริง hepcidin เป็ น small peptide ที่สร้างจากตับ มีหน้าที่ยบั ยัง้ การดูดซึมธาตุเหล็ก โดยอัตราการสร้าง
hepcidin เป็ นไปตาม iron store ในตับ
การดูดซึมธาตุเหล็กแบ่งได้เป็ น 3 ระยะดังนี้
1) Intraluminal phase เป็ นระยะที่อาหารถูกย่อยโดยกรดในกระเพาะอาหารและเอนไซม์จากตับอ่อน แล้ว
ปล่อยธาตุเหล็กออกมาในรูป soluble form หรือ Fe2+
2) Mucosal (cellular) phase เป็ นระยะที่เหล็กถูกดูดซึมเขา้ มาในเซลล์ลาไส้เล็ก มีการใช้ ferric reductase
เพื่อเปลีย่ นจาก ferric iron ให้เป็ น ferrous iron ก่อนดูดซึม แล ้วขนส่งผ่าน DMT1 เมือ่ เข ้ามาแล้ว ธาตุเหล็กส่วนหนึ่งจะ
อยู่ในรูป ferritin (Fe3+) ซึ่งมักจะถูกขับออกไปกับ enterocyte ที่ตายลงไปในอุจจาระ อีกส่วนหนึ่งอาศัย ferroportin 1

การตรวจวิเคราะห์ธาตุเหล็ก 70
2
(FP1) ร่วมกับ hephaestin (ceruloplasmin-like molecules) ซึ่งเป็ น ferroxidase เปลี่ยน ferrous ให้เป็ น ferric จับ
กับ transferrin ในเลือด (สามารถจับเหล็กได้ 2 อะตอม)
3) Corporeal (circulatory) phase เป็ นระยะที่เหล็กจับกับ transferrin เพื่อไปเก็บสารองหรือใช้ในการสร้าง
เม็ดเลือดแดง

รูปที่ 1 กระบวนการดูดซึมธาตุเหล็ก
(ทีม่ า: Mahan LK, et al; 2008.)

ปัจจัยกาหนดการดูดซึมธาตุเหล็ก แบ่งได้เป็ น 2 ปัจจัย ดังนี้

1) ปัจจัยเพิ่มการดูดซึม
 ความเป็ นกรดของกระเพาะอาหาร โดย HCl มีส่วนในการเปลีย่ น ferric เป็ น ferrous iron เข ้าใจว่า ภาวะ
ที่มคี วามเป็ นกรด ทาให้ ferric iron อยู่ในรูปไออน ถูก reduce ด้วย ferric reductase ได้งา่ ย
 สารที่มค ี ุณสมบัติรีดิวซ์ (reducing agent) เช่น ascorbic acid, glutathione ช่วย reduce ferric ให้
เป็ น ferrous iron
 สารอาหารบางชนิด เช่น fructose, alcohol ส่งเสริมการดูดซึม
 ความต้องการธาตุเหล็กที่เพิ่มขึ้นของร่ างกาย เช่น ภาวะการตัง้ ครรภ์, หญิงให้นมบุตร, ผู ป้ ่ วยโลหิตจาง,
เด็กที่กาลังเจริญเติบโต

การตรวจวิเคราะห์ธาตุเหล็ก 71
3
 2) ปัจจัยลดการดูดซึม
 ภาวะเป็ นด่างในลาไส้ เช่น ทานยาลดกรดในกระเพาะอาหาร, ทานอาหารที่เป็ นด่าง หรือภาวะที่กระเพาะ
อาหารหลังกรด
่ HCl ไม่ได้
 ส่วนประกอบของของสารที่เจือปนกับธาตุเหล็กในอาหาร เช่น phosphate, phytate, oxalate จะไปจับกับ
ธาตุเหล็กเป็ น insoluble complex ยากต่อการดูดซึม

รูปที่ 2 เมตาบอลิสมของธาตุเหล็กในผูใ้ หญ่

(ทีม่ า: Mahan LK, et al; 2008.)

เทคนิคการตรวจวิเคราะห์ระดับเหล็กในร่างกาย
การตรวจวิเคราะห์เพื่อบ่งชี้ความผิดปกติท่เี กี่ยวข ้องกับธาตุเหล็กในร่างกายมีหลายวิธีดว้ ยกัน ได้แก่ serum iron
(total iron content), total iron binding capacity (TIBC), transferrin saturation และ serum ferritin นอกจากนี้
ยังมีการตรวจทางโลหิตวิทยา เช่น ปริมาตรเม็ดเลือดแดงอัดแน่น (packed red cell volume), จานวนเม็ดเลือดแดง
(erythrocyte count) และดัชนีเม็ดเลือดแดง (erythrocyte indices) เป็ นต้น

การตรวจวัดปริมาณธาตุเหล็กในเลือด
การตรวจหาความเข ้มข้นของธาตุเหล็กในเลือดจะจาเพาะต่อ Fe3+ ที่จบั อยู่กบั transferrin และไม่ใช่ iron ที่อยู่ใน
รูป free Hb ในนา้ เลือด ตัวอย่างตรวจที่ใช้อาจเป็ น serum หรือ heparinized plasma แต่ anticoagulants ชนิดอื่น ๆ
เช่น oxalate, citrate, หรือ ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ไม่เหมาะที่จะใช้ เนื่องจากจับกับ Fe ion ได้ เวลา

การตรวจวิเคราะห์ธาตุเหล็ก 72
4
เก็บตัวอย่างตรววจที่แนะนา คือช่วงตอนเช้า (early morning) เนื่องจากระดับของธาตุเหล็กมีความแตกต่า งในระหว่างวัน
(diurnal variation) ตัวอย่างตรวจที่มี visible hemolysis ไม่สามารถนามาใช้ตรวจได้
วิธีการตรวจใช้หลักการ Spectrophotometry ซึ่งในปัจจุบนั มีการ adapt ให้ใช้กบั เครื่องวิเคราะห์อตั โนมัติได้
หลัก การวิเ คราะห์ป ระกอบด้วยขัน้ ตอนหลัก ๆ ดังนี้ 1) ทาให้ Fe3+ หลุดออกจาก transferrin โดยการลด pH
(acidification) ของ serum 2) ใช้ ascorbate หรือ reducing agent อื่น ๆ ไป reduce Fe3+ ให้เป็ น Fe2+ 3) Fe2+ จับ
เป็ นสารเชิงซ้อน (complex) กับ chromogen เช่น ferrozine, ferene, thiocyanate o-phenanthroline หรื อ
bathophenanthroline แล ้ววัดค่าการดูดกลืนแสง
ในปี ค.ศ. 1971 Persijn และคณะ ใช้ ferrozine เป็ น chromogen ทาปฏิกิริยากับ Fe2+ เกิดเป็ นสารประกอบ
เชิงซ้อนสีมว่ ง (ดังปฏิกิริยาด้านล่าง) วัดการดูดกลืนแสงได้ท่ี 560 nm
ac d c ed u
Fe (III) → Fe (II)
Fe(II) + Ferrozine → Violet Colored Complex

การตรวจความสามารถในการจับธาตุเหล็กโดยรวม
ความสามารถในการจับธาตุเหล็ก (total iron binding capacity; TIBC) หมายถึง ปริมาณธาตุเหล็กที่นามาใช้
จับกับ transferrin ทัง้ หมดในเลือด โดยในภาวะปกติ มี transferrin ประมาณ 1 ใน 3 ที่จบั อยู่กบั เหล็ก ส่วนที่เหลือ
เรียกว่า unsaturated iron-binding capacity (UIBC) ค่า TIBC นี้ช่วยประเมินปริมาณของ transferrin ในเบื้องต้นได้
TIBC วัดได้จากการเติม Fe3+ ที่มปี ริมาณเพียงพอเขา้ ไปจับกับ binding site ของ transferrin ให้หมด เติม
MgCO3 เขา้ ไปเพื่อตกตะกอนเอา Fe3+ ส่วนเกินที่ไม่ได้จ บั กับ transferrin ออก แลว้ ปัน่ เหวี่ย งเพื่อ เก็บเฉพาะ
supernatant ที่มี soluble iron ซึ่งจับ transferrin นาไปวิเคราะห์ดว้ ยวิธีวดั ปริมาณธาตุเหล็กข ้างต้น
ในวิธีวดั TIBC ของ Pointe Scientific ใช้การวัดโดยอ้อมจากค่า unsaturated iron-binding capacity
(UIBC) ซึ่งหมายถึงปริมาณธาตุเหล็กที่สามารถจับกับ transferrin ส่วนที่เป็ น unsaturated หลักการวัดกระทาได้โดยเติม
ferrous ion (Fe2+) ที่ทราบปริมาณลงใน serum ในสภาวะ alkaline pH โดย Fe2+ จะไปจับกับ binding site ส่วนที่
เหลือของ transferrin ที่เรียกว่า unsaturated iron-binding sites วัดปริมาณ Fe2+ ที่เหลือจากการจับกับ transferrin
ด้วย ferrozine reaction นาค่าที่ได้มาคานวณเพื่อหา UIBC โดยการหาความแตกต่างระหว่างปริมาณ Fe2+ ที่เติมในการ
ทดสอบกับปริมาณ Fe2+ ที่เหลือจากการจับ transferrin สาหรับ TIBC หาได้จาก นา UIBC รวมกับ serum iron
UIBC = Known Fe2+ - Measured unbound Fe2+
TIBC = UIBC + Serum iron
พิกดั อ้างอิงของ TIBC มีค่าประมาณ 250-425 g/dL
นอกจากนี้ ยังสามารถหาค่าร้อยละการอิม่ ตัวของ transferrin (transferrin saturation) ได้จาก
Transferrin saturation (%) = 100 x serum iron/TIBC
พิกดั อ้างอิงของ percent saturation ประมาณร้อยละ 20-50 แต่ vary ได้ตามอายุและเพศ
การตรวจวัดระดับทรานสเฟอร์รินและเฟอร์ริติน
ระดับ transferrin วัดได้โดยหลักการ immunochemistry เช่น nephelometry ระดับของ transferrin หรือ
TIBC จะเพิ่มขึ้นในภาวะพร่องธาตุ เหล็ก (iron deficiency) และจะลดลงในภาวะเหล็กเกิน (iron overload) และ
การตรวจวิเคราะห์ธาตุเหล็ก 73
5
hemochromatosis นอกจากนี้ transferrin ยังอาจลดลงในภาวะติดเชื้อเรื้อรังหรือมะเร็ง (malignancies) ดังแสดงใน
ตารางที่ 2
ระดับของ transferrin นิยมใช้เป็ นตัวชี้บ่งถึงสภาวะทางโภชนาการ ในภาวะที่มกี ารอักเสบ ระดับของ transferrin
จะลดลง เนื่องจากเป็ น negative acute-phase protein
ระดับของ ferritin ใน serum ตรวจวัดได้โดย immunochemical methods เช่น Immunoradiometric
assay (IRMA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) และ chemiluminescent techniques ระดับของ
ferritin ลดลงในภาวะโลหิตจางจากการขาดธาตุเหล็ก (iron-deficiency anemia) แต่จะเพิ่มขึ้นในภาวะ iron overload
และ hemochromatosis นอกจากนี้ยงั มีระดับเพิ่มขึ้นได้ในภาวะต่าง ๆ เช่น chronic infections, malignancy และ
viral hepatitis

ตารางที่ 1 แสดงพิกดั อ้างอิงของสถานะธาตุเหล็กในร่างกาย

(ทีม่ า: Bishop ML, et al; 2010)
Serum iron Transferrin Ferritin Percent TIBC
กลุ่มผูป้ ่ วย
(g/dL) (mg/dL) (g/dL) saturation (g/dL)
Newborn 100-250 130-275 25-200 12-50 100-400
Infant 40-100 200-360 200-600 12-50 100-400
Child 50-120 200-360 7-140 12-50 100-400
Male (adult) 50-160 200-380 20-250 20-55 250-425
Female (16-40 years) 45-150 200-380 10-120 15-50 250-425
Female (>40 years) 10-250

ตารางที่ 2 ผลการตรวจสถานะธาตุเหล็กในสภาวะต่าง ๆ
(ทีม่ า: Bishop ML, et al; 2010)

การตรวจวิเคราะห์ธาตุเหล็ก 74
6
เอกสารอ้างอิ ง
1. Bishop ML, Fody EP, Schoeff LE, editors. Clinical Chemistry: Techniques, principles,
correlations. 6th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2010.
2. Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, editors. Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry. 6th ed. St.
Louis: Saunders Elsevier; 2008
3. Ramakrishnan S, Sulochana KN, editors. Manual of medical laboratory techniques. New Delhi:
Jaypee Brothers Medical Publishers; 2012.
4. Turgeon ML. Linne & Ringsrud’s cl n cal laboratory sc ence: the basics and routine techniques.
6th ed. China: Elsevier Mosby; 2012.
5. Mahan LK, Escott-Stump S, editors. Krause's food & nutrition therapy. 12th ed. St. Louis:
Saunders; 2008.
6. มานะ โรจนวุฒนนท์, บรรณาธิการ. พยาธิวิทยาคลินิก. พิมพ์ครัง้ ที่ 2. กรุงเทพฯ: ภาควิชาพยาธิวิทยา คณะ
แพทยศาสตร์โรงพยาบาลรามาธิบดี มหาวิทยาลัยมหิดล; 2556.
7. นีโลบล เนื่องตัน, บรรณาธิการ. ชีวเคมี 2. พิมพ์ครัง้ ที่ 7. กรุงเทพฯ: ภาควิชาชีวเคมี คณะแพทยศาสตร์ศิริราช
พยาบาล มหาวิทยาลัยมหิดล; 2549
8. Pointe Scientific. Iron/TIBC Reagent Set; 2009.

การตรวจวิเคราะห์ธาตุเหล็ก 75
7
 ปฏิบัติการ
การตรวจวัดระดับธาตุเหล็กและความสามารถในการจับธาตุเหล็ก
(ชุดทดสอบของ Pointe Scientific)

หลักการ
Serum iron: ปล่อยธาตุเหล็ก (Fe3+) จาก transferrin ด้วยกรด และ reduce ให้กลายเป็ น Fe2+ ซึ่งจะทา
ปฏิกิริยาได้กบั ferrozine เกิดเป็ นสารประกอบเชิงซ้อนสีมว่ ง วัดการดูดกลืนแสงได้ท่ี 560 nm
TIBC: เติม Fe2+ ที่ทราบปริมาณลงใน serum ภายใต้สภาวะ pH เป็ นเบส จะเกิดการจับกันระหว่าง Fe2+ และ
transferrin ที่ unsaturated iron-binding sites ส่วนของ Fe2+ ที่เหลือนาไปวัดด้วย ferrozine reaction ความแตกต่าง
ระหว่างปริมาณ Fe2+ ที่เติมลงในปฏิกิริยากับ unbound Fe2+ ที่วดั ได้ เรียกว่า unsaturated iron-binding capacity
(UIBC) ส่วน TIBC หาได้จาก TIBC = serum iron concentration + UIBC
ความสาคัญทางคลินิก
ระดับของ serum iron ลดลง พบได้ในภาวะ chronic blood loss, insufficient intake หรือ absorption of
iron และภาวะที่มกี ารเพิ่มความต้องการเก็บ iron เช่น ผูห้ ญิงตัง้ ครรภ์ เป็ นต้น ผูป้ ่ วยที่มรี ะดับ iron สูงขึ้น พบได้ในภาวะ
เพิ่มการทาลาย red cell, ลดการสังเคราะห์ red cell, เพิ่มการ intake หรือเพิ่มการปล่อย iron จากแหล่งเก็บในร่างกาย
ระดับของ TIBC สูงขึ้น อาจเนื่องมาจากภาวะเพิ่มการสังเคราะห์ apotransferrin เช่น ภาวะพร่องธาตุเหล็กเรื้อรัง
เป็ นต้น หรือภาวะเพิ่มการปล่อย ferritin เช่น hepatocellular necrosis เป็ นต้น ระดับของ TIBC ลดลงได้ในภาวะตับ
แข็ง (cirrhosis) และ hemochromatosis เนื่องจาก เกิดภาวะพร่อง ferritin หรือ ใน nephrosis เนื่องจากการสูญเสีย
apothransferrin

น้ายาตรวจวิเคราะห์
1. Iron buffer reagent: Hydroxylamine hydrochloride 220 mM in acetate buffer, pH 4.5 with
surfactant.
2. UIBC buffer reagent: Tris 500mM, pH 8.1 with surfactant, Sodium Azide 0.05% (w/v) as
preservative.
3. Iron color reagent: Ferrozine 16.7mM in hydroxylamine hydrochloride.
4. Iron standard (500 g/dL): Ferrous chloride in hydroxylamine hydrochloride.

ตัวอย่างตรวจวิเคราะห์
1. ควรใช้ fresh และ unhemolyzed serum
2. ต้องแยก serum ให้เร็ว เมือ่ เกิด clot แล ้ว
3. สามารถใช้ heparinized plasma ได้ แต่สารต้านการแข็งตัวของเลือดชนิดอื่น ๆ ไม่ควรใช้ เพราะอาจมีการ
ปนเปื้ อนจาก iron
4. serum iron มีความคงตัวประมาณ 4 วันที่อุณหภูมหิ อ้ ง และ 7 วันที่อุณหภูมิ 2-8oC

การตรวจวิเคราะห์ธาตุเหล็ก 76
8
สารรบกวนการตรวจวิเคราะห์
1. ยาหรือสารบางชนิดที่มผี ลรบกวนต่อระดับของ circulating iron
2. เหล็กที่อยู่ใน Hb ไม่เข ้าทาปฏิกิริยากับวิธีน้ ี ดังนัน้ hemolysis เล็กน้อย จึงไม่รบกวนการตรวจวัด แต่หากมี
gross hemolysis สามารถรบกวนการตรวจวิเคราะห์ได้จากการดูดกลืนแสง
3. อุปกรณ์ท่ใี ช้ในการทดสอบ เช่น หลอดทดลอง, ปิ เปตต์ เป็ นต้น ต้องทาให้ปราศจาก iron โดยการล ้างด้วย 1%
or 0.1 N HCI หรือ HNO3 แลว้ ตามด้วยการลา้ งด้วยนา้ กลัน่ (distilled water) หรือ deionized water ที่ไม่มี iron
หลาย ๆ ครัง้

วิธีการตรวจวัดระดับธาตุเหล็ก
1. เติมสารต่าง ๆ ลงในแต่ละหลอด ดังตาราง
Blank Standard Control Sample
Iron buffer reagent
2.5 2.5 2.5 2.5
(mL)
Iron-free water (mL) 0.5 - - -
Standard (mL) - 0.5 - -
Control (mL) - - 0.5
Sample (mL) - - - 0.5
2. เขย่าผสมให้เข ้ากัน แล้ววัดการดูดกลืนแสงที่ 560 nm โดยใช้ reagent blank (RB) ปรับ 0
3. บันทึกผลการดูดกลืนแสง (A1 reading) แล ้วเติมสารลงในหลอด
Iron color reagent
0.05 0.05 0.05 0.05
(mL)
4. เขย่าผสมให้เข ้ากัน แล ้วนาไปบ่มที่ 37oC เป็ นเวลา 10 นาที
5. วัดการดูดกลืนแสงที่ 560 nm โดยใช้ RB ปรับ 0 อ่านค่าการดูดกลืนแสง (A2 reading)

วิธีการคานวณ

est - est
Serum iron (g/dL) x Conc. of Std
td - td
วิธีการตรวจวัด UIBC
1. เติมสารต่าง ๆ ลงในแต่ละหลอด ดังตาราง
Blank Standard Control Sample
UIBC buffer reagent
2.0 2.0 2.0 2.0
(mL)
Iron-free water (mL) 1.0 0.5 - -
การตรวจวิเคราะห์ธาตุเหล็ก 77
9
 Blank Standard Control Sample
Standard (mL) - 0.5 0.5 0.5
Control (mL) - - 0.5 -
Sample (mL) - - - 0.5
2. เขย่าผสมให้เข ้ากัน แล้ววัดการดูดกลืนแสงที่ 560 nm โดยใช้ reagent blank (RB) ปรับ 0
3. บันทึกผลการดูดกลืนแสง (A1 reading) แล ้วเติมสารลงในหลอด
Iron color reagent
0.05 0.05 0.05 0.05
(mL)
4. เขย่าผสมให้เข ้ากัน แล ้วนาไปบ่มที่ 37oC เป็ นเวลา 10 นาที
5. วัดการดูดกลืนแสงที่ 560 nm โดยใช้ RB ปรับ 0 อ่านค่าการดูดกลืนแสง (A2 reading)

วิธีการคานวณ
est - est
UIBC (g/dL) = Conc. of Std - x Conc. of Std
td - td

ความแตกต่างระหว่าง A1 Test และ A2 Test ในบางครัง้ อาจต่างกันน้อยมาก เนื่องจากมีระดับ unsaturation

ของ transferrin กับ iron สูงมาก ควรนาตัวอย่างตรวจมาเจือจางในอัตราส่วน 1:1 ด้วย iron-free water และตรวจ
วิเคราะห์อีกครัง้ ผลที่ได้นามาคูณด้วย 2
การคานวณหา TIBC
Iron Level + UIBC = TIBC (g/dL)
SI Unit Conversion g/dl x 0.179 = mo/L

การตรวจวิเคราะห์ธาตุเหล็ก 78
10
 การตรวจวิเคราะห์ก๊าซในเลือด

อ.ทนพ. สุวิทย์ คล่องทะเล

คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยเวสเทิร์น

การตรวจวิเคราะห์ก๊าชในเลือด (blood gas analysis) เป็ นส่วนหนึ่งของการตรวจทางเคมีคลินิกที่สะท้อนถึง

สมรรถภาพของระบบหายใจ โดยในสภาวะปกติ ร่างกายมีการแลกเปลีย่ นก๊าซผ่านทางระบบหายใจ (respiratory system)
ซึ่งใช้ปอดในการนาเอา O2 เข ้าสู่เลือดแดง แล้วจับกับ hemoglobin ของเม็ดเลือดแดงนาไปเลี้ยงอวัยวะหรือเนื้อเยื่อต่าง ๆ
ในขณะเดียวกัน CO2 ที่เป็ นของเสียจากกระบวนการใช้พลังงานของเซลล์ก็ถูกขับออกจากปอดวนเวียนเป็ นวัฏจักรเช่นนี้ ไป
เรื่อย ๆ การตรวจวิเคราะห์กา๊ ซในเลือด นอกจากจะบ่งถึงการทางานของปอดแล ้ว ยังเกี่ยวเนื่องกับระบบการควบคุมสมดุล
กรดด่างอีกด้วย
การตรวจวิเคราะห์กา๊ ซในเลือด ประกอบด้วย ค่า pH, แรงดันย่อยของ O2 (partial pressure of oxygen; PO2
หรือ PaO2), แรงดันย่อยของ CO2 (partial pressure of CO2; PCO2 หรือ PaCO2), HCO3-, การอิ่มตัวของออกซิเจน
(Oxygen saturation; SO2) นอกจากนี้ ยังอาศัยค่า anion gap ในการวิเคราะห์ร่วมด้วย
วัตถุประสงค์ของการตรวจนี้ สามารถสรุปได้ คือ
1. ประเมินสมรรถภาพของปอด
2. ประเมินการขนส่ง oxygen (oxygenation), การระบายอากาศ (ventilation)
3. วิเคราะห์สมดุลกรดด่าง (acid-base balance)

สิ่ งส่งตรวจและขัน้ ตอนก่อนการวิ เคราะห์

ก่อนการเก็บสิ่งส่งตรวจ ต้องมีการเตรียมผูป้ ่ วยให้อยู่ในสภาวะพักอย่างน้อย 5 นาที เนื่องจากอารมณ์ ความรู ส้ ึก
ความกลัว ของผู ป้ ่ วยก่ อ นการเก็ บ สิ่ ง ส่ ง ตรวจท า ให้เ กิ ด ความแปรปรวนของก๊ า ซได้จ ากการที่ ผู ป้ ่ วยหายใจเร็ ว
(hyperventilation) เป็ นผลให้ CO2 ถูกขับออกมาก ค่า PCO2 ที่วดั ได้จึงลดลง และยังส่งผลต่อค่า pH ที่สูงขึ้นด้วย
ในกรณีท่ผี ูป้ ่ วยได้รบั การรักษาด้วยการให้ออกซิเจน ควรเจาะเก็บสิ่งส่งตรวจหลังจากให้ออกซิเจนไปแล ว้ อย่างน้อย
20 นาที เพราะผูป้ ่ วยโรคปอดส่วนใหญ่มคี วามผิดปกติใน ventilation จึงต้องรอเวลาให้ผูป้ ่ วยมีการแลกเปลีย่ นก๊าซเต็มที่
ชนิ ดของสิ่งส่งตรวจสาหรับวิเคราะห์กา๊ ซในเลือด ได้แก่
1. เลือดจากเส้นเลือดแดง (arterial blood)
เป็ นสิ่งส่งตรวจที่นิยมใช้สาหรับวิเคราะห์กา๊ ซในเลือด เพราะบ่งชี้ถงึ ระดับของออกซิเจนได้ดที ่สี ุด มักเจาะ
ที่แขนผูป้ ่ วย เส้นเลือดที่เลือกเจาะได้แก่ brachial artery เป็ นเส้นเลือดแดงบริเวณขอ้ พับของขอ้ ศอก, radial artery
บริเวณข ้อมือ, femoral artery บริเวณขาหนีบ และ dorsalis pedis artery บริเวณหลังเท้า การเจาะเก็บเลือดแดงกระทา
โดยแพทย์ท่มี คี วามเชี่ยวชาญ เนื่องจากเป็ นหัตถการที่มคี วามเสี่ยงทางการแพทย์สูง เช่น เกิด hematoma, thrombosis
เป็ นต้น

การตรวจวิเคราะห์ก๊าซในเลือด 79
1
 สารต้านการแข็งตัวของเลือดที่แนะนาให้ใช้ คือ heparin ชนิดผง (lyophilized) เนื่องจากไม่ทาให้เกิด
dilutional effect หากไม่มกี ็สามารถใช้ liquid heparin เคลือบภายในหลอด syringe ได้ แต่ตอ้ งกาจัดของเหลว
ส่วนเกินออก มิฉะนัน้ จะส่งผลต่อผลการตรวจโดยเฉพาะ PCO2 ที่จะลดลง
การเจาะเก็บเลือดนิยมใช้ท่ี radial artery มากที่สุด และควรตรวจการไหลเวียนเลือดด้วย modified
Allen test เสียก่อน โดยให้ผูป้ ่ วยกามือแน่น แลว้ ผูเ้ จาะใช้มอื กดบริเวณ ulnar artery และ radial artery ให้ผูป้ ่ วยกาง
นิ้วออก และปล่อยการกด ulnar artery ออก มือจะเปลีย่ นจากซีดเป็ นสีแดงทันที หากยังคงซีดแสดงว่า การไหลเวียนเลือด
มีปญั หา ควรเลือกเจาะจากเส้นเลือดแดงที่อ่นื

รูปที่ 1 Modified Allen test

(ทีม่ า: http://nursingcrib.com/demo-checklist/allens-test/)

เมื่อ ได้ต วั อย่างเลือ ดแลว้ รี บนาส่งห้อ งปฏิบ ตั ิก ารโดยทันที และควรเก็บสิ่งส่งตรวจในเกล็ดนา้ แข็ง

โดยเฉพาะกรณีท่ไี ม่สามารถตรวจทันภายใน 10-15 นาที เพื่อยับยัง้ อัตราการเกิด metabolism ของเม็ดเลือดแดง ซึ่งจะมี
ผลให้ค่า pH และ PO2 ลดลง ส่วน PCO2 สูงขึ้น อย่างไรก็ตาม ในผูป้ ่ วยที่มี leukocyte count มากกว่า 100,000
cells/microliter หรือ high platelet count ต้องทาการตรวจ blood gas ภายหลังเจาะเลือดทันที
กรณีท่ี sample มีอากาศปนจากภายนอก อาจเกิดในขณะเจาะเก็บเลือดหรือขัน้ ตอนการวิเคราะห์ จะทา
ให้ค่า PCO2 ลดลง เนื่องจากในอากาศมี PCO2 น้อยมาก ส่วนค่า PO2 แปรปรวนไปจากความเป็ นจริง อาจมากขึ้นหรือ
น้อยลง ขึ้นอยู่กบั PO2 ของผูป้ ่ วยในขณะนัน้ ว่ามากหรือน้อยกว่า PO2 ในอากาศ
2. เลือดจากเส้นเลือดฝอย (capillary blood)
เป็ นอีกทางเลือกในการเก็บเลือด ในกรณีท่ไี ม่สามารถเจาะเก็บเลือดแดงได้ โดยเฉพาะในเด็กเล็ก โดย
ตาแหน่งที่นิยมเจาะ คือ บริเวณด้านข้างของฝ่ าเท้า นอกจากนี้ อาจใช้ตาแหน่งใบหู หรือปลายนิ้วได้ ควรระลึกอยู่เสมอว่า
PO2 จะน้อยกว่าในเลือดแดง แต่ PCO2 สูงกว่าในเลือดแดง ส่วน pH น้อยกว่าเลือดแดงประมาณ 0.02-0.05
3. เลือดจากเส้นเลือดดา (venous blood)
ใช้ในกรณีศึกษาการลัดของเลือดในปอด (arteriovenous shunt)

เทคนิ คการตรวจวิ เคราะห์กา๊ ซในเลือด

ปัจจุบนั มีเครื่องวิเคราะห์อตั โนมัติท่ผี นวกการตรวจวิเคราะห์กา๊ ซในเลือดแต่ละชนิดไว้ดว้ ยกันในเครื่องเดียว โดย
ใช้หลัก การทางไฟฟ้ าเคมี (electrochemistry) มี electrode ที่จ าเพาะต่ อสารที่ตอ้ งการวัด เรี ยกว่า Ion selective
electrode (ISE) ได้แก่ pH electrode สาหรับวัดความต่างศักย์ไฟฟ้ าที่เกิดจาก H+, PCO2 electrode สาหรับวัดค่า
การตรวจวิเคราะห์ก๊าซในเลือด 80
2
PCO2 ทางอ้อม และ PO2 electrode สาหรับวัดค่า PO2 โดยใช้ ammeter ส่วน HCO3- นัน้ อาศัยจากการคานวณตาม
สมการของ Henderson-Hasselbalch ดังต่อไปนี้

1. การตรวจวิเคราะห์ PO2
ระบบการตรวจ PO2 ประกอบด้วย special glass รู ปทรงกระบอก ภายในมี silver/silver chloride
ทาหน้าที่เป็ น anode และมี platinum (Pt) ทาหน้าที่เป็ น cathode และทัง้ หมดนี้จ่มุ อยู่ภายในสารละลาย electrolyte คือ
NaCl การตรวจหา PO2 ใช้หลักการวัดการไหลของกระแสในวงจร เรียกว่า amperometric ซึ่งสัมพันธ์กบั ปริมาณของ O2
ที่ถูก reduce ที่ cathode โดย oxygen electrode นี้มี O2 permeable membrane ห่อหุม้ ที่ส่วนปลาย เพื่อเป็ นเยื่อ
เลือกผ่านแต่เฉพาะ O2 เท่านัน้
ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นเป็ นดังนี้
1) Cathode (มีโลหะ platinum)
O2 + 2H2O + 4e-  2H2O2 + 4e-  4OH-
4OH- + 4NaCl  4NaOH + 4Cl-
2) Anode
4Ag + 4Cl-  4AgCl + 4e-
เมือ่ O2 ที่ละลายใน sample แพร่ผ่านเยื่อเลือกผ่านเข ้ามาใน electrolyte และสัมผัสกับ cathode แล้ว
จะถูก reduce โดย electron ที่มาจากขัว้ anode ในระบบ มีการให้ศกั ย์ไฟฟ้ าประมาณ -0.6 V และมี microammeter
อยู่ระหว่าง cathode และ anode เพื่อวัดการไหลของกระแส จากปฏิกิริยาขา้ งต้น จะเห็นได้ว่า มี electron จานวน 4
electron วิ่งเขา้ มาที่ cathode ทุก ๆ 1 โมลของ O2 ซึ่งสามารถวัดการไหลของกระแสได้อย่างสัมพันธ์กบั PO2 ใน
sample

รูปที่ 2 Electrode ตรวจวัด PO2

(ทีม่ า: http://www.derangedphysiology.com/php/Arterial-blood-gases)
การตรวจวิเคราะห์ก๊าซในเลือด 81
3
 อย่างไรก็ตาม O2 permeable membrane นี้ อาจอนุ ญาตให้ก๊าซอื่น ๆ ที่มใิ ช่ O2 ผ่านได้ เช่น CO2
และ N2 เป็ นต้น แต่กา๊ ซเหล่านี้จะไม่ถูก reduce ที่ cathode หากมีการควบคุมศักย์ไฟฟ้ าอย่างดี

2. การตรวจวิเคราะห์ pH
การตรวจวิเคราะห์ pH เป็ นการวัดความต่างศักย์ไฟฟ้ าที่เรียกว่า potentiometric ซึ่งเกิดจาก proton
(H+) ระบบการวัดประกอบด้วย electrode 2 ชนิด คือ 1) electrode ตรวจวัด (measuring electrode) เป็ น H+
sensitive glass membrane ภายในบรรจุนา้ ยาบัฟเฟอร์ 2) electrode อ้างอิง (reference electrode) เป็ นแท่งแก้วรู ป
ทรงกระบอกยาว มีลวดนาไฟฟ้ า silver อยู่ในสารละลายเข ้มข้น เช่น saturated KCl ส่วนปลายของ electrode มีรูเปิ ดที่
เรียกว่า breathing hole เป็ นจุดเชื่อมต่อกับสารละลาย electrode อ้างอิงที่นิยมใช้ได้แก่ saturated calomel electrode
และ Ag/AgCl electrode
ในเครื่องมือวัด pH มี voltmeter สาหรับวัดค่าความต่างศักย์ ( E) ระหว่าง 2 electrode ประกอบอยู่
ความต่างศักย์น้ สี มั พันธ์กบั ความเข ้มข้นของ H+ ตามสมการของ Nernst ดังนี้
ที่ 25oC
เมือ่ E0 คือ standard potential of electrochemical cell
n คือ charge of analyte ion i
ai คือ activity of analyte ion i

รูปที่ 3 pH electrode
(ทีม่ า: http://www.seafriends.org.nz/dda/ph.htm)

3. การตรวจวิเคราะห์ PCO2
หลักการวัด PCO2 เหมือนกับการวัด pH คือ ใช้ potentiometry แต่เป็ นการวัดโดยอ้อม หรืออาจกล่าว
ว่าเป็ นวิธีดดั แปลงการวัด pH เครื่องตรวจวัดประกอบด้วย pH sensitive glass electrode แช่อยู่ใน electrolyte ซึ่ง
ส่วนใหญ่เป็ น bicarbonate buffer, KCl และมี reference electrode Ag/AgCl องค์ประกอบทัง้ หมดนี้ถูก หุม้ ด้วยเยื่อ
เลือกผ่านที่อนุญาตให้เฉพาะ CO2 ใน sample เท่านัน้ ผ่านได้ เมื่อมี CO2 แพร่ผ่านเยื่อเลือกผ่านเขา้ มาทาปฏิกิริยากับนา้
การตรวจวิเคราะห์ก๊าซในเลือด 82
4
เกิดเป็ น H2CO3 (carbonic acid) แล ้วจะแตกตัวเป็ น bicarbonate และ H+ โดย H+ ที่เกิดขึ้นนี้จะถูกตรวจวัดด้วย pH
sensitive electrode ซึ่งเป็ นปฏิภาคโดยตรงกับ PCO2

รูปที่ 4 PCO2 measurement

(ทีม่ า: http://www.derangedphysiology.com/php/Arterial-blood-gases)

4. การตรวจวิเคราะห์ความอิ่มตัวของออกซิเจน
ความอิ่มตัวของออกซิเจน วัดได้โดยวิธี spectrophotometry ที่อาศัยการดูดซับคลื่นแสงต่างกันของ
hemoglobin ในแต่ ล ะรู ป แบบ ทัง้ นี้ ในคนปกติ hemoglobin ในเลือ ดแบ่ ง ออกได้เ ป็ น 4 รู ป แบบ คื อ 1)
oxyhemoglobin (O2Hb) เป็ น hemoglobin ที่จบั กับ O2 แบบ reversible 2) deoxyhemoglobin (HHb; reduced
hemoglobin) เป็ น hemoglobin ในสภาพรี ดิ ว ซ์ มิไ ด้จ ับ กับ O2 แต่ ส ามารถจับ ได้ใ นภาวะที่มี O2 3)
carboxyhemoglobin (COHb) เป็ น hemoglobin ที่จบั กับ CO แบบ reversible แต่สมั พรรคภาพในการจับแข็งแรงกว่า
hemoglobin กับ O2 200 เท่า 4) methemoglobin (MetHb) เป็ น hemoglobin ที่ไม่สามารถจับกับ O2 ได้
เนื่องจาก Fe อยู่ในสภาพออกซิไดซ์ คือ Fe3+ แต่สามารถ reduce กลับเป็ น Fe2+ ได้ดว้ ยการเร่งของ methemoglobin
reductase ในเม็ดเลือดแดง วิธีการวัดความอิ่มตัวของ O2 อาจแบ่งได้เป็ น
4.1 Oxygen saturation (SO2)
เป็ นการวัดโดยอาศัยหลักการ spectrophotometry เช่น เครื่องตรวจวัดความอิ่มตัวออกซิเจน
ของ hemoglobin จากชีพจร (pulse oximeter) วัดโดยอาศัยหลักการดูดซับคลืน่ แสงที่แตกต่างกันของ O2Hb และ HHb
ซึ่ง O2Hb ดูดซับคลืน่ แสงช่วงความยาวคลื่น 660 (600-750) nm (คลื่นแสงสีแดง) ส่วน HHb ดูดซับคลื่นแสงความยาว
คลืน่ 940 (850-1000) nm (คลืน่ อินฟาเรด) เครื่อง pulse oximeter จะปล่อยคลื่นแสง 2 ช่วงคลื่น คือ คลื่นความยาว
660 และ 940 nm เมือ่ ได้ค่าความเข ้มข้นของ hemoglobin 2 ชนิดแล ้ว คานวณเป็ น SO2 ดังสมการ

การตรวจวิเคราะห์ก๊าซในเลือด 83
5
 SO2 = x 100

ค่าอ้างอิงในผูใ้ หญ่ คือ ประมาณร้อยละ 94-98 อย่างไรก็ตาม ค่า SO2 ด้วยวิธีน้ มี ขี ้อจากัด เนื่องจากยังมี
hemoglobin อีกหลายชนิดที่ไม่ถูกนามาคานวณ อาจเรียกการวัดด้วยวิธีน้ วี ่า functional hemoglobin saturation
4.2 Fractional oxyhemoglobin (FO2Hb)
อาศัยหลักการ spectrophotometry เช่น co-oximetry เป็ นการตรวจที่ใช้ความยาวคลื่นแสง
4 ช่วง (ปัจจุบนั มีการพัฒนาให้สามารถวัดได้มากกว่า 4 ช่วง) เพื่อให้สามารถวัดความเข ้มข้นของ hemoglobin แต่ละชนิด
ได้ อาจเรียกอีกชื่อว่า arterial oxygen saturation (SaO2) ค่าอ้างอิงในผูใ้ หญ่มคี ่าประมาณร้อยละ 90-95
FO2Hb = x 100

รูปที่ 5 คุณสมบัติการดูดซับคลืน่ แสงของ hemoglobin แต่ละชนิด

(ทีม่ า: http://www.masimo.com/rainbow/about.htm)

4.3 Estimated oxygen saturation

ใน blood gas analyzer มีการคานวณค่าการอิ่มตัวของออกซิเจนจาก PO2 โดยการเทียบจาก
oxygen-hemoglobin dissociation curve (รูปที่ 7) ค่าที่ได้ดว้ ยวิธีน้ ี จะถูกต้องก็ต่อเมื่อ hemoglobin concentration
และระดับของ 2,3 DPG มีค่าปกติ และไม่มคี วามผิดปกติของ hemoglobin อื่น ๆ ร่วมด้วย CLSI จึงไม่แนะนาให้ใช้ค่านี้
ในการประเมินผูป้ ่ วย

การแปลผลการตรวจวิ เคราะห์
โดยทัว่ ไป การแปลผลการตรวจวิเคราะห์ก๊าซ ทาได้โดยการประเมินระดับออกซิเจนในเลือด ประเมินภาวะการ
หายใจ และประเมินสภาวะกรด-ด่างในร่างกาย โดยอาศัยผลการตรวจทางห้องปฏิบตั ิการหลายขอ้ มูลมาช่วย การส่งตรวจ
ก๊าซในเลือดมักกระทาในกรณีท่ผี ูป้ ่ วยมีอาการรุนแรง เช่น ผูป้ ่ วยในหอฉุกเฉิน ผูป้ ่ วยในหอผูป้ ่ วยหนัก (intensive care
unit; ICU) ผูป้ ่ วยที่อยู่ในระหว่างการดมยาเพื่อผ่าตัด ผูป้ ่ วยที่ได้รบั การรักษาด้วยการให้ O2, ผูป้ ่ วยที่มภี าวะการหายใจ

การตรวจวิเคราะห์ก๊าซในเลือด 84
6
ล ้มเหลว และผูป้ ่ วยที่มกี ารเสียสมดุลของกรด-ด่าง เช่น ผูป้ ่ วยที่ได้รบั สารพิษ ผูป้ ่ วยท้องเสียอย่างรุนแรง ผูป้ ่ วยไตวาย เป็ น
ต้น ข้อมูลที่นามาใช้ในการวิเคราะห์ ได้แก่
1. Blood pH บ่งชี้ถงึ สภาวะความเป็ นกรดหรือด่างของร่างกาย โดยในเลือดแดงมี pH อยู่ท่ี 7.35-7.45 ส่วนใน
เลือดดามีค่า pH ประมาณ 7.32-7.42 หากค่า pH ในเลือดแดงอยู่นอกเหนื อช่วง 6.9-7.7 ร่างกายไม่สามารถทนได้
(survival unlikely)

รูปที่ 6 ค่า pH ในเลือดแดงกับความสัมพันธ์ทางคลินิก

(ทีม่ า: Malley WJ; 2005)

2. PO2 บ่งชี้ถึง oxygenation ของเลือด ในเลือดแดงมีค่าประมาณ 80-100 mmHg (Torr) ส่วนเลือดดามี

ค่าประมาณ 40 mmHg กรณีท่มี ี PO2 ตา่ กว่า 80 mmHg เรียกว่า hypoxemia ซึ่งแบ่งระดับ severity ได้ 3 ระดับ คือ
mild hypoxemia (60-80 mmHg), moderate hypoxemia (40-60 mmHg) และ severe hypoxemia (น้อยกว่า 40
mmHg)
3. PCO2 บ่งชี้ถึงสภาวะการหายใจของผูป้ ่ วย CO2 ในร่างกายแบ่งออกเป็ น 3 รู ป คือ NaHCO3 ละลายอยู ใน
plasma คิดเป็ นร้อยละ 63 อีกประมาณร้อยละ 29 จับอยู่กบั reduced hemoglobin เป็ น carbamino compound ใน
เม็ดเลือดแดง ส่วน CO2 อีกร้อยละ 8 ละลายอยู่ใน plasma ค่า PCO2 ที่วดั ได้จากเครื่องเป็ นการวัดส่วน dissolved CO2
โดยปกติในเลือดแดงมี PCO2 ประมาณ 35-45 mmHg ในเลือดดา ประมาณ 41-51 mmHg หากร่างกายมีการหายใจเร็ว
ที่เรียกว่า alveolar hyperventilation ค่า PCO2 ที่วดั ได้จะน้อยกว่าปกติ (hypocapnia) แต่หากร่างกายมี alveolar
hypoventialation ค่า PCO2 จะมากกว่าปกติ (hypercapnia)
4. HCO3- บ่งชี้ถงึ สภาวะความเป็ นกรด-ด่างของร่างกาย มีค่าปกติในเลือดแดงประมาณ 21-28 mEq/L ในเลือดดา
ประมาณ 22-29 mEq/L ค่านี้ เครื่องมือวิเคราะห์อาจใช้การคานวณ หรือวัดโดยตรง
5. SO2 เป็ นค่าที่บอกถึงสภาวะการจับตัวกันของ O2 กับ hemoglobin ในเม็ดเลือดแดง นิยมแสดงเป็ นค่าร้อยละ
โดยปกติในเลือ ดแดงมีค่า ประมาณร้อ ยละ 97 ส่วนเลือ ดดาประมาณร้อ ยละ 40-70 การจับตัวกันของ O2 และ
hemoglobin อยู่ภายใต้ปจั จัยต่าง ๆ ได้แก่ อุณหภูม,ิ PCO2, pH และ 2,3-diphosphoglycerate (2,3-DPG) ซึ่งอธิบาย
ได้ตาม oxyhemoglobin dissociation curve กรณี ท่เี ป็ น shift to the right แสดงว่า O2 affinity ของ hemoglobin
ลดลง เกิดจาก pH ลดลง, 2,3-DPG, อุณหภูมิ และ PCO2 เพิ่มขึ้น กรณี shift to left แสดงว่า O2 affinity ของ
hemoglobin เพิ่มขึ้น ทาให้การปล่อย O2 แก่เซลล์ลดลง เกิดจาก pH เพิ่มขึ้น, 2,3-DPG, อุณหภูมิ และ PCO2 ลดลง

การตรวจวิเคราะห์ก๊าซในเลือด 85
7
 รูปที่ 7 oxygen-hemoglobin dissociation curve
(ทีม่ า: http://lifeinthefastlane.com/ccc/oxygen-haemoglobin-dissociation-curve/)

6. Base excess (BE) หรือค่าด่างเกิน ได้จากครื่องวิเคราะห์ทาการตรวจวัดด่างหรือกรดที่ตอ้ ง titrate เพื่อให้

เลือดมี pH กลับมาที่ 7.4 ที่ PCO2 40 mmHg ปกติ BE มีค่าประมาณ -2.5 ถึง +2.5 mEq/L บ่งชี้ถึงความผิดปกติทาง
metabolic เท่านัน้ หากค่า BE มากกว่าปกติช่วยบ่งถึงภาะว metabolic alkalosis หาก BE น้อยกว่าปกติช่วยบ่งถึงภาวะ
metabolic acidosis อย่างไรก็ตาม มีแพทย์บางท่านระบุว่า การใช้ BE ในการแปลผลการตรวจวิเคราะห์ก๊าซในเลือดไม่
ใคร่จะมีประโยชน์เท่าใดนัก เนื่องจากมีความซับซ้อนในการตรวจวัดและแปลผล และไม่ค่อยมีประโยชน์ในการประยุกต์ใช้
ทางคลินิก รวมทัง้ ค่าที่วดั ได้ระหว่าง in vitro และ in vivo มีความแตกต่างกันอย่างมาก
7. Anion gap เป็ นค่าที่บอกถึงความสมดุ ลของประจุไฟฟ้ า (electroneutrality) ในส่วนของเหลวของร่างกาย
โดยปกติมคี ่า เฉลี่ยประมาณ 12 mEq/L หรือ 8-16 mEq/L ซึ่งหาได้จาก Anion gap = [Na+] - [Cl- + HCO3-] หรือ
เขียนอีกนัยหนึ่งว่า Anion gap = [unmeasured anion] - [unmeasured cation] โดยค่า anion gap อาจเพิ่มขึ้นหรือ
ลดลงได้ ในภาวะต่าง ๆ ดังนี้
7.1 ภาวะที่มี anion gap สูงขึ้น เกิดจาก 1) มี organic acid สะสมในเลือดจากภาวะต่าง ๆ เช่น
lactic acidosis, ketoacidosis, renal failure, intoxication, rhabdomyolysis ทาให้มี unmeasured anion เพิ่ม
สูงขึ้น 2) กรณีท่เี กิด metabolic alkalosis ร่วมกับภาวะขาดนา้ ในร่างกาย โดยอาจเกิดจาก albumin มีความเขม้ ข้นมาก
ขึ้น 3) ความผิดพลาดในการตรวจวิเคราะห์ หากผูป้ ่ วยยังคงมีอาการปกติดี แต่ผลมีความผิดปกติก็ชวนให้คานึงได้
7.2 ภาวะที่มี anion gap ลดลง เกิดจาก 1) มี unmeasured cation เพิ่มขึ้น จากภาวะต่าง ๆ เช่น z
ผูป้ ่ วย multiple myeloma ซึ่งมีระดับ Ca2+ สูงในเลือด, ภาวะ hypermagnesemia, ภาวะ hypercalcemia และผูป้ ่ วย
ที่ได้ร บั ยาบางชนิด เช่น lithium ที่เกินขนาด เป็ นต้น 2) ภาวะที่ unmeasured anion ลดลง เช่น ภาวะ hypo-
albuminemia โดยพบว่า ค่า anion gap จะลดลงประมาณ 2.5 mEq/L ทุก ๆ การลดลงของ albumin ในเลือด 1 g/dL
จาก 4 g/dL
นอกจากนี้ anion gap ยังสามารถนาไปคานวณเพื่อหาค่า anion gap excess หรือ delta gap ได้
เพื่อช่วยในการวินิจฉัย mixed acid-base disorders โดยคานวณได้จาก gap = AG - HCO3- หรืออาจเขียน
ใหม่ได้ว่า gap = [measured AG - reference AG] - [reference HCO3-] - measured HCO3-] หรือ gap =
(measured AG - 12) - (24 - measured HCO3-) ค่าปกติของ gap คือ ประมาณ 0  6 หากค่าน้อยกว่า -6 ช่วยบ่งชี้

การตรวจวิเคราะห์ก๊าซในเลือด 86
8
ว่ามีภาวะ normal anion gap metabolic acidosis หรือ chronic respiratory alkalosis ร่วมอยู่ เนื่องจากค่า HCO3-
น่าจะน้อยกว่าปกติ หากค่า มากกว่า +6 แสดงว่ามีภาวะ metabolic alkalosis ร่วมอยู่ดว้ ย เนื่องจากค่า HCO3- สูงกว่า
ปกติมาก
วิธีการแปลผลการตรวจวิเคราะห์กา๊ ซในเลือด
การแปลผลอาจแบ่งได้เป็ น การแปลผลที่เกี่ยวกับกรด-ด่าง การแปลผลที่เกี่ยวกับออกซิเจน และการแปลผลที่
เกี่ยวกับสภาพการหายใจ ในที่น้ จี ะได้กล่าวโดยรวม
1. ประเมิน oxygenation
- พิจารณาได้จาก PO2 แลว้ แปลผลเป็ น normoxia หรือ hypoxemia การแปลผล PO2 มีประโยชน์ในการ
วินิจฉัยภาวะเขียว (cyanosis) ในผูป้ ่ วยได้ ตามหลักเกณฑ์ต่อไปนี้
1) ถ้าหากพบว่า PO2 ตา่ ร่วมกับมี PCO2 สูงกว่า 45 mmHg สาเหตุการเกิด cyanosis น่าจะมาจาก
hypoventilation หรือ diffusion defect อย่างรุนแรง
2) ถ้าหากค่า PO2 ตา่ ร่วมกับ PCO2 ตา่ หรือปกติ สาเหตุท่เี ป็ นไปได้คือ ventilation perfusion defect
และ right to left shunt defect แยกจากกันได้ดว้ ย hypoxia test โดยให้ผูป้ ่ วยได้รบั ออกซิเจนลดลงจากร้อยละ 14,
12 และ 10 ตามลาดับ หากค่า PO2 เพิ่มขึ้นแสดงว่าเป็ น ventilation perfusion defect แต่ถา้ ค่า PO2 ไม่เพิ่มขึ้น แสดง
ว่าเป็ น right to left shunt defect
- พิจารณาจาก SO2
- พิจารณาจาก ความแตกต่างระหว่างความดันออกซิเจนในถุงลมปอดและในเลือด (D(A-a)O2) เขียนเป็ นสมการ
ได้ว่า D(A-a)O2 = PAO2 - PaO2 ซึ่งค่า PAO2 นี้คานวณได้จาก PAO2 = (FiO2 x 713) – (PaCO2 / R)
เมือ่ FiO2 คือ สัดส่วนปริมาณของออกซิเจนในอากาศที่หายใจ
713 คือ ค่าที่ได้จากความดัน 1 บรรยากาศ (1 atm = 760 mmHg, ความดันนา้ = 47
mmHg) = 760 – 47
R คือ respiratory quotient เป็ นสัดส่วนระหว่างปริมาตรของ CO2 production กับ O2
consumption เป็ นค่าคงที่เท่ากับ 0.8
เราสามารถเขียน D(A-a)O2 ได้ใหม่ว่า
D(A-a)O2 = (FiO2 x 713) – PaCO2 - PaO2
โดยปกติมคี ่าประมาณ 15-20 mmHg แต่เปลี่ยนแปลงได้ตามอายุ (ผูป้ ่ วยสูงอายุ มีค่าปกติ = 0.4 x
อายุ ) หากค่าสูงกว่าปกติ อาจเกิดจาก ventilation/perfusion (V/Q) mismatch หรือ ภาวะ shunt ซึ่งอาจเกิดจาก
anatomical shunt (เกิดจาก venous blood ไม่ไหลผ่า นถุง ลม แต่ ใช้เ ส้น ทางอื่ นทาให้เ กิดการผสมระหว่า ง
deoxygenated blood กับ oxygenated blood) เช่น ตับแข็ง, โรคหัวใจพิการแต่กาเนิด เป็ นต้น หรือ shunt disease
เช่น acute respiratory distress syndrome, pulmonary edema เป็ นต้น
2. พิจารณาสภาพการหายใจ
ตัวแปรที่ใช้ประเมินสภาพการหายใจที่สาคัญ คือ PCO2 หากค่ามากกว่า 45 mmHg แสดงว่ามี alveolar
hypoventilation แต่ถา้ มากกว่า 80 mmHg แสดงว่ามี severe alveolar hypoventilation ในทางตรวกันขา้ มหากมีค่า

การตรวจวิเคราะห์ก๊าซในเลือด 87
9
น้อยกว่า 35 mmHg แสดงว่ามี alveolar hyperventilation อย่างไรก็ตาม ในผูห้ ญิงตัง้ ครรภ์ ค่าปกติของ PCO2 จะอยู่ท่ี
28-32 mmHg เนื่องจาก progesterone ไปกระตุน้ ศูนย์ควบคุมการหายใจในสมอง
3. พิจารณาสภาวะกรด-ด่าง (รูปที่ 8)
3.1 ตรวจสอบความถูกต้องของผลการตรวจโดยหาความแตกต่างระหว่าง HCO3- ที่ได้จากการคานวณ
ของการวิเคราะห์เลือดแดงเทียบกับค่าที่ได้จากการวัดจริงของ PCO2 จากสูตร
H+ = 24 x PCO2 / HCO3-
ค่าที่ได้ตอ้ งต่างกันไม่เกิน 2 จึงจะยืนยันว่าไม่มคี วามผิดพลาดของผลการตรวจ

รูปที่ 8 แนวทางการวินิจฉัยความผิดปกติสมดุลกรด-ด่าง
3.2 ประเมินค่า blood pH ว่าเป็ น acidemia หรือ alkalemia
3.3 พิจารณาค่า PCO2 และ HCO3- เพื่อหาความผิดปกติแบบปฐมภูมิ (primary disturbance) โดยดู
ความสัมพันธ์กบั ค่า pH ควรคานึงอยู่เสมอว่า PCO2 เป็ นตัวแทนของ respiratory cause ส่วน HCO3- เป็ นตัวแทนของ
metabolic cause
3.4 พิจารณาว่ามีการปรับชดเชย (compensation) หรือไม่ โดยการดูทิศทางการปรับค่าเพื่อต้านกับ
primary disturbance
หากค่า pH ห่างไปจากปกติมากและไม่มกี ารปรับแก้เลย แสดงว่าเป็ น acute
การตรวจวิเคราะห์ก๊าซในเลือด 88
10
 หากมีการปรับแก้ และ pH เข ้าใกล ้ค่าปกติ แสดงว่าเป็ น partially compensate (subacute)
หากมี full compensation และ pH เข ้าสู่เกณฑ์ปกติ แสดงว่าเป็ น chronic
3.5 คานวณหา anion gap
3.6 เปรียบเทียบค่า anion gap และค่า HCO3- จากสูตร AG / HCO3- พิจารณาได้ดงั นี้
- น้อยกว่า 0.4 บ่งชี้ภาวะ normal anion gap metabolic acidosis
- 0.4-0.8 บ่งชี้ภาวะ wide and normal anion gap metabolic acidosis
- มากกว่า 2 บ่งชี้ภาวะ metabolic alkalosis และ wide anion gap metabolic acidosis
ความสัมพันธ์ทางคลินิกและผลการตรวจทางห้องปฏิบตั ิการ
ผลการตรวจก๊าซในเลือดที่ได้ มีความสัมพันธ์กบั อาการทางคลินิก เช่น
1. เมือ่ PCO2 มากกว่า 80 mmHg หรือ pH 7.25 ผูป้ ่ วยมักซึมและพูดไม่รูเ้ รื่อง
2. หาก PCO2 มากกว่า 100 mmHg และ pH น้อยกว่า 7.14 ผูป้ ่ วยอาจหมดสติได้ โดยขึ้นอยู่กบั อัตราการ
เพิ่มขึ้นของ PCO2 ด้วย ถ้าเพิ่มเร็วอาการจะปรากฏเร็ว
3. PCO2 น้อยกว่า 40-50 mmHg หรือ O2 saturation น้อยกว่าร้อยกว่า 75-80 ผูป้ ่ วยมี cyanosis ได้

ตารางที่ 1 ความผิดปกติของผลการตรวจก๊าซในเลือดกับภาวะต่าง ๆ
(ทีม่ า: จิตลัดดา ดีโรจนวงศ์ และคนอื่น ๆ; 2546)

การตรวจวิเคราะห์ก๊าซในเลือด 89
11
ตัวอย่างการแปลผล
กรณีศึกษาที่ 1 (จิตลัดดา ดีโรจนวงศ์ และคนอื่น ๆ; 2546)
ผูป้ ่ วยเด็กหญิงอายุ 12 ปี underlying asthma มาโรงพยาบาลด้วยอาการหายใจหอบเหนื่อยมา 2 ช.ม. ผลการ
ตรวจ arterial blood gas เป็ นดังนี้
pH 7.47, PCO2 34 mmHg, PO2 75 mmHg, HCO3- 24.5 mEq/L, BE +2.0 mEq/L, SO2 95%
วิเคราะห์ผล
1. oxygenation PO2 75 mmHg mild hypoxemia
2. ventilation PCO2 34 mmHg hyperventilation
3. gas exchange D(A-a)O2 = PAO2 - PaO2
= (FiO2 x 713) - (PaCO2 / R) - PaO2
= (0.21 x 713) - (34 / 0.8) - 75
= 33 mmHg abnormal
4. acid-base status
pH 7.47 alkalosis
PCO2 34 mmHg respiratory alkalosis
HCO3- 24.5 mEq/L normal
Compensation uncompensation
Analysis acute respiratory alkalosis
วิจารณ์กรณี ศึกษา
1. ผูป้ ่ วยมี mild hypoxemia, hyperventilation และ gas exchange ที่ผดิ ปกติ โดยสาเหตุของ hypoxemia
และ abnormal gas exchange น่าจะมาจาก ventilation/perfusion mismatch เพราะผูป้ ่ วยมีประวัติเป็ น asthma
2. ผูป้ ่ วยมี acute respiratory alkalosis จาก hyperventilation

กรณีศึกษาที่ 2 (Martin L; 1999)

ผูป้ ่ วยชายอายุ 58 ปี มาโรงพยาบาลด้วยอาการหายใจไม่อ่ิม (shortness of breath) ปกติผู ป้ ่ วยได้ร บั ยา
diuretic เพื่อรักษา hypertension และ aspirin สูบบุหรี่วนั ละ 1 ซอง ผลการตรวจ arterial blood gas เป็ นดังนี้
pH 7.53, PCO2 37 mmHg, PO2 62 mmHg, HCO3- 30 mEq/L, Hb 14 g%, SO2 87%, COHb 7.8%
(<3%)
วิเคราะห์ผล
1. oxygenation PO2 62 mmHg mild hypoxemia
2. ventilation PCO2 37 mmHg normoventilation
3. gas exchange D(A-a)O2 = PAO2 - PaO2
= (FiO2 x 713) - (PaCO2 / R) - PaO2
= (0.21 x 713) - (37 / 0.8) - 62
การตรวจวิเคราะห์ก๊าซในเลือด 90
12
 = 41.48 mmHg abnormal
4. acid-base status
pH 7.53 alkalosis
PCO2 37 mmHg normal
-
HCO3 30 mEq/L metabolic alkalosis
Compensation uncompensation
Analysis metabolic alkalosis
วิจารณ์กรณี ศึกษา
1. ผูป้ ่ วยมี mild hypoxemia และ gas exchange ที่ผิดปกติ โดยสาเหตุของ hypoxemia และ abnormal
gas exchange น่าจะมาจาก ventilation/perfusion mismatch ค่า SO2 ลดลง ส่วนหนึ่งน่าจะเกี่ยวกับ PO2 ลด แต่
สาเหตุหลักคือมี carboxyhemoglobin สูงขึ้น เนื่องจากสูบบุหรี่ ค่า CO2 ในผูป้ ่ วยถือว่าเพีย งพอ ไม่มี hyper- หรื อ
hypoventilation
2. ผูป้ ่ วยมี metabolic alkalosis น่าจะเป็ นผลมาจากการได้รบั diuretics ควรตรวจดูภาวะ hypokalemia

เอกสารอ้างอิ ง
1. จิตลัดดา ดีโรจนวงศ์, ดุสติ สถาวร, นวลจันทร์ ปราบพาล, บรรณาธิการ. New insights in pediatric critical
care. กรุงเทพฯ: ชมรมโรคระบบหายใจและเวชบาบัดวิกฤตในเด็กแห่งประเทศไทย; 2546.
2. ดุสติ จิรกุลสมโชค, สัญญา ร้อยสมมุติ, ปณคพร วรรณานนท์, เทิดไทย ทองอุ่น, วิยะดา ปัญจรัก. สรีรวิทยาของ
ไต ความผิดปกติของอิเ ล็ก โทรไลต์และของกรดด่า ง. พิมพ์ครัง้ ที่ 4. ขอนแก่ น : ภาควิชาสรี รวิทยา คณะ
แพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น; 2554.
3. บดินทร์ ขวัญนิมติ ร. การวัดความอิ่มตัวออกซิเจนของฮีโมโกลบินจากชีพจรในผูใ้ หญ่ . สงขลานครินทร์เวชสาร
2549;24(3):245-52.
4. พรรธนมณฑ์ อุชชิน, ชุติธร เกตุลอย, อรุณี ทองอัครนิโรจน์, รชต วรเวชวัฒนะ, ชรัต ทองประยู ร, บรรณาธิการ.
พยาธิวิทยาคลินิก . พิมพ์ครัง้ ที่ 4. กรุงเทพฯ: ภาควิชาเวชศาสตร์ชนั สู ตร คณะแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์
มหาวิทยาลัย; 2555.
5. มานะ โรจนวุฒนนท์, บรรณาธิการ. พยาธิวิทยาคลินิก. พิมพ์ครัง้ ที่ 2. กรุงเทพฯ: ภาควิชาพยาธิวิทยา คณะ
แพทยศาสตร์โรงพยาบาลรามาธิบดี มหาวิทยาลัยมหิดล; 2556.
6. วิโรจน์ ไววานิชกิจ. การตรวจวิเคราะห์กา๊ ซในเลือ ด. กรุงเทพฯ: สานักพิมพ์แห่งจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย; 2551.
7. สุทศั น์ รุ่งเรืองหิรญั ญา. การตรวจวิเคราะห์ก๊าซในเลือดแดง ตอนที่ 1 ขอ้ บกพร่องที่พบบ่อยและการแปลผล
เบื้องต้น. วชิรเวชสาร 2004;48(1):41-6.
8. สุทศั น์ รุ่งเรืองหิรญั ญา. การตรวจวิเคราะห์กา๊ ซในเลือดแดง ตอนที่ 2 การแปลผลสมดุลกรด-ด่างในเลือด. วชิร
เวชสาร 2004;48(2):117-22.

การตรวจวิเคราะห์ก๊าซในเลือด 91
13
 รายงานปฏิ บตั ิ การ

ชื่อ-สกุล___________________________________ รหัสนิสติ _________________

ตอนที่ 1 จงวิเคราะห์และวิจารณ์กรณีศึกษาต่อไปนี้
กรณีศึกษาที่ 1 (จิตลัดดา ดีโรจนวงศ์ และคนอื่น ๆ; 2546)
ผูป้ ่ วยเด็กหญิงอายุ 2 ปี มีไข ้ ไอ หอบมา 5 วัน เมือ่ มาถึงโรงพยาบาล มี cyanosis และหอบมาก แพทย์ใส่ท่อ
ช่วยหายใจและบีบ ambu bag ด้วย O2 100% หลังจากนัน้ เจาะเก็บเลือดแดง ผลการตรวจ blood gas เป็ นดังนี้
pH 7.32, PCO2 48 mmHg, PO2 70 mmHg, HCO3- 18.4 mEq/L
วิเคราะห์ผล
1. oxygenation ............................................................................................................................. ...............
2. ventilation .................................................................................................................................................
3. gas exchange ...........................................................................................................................................
.......................................................................................................................................................................................
.......................................................................................................................................................................................
............................................................................................................................. ..........................................................
4. acid-base status
.......................................................................................................................................................................................
.......................................................................................................................................................................................
.......................................................................................................................................................................................
.......................................................................................................................................................................................
วิจารณ์กรณี ศึกษา
............................................................................................................................. ..........................................................
............................................................................................................................................................................... ........
........................................................................................................................... ............................................................
............................................................................................................................. ..........................................................

กรณีศึกษาที่ 2
ผูป้ ่ วยชายอายุ 47 ปี มีประวัติการดื่มสุราอย่างหนัก มีอาการปวดท้องอย่างรุนแรง คลืน่ ไส้และอาเจียนมา 2 วัน
ผลการตรวจทางห้องปฏิบตั ิการเบื้องต้น:
sodium 132 mmol/L, chloride 92 mmol/L, HCO3- 16 mEq/L, creatinine 1.5 mg/dL (0.6-1.1),
amylase 400 U/L (30-110), lipase 250 U/L (0-160)
ผลการตรวจ blood gas:
pH 7.28, PCO2 34 mmHg, PO2 88 mmHg, HCO3- 16 mEq/L
การตรวจวิเคราะห์ก๊าซในเลือด 92
14
 วิเคราะห์ผล
1. oxygenation .......................................................................................................................... ..................
2. ventilation .................................................................................................................................................
3. gas exchange ...........................................................................................................................................
............................................................................................................................. ..........................................................
............................................................................................................................. ..........................................................
.......................................................................................................................................................................................
4. acid-base status
.......................................................................................................................................................................................
.......................................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................. .....................................................
.......................................................................................................................................................................................
วิจารณ์กรณี ศึกษา
............................................................................................................................. ..........................................................
............................................................................................................................. ..........................................................
................................................................................................................................................... ....................................
.......................................................................................................................................................................................

กรณีศึกษาที่ 3 (ดุสติ จิรกุลสมโชค และคนอื่น ๆ; 2554)

ผูป้ ่ วยชายอายุ 50 ปี มีอาการท้องเสีย กินยาปฏิชีวนะเพื่อทาลายเชื้อโรค และกินยาลดการเคลื่อนไหวของลาไส้
ผูป้ ่ วยยังคงมีอาการท้องเสียมากกว่า 10 วัน สภาพร่างกายแย่ลง ต่อมาผูป้ ่ วยทานไอศครีม แต่อาการกลับทรุดมากขึ้น ผล
การตรวจร่างกาย ผูป้ ่ วยมีอาการสับสน ไม่ให้ความร่วมมือกับแพทย์
ผลการตรวจทางห้องปฏิบตั ิการเบื้องต้น:
anion gap 19 mEq/L, Osmolal gap 0 mOsml/Kg H 2O, albumin 3.8 g/dL, ketoacid negative
ผลการตรวจ blood gas:
pH 7.2, PCO2 25 mmHg, HCO3- 10 mEq/L
วิเคราะห์ผล
1. ventilation ............................................................................................................... ..................................
2. acid-base status
.......................................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................. ......................
.......................................................................................................................................................................................
.......................................................................................................................................................................................
3. anion gap ................................................................................................................ .......................

การตรวจวิเคราะห์ก๊าซในเลือด 93
15
 วิจารณ์กรณี ศึกษา
.......................................................................................................................................................................................
............................................................................................................................. ..........................................................
............................................................................................................................. ..........................................................
.............................................................................................................................................................................. .........

ตอนที่ 2 จงตอบคาถามต่อไปนี้
1. การตรวจวิเคราะห์ blood gas ควรใช้ส่งิ ส่งตรวจชนิดใด
.................................................................................................................................................................. ....................
2. หากสิ่งส่งตรวจสัมผัสกับอากาศ จะส่งผลต่อค่า blood gas อย่างไร
.......................................................................................................................................................................... .............
...................................................................................................................... .................................................................
3. หากนาสิ่งส่งตรวจส่งห้องปฏิบตั ิการล่าช้า จะส่งผลต่อค่า blood gas อย่างไร
.......................................................................................................................................................................................
............................................................................................................................. ..........................................................
4. ผูป้ ่ วย diabetic ketoacidosis ควรมีผลการตรวจ blood gas เป็ นอย่างไรบ้าง
............................................................................................................................. ..........................................................
.......................................................................................................................................................................................
5. ระบุภาวะของผูป้ ่ วยลงในแต่ละช่อง
ผูป้ ่ วย pH pCO2 HCO3- ภาวะ
พลาธิป 7.32 28 14
พลาธวย 7.47 20 14
พลาธ้วย 7.08 49 14
พลาธ๋วย 7.51 49 38

6. เพราะเหตุใดในผูป้ ่ วย CO poisoning จึงมีค่า SO2 ที่วดั ด้วยวิธี pulse oximetry ปกติ

.......................................................................................................................................................................................
............................................................................................................................. ..........................................................
............................................................................................................................. ..........................................................
.......................................................................................................................................................................................
7. ผูป้ ่ วยรายหนึ่งมีอาการท้องร่วงรุนแรง มีผลการตรวจ blood gas คือ pH 6.98, PCO2 13 mmHg, HCO3- 3 mEq/L
7.1 ผูป้ ่ วยรายนี้มคี วามผิดปกติของกรด-ด่างอย่างไร
............................................................................................................................. ..........................................................
............................................................................................................................................................. ..........................
การตรวจวิเคราะห์ก๊าซในเลือด 94
16
 7.2 ในการช่วยเหลือผูป้ ่ วยให้พน้ อันตรายจาก pH ที่ตา่ มากให้เป็ น pH 7.20 โดยการให้สารละลาย NaHCO3 ถ้า
กาหนดให้ PCO2 คงที่ คือ 13 mmHg จะต้องทาให้ plasma HCO3- เพิ่มเป็ นเท่าไร (กาหนดให้ pH 7.20 มี H+ 63
mEq/L)
............................................................................................................................. ..........................................................
............................................................................................................................. ..........................................................
7.3 การทาให้ pH เปลี่ยนจาก 6.98 เป็ น 7.20 จะทาให้ alveolar ventilation ลดลง ถ้า PCO2 = 18 mmHg
จะต้องทาให้ plasma HCO3- เพิ่มเป็ นเท่าไร
............................................................................................................................. ..........................................................
............................................................................................................................. ..........................................................
8. ผูป้ ่ วยหญิงสาวอายุ 25 ปี ถูกนาส่งโรงพยาบาล ผู ป้ ่ วยพยายามฆ่าตัวตายด้วยการกิน aspirin ปริมาณมากเมื่อ 2-3
ชัว่ โมงก่อนมาโรงพยาบาล ผล arterial blood gas ในข้อใดเป็ นของผูป้ ่ วยรายนี้
pH PO2 (mmHg) PCO2 (mmHg) HCO3- (mEq/L)
ก 7.25 95 19 8
ข 7.29 55 60 28
ค 7.40 95 40 24
ง 7.59 95 16 15
จ 7.70 95 16 22

อย่าเกียจคร้านการเรียนเร่งอุตส่าห์ มีวิชาเหมือนมีทรัพย์อยู่นับแสน
จะตกถิน่ ฐานใดคงไม่แคลน ถึงคับแค้นก็พอยังประทังตน
อันความรู้รู้กระจ่างแต่อย่างเดียว แต่ให้เชี่ยวชาญเถิดจะเกิดผล
อาจจะชักเชิดชูฟูสกนธ์ ถึงคนจนพงศ์ไพร่คงได้ดี
เกิดเป็นชายชาวสยามตามวิสัย หนังสือไทยก็ไม่รู้ดูบัดสี
ต้องอับอายขายหน้าทั้งตาปี ถึงผู้ดีก็คงด้อยถอยตระกูล
จะต่่าเตี้ยเสียชื่อว่าโฉดช้า จะชักพายศลาภให้สาบสูญ
ทั้งขายหน้าญาติวงศ์พงศ์ประยูร จะเพิ่มพูนติฉินค่านินทา
หนึ่งหนังสือหรือต่ารับฉบับบท เป็นของล้วนควรจดจ่าศึกษา
บิดาปู่สู้เสาะสะสมมา หวังให้บุตรนัดดาได้ร่าเรียน

พระศรีสุนทรโวหาร (น้อย อาจารยางกูร)

การตรวจวิเคราะห์ก๊าซในเลือด 95
17
 MT2317 เคมีคลินิกทั่วไป (2-2557)
สารบ่งชี้มะเร็ง (Tumor markers)
ดร.วรวุฒิ สมศักดิ์ หัวหน้าสาขาวิชาเคมีคลินิก
คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยเวสเทิร์น

จงแปลผลการตรวจสารบ่งชี้มะเร็ง

Case study 1 ………………………………………………………………………………. Stage ……………………………………………………………….

Tumor markers Results Tumor markers Results
CEA H CA19-9 N
AFP H CA-125 N
CA15-3 HHH PSA N
CA27.29 HHH hCG HH

Case study 2 ………………………………………………………………………………. Stage ……………………………………………………………….

Tumor markers Results Tumor markers Results
CEA H CA19-9 HHH
AFP H CA-125 N
CA15-3 N PSA N
CA27.29 N hCG N

Case study 3 ………………………………………………………………………………. Stage ……………………………………………………………….

Tumor markers Results Tumor markers Results
CEA H CA19-9 H
AFP HHH CA-125 HH
CA15-3 N PSA N
CA27.29 N hCG HH

96
1
Case study 4 ………………………………………………………………………………. Stage ……………………………………………………………….
Tumor markers Results Tumor markers Results
CEA H CA19-9 N
AFP H CA-125 N
CA15-3 N PSA N
CA27.29 N hCG HHH

Case study 5 ………………………………………………………………………………. Stage ……………………………………………………………….

Tumor markers Results Tumor markers Results
CEA H CA19-9 HH
AFP H CA-125 HH
CA15-3 HH PSA N
CA27.29 HH hCG HH

Case study 6 ………………………………………………………………………………. Stage ……………………………………………………………….

Tumor markers Results Tumor markers Results
CEA H CA19-9 N
AFP H CA-125 N
CA15-3 N PSA HH
CA27.29 N hCG HH

97
2
ชื่อ................................................................ รหัส..............................................................
MT2317 เคมีคลินิกทั่วไป (2-2557)
เรื่อง สารบ่งชี้มะเร็ง (Tumor markers)
ดร.วรวุฒิ สมศักดิ์
หัวหน้าสาขาวิชาเคมีคลินิก คณะเทคนิคการแพทย์
มหาวิทยาลัยเวสเทิร์น

จงอธิบายความสัมพันธ์ทางคลินิกของภาวะต่างๆต่อไปนี้
1. Well-fed state
2. Early-fasting state
3. Fasting state
4. Exercise
5. Stress
6. Liver disease
7. Renal disease
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
98
Clinical Chemistry 58:5
826–830 (2012) Clinical Case Study

A 54-Year-Old Diabetic Man with Low Serum Cholesterol

Ugur Turk,1 Gunes Basol,2* Burcu Barutcuoglu,2 Fahri Sahin,3 Sara Habif,2
Patrizia Tarugi,4 and Oya Bayindir2

CASE DESCRIPTION
A 54-year-old asymptomatic man with a 5-year history
of type 2 diabetes mellitus (T2DM)5 was found to have
an extremely low serum cholesterol concentration. He
had no history of major childhood illness, malabsorp-
tion, or any cardiovascular or neurologic dysfunction.
He had smoked for 30 years and was not using alcohol
or any lipid-lowering drugs. Additionally, he was not a
vegetarian. His family history included stroke (father
died at age 52 years) and chronic kidney disease (57-
year-old brother). His eldest son had died of a sus-
pected myocardial infarction at the age of 21 years. The
patient had a blood pressure of 120/80 mmHg, a heart
rate of 78 beats/min, and a body mass index of 32 kg/m2.
The results of a physical examination were normal. He-
patic steatosis and mild hepatomegaly were observed via
abdominal ultrasonography. A transthoracic echocardio-
gram was normal, and the results of a treadmill exercise
test (Bruce protocol) were negative.
Laboratory studies were performed. Serum con-
centrations of liver enzymes, results of thyroid function
tests, and values of hematology parameters were all
normal, as were those for serum bilirubin, creatinine,
urea nitrogen, uric acid, and calcium. The fasting se-
rum glucose concentration was increased [155 mg/dL
(8.6 mmol/L); reference interval, 60 –110 mg/dL (3.33–
6.11 mmol/L)], and the patient’s hemoglobin A1c value
was 7% (reference interval, 4%– 6%). The laboratory
results for serum lipids, lipoproteins, apolipoproteins,
proteins, immunoglobulins, and fat-soluble vitamins
and provitamins are shown in Table 1. Of note, the
serum concentrations of total cholesterol (TC), triglyc-
1
Department of Cardiology, Central Hospital, Izmir, Turkey; Departments of
2
Clinical Biochemistry and 3 Hematology, Ege University Faculty of Medicine,
Izmir, Turkey; 4 Department of Biomedical Sciences, University of Modena e
Reggio Emilia, Modena, Italy.
* Address correspondence to this author at: Ege University Faculty of Medicine,
Department of Clinical Biochemistry, 35100 Izmir, Turkey. Fax: !90-232-
3392144; e-mail gunes.basol@ege.edu.tr.
This case was presented as a poster presentation at the IFCC-WorldLab and
EuroMedLab, Berlin 2011.
Received February 9, 2011; accepted July 20, 2011.
DOI: 10.1373/clinchem.2011.163543
5
Nonstandard abbreviations: T2DM, type 2 diabetes mellitus; TC, total cholesterol;
LDL-C, LDL cholesterol; apo B, apolipoprotein B; HBL, hypobetalipoproteinemia;
ABL, abetalipoproteinemia; CMRD, chylomicron retention disease; FHBL, familial
HBL; MGUS, monoclonal gammopathy of undetermined significance.
QUESTIONS TO CONSIDER
1. What are the typical lipid abnormalities seen in persons
with T2DM?
2. What are possible causes for low serum cholesterol,
LDL, and apo B?
3. What further testing could be done to clarify the cause
of the decreased lipid concentrations in this case?
4. Given the patient’s serum total protein and globulin
results, what additional testing should be performed?
erides, LDL cholesterol (LDL-C), and apolipoprotein B
(apo B) were all markedly decreased. The serum con-
centrations of total protein and globulin were both
high. The results of serologic tests for hepatitis A, B,
and C viruses and HIV were negative.
DISCUSSION
OVERVIEW OF HYPOBETALIPOPROTEINEMIA
Hypobetalipoproteinemia (HBL) is defined by plasma
concentrations of TC, LDL-C, or apo B that are lower
than the fifth percentile (1 ). Primary HBL includes
a group of genetic disorders: abetalipoproteinemia
(ABL), chylomicron retention disease (CMRD), and
familial HBL (FHBL). ABL and CMRD are very rare
recessive disorders caused by mutations in the MTTP6
(microsomal triglyceride transfer protein) and SAR1B
[SAR1 homolog B (S. cerevisiae)] genes, respectively.
ABL, a condition usually diagnosed early in life, fea-
tures steatorrhea, oral fat intolerance, acanthocytosis,
retinitis pigmentosa, and neurologic abnormalities.
The plasma lipid profile of ABL patients is characterized
by extremely low plasma TC, VLDL, and LDL concentra-
tions, and an almost complete absence of apo B. CMRD is
characterized by the absence of apo B-48 in plasma. Ste-
atorrhea, malnutrition, and growth retardation are the
main clinical manifestations of CMRD. Because hepatic
apo B synthesis is maintained, LDLs are present in the
plasma. FHBL is a codominant disorder with a frequency
6
Human genes: MTTP, microsomal triglyceride transfer protein; SAR1B, SAR1
homolog B (S. cerevisiae); APOB, apolipoprotein B (including Ag(x) antigen).

826 99
 Clinical Case Study

Table 1. Selected patient laboratory results with corresponding reference intervals.

Variable Result Reference interval

Lipids, lipoproteins, and apolipoproteins

TC, mg/dL (mmol/L) 70 (1.81) "200 (5.18)b
TG,a mg/dL (mmol/L) 22 (0.25) "150 (1.69)b
LDL-C, mg/dL (mmol/L) 10 (0.26) "100 (2.59)c
HDL-C, mg/dL (mmol/L) 56 (1.45) !60 (1.55)b
apo A-1, mg/dL (g/L) 106 (1.06) 104–202 (1.04–2.02)
apo B, mg/dL (g/L) "20 ("0.2) 66–133 (0.66–1.33)
Serum proteins and immunoglobulins
Total Protein, g/dL (g/L) 8.6 (86) 6.4–8.3 (64–83)
Albumin, g/dL (g/L) 4.2 (42) 3.5–5.2 (35–52)
Globulin, g/dL (g/L) 4.4 (44) 2.5–3.5 (25–35)
"2-Microglobulin, mg/L (nmol/L) 1.5 (127) 0.96–2.16 (81–183)
IgA, mg/dL (g/L) 2300 (23) 57–543 (0.57–5.43)
IgG, mg/dL (g/L) 696 (6.96) 700–1600 (7.00–16.00)
IgM, mg/dL (g/L) "25 ("0.25) 40–230 (0.4–2.3)
Fat-soluble vitamins and provitamins
Vitamin E, mg/dL (#mol/L) 0.52 (12.1) 0.60–1.80 (13.9–41.8)
"-Carotene, #g/dL (#mol/L) 7.2 (0.13) 10–80 (0.19–1.50)
a
TG, triglycerides.
b
Desirable value is indicated in parentheses.
c
Optimal value is indicated in parentheses.

in the heterozygous form of 1 in 500 to 1 in 1000. FHBL
heterozygotes are often symptom free but may also pres-
ent with nonalcoholic fatty liver disease and a mild in-
crease in the serum concentrations of liver enzymes.
FHBL homozygotes may experience severe fat malab-
sorption and show severe clinical and biochemical mani-
festations similar to those of ABL. Interestingly, plasma
apo B concentrations are lower than expected for the de-
ficiency of only 1 gene, as was the case here. Approxi-
mately 50% of FHBL patients are carriers of pathogenic
mutations in the APOB [apolipoprotein B (including
Ag(x) antigen)] gene. Most APOB mutations cause the
formation of truncated apo B forms, which have reduced
capacity to export lipids from the hepatocytes as lipopro-
tein constituents. Truncated apo B forms with a size
smaller than apo B-30 are not detectable in plasma be-
cause they are rapidly cleared. Detectable truncated forms
appear to be more frequent in patients with moderate
HBL, because long truncated apo B molecules maintain a
residual lipid-binding capacity to form lipoprotein parti-
cles. Truncated apo B molecules shorter than apo B-70.5
are cleared from the plasma mostly by the kidney, whereas
truncated apo B molecules with a size !70% of that of apo
B-100 are removed by the liver (1, 2 ).
HBL can also be caused by several nongenetic fac-
tors, such as a strict vegetarian diet, malnutrition,
drugs, and disease-related conditions. These factors are
regarded as secondary causes of HBL. Because the liver
plays a key role in the metabolism of most plasma lipo-
proteins and apolipoproteins, alterations in plasma lipid
patterns can be observed in conditions characterized by
hepatic cellular damage, such as infections by hepatitis B
and C viruses, cirrhosis, or hepatocellular carcinoma.
Chronic parenchymal liver diseases (including hepatocel-
lular carcinoma) lead to a decrease in plasma cholesterol
by impairing the synthesis and metabolism of cholesterol.
Moreover, increased consumption of cholesterol by tu-
mor cells plays a role in reducing serum cholesterol in
hepatocellular carcinoma (3 ). Advanced stages of HIV
infection are characterized by reduced TC, HDL-C, and
LDL-C concentrations and increased triglyceride con-
centrations in the plasma (4 ). Enhanced cholesterol
excretion and an increased LDL turnover are believed
to be responsible for the hypocholesterolemia seen in
hyperthyroidism (5 ). Malnutrition and inflammation are
thought to be responsible for the hypocholesterolemia
observed in chronic hemodialysis patients (6 ).
FURTHER ANALYSIS OF LOW LDL-C AND apo B
Secondary hyperlipoproteinemia with increased
VLDL-C concentrations and decreased HDL-C con-
centrations usually accompany T2DM. Noteworthy

Clinical Chemistry 58:5 (2012) 827

100
Clinical Case Study
was that despite the presence of T2DM, our patient had
very low lipid concentrations in the serum. When the
patient was questioned further, he remembered that he
had previously had low cholesterol concentrations
(data not available). To rule out interference in the
measurement, we analyzed the reaction kinetics of
the lipid parameters that had been measured with the
Roche Modular system and commercial kits. The reac-
tion curves were normal, and the patient’s data met all
the biochemical criteria for an HBL diagnosis.
In the differential diagnosis, secondary causes of
HBL were excluded first. The patient was not a vegetar-
ian and not using any lipid-lowering drugs. Further-
more, he had no signs, symptoms, or laboratory find-
ings of any disease that could be associated with
secondary HBL. Therefore, the patient’s disease was
diagnosed phenotypically as primary HBL.
ABL, CMRD, and homozygous FHBL are associ-
ated with a severe clinical phenotype, notably in chil-
dren and young adults (2 ). Our patient, however,
showed no evidence of malabsorption, retinitis pig-
mentosa, or neurologic disease, and there was no evi-
dence of acanthocytes. The mild clinical phenotype
strongly suggested the clinical diagnosis of heterozy-
gous FHBL. Given that the patient’s family history in-
cluded a sudden death of a son at a young age and that
heterozygous FHBL carriers of short truncated forms
might be at risk of developing more-severe liver disease
in the presence of other factors that can cause liver
injury, we confirmed our diagnosis through molecular
diagnosis by identifying the mutation in the APOB
gene. Sequence analysis of the APOB gene showed the
presence of a single-nucleotide substitution in exon 26
(c.7692C#T) in the heterozygous state. This substitu-
tion converts the arginine codon at position 2495 into a
termination codon (p.R2495X), leading to the forma-
tion of a truncated apo B containing 2494 amino acid
residues (instead of the 4536 residues in the full-length
apo B protein). This truncated apo B, designated apo
B-55 according to the accepted nomenclature, had pre-
viously been described in FHBL (7, 8 ).
FHBL, T2DM, AND CARDIOVASCULAR DISEASE
Cardiovascular disease is a well-known severe compli-
cation of T2DM. Prospective results from the Bruneck
Study showed that T2DM is a strong independent pre-
dictor of advanced carotid atherosclerosis (9 ). The use
of the thickness of the carotid intima-media as a surro-
gate marker of cardiovascular disease has been applied
in several trials that have investigated T2DM patients.
Although our patient had several cardiovascular risk
factors, he did not manifest any macrovascular compli-
cations. Additionally, his carotid intima-media thick-
ness (0.53– 0.58 mm) was normal and without athero-
sclerotic plaques. These findings suggest a protective
828 Clinical Chemistry 58:5 (2012) 101
POINTS TO REMEMBER
• HBL is defined by plasma TC, LDL-C, or apo B concen-
trations that are lower than the fifth percentile. HBL
may be caused by mutations in several genes (primary
HBL) and by several nongenetic factors, such as a strict
vegetarian diet, malnutrition, drugs, and disease-related
conditions (secondary HBL).
• FHBL is an autosomal codominant disorder that may be
caused by mutations in the gene encoding apo B that
lead to the formation of truncated apo B species.
• FHBL heterozygotes are often symptom free but may
also present with nonalcoholic fatty liver disease and a
mild increase in serum concentrations of liver enzymes.
The presence of FHBL can be protective against the
progression of atherosclerosis, owing to reduced life-
time exposure to atherogenic apo B– containing lipo-
proteins.
• MGUS is an asymptomatic premalignant disorder de-
fined by a serum monoclonal protein concentration
%3.0 g/dL (%30 g/L) and by %10% plasma cells in the
bone marrow without evidence of multiple myeloma or
other related malignant disorder.
effect of low LDL-C in FHBL and are consistent with
those of Pulai et al., who found no macrovascular com-
plications in two apo B-55 carriers with T2DM (8 ).
INVESTIGATION OF INCREASED TOTAL SERUM PROTEIN
The patient’s increased serum concentrations of total
protein and globulins prompted further evaluation. An
immunoglobulin quantification showed a greatly in-
creased IgA concentration, a markedly decreased IgM
concentration, and a borderline-low IgG concentra-
tion (Table 1). Serum protein electrophoresis revealed
a monoclonal spike of 1.57 g/dL (15.7 g/L) in the "
region. This monoclonal band was characterized via
serum immunofixation electrophoresis as an IgA$
band. Protein electrophoresis and immunofixation
electrophoresis of the urine did not reveal the presence
of a monoclonal protein. Plasma cells were slightly in-
creased (by 5%– 6%) in the bone marrow (reference
interval, 0.2%–2.2%). The radiologic skeletal survey
revealed no osteolytic lesions. Because the patient
showed no clinical manifestations related to the mono-
clonal gammopathy, such as hypercalcemia, anemia,
renal insufficiency, or bone lesions, he was diagnosed
with monoclonal gammopathy of undetermined sig-
nificance (MGUS). MGUS is an asymptomatic prema-
lignant disorder that is identified through routine
blood tests, usually in people !50 years of age. MGUS
 Clinical Case Study

is defined by a serum monoclonal protein concentra-
tion %3.0 g/dL (%30 g/L) and by %10% plasma cells in
the bone marrow without evidence of multiple my-
eloma or other related malignant disorder (10 ).
We therefore identified FHBL and MGUS inde-
pendently of each other in an asymptomatic diabetic
patient who was referred for further evaluation of his
extremely low serum cholesterol concentration. The
patient was sent to the endocrinology and gastroenter-
ology departments for follow-up of the T2DM and
fatty liver, respectively. Furthermore, the hematology
department started to monitor the patient, because pa-
tients with MGUS are at increased risk for progression
to multiple myeloma.
Author Contributions: All authors confirmed they have contributed to
the intellectual content of this paper and have met the following 3 re-
quirements: (a) significant contributions to the conception and design,
acquisition of data, or analysis and interpretation of data; (b) drafting
or revising the article for intellectual content; and (c) final approval of
the published article.
Authors’ Disclosures or Potential Conflicts of Interest: No authors
declared any potential conflicts of interest.

1. Schonfeld G. Familial hypobetalipoproteinemia: a
review. J Lipid Res 2003;44:878 – 83.
2. Tarugi P, Averna M, Di Leo E, Cefalu AB, Noto D,
Magnolo L, et al. Molecular diagnosis of
hypobetalipoproteinemia: an ENID review. Ath-
erosclerosis 2007;195:e19 –27.
3. Jiang J, Nilsson-Ehle P, Xu N. Influence of liver
cancer on lipid and lipoprotein metabolism. Lipids
Health Dis 2006;5:4.
4. Grunfeld C, Pang M, Doerrler W, Shigenaga JK,
Jensen P, Feingold KR. Lipids, lipoproteins, tri-
glyceride clearance, and cytokines in human im-
References
munodeficiency virus infection and the acquired
immunodeficiency syndrome. J Clin Endocrinol
Metab 1992;74:1045–52.
5. Duntas LH. Thyroid disease and lipids. Thyroid
2002;12:287–93.
6. Kaysen GA. Biochemistry and biomarkers of in-
flamed patients: why look, what to assess. Clin
J Am Soc Nephrol 2009;4(Suppl 1):S56 – 63.
7. Welty FK, Ordovas J, Schaefer EJ, Wilson P, Young
SG. Identification and molecular analysis of two
apoB gene mutations causing low plasma choles-
terol levels. Circulation 1995;92:2036 – 40.
8. Pulai JI, Latour MA, Kwok PY, Schonfeld G. Diabetes
mellitus in a new kindred with familial hypobetali-
poproteinemia and an apolipoprotein B truncation
(apoB-55). Atherosclerosis 1998;136:289 –95.
9. Bonora E, Kiechl S, Oberhollenzer F, Egger G,
Bonadonna RC, Muggeo M, Willeit J. Impaired glu-
cose tolerance, type II diabetes mellitus and carotid
atherosclerosis: prospective results from the
Bruneck Study. Diabetologia 2000;43:156 – 64.
10. Kyle RA, Rajkumar SV. Monoclonal gammopa-
thies of undetermined significance. Best Pract Res
Clin Haematol 2005;18:689 –707.

Commentary
Mohit Jain1 and Jorge Plutzky1*

In this case of hypobetalipoproteinemia (HBL), differ-
ential diagnoses for genetic and secondary HBL are
provided. Several additional issues can be noted.
This patient also had an IgA paraproteinemia, which
can influence cholesterol concentrations. Monoclonal
paraproteinemia can hinder lipoprotein clearance,
thereby increasing circulating cholesterol while artifactu-
ally lowering cholesterol measurements (1 ). This pa-
tient’s cholesterol concentrations were lower than those
typically observed with heterozygous genetic HBL, raising
the question of paraprotein interference or another un-
identified heterozygous mutation influencing apolipo-
protein B (apo B) concentrations. Perhaps another famil-
ial variant was in play in the death of the proband’s son at
age 21 years.
1
Vascular Disease Prevention Program, Cardiovascular Division, Brigham and
Women’s Hospital, Boston, MA.
* Address correspondence to this author at: Vascular Disease Prevention Pro-
gram, Cardiovascular Division, Brigham and Women’s Hospital/Harvard Medical
School, 77 Avenue Louis Pasteur, NRB 742, Boston, MA 02115. Fax 617-525-
4366; e-mail jplutzky@rics.bwh.harvard.edu.
Received February 22, 2012; accepted February 28, 2012.
DOI: 10.1373/clinchem.2012.182139
Familial hypocholesterolemia has received recent
attention with the identification of mutations in the
ANGPTL32 (angiopoietin-like 3) and PCSK9 (propro-
tein convertase subtilisin/kexin type 9) genes as novel
causes of low cholesterol concentrations (2 ). Like
HBL-associated apo B variants, ANGPTL3 and PCSK9
mutations appear well tolerated and potentially
atheroprotective, features that are generating thera-
peutic interest in these targets. Similarly, inhibiting
APOB transcription via the use of antisense oligonucle-
otides is in late-stage therapeutic development. Ongo-
ing attempts to lower apo B concentrations despite the
success of statins and other cholesterol-lowering med-
ications (e.g., ezetimibe, bile acid sequestrants, niacin)
reflect many clinical issues: statin intolerance, high
baseline cholesterol concentrations, the lowering of
LDL goals, and the increasing identification of familial
hypercholesterolemia and its treatment challenges.
2
Human genes: ANGPTL3, angiopoietin-like 3; PCSK9, proprotein convertase
subtilisin/kexin type 9.

Clinical Chemistry 58:5 (2012) 829

102
Clinical Chemistry 61:2
330–334 (2015)
An Infant with Persistent Jaundice and a Normal
Newborn Direct Bilirubin Measurement
Sanjiv Harpavat,1* Sridevi Devaraj,1,2 and Milton J. Finegold1,2
CASE DESCRIPTION
A 54-day-old infant of Asian descent presented with
jaundice. He first started appearing yellow a few weeks
after birth. His pediatrician initially recommended in-
creasing sunlight exposure. At subsequent visits, the
pediatrician recommended stopping breastfeeding.
Despite these interventions, the infant’s jaundice per-
sisted and his stools became pale. At 52 days of life
(DoL),3 he had a serum bilirubin measured, and the
reported “Bilirubin, Direct” concentration of 5.54
mg/dL (reference interval, 0.0 – 0.4 mg/dL) prompted
an immediate referral (see Table 1 for a summary of
laboratory results).
The infant’s physical examination and evaluation
results were most consistent with biliary atresia (BA). He
had marked jaundice, with a reported “Bili Conjugated”
of 4.7 mg/dL (reference interval, 0.0 – 0.2 mg/dL), as
well as increased aspartate aminotransferase, alanine
aminotransferase, and !-glutamyltransferase activi-
ties. He otherwise appeared well and had 2 newborn
screens with results within reference intervals, making
infectious or metabolic etiologies unlikely. Further-
more, protease inhibitor typing, chest radiograph, and
abdominal ultrasound revealed no abnormalities, ar-
guing against other liver-associated causes such as
"1-antitrypsin disease, Alagille syndrome, and chole-
dochal cyst.
There was one laboratory result, however, that was
inconsistent with BA: his newborn conjugated bilirubin
concentration, reported as “Neonatal Dbil.” In our expe-
rience, infants with BA have newborn direct or conju-
gated bilirubin concentrations that exceed their birth
hospital’s derived reference interval (1 ). In contrast, this
infant had a reported “Neonatal Dbil” concentration of
0.5 mg/dL on DoL 1, which was within the birth hospi-
tal’s reported reference interval of 0.0 – 0.6 mg/dL. The
bilirubin was measured using a Vitros analyzer, and the
1
Department of Pediatrics and 2 Department of Pathology, Baylor College of Medicine
and Texas Children’s Hospital, Houston, TX.
* Address correspondence to this author at: Clinical Care Center 1010, 6701 Fannin St.,
Houston, TX 77030. Fax 832-825-3633; e-mail harpavat@bcm.edu.
Received February 8, 2014; accepted June 24, 2014.
DOI: 10.1373/clinchem.2014.223115
© 2014 American Association for Clinical Chemistry
3
Nonstandard abbreviations: DoL, day of life; BA, biliary atresia.
330
Clinical Case Study
QUESTIONS TO CONSIDER
1. What is the difference between “Neonatal Dbil,” “Bil-
irubin, Direct,” and “Bili Conjugated”?
2. How should reference intervals be established?
3. Why are the reference intervals for the 3 tests in Table
1 different?
reference interval was derived by the manufacturer based
on “40 apparently healthy neonates” (2 ).
Because infants with BA treated earlier have the best
outcomes, we continued the evaluation despite the dis-
crepant newborn bilirubin concentrations. He promptly
underwent liver biopsy, which showed fibrosis and bile
duct proliferation characteristic of BA. Subsequent intra-
operative cholangiogram confirmed the BA diagnosis.
However, one important question still remained: how
could the infant’s reportedly normal “Neonatal Dbil”
concentration at birth be explained?
DISCUSSION
As many as 15% of infants may present to their pediatri-
cians for evaluation of jaundice (3 ). Most have increased
unconjugated bilirubin concentrations, which can usu-
ally be treated supportively with increasing sunlight ex-
posure or switching from breast milk to formula. Some
infants, on the other hand, have high conjugated biliru-
bin concentrations. These infants may have more se-
rious diseases that require prompt intervention, be-
cause increased conjugated bilirubin concentrations
are a marker for a variety of infectious, metabolic,
and/or liver conditions.
For infants with increased conjugated bilirubin con-
centrations, practitioners should review the bilirubin
measurements in the newborn period to help make the
diagnosis. Newborn total bilirubin concentrations are of-
ten measured to determine need for phototherapy and, as
in this case, total as well as conjugated (commonly re-
ferred to as “Dbil,” “direct,” or “conjugated”) concentra-
tions are reported. If the newborn conjugated concentra-
tion is high, the practitioner can assume the infant was
born with disease and should suspect metabolic or
liver-related causes. If the newborn conjugated con-
103

Table 1. Summary of fractionated bilirubin results.
Day of
life Test name Assay
1 “Neonatal Dbil” Direct spectrophotometry
52 “Bilirubin, Direct” Chemical reaction (Diazo)
54 “Bili Conjugated” Direct spectrophotometry
centration is within reference intervals, the practitio-
ner can assume the infant acquired the disease some-
time after birth and should consider infectious causes
more likely.
Unfortunately, as highlighted by this case, practitio-
ners face a number of challenges in interpreting newborn
conjugated bilirubin concentrations correctly. Our in-
fant did indeed have high conjugated bilirubin concen-
trations at birth, consistent with his diagnosis of BA.
However, his newborn concentration was overlooked be-
cause of 2 subtle yet critical details: (a) the result was
reported as “Dbil,” when in fact “conjugated” bilirubin
was assayed; and (b) the reference interval was too broad
for newborn “conjugated” bilirubin assays. How these
errors occurred—and continue to occur— can be under-
stood by examining the nuances of conjugated bilirubin
measurements.
CONJUGATED BILIRUBIN IS INCREASED IN LIVER DISEASE
Serum generally contains 2 types of bilirubin. The first
type, unconjugated bilirubin, forms when old red blood
cells are cleared and heme is degraded. Unconjugated
bilirubin can present a problem in neonates, because in-
creased concentrations can accumulate in the developing
brain and cause the devastating neurological disease ker-
nicterus. As a result, high unconjugated concentrations
in newborns are treated with phototherapy, which lowers
unconjugated bilirubin by converting it to dozens of dif-
ferent isomers that are more efficiently cleared from the
circulation (4 ).
The second type, conjugated bilirubin, is formed
when hepatocytes process unconjugated bilirubin for ex-
cretion. Hepatocytes collect unconjugated bilirubin from
the circulation and make it more water soluble by attach-
ing— or conjugating—1 or 2 glucuronide moieties to
bilirubin through a well-characterized esterification reac-
tion. Hepatocytes then secrete the bilirubin mono- and
diglucuronide into the canalicular space, where it dis-
solves in bile and ultimately passes out of the body with
stools (4 ).
Conjugated isoforms accumulate in serum in a vari-
ety of liver diseases. For example, bilirubin mono- and
diglucuronide concentrations can increase if hepatocytes
lyse (as in viral infections) or if bilirubin is not trans-
ported across the hepatocyte’s membrane correctly (as in
Clinical Case Study
Result, Reference interval, Reference interval
Instrument mg/dL mg/dL source
Vitros 0.5 0.0–0.6 Manufacturer
Roche 5.54 0.0–0.4 Laboratory derived
Vitros 4.7 0.0–0.2 Laboratory derived
Dubin-Johnson syndrome). They can also increase in
diseases such as BA where bile ducts are obstructed. Nor-
mal bile flow ceases, preventing all components of bile,
including conjugated bilirubin, from passing appropri-
ately. Instead, bile backs up into the liver and eventually
into the bloodstream.
Delta bilirubin is a third form of conjugated biliru-
bin, which is only present in chronic liver diseases. Delta
bilirubin forms when serum concentrations of bilirubin
mono- and diglucuronide are so high that some cova-
lently bind with albumin. Delta bilirubin’s bond with
albumin is essentially irreversible, and delta bilirubin
clearance follows the slow kinetics of albumin clearance.
As a result, delta bilirubin concentrations can be present
even after bilirubin mono- and diglucuronide have been
cleared and a patient’s primary liver problem has resolved
(4 ).
DIRECT AND CONJUGATED ASSAYS ARE NOT EQUIVALENT
The first issue in this case was an issue in reporting. The
laboratory reported a “Dbil” result when in fact “conju-
gated” bilirubin was assayed. “Direct” and “conjugated”
bilirubin assays are widely available, and, as in this pa-
tient, are often performed in the same patient at different
times. As a result, the 2 are often confused and used
interchangeably. However, the 2 are very different assays,
measuring different bilirubin fractions using unrelated
technologies.
“Direct” bilirubin assays measure all conjugated bil-
irubin (bilirubin monoglucuronide, bilirubin diglucu-
ronide, and delta bilirubin) as well as some unconjugated
bilirubin. “Direct” assays involve a chemical reaction
with diazo dyes, followed by quantification of azobiliru-
bin produced over a specified time. All conjugated bili-
rubin forms react quickly, whereas unconjugated biliru-
bin forms react more slowly (unconjugated bilirubin
forms can react quickly if an accelerant is added, as is
done for total bilirubin measurements). Hence, the “di-
rect” assays always include delta bilirubin and a small
amount of unconjugated bilirubin (4 ).
The “conjugated” bilirubin assay, on the other hand,
measures bilirubin mono- and diglucuronide alone. This
assay is based on direct spectrophotometry, using the BuBc
slide on the Vitros analyzer. The BuBc slide shifts the ab-
sorbance spectrum of bilirubin mono-/diglucuronide by
Clinical Chemistry 61:2 (2015) 331
104
Clinical Case Study
30 – 40 nm, thereby allowing these forms to be quantified
separately from unconjugated and delta forms (5 ). As a re-
sult, “conjugated” measurements are usually less than “di-
rect” measurements, because they do not include delta bili-
rubin or any unconjugated bilirubin [compare DoL 54 and
52 concentrations in this case (Table 1)].
Though “direct” and “conjugated” assays are the
most commonly available, they are not the only ways to
measure conjugated bilirubin concentrations. For exam-
ple, the bilirubin oxidase and vanadate oxidation meth-
ods are enzymatic and chemical assays, respectively. They
involve converting conjugated bilirubin forms into bili-
verdin and, unlike the diazo method, are unaffected by
coexisting substances such as hemoglobin or vitamin C
(6 ). HPLC, currently used mainly for research purposes
(4 ), can also be used. HPLC offers the advantage of de-
tecting minor bilirubin fractions such as those produced
with phototherapy.
“DIRECT” AND “CONJUGATED” REFERENCE INTERVALS
SHOULD BE VERIFIED
The second issue in this case was an issue of borrowing
reference intervals. Many laboratories face challenges with
pediatric reference intervals. Few have the resources to de-
rive their own ranges of values for every test and age. Instead
they borrow reference intervals from manufacturers, and
now, more recently, from large initiatives such as the
CALIPER (Canadian Laboratory Initiative on Pediatric
Reference Intervals) database (7 ). In many scenarios, this is
appropriate; however, “direct” and “conjugated” bilirubin
assays deserve special consideration.
For example, “direct” assay methods differ from labo-
ratory to laboratory, complicating the use of a single refer-
ence interval. “Direct” measurements using the diazo
method vary depending on a number of site-specific factors,
including how long the chemical reaction is allowed to pro-
ceed, the pH of the reaction, the strength of the diazo re-
agents, and the instrument used (4 ). As result, reference
intervals that combine data from many laboratories, such as
a published range of approximately 0.0 –1.0 mg/dL from
2898 infants age 0 –14 days, are too broad to be of practical
use (8 ). Instead, derived reference intervals similar to the
range from the DoL 52 measurement in this case are clini-
cally more meaningful.
For the “conjugated” assay, borrowing reference inter-
vals poses a different problem, as demonstrated in this case.
The “conjugated” assay should vary less from laboratory to
laboratory because it always uses the same reagent (the BuBc
slide) and is performed on the same instrument (the Vitros
analyzer). However, the manufacturer’s reference interval of
0.0 – 0.6 mg/dL does not match that derived in clinical prac-
tice. For example, a much narrower range of 0.0 – 0.3
mg/dL was calculated from 64095 newborns ages 0 –14
days who had a clinical reason to have bilirubin measured
(8 ). Similarly, our hospital and others with the Vitros ana-
332 Clinical Chemistry 61:2 (2015) 105
lyzer independently derived a reference interval of 0.0 – 0.2
mg/dL by using concentrations from cohorts of healthy
newborns.
We surmise 2 reasons for why such a broad reference
interval was used by the manufacturer. First, the manu-
facturer may have used too small of a sample size for their
reference interval calculations. The manufacturer reports
using measurements from 40 newborns for its reference
interval, whereas the standard is to calculate reference
ranges using samples from at least 120 individuals (2, 9 ).
Second, widening the reference interval could reduce
false positives and increase specificity. The upper limit of
the reference interval is traditionally defined as the high-
est 2.5% of concentrations, resulting in increased con-
centrations in as many as 1 in 40 cases. By broadening the
reference interval beyond the standard limits, the high
positive rate would certainly decrease; however, it does so
at the expense of missing cases with serious disease, such
as the infant in this case.
CLINICAL IMPLICATIONS
The newborn in this case was overlooked because of 2
subtle but clinically important problems, which we were
able to uncover only after considerable investigation. The
most important clue was realizing that the laboratory was
actually measuring “conjugated” bilirubin concentra-
tions. Whereas a “direct” bilirubin concentration of 0.5
mg/dL could be within the reference interval because of
measurement variations, a “conjugated” bilirubin con-
centration of 0.5 mg/dL is well above all published and
independently derived reference intervals. This discrep-
ancy prompted us to further question how the laboratory
obtained its reference intervals.
Importantly, if only 1 of the 2 problems had occurred,
this infant could have been recognized in the newborn pe-
riod. For example, had the test been labeled correctly, some
providers would have recognized the high “conjugated” bil-
irubin concentration despite the reference interval provided.
Similarly, had a narrower reference interval been used, all
providers would have identified the bilirubin concentration
as abnormal regardless of how the test was labeled. Unfor-
tunately, when both problems are combined, the test result
becomes impossible to interpret correctly without more in-
formation.
Theoretically, the error prevented what could have
been an earlier diagnosis and treatment, which in turn
correlates with delaying or even preventing need for liver
transplantation (10 ). With an abnormal newborn con-
centration, the infant’s pediatrician would have been ad-
vised to repeat the test at the 2-week well-child visit.
Although this method introduces a small delay, in our
experience it effectively excludes many of the newborns
who test high but do not have liver disease. This infant
would have retested high at 2 weeks and would have then
been referred to us urgently. We would have performed
 Clinical Case Study

an identical evaluation, but treatment would have been

POINTS TO REMEMBER
• Newborn “direct” and “conjugated” bilirubin concentra-
tions can help identify infants with serious liver diseases
such as BA.
• “Direct” assays use a chemical reaction and measure
bilirubin monoglucuronide, bilirubin diglucuronide, delta
bilirubin, and a small amount of unconjugated bilirubin.
• The “conjugated” assay uses spectrophotometry and mea-
sures bilirubin monoglucuronide and bilirubin diglucuronide.
• Reference intervals for newborn “direct” or “conju-
gated” bilirubin concentrations should be verified inde-
pendently by each laboratory.
given before the DoL 30 mark instead of after DoL 54.
Hence, while not diagnostic for BA, newborn conjugated
bilirubin concentrations—if reported correctly with ap-
propriate reference intervals— have the potential to ac-
celerate the BA diagnosis and ultimately improve how
infants fare with the disease.
Author Contributions: All authors confirmed they have contributed to
the intellectual content of this paper and have met the following 3 require-
ments: (a) significant contributions to the conception and design, acquisi-
tion of data, or analysis and interpretation of data; (b) drafting or revising
the article for intellectual content; and (c) final approval of the published
article.
Authors’ Disclosures or Potential Conflicts of Interest: No authors
declared any potential conflicts of interest.

1. Harpavat S, Finegold MJ, Karpen SJ. Patients with bili-
ary atresia have elevated direct/conjugated bilirubin
levels shortly after birth. Pediatrics 2011;128:e1428 –
33.
2. Ortho-Clinical Diagnostics. Instructions for use: VITROS
chemistry products BuBc slides (bilirubin, unconju-
gated and conjugated). Version 6.0. Rochester (NY):
Ortho-Clinical Diagnostics, Inc.; 2012.
3. Moyer V, Freese DK, Whitington PF, Olson AD, Brewer F,
Colletti RB, Heyman MB. Guideline for the evaluation of
cholestatic jaundice in infants: recommendations of the
North American Society for Pediatric Gastroenterology,
Hepatology and Nutrition. J Pediatr Gastroenterol Nutr
2004;39:115–28.
References
4. Lo SF, Doumas BT. The status of bilirubin measurements
in U.S. laboratories: why is accuracy elusive? Semin
Perinatol 2011;35:141–7.
5. Wu TW, Dappen GM, Spayd RW, Sundberg MW, Pow-
ers DM. The Ektachem clinical chemistry slide for si-
multaneous determination of unconjugated and
sugar-conjugated bilirubin. Clin Chem 1984;30:
1304 –9.
6. Kosaka A, Yamamoto C, Morishita Y, Nakane K. Enzy-
matic determination of bilirubin fractions in serum. Clin
Biochem 1987;20:451– 8.
7. Estey MP, Cohen AH, Colantonio DA, Chan MK, Marvasti
TB, Randell E, et al. CLSI-based transference of the
CALIPER database of pediatric reference intervals from
Abbott to Beckman, Ortho, Roche and Siemens Clinical
Chemistry Assays: direct validation using reference
samples from the CALIPER cohort. Clin Biochem 2013;
46:1197–219.
8. Davis AR, Rosenthal P, Escobar GJ, Newman TB. Inter-
preting conjugated bilirubin levels in newborns. J Pedi-
atr 2011;158:562–5 e1.
9. CLSI. Defining, establishing, and verifying reference in-
tervals in the clinical laboratory. CLSI document C28 –
A3. Wayne (PA): CLSI; 2008.
10. Jimenez-Rivera C, Jolin-Dahel KS, Fortinsky KJ,
Gozdyra P, Benchimol EI. International incidence and
outcomes of biliary atresia. J Pediatr Gastroenterol Nutr
2013;56:344 –54.

Commentary
Allah B. Haafiz*

BA is the most common cause of liver transplantation in
children. The success of the Kasai procedure progres-
sively diminishes with older age at the time of surgery.
Early identification of conjugated hyperbilirubinemia re-
mains the first step toward the timely diagnosis of BA. In
this context, Harpavat et al. present an illustrative case
that underscores the subtle yet clinically relevant differ-
ence between conjugated and direct hyperbilirubinemia.
An elegant discussion follows the case presentation show-
ing how the synonymous use of “direct” and “conju-
Pediatric Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, UAMS College of Medicine,
Little Rock, AR.
* Address correspondence to the author at: UAMS College of Medicine, Arkansas Children
Hospital, 1 Children’s Way, Slot 512-7, Little Rock, AR 72202. Fax 501-364-6291; e-mail
haafizallah@uams.edu.
Received August 13, 2014; accepted August 15, 2014.
DOI: 10.1373/clinchem.2014.229831
© 2014 American Association for Clinical Chemistry
gated” bilirubin is incorrect, misleading, and can delay
the diagnosis of BA. This discussion is timely because
most clinicians are not familiar with the highlighted bio-
chemical and methodological nuances. However, the dis-
cussion does not assertively link this case with, and thus
draw the attention of the reader to, the wider implica-
tions of the issues so elegantly presented. For example,
the main message of this report—the incorrect interpre-
tation of “Neonatal Dbil” delaying the diagnosis of BA—
reinforces the conclusions of a recent landmark study
published by the same group, which is casually referenced
in the context of the case presentation. This notable study
(1 ) documented that direct-reacting or conjugated bili-
rubin is increased as early as 24 – 48 h after birth in most
children with the perinatal form of BA, which accounts
for 70%– 85% of BA in infants. These findings raise the
possibility that measurements of conjugated or direct bil-
irubin could be used as a screening tool for early detection

Clinical Chemistry 61:2 (2015) 333

106
Clinical Chemistry 60:11
1375–1379 (2014)
Unexpected Test Results in a Patient with
Multiple Myeloma
A. Gilbert Jelinek* and Lorin M. Bachmann
CASE DESCRIPTION
A 53-year-old male patient with an established diagnosis
of IgG ␭ multiple myeloma was seen by a hematologist–
oncologist in consultation from an outside hospital. He
had previously received 1 cycle of chemotherapy treat-
ment, but he was found to be intermittently noncom-
pliant with his therapy. The patient reported occasional
nosebleeds and fatigue. Except for a slightly cachectic
appearance, the physical examination was unremark-
able. Laboratory results are shown in Table 1.
Serum protein electrophoresis revealed monoclo-
nal paraproteinemia in high abundance marked by an
intense band in the ␥ region. Immunofixation electro-
phoresis was not ordered at that time, but it was previ-
ously performed at another institution and was posi-
tive for IgG monoclonal protein.
The attending pathologist noted the discrepancy
between the presence of a monoclonal band by serum
protein electrophoresis and the patient’s quantitative
immunoglobulin measurements. Several additional
suspicious test results were also noted.
DISCUSSION
Multiple myeloma is a hematologic malignancy char-
acterized by proliferation of a neoplastic plasma cell
population that usually leads to abundant production
of a monoclonal immunoglobulin, also called parapro-
tein or M-protein, as well as decreased concentrations
of normal polyclonal immunoglobulins. Overwhelm-
ing expansion of plasma cells in the bone marrow with
concomitant suppression of other normal blood cell
lineages often results in thrombocytopenia and ane-
mia, which are classically manifested as symptoms of
bleeding and fatigue. Renal insufficiency, as evi-
denced by increased blood creatinine and blood urea
nitrogen concentrations, also may occur and is likely
due to filtration of associated monoclonal free light
Department of Pathology, Virginia Commonwealth University, Richmond, VA.
* Address correspondence to this author at: Virginia Commonwealth University,
1101 East Marshall St., Sanger Hall Rm. 4-005, Richmond, VA, 23298. Fax
804-628-0290; e-mail argilbert@mcvh-vcu.edu.
Received July 30, 2013; accepted January 16, 2014.
DOI: 10.1373/clinchem.2013.213884
© 2014 American Association for Clinical Chemistry
107
Clinical Case Study
QUESTIONS TO CONSIDER
1. What are some expected laboratory results in a patient
with multiple myeloma?
2. Which of the patient’s laboratory test results are unex-
pected given his diagnosis of multiple myeloma?
3. What types of laboratory errors can occur in patients
with multiple myeloma?
chains, which can cause tubular damage. Serum pro-
tein electrophoresis typically yields a discrete band
in the ␥ region, and immunofixation demonstrates
the presence of IgG monoclonal protein in over 50%
of cases (1 ).
Overproduction of plasma proteins in concentra-
tions that exceed typical physiologic limits can be an
important source of laboratory test interference. Para-
proteins can adversely affect various instruments
and methodologies. For example, a paraprotein-
associated increase in blood viscosity can cause dif-
ficulty in sample aspiration by some instruments
that results in assessments being performed on
smaller-than-expected sample volumes and subse-
quent falsely decreased laboratory results (2 ). In ad-
dition, M-proteins, especially those that are also
cryoglobulins, can precipitate and cause erroneous
measurements via several methods (1 ). Other inter-
ferences such as the prozone effect and the volume
displacement effect are discussed below.
IMMUNOGLOBULIN EXCESS AND THE PROZONE EFFECT
Quantitative immunoglobulin concentrations in this
case were suspiciously low considering the marked in-
creases in total protein, the large monoclonal band
identified on serum electrophoresis, and the patient’s
anemia and thrombocytopenia, all of which suggested
the presence of active disease.
Immunoglobulins IgA, IgM, and IgG were mea-
sured using polyethylene glycol-enhanced immuno-
turbidimetric methods in which antihuman immuno-
globulin in the reagent binds to immunoglobulin in the
patient sample to generate a precipitate, thereby in-
creasing the turbidity of the solution (3 ). The resulting
absorbance is then used to calculate the immunoglob-
1375
Clinical Case Study

hypothesized that expression of atypical epitopes or

Table 1. Chemistry and hematology laboratory results. large concentrations of single clones causes incomplete
reaction of the reagent antibodies with the aberrant
Laboratory testa Reference interval Result
immunoglobulins, resulting in inaccurate measure-
IgG 700–1700 mg/dL ⬍140 mg/dL ments when using routine immunoassay methods.
7.0–17.0 g/L ⬍1.4 g/L Immunoturbidimetric and nephelometric meth-
IgA 70.0–450.0 mg/dL ⬍5.0 mg/dL ods are susceptible to an additional type of interference
0.7–4.5 g/L ⬍0.05 g/L
known as antigen excess or prozone effect. This phe-
nomenon occurs when excessive quantities of antigen
IgM 50–250 mg/dL ⬍21 mg/dL
inhibit stable antigen–antibody complex formation.
0.5–2.5 g/L ⬍0.21 g/L
The subsequent decrease in detected absorbance leads
Sodium 135–145 mmol/L 124 mmol/L to a falsely low measured concentration (3, 4 ). Detec-
Potassium 3.6–5.1 mmol/L 5.2 mmol/L tion of the prozone effect requires dilution of the sam-
Chloride 100–110 mmol/L 102 mmol/L ple to remove the antigen excess and allow appropriate
Carbon Dioxide 21–33 mmol/L 22 mmol/L formation of the antigen–antibody complex, resulting
Creatinine 0.60–1.20 mg/dL 2.54 mg/dL in an accurate measurement (3, 5 ). The prozone effect
53–106 ␮mol/L 224 ␮mol/L
is more often observed when measurements are ob-
tained using an immunoturbidimetric method; mod-
Blood urea nitrogen 8–23 mg/dL 36 mg/dL
ern nephelometers are typically less susceptible to this
2.9–8.2 mmol/L 12.9 mmol/L effect because they employ an automatic dilution step
Glucose 65–100 mg/dL 96 mg/dL to detect antigen excess (5 ).
3.61–5.55 mmol/L 5.33 mmol/L Testing was repeated with a 1:100 dilution (1
Total calcium 8.9–10.7 mg/dL 9.2 mg/dL part serum to 99 parts normal saline) and an IgG
2.23–2.68 mmol/L 2.3 mmol/L concentration of 14 400 mg/dL (144.0 g/L) was ob-
Total protein 6.4–8.5 g/dL 18.4 g/dL tained, which was consistent with the serum protein
electrophoresis results and the patient’s overall clin-
64.0–85.0 g/L 184 g/L
ical presentation. Repeat measurements of IgA and
Inorganic phosphate 2.50–4.60 mg/dL 14.49 mg/dL
IgM were not performed due to sample volume
0.81–1.49 mmol/L 4.68 mmol/L constraints.
White blood cell count 3.7–9.7 ⫻ 109/L 4.7 ⫻ 109/L
Hemoglobin 13.3–17.2 g/dL 8.2 g/dL IMMUNOGLOBULIN EXCESS AND THE VOLUME
133.0–172.0 g/L 82.0 g/L DISPLACEMENT EFFECT

Hematocrit 38.9%–50.9% 24.6%
Platelet count 179–373 ⫻ 109/L 104 ⫻ 109/L
Mean corpuscular 81.2–94.0 fL 91.6 fL
volume
a
Chemistry and hematology measurements were performed using the Sie-
mens Healthcare Diagnostics ADIVA 1800 and ADVIA 2420 analyzers,
respectively.
ulin concentration in the patient sample from the cal-
ibration curve.
Aberrant immunoglobulins expressed in monoclo-
nal gammopathies may cause interference in routine im-
munoassay methods. Reagent immunoglobulins used in
methods for immunoglobulin quantification are opti-
mized to recognize the diverse constellation of circu-
lating polyclonal immunoglobulins found in physio-
logical states other than monoclonal gammopathy. The
presence of an overabundance of a single clone has
been shown to cause unexpected behavior in routine
immunoassay methods, resulting in erroneously high
or low immunoglobulin measurements (4 ). It has been
The patient’s initial serum sodium was 124 mmol/L,
but he lacked symptoms of hyponatremia. The low so-
dium concentration was found to be a result of pseu-
dohyponatremia, an artificially low measurement of
sodium concentration produced by the presence of se-
vere hyperproteinemia.
In healthy individuals, the plasma volume is com-
prised of approximately 93% water, which contains
dissolved electrolytes and other compounds, whereas
the remaining plasma volume consists of lipids and
proteins (2, 3 ). Substantial increases in plasma pro-
teins and/or lipids can cause displacement of the
aqueous component and its dissolved solutes in a phe-
nomenon called volume displacement. Although the
proportion of plasma water occupies a relatively
smaller percentage of the total plasma volume, the sol-
ute concentrations within the plasma water are physi-
ologically normal.
For measurement of serum electrolytes, many lab-
oratories employ ion-selective electrodes (ISE) that
utilize indirect potentiometry, in which patient sam-
ples are diluted before the measurement process.
Prediluting the sample prevents excessive protein ex-

1376 Clinical Chemistry 60:11 (2014) 108


posure to the ISE membrane, thus minimizing elec-
trode degradation and calibration drift (6 ). Instru-
ments that utilize a predilution step assume a normal
ratio exists between the plasma water volume and the
total plasma volume (2 ). This assumption may be in-
valid when analyzing samples containing abnormal in-
creases in proteins and/or lipids and can lead to falsely
low measurements of solute, with sodium being most
commonly affected. The volume displacement effect
can be avoided in these samples by employing ion-
selective electrodes that utilize direct potentiometry, in
which electrolyte measurements are evaluated in an
undiluted plasma sample (6 ).
The original serum sodium result of 124 mmol/L,
as measured by indirect potentiometry, was incon-
sistent with the patient’s clinical presentation. In this
case, the volume displacement effect was suspected
as the most likely etiology of the pseudohypona-
tremia. The patient’s serum sodium concentration
was repeated utilizing direct potentiometry on the
NOVA CCX analyzer, and a sodium concentration
of 138.5 mmol/L, which is within the reference in-
terval, was obtained.
IMMUNOGLOBULIN EXCESS AFFECTING MEASUREMENT
OF PHOSPHOROUS
On initial measurement the patient’s serum inorganic
phosphate was markedly increased, but the calcium
concentration was within the reference interval. Serum
inorganic phosphate and calcium concentrations are
maintained within a tight physiologic range via closely
associated mechanisms regulated by the kidney, bone,
and gut (1 ). An interfering substance producing
factitious hyperphosphatemia, or “pseudohyperphos-
phatemia,” was suspected owing to the profoundly
high inorganic phosphate concentrations in a relatively
asymptomatic patient with calcium concentrations
within the reference interval.
Spectrophotometric quantification of serum inor-
ganic phosphate concentration is based on the reaction
of phosphate ions with ammonium molybdate to form
a phosphomolybdate complex (1, 7 ). Absorbance of
the unreduced phosphomolybdate complex is mea-
sured and indexed to a calibration curve to determine
analyte concentration (3, 7 ). The formation of the
complex is pH dependent and uses an acid buffer
(3, 7 ). The low pH environment of the reaction mix-
ture can lead to precipitation of immunoglobulins and
result in increased turbidity and light scattering (5, 7 ).
Resolution of the interference is obtained by diluting
the sample or removing the plasma proteins via various
deproteinization methods (5, 7 ).
The initial measurement of inorganic serum phos-
phate was 14.49 mg/dL (2.50 – 4.60 mg/dL) [4.68
mmol/L (0.81–1.49 mmol/L)], which exceeded the ab-
109
Clinical Case Study
POINTS TO REMEMBER
• Multiple myeloma is a hematologic malignancy character-
ized by proliferation of a neoplastic plasma cell population
leading to increased production of a monoclonal immuno-
globulin. It is often accompanied by thrombocytopenia,
anemia, and renal failure.
• Immunoturbidimetric methods are subject to interfer-
ence via the prozone effect, in which excess antigen
inhibits stable antigen–antibody complex formation, re-
sulting in decreased absorbance and a falsely low result.
Detection of the prozone effect requires sample dilution.
• The volume displacement effect is caused by increased
concentrations of protein or lipids which displace aqueous
components of blood. This effect can be avoided by utiliz-
ing direct potentiometry in which electrolyte measure-
ments are evaluated in an undiluted plasma sample.
• Spectrophotometric quantification of serum inorganic
phosphate concentrations may give falsely increased re-
sults owing to immunoglobulin precipitation. Resolution of
pseudohyperphosphatemia is obtained by diluting the
sample, thereby reducing the quantity of plasma proteins.
sorbance limit for the assay. A 1:5 dilution (1 part se-
rum to 4 parts normal saline) was performed and a
serum phosphate concentration within the reference
interval [4.4 mg/dL (1.41 mmol/L)] was obtained.
SUMMARY
Multiple myeloma is a hematologic disease that often
results in increased production of monoclonal immu-
noglobulins. As the paraprotein concentration rises,
the potential for erroneous results increases. This
case illustrates how unusually high concentrations of
serum immunoglobulins can result in multiple lab-
oratory interferences, including the prozone effect,
the volume displacement effect, and precipitation
interference. Laboratorians should remain attentive
to potential sources of discrepant results in patients
with high plasma protein concentrations and should
take appropriate action to prevent the release of er-
roneous results.
Author Contributions: All authors confirmed they have contributed to
the intellectual content of this paper and have met the following 3 re-
quirements: (a) significant contributions to the conception and design,
acquisition of data, or analysis and interpretation of data; (b) drafting
or revising the article for intellectual content; and (c) final approval of
the published article.
Authors’ Disclosures or Potential Conflicts of Interest: No authors
declared any potential conflicts of interest.
Clinical Chemistry 60:11 (2014) 1377
Commentary
References
1. McPherson RA, Pincus MR, Henry JB. Henry’s clinical diagnosis and manage-
ment by laboratory methods. 21st ed. Philadelphia (PA): Elsevier Saunders;
2007.
2. Vaswani SK, Sprague R. Pseudohyponatremia in multiple myeloma. South
Med J 1993;86:251–2.
3. Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE. Tietz textbook of clinical chemistry and
molecular diagnostics. 4th ed. St. Louis (MO): Elsevier Saunders; 2006.
Commentary
Jerry A. Katzmann*
This case brings to mind the tale of Goldilocks and the 3
bears: we appreciate when monoclonal immunoglobulin
concentrations are not too high and not too low, but just
right. Most monoclonal gammopathies have concentra-
tions that are easily detected and quantified by electro-
phoretic and/or nephelometric or turbidimetric meth-
ods. The extremes of low and high immunoglobulin
concentrations, however, are part of the diversity of
plasma cell proliferative diseases and may be orders of
magnitude outside of ranges typically encountered. From
experience with light chain myeloma and primary amy-
loidosis, we are most often concerned about low serum
concentrations of monoclonal proteins. On rarer occa-
sions high concentrations are problematic. Automated
protein analyzers (unlike most chemistry analyzers) use
various approaches to identify high-concentration pro-
zone effects, including assessment of the initial rate of the
light scatter reaction, addition of antigen at the comple-
tion of the reaction, and/or quantification at 2 dilutions.
The myeloma diagnosis in this case was known to
the clinician, and laboratory results were consistent
Department of Laboratory Medicine and Pathology, Mayo Clinic, Rochester, MN.
* Address correspondence to the author at: Hilton 210, Department of Laboratory
Medicine and Pathology, Mayo Clinic, Rochester, MN 55905. Fax 507-266-
4088; e-mail katzmann@mayo.edu.
Received March 19, 2014; accepted March 25, 2014.
DOI: 10.1373/clinchem.2014.224873
© 2014 American Association for Clinical Chemistry
Commentary
Jim D. Faix*
Multiple myeloma is named for the multiple lesions
that form as malignant plasma cells appear in patients’
Stanford Clinical Laboratory at Hillview, Stanford University, Palo Alto, CA.
* Address correspondence to the author at: Stanford Clinical Lab at Hillview,
1378 Clinical Chemistry 60:11 (2014)
4. Attaelmannan M, Levinson S. Understanding and identifying monoclonal
gammopathies. Clin Chem 2000;46(8 Pt 2):1230 – 8.
5. Dalal BI, Brigden ML. Factitious biochemical measurements resulting from
hematologic conditions. Am J Clin Pathol 2009;131:195–204.
6. NCCLS. Standardization of sodium and potassium ion-selective electrode
systems to the flame photometric reference method; approved standard. 2nd
ed. Wayne (PA): NCCLS; 2000. NCCLS document C29-A2.
7. McClure D, Lai LC, Cornell C. Pseudohyperphosphatemia in patients with
multiple myeloma. J Clin Pathol 1992;45:731–2.
with myeloma-associated bone marrow suppression
(hemoglobin, hematocrit, platelet count) and renal
impairment (creatinine, urea nitrogen). The apparent
absence of immunoglobulins might have suggested a
nonsecretory or light chain myeloma except for the se-
rum protein electrophoresis and dramatically in-
creased serum total protein. Dilution and reanalysis of
the serum yielded a quantitative IgG of 14 400 mg/dL,
which was compatible with the serum M spike.
As Jelinek and Bachmann point out, there are
other idiosyncratic analytic problems caused by mono-
clonal immunoglobulins that are unrelated to concen-
tration. The most common of these are preanalytic and
analytic cryoglobulin precipitates. The unique nature
of each monoclonal gammopathy warrants our atten-
tion to the entire case, and evaluation of such cases
frequently benefits from open lines of communication
with clinicians.
Author Contributions: All authors confirmed they have contributed to
the intellectual content of this paper and have met the following 3 re-
quirements: (a) significant contributions to the conception and design,
acquisition of data, or analysis and interpretation of data; (b) drafting
or revising the article for intellectual content; and (c) final approval of
the published article.
Authors’ Disclosures or Potential Conflicts of Interest: No authors
declared any potential conflicts of interest.
3375 Hillview Ave., Palo Alto, CA 94304-1204. E-mail jim.faix@stanford.edu.
Received February 5, 2014; accepted February 7, 2014.
DOI: 10.1373/clinchem.2014.222554
© 2014 American Association for Clinical Chemistry
110
Clinical Chemistry 58:6
974–978 (2012)
Persistent Hemolysis in a Patient with Pancreatitis
Stephen L. Cook* and David E. Bruns
CASE
A 43-year-old man with a history of acute and chronic
pancreatitis presented with a 1-day history of severe
burning and squeezing epigastric pain without nausea,
vomiting, or diarrhea. The pain was similar to the pa-
tient’s previous episodes of acute pancreatitis, for
which he had had multiple hospitalizations. The pa-
tient’s other diagnoses were hypertriglyceridemia,
chronic kidney disease, and diabetes. On physical ex-
amination, the patient was afebrile and his abdomen
was firm, with epigastric tenderness, guarding, and de-
creased bowel sounds.
On admission, serum lipase activity was 1506 U/L
[reference interval (RI), 8 –78 U/L]; amylase was not
measured. Serum triglycerides were 1606 mg/dL (18.15
mmol/L) [RI, 55–320 mg/dL (0.62–3.62 mmol/L)].
The total cholesterol was 205 mg/dL (5.31 mmol/L)
[RI, !200 mg/dL (!5.18 mmol/L)] and HDL was 14
mg/dL (0.36 mmol/L) [RI, 30 – 65 mg/dL (0.78 –1.68
mg/dL)]. The creatinine concentration was 1.1 mg/dL
(83 !mol/L) [RI, 0.7–1.3 mg/dL (53.4 –99.1 !mol/L)]
and blood urea nitrogen was 14 mg/dL (5.0 mmol/L)
[RI, 8.9 –20.6 mg/dL (3.2–7.4 mmol/L)]. Imaging by
computed tomography demonstrated intrapancreatic
pseudocysts and peripancreatic fat stranding. The pa-
tient was treated with bowel rest, aggressive intrave-
nous fluid resuscitation, and pain management.
On day 2 of hospitalization, laboratory testing was
complicated by significant hemolysis, raising the ques-
tions of in vivo vs in vitro hemolysis and whether or not
to release laboratory results. Hemolysis had not been
seen in blood drawn on day 1, but starting on day 2
every sample was hemolyzed in multiple tube types (in-
cluding EDTA, lithium heparin, and sodium citrate
tubes) throughout the course of the patient’s hospital
stay. Between the first and second day, the hemoglobin
concentration decreased from 14.6 –13.8 g/dL (146 –
138 g/L) [RI, 14.0 –18.0 g/dL (140 –180 g/L)], potas-
sium increased from 4.2– 6.3 mmol/L (RI, 3.4 – 4.8
Department of Pathology, University of Virginia School of Medicine, Charlottes-
ville, VA.
* Address correspondence to this author at: P.O. Box 800168, Department of
Pathology, University of Virginia School of Medicine, Charlottesville, VA 22908.
Fax 434-924-2107; e-mail slc3mc@virginia.edu.
Received April 21, 2011; accepted June 13, 2011.
DOI: 10.1373/clinchem.2011.167452
974
Clinical Case Study
QUESTIONS TO CONSIDER
1. What are causes of in vivo and in vitro hemolysis and
how are they distinguished?
2. How does hemolysis affect test results?
3. What is the likely cause of pancreatitis in this patient?
4. What is the association between hemolysis and
pancreatitis?
mmol/L), sodium decreased from 137–133 mmol/L
(RI, 136 –145 mmol/L), and chloride was unaffected.
Serum haptoglobin concentration was 56 mg/dL (0.56
g/L) [RI, 30 –200 mg/dL (0.3–2.0 g/L)], and reticulo-
cyte count was 1.69% (RI, 0.7–2.5%).
DISCUSSION
Hemolysis is the damage or disruption of erythrocyte
cellular membranes, which causes the release of intra-
cellular components into plasma. Hemolysis can occur
in the patient (in vivo) or outside the patient at some
point between the drawing of the sample and its anal-
ysis (in vitro).
CAUSES OF HEMOLYSIS
The common causes of hemolysis are presented in Ta-
ble 1. The phenomena leading to in vivo hemolysis can
be categorized as intravascular and extravascular he-
molysis on the basis of the site of red blood cell destruc-
tion. Depending on the type of insult to the red
blood cell membrane, the cells may lyse immediately
(intravascular) or be destroyed by the monocyte–
macrophage system in the spleen, liver, or bone mar-
row (extravascular). Laboratory testing is essential in
determining the presence and cause of hemolysis. In-
creased serum lactate dehydrogenase (LD), decreased
haptoglobin, and free urine hemoglobin are signs of in
vivo hemolysis. Spherocytes on a peripheral blood
smear and a positive direct antiglobulin test are find-
ings that indicate the occurrence of antibody-mediated
in vivo hemolysis. Schistocytes on a peripheral blood
smear indicate microangiopathic hemolysis. An in-
creased number of reticulocytes signifies a physiologic
response to anemia and indicates in vivo hemolysis.
Persistent hemolysis in multiple samples at different
111

Table 1. Potential causes of in vivo and
in vitro hemolysis.a
In vivo hemolysis
Extravascular hemolysis
Enzyme deficiencies (e.g., glucose-6–phosphate
dehydrogenase deficiency)
Hemoglobinopathies (e.g., sickle cell, thalassemia)
Erythrocyte membrane defects (e.g., hereditary
spherocytosis)
Infection (e.g., bartonella, babesia, malaria)
Autoimmune hemolytic anemia
Other (e.g., hypersplenism, liver disease)
Intravascular hemolysis
Microangiopathy (e.g., prosthetic heart valve, thrombotic
thrombocytopenic purpura)
Transfusion reaction
Infection (e.g., sepsis, severe malaria)
Paroxysmal cold hemoglobinuria
Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria
In vitro hemolysis
Excessive aspiration force (blood drawn too vigorously,
especially through small or superficial veins)
Catheter partially obstructed
Blood forced into the tube from syringe
Specimen frozen
Mechanical damage (e.g., shaking, excessive force in
pneumatic tubes)
Delay in analysis
a
Adapted from Table 2 in Schrier (11 ).
collection times and in multiple tube types, as seen in
this patient, suggests in vivo hemolysis. Communica-
tion with the clinical team and correlation with the
patient’s history is critical to determine if there is rea-
son to suspect in vivo hemolysis.
Distinguishing in vivo from in vitro hemolysis is of
critical importance for patient safety and clinical man-
agement. A finding of in vivo hemolysis not only is
clinically important in itself, but, moreover, the plasma
concentrations of analytes in the blood collection tube
are the plasma concentrations in the patient and thus
are important and must be reported. By contrast, in the
setting of in vitro hemolysis, certain laboratory val-
ues should not be reported, because they do not re-
flect the concentrations in the patient and may be
misleading.
In an analysis of hemolyzed samples at one in-
stitution (1 ), approximately 3% of hemolyzed sam-
ples were found to reflect in vivo hemolysis. In 95%
of the cases of in vitro hemolysis, a specific error in
112
Clinical Case Study
Table 2. Predominant mechanism of effect of
hemolysis on common laboratory tests.
Analytical interference
Alkaline phosphatase
Iron
Lipase
"-Glutamyl transferase
Sodium
Chloride
In vivo physiologic effect
Potassium
Lactate dehydrogenase
Magnesium
Phosphorus
Aspartate aminotransferase
Alanine aminotransferase
sample collection and/or processing was found. A
third of the cases of in vivo hemolysis were not clin-
ically suspected, and the laboratory played a critical
role in bringing it to the attention of the treating
physicians. It is important for laboratories to have
guidelines in place for (a) systematic identification
and quantification of hemolysis, (b) clinician con-
tact and warning of the possibility of in vivo hemo-
lysis, and (c) requests for a second sample.
The investigation of hemolyzed samples is guided
by a systematic search for an etiology, guided by knowl-
edge of common etiologies (Table 1). If no underlying
cause of in vivo hemolysis can be identified, a search for
a cause of in vitro hemolysis should be undertaken in
an effort to reduce the occurrence of in vitro hemolysis
in the health system.
EFFECT OF HEMOLYSIS ON LABORATORY TESTS
Hemolysis is an important source of preanalytical error
and has been reported to influence many laboratory
results, including potassium, sodium, calcium, phos-
phorus, magnesium, bilirubin, haptoglobin, total pro-
tein, aldolase, amylase, LD, aspartate aminotransferase
(AST), alanine aminotransferase, alkaline phospha-
tase, acid phosphatase, "-glutamyl transferase, folate,
and iron (2 ). Hemolysis can affect the validity of the
specific chemical assay being performed (analytical in-
terference) through spectrophotometric or chemical
interference. Alternatively, release of intracellular con-
tents affects the plasma concentration of certain com-
pounds; thus in vivo hemolysis has a physiologic effect on
the patient. The contribution of each of these sources of
error varies by analyte and method (Table 2). For exam-
Clinical Chemistry 58:6 (2012) 975
Clinical Case Study
ple, the concentrations of potassium, magnesium,
phosphate, LD, AST, and alanine aminotransferase are
much higher in red blood cells than in plasma, and thus
hemolysis increases their plasma concentrations. By
contrast, spectral interference from hemoglobin is the
dominant issue for common spectrophotometric as-
says for alkaline phosphatase, iron, lipase, and
"-glutamyl transferase (3 ). It is possible for both
mechanisms to be operative, e.g., if AST is measured by
a colorimetric method, spectral overlap may cause an
artifactual increase in the AST result in addition to the
true increase of AST in the plasma due to the release of
intracellular contents.
ETIOLOGY OF PANCREATITIS
The most common causes of acute pancreatitis in the
US are alcohol use and gallstones, but marked hyper-
triglyceridemia, as seen in this case, is a well-recognized
cause. It is generally thought that only a serum triglyc-
eride concentration "1000 mg/dL (11.3 mmol/L) can
cause pancreatitis (4, 5 ). Thus, the triglyceride concen-
trations are markedly high in these patients, and should
not be confused with the mild hyperlipidemia seen in
approximately 50% of patients with acute pancreatitis
of any cause (4 ). Mild to moderate hypertriglyceride-
mia in acute pancreatitis is more common than pan-
creatitis due to hypertriglyceridemia. Furthermore,
patients with a moderate hypertriglyceridemia may
acutely have markedly increased triglycerides and pan-
creatitis following ingestion of certain medications or
alcohol. The pathophysiology of hypertriglyceridemia-
induced pancreatitis is not completely understood (6 ).
Amylase and lipase activities may be within RIs in those
pancreatitis patients who have hypertriglyceridemia
(4 ).
HEMOLYSIS AND ACUTE PANCREATITIS
The association of acute pancreatitis and hemolysis is
less widely appreciated than the association of pancre-
atitis with lipemic serum. Massive hemolysis can trig-
ger acute pancreatitis and, moreover, hemolysis is seen
in patients with cases of acute pancreatitis that have
other etiologies.
Approximately 25% of cases of massive hemolysis
are complicated by acute pancreatitis (7 ). It has been
proposed that the large amounts of heme in the blood
stream stimulate a proinflammatory state (8 ). Heme-
induced cytokine release may lead to acute pancreatitis
through recruitment of inflammatory cells and gener-
ation of reactive oxygen species, as well as via an effect
on the pancreatic microvasculature leading to ischemia
(9 ). The mechanism of hemolysis resulting from acute
pancreatitis is not well understood.
976 Clinical Chemistry 58:6 (2012)
POINTS TO REMEMBER
• Hemolysis can occur in vitro and in vivo and is difficult
to distinguish by laboratory analysis alone; therefore
guidelines for identification of hemolysis and ample
communication between the laboratory and clinicians
are required.
• A systematic investigation should be undertaken to
determine the cause of hemolysis in the interest of
patient safety.
• Hemolysis can affect laboratory values in an analyte-
and method-specific manner, and if in vivo hemolysis is
suspected these values are clinically important and
should be reported if analytical interference from he-
molysis can be ruled out.
• In vivo hemolysis can both cause and be caused by
acute pancreatitis.
RESOLUTION OF THE CASE
By the fourth day after admission, the patient had re-
turned to his normal state of health; his serum triglyc-
eride concentration had decreased to 698 mg/dL (7.89
mmol/L), and his serum lipase concentration had
fallen to 122 U/L. Given the only mildly increased total
cholesterol, this patient fits type I or type V hyperlipid-
emia, requiring measurement of VLDL to differentiate
(10 ). He was discharged with a diagnosis of acute pan-
creatitis secondary to hypertriglyceridemia. The hemo-
lysis was concluded to be in vivo given its persistence,
the haptoglobin concentrations at the lower region of
the RI, and the decrease in hemoglobin. As previously
discussed, hypertriglyceridemia and hemolysis can be
causes of acute pancreatitis. In this patient, the princi-
pal cause was concluded to be hypertriglyceridemia,
given the patient’s history of recurrent episodes of
acute pancreatitis correlating with episodes of poor tri-
glyceride control. Prescriptions were provided for
gemfibrozil and fish oil for management of his hyper-
triglyceridemia. At the time of his follow-up office
visits 1 week and 3 months later he required pain med-
ication for chronic pancreatitis and his plasma concen-
tration of triglycerides remained increased.
Author Contributions: All authors confirmed they have contributed to
the intellectual content of this paper and have met the following 3 re-
quirements: (a) significant contributions to the conception and design,
acquisition of data, or analysis and interpretation of data; (b) drafting
or revising the article for intellectual content; and (c) final approval of
the published article.
113

Authors’ Disclosures or Potential Conflicts of Interest: Upon man-
uscript submission, all authors completed the author disclosure form.
Disclosures and/or potential conflicts of interest:
Employment or Leadership: D.E. Bruns, AACC.
Consultant or Advisory Role: D.E. Bruns, Roche.
Stock Ownership: None declared.
Honoraria: None declared.
Research Funding: None declared.
Expert Testimony: None declared.
References
1. Carraro P. Hemolyzed specimens: a reason for rejection or a clinical chal-
lenge? Clin Chem 2000;46:306 –7.
2. Lippi G, Blanckaert N, Bonini P, Green S, Kitchen S, Palicka V, et al.
Haemolysis: an overview of the leading cause of unsuitable specimens in
clinical laboratories. Clin Chem Lab Med 2008;46:764 –72.
3. Lippi G, Salvagno GL, Montagnana M, Brocco G, Guidi GC. Influence of
hemolysis on routine clinical chemistry testing. Clin Chem Lab Med 2006;
44:311– 6.
Commentary
Geraldine P. Schechter1,2*
Fewer than 2% of hemolyzed blood samples are due to in
vivo hemolysis (1 ). In this patient with a relatively mild
episode of pancreatitis, multiple hemolyzed specimens
raised concerns of in vivo hemolysis because of the con-
current findings of a haptoglobin concentration of 56 mg/
dL, at the lower region of the reference interval, and a
decrease in hemoglobin from 14.6 to 13.8 g/dL. From the
clinician’s perspective, the minor decrease in hemoglobin
was more likely explained by the administration of intra-
venous hydration rather than hemolysis. Acute hemolytic
anemia in pancreatitis is usually secondary to dissemi-
nated intravascular coagulation as a result of severe com-
plications not evident in this patient.
Proving in vivo hemolysis in this situation is diffi-
cult. Increased lactic dehydrogenase activities can re-
sult from in vitro hemolysis. The reticulocyte count is
often within reference intervals in acute hemolysis ow-
ing to a delay in marrow response. The presence of
schistocytes or “shift” reticulocytes in a peripheral
blood smear could have pointed to in vivo hemolysis.
Serum haptoglobin, despite being an acute-phase reac-
tant, remains the best test of in vivo hemolysis. Hemo-
lyzing patients who have inflammation indicated by
1
Hematology Section, Medical Service, Washington Veterans Affairs Medical Center,
and 2 Department of Medicine, George Washington University, Washington, DC.
* Address correspondence to the author at: Veterans Affairs Medical Center,
50 Irving St. NW, Washington, DC 20422. Fax 202-518-4300; e-mail
g.p.schechter@med.va.gov.
Received March 18, 2012; accepted March 26, 2012.
DOI: 10.1373/clinchem.2012.182162
114
Clinical Case Study
4. Yadav D, Pitchumoni CS. Issues in hyperlipidemic pancreatitis. J Clin Gas-
troenterol 2003;36:54 – 62.
5. Ewald N, Hardt PD, Kloer HU. Severe hypertriglyceridemia and
pancreatitis: presentation and management. Curr Opin Lipidol 2009;20:
497–504.
6. Yang F, Wang Y, Sternfeld L, Rodriguez JA, Ross C, Hayden MR, et al. The
role of free fatty acids, pancreatic lipase and Ca2# signaling in injury of
isolated acinar cells and pancreatitis model in lipoprotein lipase deficient
mice. Acta Physiol 2009;195:13–28.
7. Druml W, Laggner AN, Lenz K, Grimm G, Schneeweiss B. Pancreatitis in
acute hemolysis. Ann Hematol 1991;63:39 – 41.
8. Saruc M, Yuceyar H, Turkel N, Ozutemiz O, Tuzcuoglu I, Ayhan S, et al. The
role of heme in hemolysis-induced acute pancreatitis. Med Sci Monit 2007;
13:67–72.
9. Araujo FB, Barbosa DS, Hsin CY, Maranhao RC, Abdalla DSP. Evaluation of
oxidative stress in patients with hyperlipidemia. Atherosclerosis 1995;117:
61–71.
10. Frederickson DS. An international classification of hyperlipidemias and hy-
perlipoproteinemias. Ann Intern Med 1971;75:471–2.
11. Schrier SL. Approach to the diagnosis of hemolytic anemia in the adult.
[UpToDate]. http://www.uptodate.com/contents/approach-to-the-diagnosis-of-
hemolytic-anemia-in-the-adult#subscribeMessage (Accessed April 2012).
increased C-reactive protein concentrations will usu-
ally have low haptoglobin concentrations of !30
mg/dL (2 ) because the haptoglobin– hemoglobin com-
plex is cleared from the circulation with a half-life of
10 to 30 min. Repeating the haptoglobin analysis 24 h
later would have been helpful to evaluate whether the
hemolyzed specimens were due to continuing intravas-
cular hemolysis, because haptoglobin requires 5 days to
regenerate. One might speculate that the circulation of
pancreatic enzymes may have resulted in subclinical
membrane abnormalities, making the red cells more
susceptible to the common preanalytic causes of spec-
imen hemolysis (1 ). A less likely cause was the local
release of hemoglobin into the circulation by the dam-
aging effect of the released enzymes on in situ hemato-
mas, thereby mimicking intravascular hemolysis.
Author Contributions: All authors confirmed they have contributed to
the intellectual content of this paper and have met the following 3 require-
ments: (a) significant contributions to the conception and design, acquisition of
data,oranalysisandinterpretationofdata;(b)draftingorrevisingthearticlefor
intellectual content; and (c) final approval of the published article.
Authors’ Disclosures or Potential Conflicts of Interest: No authors
declared any potential conflicts of interest.
References
1. Carraro P, Servidio G, Plebani M. Hemolyzed specimens: a reason for rejection
or a clinical challenge. Clin Chem 2000;42:306 –7.
2. Kormoczi GF, Saemann C, Buchta M. Influence of clinical factors on the
haemolysis marker haptoglobin. Eur J Clin Invest 2006;36:202–9.
Clinical Chemistry 58:6 (2012) 977