= VALIDACION DE METODOS Version: 01 @q er paOceIO CUALITATIVOSPARAANALISIS. | | Nacional D5 REDES EN SALUD PUBLICA MICROBIOLOGICO 2015-06-18 Save - eae Pagina 1 de 15 4. OBJETIVO Definir los lineamientos generales para realizar la validacién primaria 0 secundaria seguin el caso, de las diferentes metodologias analiticas normalizadas, normalizadas modificadas, del fabricante ylo reconocidas por la comunidad cientifica, empleadas para la ejecucion de los ensayos de tipo cualitativo de caracter microbiolégico en los labotatorios que pertenecen 2 los Grupos de laboratorios de la Direccion de Redes en Salud Publica (DRSP) del Instituto Nacional de Salud en el marco dela normas objeto de acrectacin, con el fr de aseguas que gs mstodos adopados sao eee romes cil cea no in ne i eats mite requerimientos establecidos por el cliente. a VIGENTE » 2. ALCANCE oo Los métodos analiticos cualitativos de tipo microbiolégico, empleados para la ejecucién de los ‘ensayos en los laboratorios que pertenecen a los Grupos de laboratorios de la Direccién de Redes en Salud Publica (DRSP) del Instituto Nacional de Salud en el marco de las normas objeto de acreditacion 3, RESPONSABILIDAD ‘+ Coordinador de Grupo: Tiene la responsabilidad y autoridad para gestionar los recursos pertinentes, con el fin de llevar a cabo los ejercicios de validacién primaria o secundaria de las metodologias analiticas adoptadas para la ejecucién de los ensayos, De igual forma es responsable de la revision y aprobaci6n del Informe de validacion + Responsable Técnico, Lider Técnico: Son coresponsables en estructurar el disefio experimental del ejercicio de validacion primaria 0 secundaria segun aplique, contando con la interaccion de los Jideres técnicos segun su competencia. De igual forma son corresponsables de realizar el analisis final y consolidado de los resultados del ejercicio de validacién primaria o secundaria, a fin de presentarlos al Coordinador de Grupo. + Lideres Técnicos: Son responsables del analisis de los materiales de referencia, muestras rutinarias y/o estandares intemnos de trabajo establecidos en el eercicio de validacion primaria © secundaria, con el fin de presentar los respectivos resultados al Responsable Técnico. 4, DEFINICIONES Y ABREVIATURAS Las definiciones aplicables para este documento corresponden al ambito especifico para ensayos de tipo microbiologico; se considera pertinente dar la especificidad en el enfoque, con el fin de faciltar la comprensién y aplicacién de os lineamientos relacionados. * Acuerdo: Corresponde a la probabilidad de encontrar el mismo resultado en dos muestras idénticas, analizadas en el mismo laboratorio, bajo condiciones de repetibilidad. [ISO 16140:2003] + Concordancia: Coresponde a la probabilidad de encontrar el mismo resultado en dos muestras idénticas, cuando son analizadas en condiciones de reproducibiidad o precision intermedia. [ISO 16140:2003]= VALIDACION DE METODOS Version: 04 @Q he PROCESO CUALITATIVOS PARA ANALISIS o actense oe REDES EN SALUD PUBLICA MICROBIOLOGICO 2015-06-19 fii Pagina 2 de 15 + Desviacién Negativa: (Falsos Negativos) Ocurre, en analisis cualitativo, cuando el método altemativo da un resultado negativo sin confirmacion y el metodo de referencia da un resultado positivo. Esta desviacion se convierte en un resultado negative falso cuando puede ‘demostrarse que el resultado verdadero es positive. [G-ENAC-04]. Para el enfoque de analisis cualitativo en los laboratorios del INS. corresponden a muestras que arrojan resultado negativo ‘cuando la correcta caracterizacién indica que es positivo. + Desviacién Positiva: (Falsos Positives) Ocurre, en andlisis cualitativo, cuando el método ‘alterativo da un resultado positivo sin confirmacion y el método de referencia da un resultado Negativo. Esta desviacion se convierte en un resultado positivo falso cuando puede demostrarse que el resultado verdadero es negativo. [G-ENAC-04). Para el enfoque de analisis, cualittivo en los laboratorios del INS, corresponden a muestras que arrojan resultado positive, ‘cuando la correcta caracterizacién indica que es negativo. + Especificidad/Selectividad: Capacidad de un método de evaluar de manera inequlvoca el analitofparametro en presencia de aquellos componentes cuya presencia resulta previsible, tales como imputezas, productos de degradacion y componentes de la muestra (matriz), La Selectividad puede ser afectada por la presencia de interferentes como precursores de sintesis, impurezas y productos de degradacién, entre otros. [ICH/USP-NF], Para el enfoque de analis's cualitativo en los laboratorios del INS, corresponden a la correcta caracterizacién de muestras negativas, es decir verdaderos negativos. + Exactitud: Es la proximidad entre los resultados de la prueba obtenidos mediante el procedimiento y el valor verdaderos. La exactitud de un procedimiento analltico debe establecerse en todo su intervalo. [USP-NF]. Para el enfoque de analisis cualitativo en los laboratorios del INS, corresponden a la correcta caracterizacién de muestras positivasinegativas, es decir verdaderos positivosiverdaderos negativos. + Sensibilidad: Se define como la capacidad o habilidad del método de detectar inequivocamente un analitofparametro al analizar una muestra determinada. [ICH]. Para el enfoque de andlisis cualitativo en los laboratorios del INS, corresponden a la correcta caracterizacion de muestras positivas, es decir verdaderos positives, + Validacion primaria: Establecimiento de las especificaciones para el desempefio de un nuevo metodo y/o verificacién experimental de que un método cumple criterios de calidad derivados tedricamente. [GTC84:2003] ‘+ Validacion secundaria: Demostracién mediante experimentos, de que un método establecido funciona de acuerdo con sus especificaciones cuando lo emplea el usuario. [GTC 84:2003] + Validacién: Verificacion de que los requisitos especificados son adecuados para un uso previsto. [VIM 2008] EJEMPLO Un procedimiento de medida habitvalmente utiizado para, la medicién de la concentracion en masa de niégeno en agua, puedesiamblen-velM@R56.B4"® flmecicion en el ssuero humano a” VIGENTE ® 5. CONDICIONES GENERALES =____—— + Los métodos sobre los cuales se pueden aplicar los criterios definidos en el presente documento pueden ser:= VALIDACION DE METODOS Versién: 04 qe PROCESO CCUALITATIVOS PARA ANALISIS as we Yio" REDESEN SALUD PUBLICA MicROBIOLOGICO 2015-06-19 ua eed Pagina 3 de 15 © Métodos biolégicos (se basan en a respuesta de biomodelos, células, microorganismos) Inoculacién de biomodelos, aislamientos virales, etc. © Métodos bacteriologicos (se basan reacciones 0 determinacién presencialausencia de bacterias): Analisis presencia/ausencia en diferentes matrices (aua€ tatepet Rieter. ot VIGENTE © Métodos parasitolégicos: (se basan reacciones o deter ion presencia/ausencia de parasitos) Andls's presencia/ausencia de diversos.parastos. er-diferentes--matrices (aguas, material bioldgico, etc) © Métodos de estudio viral (se basan en técnicas biolégicas 0 de biologia molecular para identificacion de virus): Métodos de PCR, RT-PCR, etc. ‘Los lineamientos que se presentan en este documento corresponden a criterios de orientacién general, puede ser necesario consultar la bibliografia relacionada para profundizar en los detalles de aplicabilidad requeridos. En caso de que existan lineamientos relacionados con la metodologia para realizar la respectiva validacién, emitidos por los entes internacionales, nacionales 0 fabricantes que avalan los métodos adoptados, estos serdn aplicados por el laboratorio siendo equivalente dicho esquema, al cumplimiento del presente documento. ‘+ Las actividades de validacién deben realizarse sobre muestras naturales 0, en su defecto, con muestras inoculadas, preferiblemente no esterilizadas para que exista microbiota interferente + De acuerdo a los parametros a estudiar puede ser necesario “forticar’ 0 “adicionar" las muestras incluidas en el estudio de validacién primaria o secundaria; para ello se sugiere cconstruir el lineamiento especifico de conformidad con lo reportado en fa literatura y directamente relacionado con él microorganismo objeto de andlisis. En este sentido, en el instructive INT-RO1.0000-012 Estandarizacién de Inéculo para Fortificacion de Muestras en Ensayos Microbiologicos se sugieren algunas estrategias para llevar a cabo el proceso de estandarizacién del inéculo. Sin embargo, independiente de la metodologia escogida el proceso debe documentarse completamente, ntes de iniciar el proceso de Validacién, se debe haber trabajado suficientemente con el método de ensayo con el fin de asegurar el conocimiento que ofrezca la garantia de que la validacion puede ser satisfactoria’ [AEFI 2000]. Los lineamientos generales para la estandarizacién de un método de ensayo cuando se implementa por primera vez en el laboratorio se encuentran definidos en el instructivo INT-R01.0000.010 Seleccién y estandarizacién de métodos de ensayo. Solo cuando el meétodo de ensayo esta plenamente definido en todos sus detalles y se tiene el convencimiento de que las Condiciones descritas son idéneas para alcanzar los resultados esperados, debe iniciarse el ejercicio validacién. A continuacién se listan los aspectos relacionados mas relevantes: © Disponer y revisar la norma aplicable (Uitima version vigente 0 anterior con justificacion técnica de su uso), el Método de Ensayo (MEN) y los documentos relacionados, correspondientes a cada ensayo incluido en el alcance. © Inventario de los materiales y reactivos que se necesitan para la Validacion primaria 0 secundaria: Identificacion, precauciones, calidad, cantidad, grado de pureza, etc.a = _ VALIDACION DE METODOS Versior itor PROCESO CUALITATIVOS PARA ANALISIS 1 NACIONAL DE REDES EN SALUD PUBLICA MICROBIOLOGICO 2015-06 - 19 Saven Gen Pagina 4 de 15 © Verificacion y optimizacién de las condiciones metrolégicas de los equipos. Se debe contar con los respectivos soportes de mantenimiento, calibracion yio calificacion ‘segun aplique, de acuerdo al programa de aseguramiento metrolégico. © Aseguramiento de las condiciones ambientales relevantes para la ejecucion de los ‘ensayos. De acuerdo a la naturaleza del ensayo, el método adoptado y las posibles modificaciones que se introduzcan al mismo, se debe definir el tipo de ejercicio a desarrollar, bien sea de validacion primaria 0 secundaria y de acuerdo a dicho eriterio, seleccionar el aleance, extension y parametros a incluir en ¢| mismo, La verificacién del cumplimiento en los aspectos previamente citados se realiza mediante la aplicacion del formato FOR-RO1.0000.053 Lista de chequeo para inicio de validacién de métodos analiticos. 8 oc ‘ 6. CONTENIDO Z Vice nro 6.1. Extonsién del ejercicio de validaci6n asi La extension y enfoque del ejercicio de validacién depende fundamentalmente del tipo de metodologia analitica que adopta el laboratorio, la naturaleza del rismo y las matrices sobre las ‘cuales se aplique. A continuacion se presentan algunos criterios generales: © El laboratorio utiliza “plenamente” un método normalizado: E! laboratorio tiene que verificar que ‘es capaz de alcanzar los rendimientos caracteristicos del método publicados (0 que sea capaz de cumplir los requisitos de la tarea analttica); debe realizar estudios de precision (acuerdo y ‘concordancia), exactitud, sensibilidad, selectividad/especifcidad, tasa de falsos negativos y falsos positivos. * El laboratorio utiliza un método normalizado, pero se quiere aplicar a una nueva matriz: El laboratorio tendra que verificar que no se identifican nuevas fuentes de error en el sistema ‘cuando se aplica a la matriz en cuestion. El mismo tipo de validacién deserito en el item anterior es requerido; adicionalmente debe estudiarse el efecto matriz y limite de deteccion para la nueva matriz, * El método ha sido publicado en Ia literatura cientifica sin caracteristicas analiticas 0 se ha han desarroliado de forma interna: El laboratono debe realizar estudios de de precision (acuerdo y concordancia), exactitud, sensibilidad, selectividadiespeciticidad, tasa de falsos negatives, tasa de falsos positvos, efecto maltiz y limite de deteccion. 6.2, Disefto experimental del ejercicio De manera general para llevar a cabo un ejercicio de Validacién es necesario definir previamente los aspectos relevantes de ejecucién que den respuesia al objetivo que se pretende consegutr Asi las cosas, los aspectos previos a considerar on ol ojercicio de validacion deboran consignarse en el formato FOR-R01.0000-066 _“Diseno __experimental__de validacion/revalidacion de métodos de ensayo”. Alli se encontrara la informacién que se detalla a confinuacion’VALIDAGION DE METODOS Versio CUALITATIVOS PARA ANALISIS. MICROBIOLOGICO 2015-06-19 Gemma 7 Lal Qe PROCESO Wem NACONSEPEREDES EN SALUD PUBLICA, Saveo Pagina 6 de 15 6.2.1. Objetivo Se debe definir de manera puntual y concreta cual es el objetivo del ejercicio, detallando el tipo de validacién a realizar, bacteria, virus 0 parasito target y el respective Método de Ensayo (MEN) 6.2.2. Alcance Se debe definir en forma clara el alcance del ejercicio, lo cual incluye el microorganismo target y las, matrices sobre las cuales aplica 6.2.3. Responsables Relacion de los funcionarios responsables que llevaran a cabo el ejercicio (profesionales responsables de la ejecucién del ensayo) y de los que revisaran y aprobaran los resultados de! mismo. 6.2.4. Parametros a estudiar Fundamentado en los atributos del método de ensayo y el tipo de ejercicio a desarrollar, se establecen los parametros a evaluar dentro del estudio, con el fin de determinar las caracteristicas de desempefio. A continuacién se relacionan dichos parémetros, teniendo en cuenta que de acuerdo a ia metodologia, se puede aplicar un grupo especifico de los mismos: ‘Acuerdo Concordancia mocuMeENTO ViGENTE Especificidad/Selectividad = DO! Sensibilidad av Exactitud @ Tasa de falsos positivos y falsos negatives watt Limite de deteccién Probabilidad de error asociada al resultado del ensayo Los esquemas para evaluacién de cada pardmetro son seleccionados segiin el método a validar y de acuerdo a la aplicablidad segin el caso, los lineamientos descritos en los anexos internos que se detallan a continuacién: PARAMETRO "ANEXO INTERNO Aouerdo Concordancia Especticdad/Selectidad Sensibilidad a Erectud asa de falsos positives yflsos negaivos Limite de detecciin OF Procadimiento POE-RO1,0000.016 Estimacion de la Probabilidad de errr asociada al resultado del ensayo geirdtteorchSaco = VALIDAGION DE MéToDOS Versin: 01 @&q 1080 PROCESO CUALITATIVOS PARA ANALISIS a NACtONALDE —_REDES EN SALUD PUBLICA MICROBIOLOGICO 2015-08-19 sd Pagina 6 de 15 En el disefio experimental se debe detallar el esquema de corrida de las muestias para los diferentes parémetios a estudiar, en términos de,cantida, tipo de muestra, dias de montae, entre otros, Q DUCUMENTO 6.2.5. Modelo de ejecucién @ VIGENTE ad ‘© Categorias y matrices: Se debe especificar el tipo dé muestras-que-se van a utlizar en el ejercicio (naturales, Materiales de Referencia primarios o secundarios, estandares internos, controles de kits comerciales, etc.), detallando la identificacién que se va a dar a las mismas y en el caso de Materiales de Referencia, toda la informacion que soporte la vigencia trazabilidad respectiva, incluidos los certificados de calidad expedidos por el fabricante. Para las muestras naturales que se emplean, se debe registrar la identificacion de la muestra y los datos que soporten a trazabilidad de la informacion relacionada con su origen y caracterizacién. De igual forma, de acuerdo a la naturaleza de las muestras, estas pueden ser categorizadas y seleccionadas (por ejemplo por el método de bloques incompletos) de tal forma que se logre una representatividad de las diferentes matrices allegadas para estudio, © Tamafio de muestra: Debe definirse el tamario de muestra para el ejercicio, criterio que puede proceder de lineamientos establecidos en publicaciones relacionadas 0 cAiculo estadistico de la misma, + Obtencién de muestras: Se debe declarar la fuente de las muestras ylo materiales de referencia empleados en el ejercicio y la evidencia de que han estado en adecuadas condiciones de almacenamiento. © Caracterizacién e identificacion de muestras: Se debe detallar la caracterizacion de las muestras y/o materiales de referencia empleados con evidencia de trazabilidad cuando aplique, asi como la identificacion que se manejara en el ejercicio, con el fin de tener claridad para el analisis de datos, * Reactivos: Se deben detallar los reactivos utlizados, especificando lote, vencimiento (si aplica) y anexando los respectivos certificados de calidad. © Equipos: Se debe realizar un listado de los equipos de medicién y auxiliares, detallando su identificacion y las especificaciones técnicas e instrumentales de cada uno, segun aplique. 6.2.6. Metodologia de ejecucién ‘* Fundamento de! método de ensayo: Se debe detallar el principio del método de ensayo, declarado en el respectivo MEN. ‘+ Competencia técnica de los lideres técnicos: Se debe presentar de manera resumida la evidencia de competencia técnica del personal que participa en el ejercicio. * Fuente de los datos: se deben definir los esquemas o herramientas para la recoleccién de datos lo cual debe hacerse preferiblemente, en hojas de trabajos que hacen parte del Sistema de Gestion de Calidad, 0 dependiendo del tipo de ejercicio y la naturaleza de los datos es posible ef uso de formatos especificamente disenados para la recoleccion de datos del ejercicio de validacién, los cuales deben quedar definidos o descritos en este item= VALIDACION DE METODOS Version: 04 @Qq PE PROCESO CCUALITATIVOS PARA ANALISIS te S286 58 genes eN SALUD PUBLICA MICROBIOLOGICO 2015-06-19 nO neas Pagina 7 do 16 '* Presentacién de los datos: se debe deseribir la metodologia de presentacién de los datos, tanto primarios como resultados de andlisis para que se reflejen en el Informe de Validacion, © Andlisis de datos: se debe describir la metodologia de andlisis de acuerdo al tipo de ensayo y pardmetro a estudiar + Criterios de aceptaciin: En este item se deben definir las especificaciones de desempeno del método, de tal forma que se tenga al criterio para comparar los datos obtenidos para los diferentes parémetros evaluados en el ejercicio de Validacién. Dichos criterios pueden coresponde incviualnenteo en conjut acres deta gad oyA you bjetves anatices det laboretorofundamentados en norm te ee cliente. Cuando dichos erterios no se encuentren documentads ol Fico sors determinarios. vot 6.3, Informe de validacion El Informe de Validacién debe dar respuesta a todos los planteamientos definidos en el disefio ‘experimental, Siendo consecuente con este principio, debera presentar la informacién relacionada cada uno de los pardmetros definidos en el disefio experimental, registrando segin aplique, la evidencia o referencia de la misma, de aspectos tales como trazabilidad, consolidados ‘de comportamiento histérico de equipos (segun aplique), operaciones de confirmacién metroldgica € equipos (Litimo mantenimiento, calibracién, calificacién operacional o verificaciones), condiciones ambientales relevantes (cuando aplique), entre otros. Adicionalmente el Informe contiene los siguientes apartados: '* Conclusions: Fundamentado en los resultados de anélisis realizados, se definen las conclusiones del estudio, teniendo en cuenta los criterios de aceptacion y/o rechazo y los lineamientos de los métodos de ensayo para los parametros especificos. ‘© Clasificacién del método: La clasificacién del método corresponde a la denominacién numérica consecutiva que el laboratorio le asigna y su declaracién para el uso del método, asi = Identificacion del método: Se realizaré por medio de cuatto (4) caracteres alfabéticos, siendo los dos primeros las letras CL que caracterizan el método como cualitativo y dos gue individualizan el tipo de método, asi CLBI_ : Método cualitativo biolégico ciBc Método cualitativo bacteriolégico CLPA : Método cualitativo parasitoléaico CLEV : Método cualitativo de estudio viral = Numeracion consecutiva: Precedida del signo numeral (#) se asignaré un numero ‘consecutive especifico por el laboratorio al método validado. = Estado: corresponde a siglas que detallan si el método ha sido validado (de manera primaria 0 secundaria) por primera vez o ha sido revalidado, asi VA: Método que ha sido Validado REVA ! Método cuya Validacién ha sido reconfirmada, es decir, ha sido re-validado,VALIDACION DE METODOS Versién: 04 CUALITATIVOS PARA ANALISIS. MICROBIOLOGICO 2018-06-19 Emi @Qq Ore PROCESO wm 81M PF REDES EN SALUD PUBLICA, Savun Pagina 8 de 16 ‘+ Declaracién de aptitud para el uso previsto: los cuales ha sido evaluado asi Clasifica el método seguin los esquemas mediante ACEPTADO (A): Evaluado en el laboratorio sin Interlaboratorios 0 estudios Colaborativos RECOMENDADO (R): Evaluado con pruebas Interlaboratorio 6 estudios Colaborativos ‘© Fecha de Validacién: Detalla el mes y afio en que fue emitido el respective Informe de Validacién asi: Mm: Dos digitos que corresponden al mes de ejecucién del ejercicio de Validacién. ‘Aa: Dos digitos correspondientes al afio de ejecucién del ejercicio de Validacién Para la elaboracién de los informes de validacién, so utilizaré | formato FOR-RO1.0000- 967"Informe de validacién/revalidacién de métodos de-ensayo” | informe de Valdacin primaria 0 secundaria del método es aprobado mediante firma por el Coorsinaceree GC. U MENTO. Q 6.4, Revalidacion . VIGENTE La revalidacion corresponde a la verificacién mediante pruebas documentadas WE tue-ur-método————— analitico previamente validado, continiia siendo suficientemente fiable en el tiempo o tras realizar modificaciones respecto al método inicial. Se puede requerir en los siguientes casos: + Paso del tiempo: Para demostrar que el método sigue siendo valido. Tipicamente con eriodicidad anual se realiza un consolidado de datos obtenidos desde los esquemas de ‘aseguramiento de la calidad y se realiza un re-andlisis para robustecer la estimacién de los parametros asociados. = Cambio en la muestra: Corresponde a la inclusion de nuevas matrices para analizar 0 ‘mosificaciones importantes en la matriz estudiada habitualmente. + Cambios instrumentales: Cuando se produzcan cambios en los equipos utiizados 0 en los elementos crticos para su funcionamiento, + Modificaciones de parametros analiticos: Cuando se decide realizar alguna modificacién en Parametros como tiempos de agitacion, proceso de extraccién, tiempos de incubacién, etc, Los pasos a seguir son: Definir el cambio y documentarlo (6.2. Disefto experimental del ejereicio) Ver si el cambio esta dentro del ambito de aplicacién, parémetros y limites Ver si el cambio esta dentro del ambito de aplicacién, parémetros y limites establecidos en el metodo. Determinar el alcance de revalidacién a realizar en funcién dal cambio, Realizar la validacién de los parémetros definidos. Para el caso de los ensayos cualitativos, se deben valorar todos los parémetros inicialmente estudiados.= \VALIDAGION DE METODOS Version: 04 Ce PROCESO CUALITATIVOS PARA ANALISIS Nacionssos REDESEN SALUD PUBLICA MICROBIOLOGICO 2015 -06 - 19| Ll Ene [Pagina 9 de 15, Las evidencias de la fase de planificacién de la revalidacién, asi como de los resultados y ef andiisis realizado en el ejercicio de revalidacién deberan registrarse en los formatos FOR- R01.0000-066 “Disefio experimental _de_validacién/revalidacién de_métodos de ensayo"y FOR-R01.0000-067 “Informe de validacién/revalidacion de métodos de ensayo” 7. DOCUMENTOS DE REFERENCIA + AOAC INTERNATIONAL. ISTA Method Validation for Seed Testing - APPENDIX 5: Instructions for—-Reviewers: Draft’ «= Test. = Plan (en _linea) ww seedtestorg).. /MVIST_APPENDIXS InstructionsforReviewers Drie (consultado en Junio de 2071), MENTO Vig. ENTE * AOAC INTERNATIONAL. Final report and executive summaries from tt ‘OAC International - Presidential Task Force on Best Practices in Microbiological Methodology: 2006-—_ + ASOCIACION ESPANOLA DE FARMACEUTICOS DE LA INDUSTRIA Validacion de métodos analiticos. Barcelona, 2001: Parte | ‘+ CENTRO INTERNACIONAL DE INVESTIGACIONES PARA EL DESARROLLO. Ensayos toxicolégicos y métodos de andlisis de calidad de agua - Capitulo 5 Métodos estadisticos para andlisis de resultados de toxicidad (en linea) hitp /web idrc.calesiev-84458-201-1- DO inl (consultado en Junio de 2011). ‘* CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE - CLSI Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation, Approved Guideline (en linea) http J/www.clsi.ora/source/ordersifree/ep17-a pdf (consultado en Junio de 2011). + Document Técnico SGC NTC/IEC 17025 Validacién de Métodos Cualitativos para analisis microbiolégico POE-RO1-LEM-0000-002 Versién 00, de 05 de septiembre del 2013, + ENTIDAD NACIONAL DE ACREDITACION - ENAC. Gula para la acreditacion de laboratorios de analisis microbiolégicos (en linea) http/iwww enac.es/web/enacidocumentos-descarga (consultado en Junio de 2011). + EURACHEM. Terminology in Analytical Measurement. Introduction VIM 3. First edition 2011 (en linea) http./www.eurachem ora/quides/pdf/TAM_2011 Final web pdf (consultado en Junio 2011) + FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS. Calidad de Métodos analiticos. Capitulo B (en linea) hitp:/hwww fao org/docrep/01 O/ah833s/AHB33S15 him (consultado en Junio de 2011) + INTERNATIONAL STANDARIZATION ORGANIZATION. 2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs, Protocol for the validation of alternative methods NFEN ISO 16140. + INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TECNICAS Y CERTIFICACION Calidad de agua Gula para la orientacion acerca de la validacién de métodos de andlisis microbiologicos. Bogota. ICONTEC 2003 (GTC 84). ‘+ INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONISATION OF TECHNICAL REQUIREMENTS FOR REGISTRATION OF PHARMACEUTICALS FOR HUMAN USE. Validation of analytical= VALIDAGION DE METODOS Version: 04 @q B00 PROCESO CUALITATIVOS PARA ANALISIS es bei be REDES EN SALUD PUBLICA MICROBIOLOGICO 2015-06-19 eee) Pagina 10 de 15 Procedures; Text and Methodology = 2 (1). ~—(en_ tinea) http:swww.ich.orgffileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q 2_R1__Guideline pdf (consultado én Junio 2011) + NATIONAL ASSOCIATION OF TESTING AUTHORITIES - NATA. ~ Guidelines for the validation and vertication of chemical test methods — Technical Note 17 (en linea) httovAwww nata.asn.au/phocadownloadipublications/Technical_publications/Technotes Infopa persilechnical_note_17 od (consultado en Junio 2011) * ORGANIZACION PANAMERICANA DE LA SALUD. Vacunacion Segura: Médulo II Laboratorio de Control de Calidad. (en linea) hitp:wwny.paho ora/spanish/ad/fchlim/ModuloVacSequra_2.pdf Washington D.C. (consultado en Junio de 2011) * THE INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY — IUPAC ‘Compendium of analytical nomenclature (en linea) hitp://old.iupac.ora/publications/analytical_compendium/Alphalndex htm | (consultado en Junio 2011), + UNIVERSITAT ROVIRA | VIRGIL! ITZIAR RUISANCHEZ, ESTHER TRULLOLS Y F. XAVIER RIUS, Validacion de metodos: cualitativos (en linea) hitp:tiwa wimica.urv.esiquimio/generaiigiveualit3,pof (CONSULTADO EN JUNIO DE 2011), 8 CONTROL DE CAMBIOS FECHA DE = VERSION APROBACION ‘AAA | MM | DD 2 hae Creacion del documento. Documento que migra del sstema SGC NTC ISONEC 17026, 0 2015 | ot | 21 | POE-ROI-LEN-0000-002 Validacion de Metodos Cualtatvos para _andlsis ricroboldgco, Version No. 00 Inclusion de formatos normalizados para la elaboracion de los disefios experimentales on 2015 | 08 | 19 | de validaciénirevalidacién de metodologias de ensayo, asi como para la elaboracion de los informes de valdaciirevaidacion de métodos de ensayo, = DOCUMENT: & ANEXOS a GCUMENTO ® VIGENTE ‘Anexo 01. Acuerdo Anexo 02. Concordancia — ————— = Anexo 03. Especificidad/Selectividad, Sensibilidad, Exactitud, Tasa de falsos positivos y falsos negativos ‘Anexo 04, Limite de deteccién \ [____ ELABORO REVISO \aPROSO ine | raw Pkobipre Qiccwiin fama Pata Mane | Lg i: Lule’, Martino Avila v Facitador Técnico Subairsctor Tecnico Equipo de Calidad Gestion de Calidad LSP Facilitador Técnico (S)‘_ VALIDACION DE METODOS Version: Of @ ee PROCESO CUALITATIVOS PARA ANALISIS we cero! ReneS EN SALUD PUBLICA MICROBIOLOGICO 2015-08-19 onan Pagina {1 de 15 ANEXO 01. ACUERDO En el andlisis cualitativo, la variable de acuerdo corresponde al criterio de PRECISION del método de ensayo y es equivalente al enfoque de repetibiidad que se maneja para los métodos ‘cuantitativos. En el ejercicio de validacién, el andlisis de ‘acuerdo’ se estructura sobre la base de los resultados obtenidos al evaluar réplicas de materiales de acuerdo al tipo de ensayo en condiciones de Tepetibilidad, es decir manteniendo constante el Jider técnico responsable, equipos, muestra, método y realizados en un periodo de tiempo lo mas corto posible. El analisis de esta variable se fundamenta en determinar la PROBABILIDAD que los resultados ‘obtenidos (positivos o negatives segun el enfoque del método) al analizar las réplicas del material de estudio, sean equivalentes entre si De manera consecutiva se van determinando las siguientes probabilidades: * La probabilidad de obtener un resultado determinado en una réplica, mediante a relacién entre dicho resultado y el total de muestras analizadas. © La probabilidad que un par de replicas den resultados iguales, es e! cuadrado de la réplica individual + La probabilidad que todas las replicas den un mismo resultado entre si, es la suma de las obtenidas para resultados positivos y negativos, EI ACUERDO se calcula promediando las probabilidades de obtener pares con el mismo NTO resultado y luego transformando el dato obtenido a porcentaje.Versién: 01 VALIDACION DE METODOS Isersroro PRcceaD: CUALITATIVOS PARA ANALISIS. eal ee S88 ReDES EN SALUD PUBLICA MICROBIOLOGICO 2015-05-19 sun) Pagina 12 de 1 ANEXO 02. CONCORDANCIA En el andlisis cualitativo, la variable de "concordancia’ corresponde al criterio de PRECISION del método de ensayo y es equivalente al enfoque de reproduciblidad intermedia que se maneja para Jos métodos cuantitativos. En el ejercicio de validacién, el andlisis de “concordancia” se estructura sobre la base de los resultados obtenidos al evaluar materiales de acuerdo al tipo de ensayo en condiciones de precision intermedia, modificando en el sistema de medicién el lider técnico responsable ylo el dia de ejecucion del ensayo (tiempo). El andlisis de esta variable se fundamenta en establecer la PROBABILIDAD que cada resultado obtenido (positive 0 negativo segtin el enfoque del método), tenga otro(s) equivalente de todos los resultados generados por los diferentes Profesionales o en diferentes dias de montaje. De manera consecutiva se van realizendo los siguientes calculos: + Establecer el numero total de resultados con los que TEORICAMENTE puede ser comparado cada dato obtenido, realizando posteriormente Ia respectiva sumatoria + Establecer el numero de resultados que en la PRACTICA fueron equivalentes a cada dato obtenido, realizando posteriormente la sumatoria, + Establecer la relacion entre los equivalentes obtenidos en la practica y los que teéricamente deberian presentarse. Es decir: valencia obtenidas en el ejrcicio T equivalencia que teoricamenle deberian presentarse 2 F0-, YY, Telia ‘+ Transformar el dato obtenido a porcentaje.ay VALIDACION DE METODOS: Version: 01 Ixsriter0 PROCESO CUALITATIVOS PARA ANALISIS = NacioNAt DE REDES EN SALUD PUBLICA MICROBIOLOGICO 2015-08-19 Saco Eosenmn Pagina 13 de 15 ANEXO 03. ESPECIFICIDAD/SELECTIVIDAD, SENSIBILIDAD, EXACTITUD, TASA DE FALSOS POSITIVOS Y NEGATIVOS Las caracteristicas de desempefio de un método cualitativo asociadas con la exactitud, especificidad y sensibilidad pueden definirse numéricamente, Estas se relacionan con las proporciones relativas de muestras que se supone son positivos o negativos (segun el enfoque del método), sobre la base de la primera impresién (presunta), comparada con la verdadera caracterizacion de la muestra utiizada Después de haber realizado n ensayos, sus resultados se dividen en cuatro categorias Numero de muestras positivas, caracterizadas como tal, VERDADEROS POSITIVOS (VP) Numero de muestras positivas, caracterizadas como negativas, FALSOS NEGATIVOS (FN) Numero de muestras negativas, caracterizadas como tal, VERDADEROS NEGATIVOS (VN) Numero de muestras negativas, caracterizadas como positivas, FALSOS POSITIVOS (FP) La caracterizacién de las muestras como POSITIVAS 0 NEGATIVAS en los ensayos cualitativos, tendré un enfoque particular a cada tipo de ensayo, pudiendo denominarse como: + Para ensayos de identidad: La muestra POSITIVA corresponderé a aquella que contiene el analito de interés y NEGATIVA, la que no lo contiene. © Para ensayos de inccuidad: La muestra POSITIVA correspondera a aquella que muestra un resultado de no inocuo y NEGATIVA, la que muestra un resultado inocuo. * Para ensayo de neutralizacién: La muestra POSITIVA correspondera a aquella que posee el componente capaz de realizar la neutralizacién y NEGATIVA, la que no lo contiene. Estas frecuencias se expresan en una tabla de 2 x 2 0 tabla de contingencia, la cual permite caracterizar el sistema fundamentado en el concepto de probabilidad, diferenciando las muestras fen dos categorias, positivo/negativo y estableciendo una comparacion respecio al resultado obtenido mediante un método de referencia, confirmatorio o una caracterizacién incuestionable. | Caracterizacion real de la muestra | Resultado obtenido al . | aplicar el método pone) ee a Presunto resultado (+) WP Presunto resultado (-) FN Se SecuMENTO Posteriormente se calculan los siguientes parametros: - VIGENTE N = Numero total de muestras (VP+VN+FP+FN) a N.= Nimero de resultados caracierizados previamente como negativos (VN=FP) N, = Numero de resultados caracterizados previamente como positivos (VP+FN) A partir de esta informacion, se calculan los porcentajes de exactitud, especificidad y sensibilidad asi Exactitud — (VP+VNIN)* 100 Fraceion de positives y negativos asignados correctamente= ‘VALIDACION DE METODOS Versién: Of Issritere PROCESO CUALITATIVOS PARA ANALISIS. | a: 6 fem Snorer REDES EN SALUD PUBLICA MICROBIOLOGICO 2015-06-19) sere Pagina 14 4015 Sensibilidad (VPIN,)* 100 Fraccién de los positivos totales correctamente asignada en el presunto resultado Especificidad/Selectividad (VN/N.)* 100 Fraccion de los negativos totales correctamente asignados en el presunto resultado asa de falsos positives FP/ (VN+FP) ero Fraccién de los positivos observados, asignados erroneamente es fom Uy, Lag, Tasa de falsos negativos (FNi(VP+FN) yr 1G, Sy Fraccion de los negativos observados, asignados erroneamente sy Sune 7 a as.VALIDACION DE METODOS Versién: 04 Sq tH PROCESO CUALITATIVOS PARA ANALISIS.—|_ tem Ss1oNs" 05 Rees EN SALUD PUBLICA MICROBIOLOGICO 2015-06-19 ANEXO 04, LIMITE DE DETECCION Ellimite de detecoion para pruebas cualitativas se describe mejor como "LODsc’ 0 numero de forganismos por gramo o millitfo de muestra en los cuales el 50% de las pruebas son positivas El término “LODss"no tiene el mismo significado que el Limite de deteccién (LD) y Limite de ‘cuantificacién (LC) para los ensayos de naturaleza quimica; se utliza para ensayos microbiolégicos para definir un rango determinado de particulas (bacterias, virus 0 macromolécula genética) en el ‘que los métodos son capaces de "detectar” la minima cantidad de analito en una porcién analitica El céloulo del LDso permite tener en cuenta los “fallos” en la deteccion debidos a homogeneidad incompleta del “analito" en la muestra 0 suspension inicial. El estudio experimental se realiza asl ‘+ Se trabajan blancos adicionados con concentraciones que se estiman cercanas al nivel de deteccion del método de ensayo o muestras naturalmente contaminadas que se diluyen apropiadamente buscando el citado limite, ‘+ Se deben trabajar por lo menos cuatro niveles de concentracion y realizar minimo diez (10) replicas de cada nivel; adicionalmente debe trabajarse el nivel de cero (0) concentracién, * El cAlculo del LODsp corresponde a la concentracién en la cual se evidencia un 50% de resultados positivos y 50% de resultados negativos, ‘+ Se deben calcular los limites de confianza a un 95% de confianza utilizando un método no Paramétrico tal como Speerman Karber. Los limites de confianza calculados se asumen con la incertidumbre asociada al LOD co + Las estimaciones de los percentiles, como la LODso corresponde a la concentracion del “analito" en la cual el 90% de los resultados obtenidos son positivos. amon) Pagina 18 de 15