Professional Documents
Culture Documents
BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 1
BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 1
Nắm rõ quy trình, nguyên tắc cách xác định hoạt độ enzyme
Nắm rõ về hoạt tính xúc tác α-amylase trong xúc tác thủy phân tinh bột thành dextrin.
Alpha amylase (EC 3.2.1.1) là một enzyme có khả năng thủy phân ngẫu nhiên liên kết
α-1,4 glucosidic trong tinh bột để tạo thành các đoạn dextrin ngắn (Van Oort, 2010).
Alpha amylase có nhiều trong các loại hạt nói chung và đại mạch nói riêng. Thông
thường, những hạt đại mạch chưa nảy mầm không có hoặc có rất ít hoạt độ amylase.
Tuy nhiên, trong suốt quá trình nảy mầm của hạt, hoạt độ amylase tăng lên đáng kể.
enzyme này có tác dụng xúc tác quá trình thủy phân của tinh bột có trong các hạt
thành các đoạn dextrin ngắn, cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho việc nảy mầm.
Amylase nói chung và α-amylase nói riêng, có vai trò quan trọng trong công nghiệp
nhất là công nghiệp thực phẩm. Chúng được sử dụng nhiều nhất trong các ngành công
nghiệp sản xuất bia rượu, mạch nha và bánh mì. Sự thủy phân tinh bột của α-amylase
có thể tóm lược thông qua phương trình sau:
α-amylase
Tinh bột Dextrin phân tử lượng thấp
Phương pháp Wohlgemuth dựa trên nguyên tắc tìm nồng độ enzyme thấp nhất có thể
thủy phân tinh bột thành dextrin đến 30 phút ở 37 oC có Cl- làm chất hoạt hóa. Dùng
iodine 0.3% để kiểm tra sự có mặt của tinh bột, nếu trong mẫu thí nghiệm vẫn còn
xuất hiện phức chất màu xanh tím chứng tỏ enzyme alpha-amylase vẫn chưa thủy
phân hết lượng tinh bộ có trong mẫu.
1.3. Tiến hành.
1.3.1. Dụng cụ và hóa chất:
- 11 ống nghiệm
- Pipet 1ml ( 4 cái)
- Tủ ấm
- NaCl 0.5%
- Tinh bột 0.5%
- H2SO4 10%
- Iodine 0.3% trong KI 0.3%
Ngâm
Lọc lần 1
Lọc lần 2
Enzyme amylase
10 ống nghiệm
10 ống nghiệm đã
pha loãng
10 ống nghiệm đã
pha loãng
2 giọt iodine
3ml nước cất Chuẩn bị ống nghiệm số 11 trong KI
So sánh màu
Kết quả
Ống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
nghiệm
Nồng độ 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024
pha loãng
Nồng độ n/ n/4 n/8 n/16 n/32 n/64 n/128 n/256 n/512 n/1024
enzyme 2
Màu v v v v v v n x x x
Chú thích:
V: Vàng
N: Nâu
X: Xanh
Tính toán:
Lượng enzyme (n) được cho vào ống nghiệm (1):
mxV 1
n=
V2
Trong đó:
V1- thể tích dịch chiết enzyme cho vào ống nghiệm (1) (1ml)
V2- thể tích dịch chiết enzyme (100ml)
m- Lượng mẫu cân vật phẩm chứa enzyme (mg)
Trong đó: F- Độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy phân
hoàn toàn tinh bột (ống nghiệm có màu trung với màu của ống nghiệm thứ 11).
Công thức phải chia 5, vì theo định nghĩa, đơn vị Wohlgemuth được tính trên 1mg
tinh bột, trong bài chúng ta sử dụng tinh bột 0.5% tương đương lượng 5mg.
Ta chọn F = 64, ống nghiệm thứ 6 là ống nghiệm có độ pha loãng lớn nhất có màu
trùng với màu của ống nghiệm thứ 11.
Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1ml dịch chiêt enzyme (NW):
n 100
N w= = =323
V 1 xW 1 x 0.31
Ống nghiệm 1, 2, 3, 4, 5, 6 tinh bột bị thủy phân hoàn toàn nên dung dịch có màu vàng
nhạt, màu giống với ống nghiệm 11.
Ống nghiêm 6 là ống có nồng độ enzyme thấp nhất thủy phân hoàn toàn tinh b ột
thànhdextrin.
Ống nghiệm 7 có màu nâu do một phần tinh bột chưa bị thủy phân.
Các ống nghiệm 8, 9, 10 có độ pha loãng cao, nồng độ enzyme α-amylase th ấp không
đủ để thủy phân hoàn toàn tinh bột nên ống nghiệm có màu xanh tím do tinh bột không bị
thủy phân và tạo phức với Iodine.
Amylase là một trong những enzyme có nhiều ứng dụng trong các ngành nh ư công
nghiệp, y tế và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt đối với ngành công nghiệp th ực
phẩm.
Kết quả bài thí nghiệm đã xác định hoạt tính của enzyme: α-amylase có trong đậu
nành. α-amylase có hoạt tính cao nhất đối với cơ chất là tinh bột tiếp theo là cyclodextrin,
glicogen, maltotriose. Nhờ α-amylase mà tinh bột sẽ được thủy phân thành dextrin,
maltose, glucose
Nồng độ enzyme càng lớn thì lượng tinh bột bị thủy phân càng nhiều.
Sau khi chuẩn bị xong 3 ống nghiệm thì để ở nhiệt độ thường chính xác 30 phút thì đem
đi đun cách thủy 10 phút. Sau đó hút 5mL dung dịch ở từng ống nghiệm ra các erlen có
đánh số tương ứng.
Xác định glucose: thêm vào mỗi bình tam giác 10ml dung dịch iodine 0,1N và 15ml
NaOH 0,1N. Chú ý nhỏ chậm từng giọt NaOH vào sao cho th ời gian nh ỏ kéo dài kho ảng
2 phút (việc này đảm bảo cho nồng độ NaIO được kiểm soát, phản ứng (2) sẽ x ảy ra t ốt
hơn). Để yên trong bóng tối 20 phút. Lấy ra, thêm vào 2ml H2SO4 1N. Định phân l ượng
iodine thêm thừa bằng Na2S2O3 0,05N với hồ tinh bột 1% làm ch ất ch ỉ th ị. L ặp l ại thí
nghiệm 3 lần.
Chuẩn độ đến khi dung dịch chuyển từ nâu thành tím rồi thành trong su ốt (r ất d ễ nh ận
ra)
Nấm men
Na2S2O3 0,05N
Kết quả
Mẫu V1 V2 V3
Lần 1 19.2 7.4 17.4
Lần 2 18.8 5.8 18.6
Lần 3 19 7.0 18.2
¿
√ ( 7.86666667 × 10−5−8.17777778 ×10−5 ) + ( 7.86666667 ×10−5 −8.17777778× 10−5 ) + ( 8.0000000 ×10−5−8.17
2
=3.35548197×10-6
¿
√ ( 1.2 ×10−5−6.2222222 ×10−6 ) + ( 1.3333333 ×10−6−6.2222222 ×10−6 ) + ( 5.3333333× 10−6 −6.2222222×10−
2
=5.38860253×10-6