8.

KROMATOGRAFSKI POSTUPCI
8.1. Uvod
• Najdjelotvorniji postupak separacije (razdvajanja) sličnih spojeva
• Tswett – ruski botaničar, 1903. prvi je proveo odjeljivanje
biljnih pigmenata na CaCO3; chroma (grč.) = boja
• Tiselius – začetnik kolonske kromatografije 1952.
• Stahl – začetnik tankoslojne kromatografije (TLC) 1950.
• Martin i James – začetnici plinske kromatografije (GC) 1952. (Nobelova
nagrada)
• 12 Nobelovih nagrada za radove s kromatografijom (1937-1972.)

• KROMATOGRAFIJA – odijeljivanje sastojaka homogene smjese

sorpcijskim procesima između stacionarne (nepokretne) faze (SF) i
mobilne (pokretne) faze (MF)
1
 • Sorpcija = adsorpcija + apsorpcija (razdjeljivanje)
• Adsorpcija – stvaranje međusloja tvari na dodirnoj površini MF i
čvrste SF
• Apsorpcija – prijenos tvari iz MF u tekuću SF (razdjeljivanje, particija)

8.2. Podjela kromatografskih procesa

(i) Prema načinu dodira SF i MF

Kolonska kromatografija – gravitacija i(li) (pod)tlak
Planarna kromatografija – gravitacija ili kapilarni efekt

2
 (ii) Prema tipu SF/MF i načinu uspostavljanja ravnoteže

KROMATOGRAFIJA

ADSORPCIJSKA RAZDJELNA
SF-čvrsta SF-tekuća

MF – tekuća MF – plin MF – tekuća MF – plin

•"klasična" • plinska (GC) •"klasična" • plinska (GC)
adsorpcijska razdjelna
kromatografija kromatografija • kapilarna
(LC) kromatografija
• TLC (tankoslojna
kromatografija) • papirna (PC)
• s izmjenjivačima • HPLC
iona
• HPLC (visoko djelotvorna
tekućinska kromatografija)

3
8.3. Adsorpcijska kromatografija
• Kolonska kromatografija
SF (Al2O3), MF (heksan, etil-acetat,...)

4
 • Elucija ("ispiranje") – razdvajanje smjese djelovanjem MF
• Brzina elucije (tR) – ovisi o adsorpciji na SF
• Adsorpcijske sile: Van der Waalsove i vodikove veze (Al2O3) ili
elektrostatske veze (izmjenjivači iona)
• TLC (Thin Layer Chromatography) – poseban slučaj

8.4. Razdjelna (particijska) kromatografija

• Tehnička izvedba – slično adsorpcijskoj kromatografiji (prethodna
slika); kolonska ili TLC (tankoslojna) kromatografija
• SF tekućina (često H2O) vezana na inertni nosač (npr. Kieselguhr =
dijatomejska zemlja)
• Brzina elucije – ovisi o topljivosti u SF, a separacija o konstanti
razdjeljenja KC:
cS cS – koncentracija tvari u SF
KC = c
M cM – koncentracija tvari u MF
5
 • PC (papirna kromatografija) – poseban slučaj
• Separacija kod obje vrste kromatografije ovisi o raspodjeli između
SF/MF (svojstvenoj za svaku tvar)

8.5. Teorija elucijske kromatografije

• Kromatografski proces – uspostavljanje i narušavanje dinamičke
ravnoteže pri prelasku tvari iz SF u MF i obratno

Dinamička ravnoteža spoja A

između stacionarne i mobilne
faze u kromatografskom
procesu

6
8.5.1. Kinetička teorija
• Najvjerojatnije ponašanje molekula razdvajanog spoja
• Molekule prelaze in MF SF kad dobiju potrebnu aktivacijsku energiju
• Zadržavanje molekule u SF/MF

7
8.5.2. Model teorijskih tavana
• Temelji se na teoriji protustrujne Craigove distribucije (frakcijska
destilacija).

Tavani u koloni za frakcijsku

destilaciju

8
• Pojedinačna uravnoteživanja (odjeljivanja) zbivaju se na odsječcima
kolone, teorijskim tavanima (HETP).
• Nakon n odjeljivanja, molekule se rasporede prema Gaussovoj krivulji.

9
• Djelotvornost kolone raste s brojem tavana (N) a obrnuto je
proporcionalna njihovoj visini (H).

L= HxN

10
• U elucijskoj kromatografiji veća djelotvornost kolone znači uže
kromatografske vrpce (bolje odjeljivanje), mada je neizbježno njihovo
širenje.

• Širina vrpce (w) upravo je proporcionalna s tR a obrnuto

proporcionlna s brzinom MF (u).

11
 tR = ukupno vrijeme
zadržavanja (retencijsko
vrijeme)
tM = vrijeme prolaska MF
τ = standardna varijancija
-2τ +2τ

• Vrpca je Gaussova krivulja, a standardno odstupanje τ računa se iz

njezine širine (w = 4τ).

• Optimalna w, u (brzina MF) i razdvajanje (α) postiže se kontrolom

nekoliko parametara (vidi 8.6.)

12
• Faktor zadržavanja – opisuje brzinu putovanja analita kroz kolonu

k = (tR – tM)/tM

k > 20 elucija traje predugo (nepovoljno)

k = 1-5 optimalno

13
• Separacijski faktor (faktor razdvajanja) – mjera za separaciju
analita A i B; pretpostavlja se da B putuje brže α>1

α = kB/kA

• Eksperimentalni podaci w (=4τ) i tR su važni za izračunavanje H i N

(kojima se izražava djelotvornost kolone)

2 2
L w tR
H = 16t 2 N = 16 w
R

• Kromatografija je mnogo djelotvornija od frakcijske destilacije jer se

male razlike u sorpcijskom ponašanju ovdje multipliciraju

• 1 destilacijski tavan ≈ 10-30 kromatografskih tavana

• Prednost kromatografije – kraće trajanje separacije (1 min – 1 sat)
(frakcijska destilacija može trajati danima) 14
 • H i N su važni komercijalni podaci; usporedba je smislena ako se radi o
istom spoju; npr. U GC-kolonama 30.000 – 500.000 teorijskih tavana

8.6. Realni kromatografski proces

• Na disperziju skupa sličnih molekula (širina vrpce) utječe niz faktora.
Što je disperzija skupova (w) manja a njihova udaljenost (∆z) veća
postupak je uspješniji

8.6.1. Faktori koji utječu na širenje (disperziju) vrpce

(i) Brzina mobilne faze (u)
• veća u – smanjuje longitudinalnu difuziju (B) ali onemogućuje
uravnoteživanje analita između MF i SF (CM, CS)
• manja u – povećava B i omogućuje uravnoteživanje

• optimalna u – najmanja B, povoljno uravnoteživanje najmanja

H i najuža w 15
Van Deemterova jednadžba

H = B/u + CS u + CM u

zbroj donjih krivulja

H = visina teorijskog tavana

B = longitudinalna difuzija
u = linearna brzina MF
CS = koeficijent prijenosa mase
u SF
CM = koeficijent prijenosa mase
u MF

optimalna brzina 16
(ii) Temperatura sustava
• idealni proces – smanjenje disperzije odnosno povećanje brzine
prijelaza SF MF
• realni proces – povećanje difuzije; potrebno naći optimum

(iii) Količina analita

• idealni slučaj – beskonačno razrjeđenje
• realni proces – promjene energetskog stanja molekula pri većim
koncentracijama negativno djeluju na uspostavljanje
ravnoteže ("kašnjenje") što povećava disperziju (w)

(iv) Promjer čestica sorbensa i kolone

• manja zrnca – veća ukupna površina ali usporavanje brzine MF (u)
• naći optimum za svaki slučaj
• u pukotinama zrnaca zadržavaju se molekule povećanje difuzije;
zato je povoljan kuglasti oblik zrnaca bez pukotina
17
 • uža kolona – bolje razlučivanje (nema ljevkastih vrpci!)

(v) Tip veze SF-analit

• prečvrste veze – razvučene vrpce
• preslabe veze – nema efekta razdvajanja
• najpogodnija Eveze = 21-63 kJ/mol
(dipol-dipol; vodikova veza, koordinacijska veza)

8.6.2. Razlučivanje
• Mjera za uspješnost kromatografije jest razlučivanje RS (tvari A i B):

Rs = 2 ∆Z/wA + wB

18
• Za bolje razlučivanje treba povećati N (broj tavana), α (separacijski faktor)
i k (faktor zadržavanja):
19
 N α-1 kB
R= 1+kB
4 α

− N se povećava smanjenjem promjera čestice SF

− k ovisi o temperaturi (GC) i o sastavu MF (LC)

8.7. Kromatografske tehnike

• U prethodnim primjerima: elucijska analiza (jedina tehnika u
razdjelnoj kromatografiji)
• Frontalna analiza i analiza istiskivanjem
− uklanjanje "repova" u adsorpcijskoj kromatografiji

8.7.1. Elucijska analiza

• Elucijski agens ili eluens – MF pri elucijskoj analizi – ne smije
reagirati sa SF
20
 • Postupna elucija – dodatak sve "jačih" eluenasa
• Gradijentna elucija – kontinuirana promjena sastava eluensa

8.7.2. Frontalna analiza

• Služi za uklanjanje "repova" u adsorpcijskoj kromatografiji
• Postupak: otopinu smjese dodaje se u kolonu do njezina zasićenja

21
 • Primjena: (i) određivanje tragova nečistoća
(ii) uklanjanje nepoželjnog sastojka (mala količina) iz smjese
(npr. EtOH iz CHCl3)

8.7.3. Analiza istiskivanjem

• Elucijska + frontalna analiza
• Tvar se nanosi na kolonu a potom dodaje otopina "istiskivala" D
(umjesto eluensa)

22
 • Učinak: D se najjače adsorbira pa istiskuje slijedom sve slabije adsorpcije
C, B, A te se dobivaju vrpce čistih tvari

8.7.4. Usporedba razdjelne i adsorpcijske kromatografije

• Odabir: razdjelna kromatografija pogodnija za razdjeljivanje srodnih
spojeva (homologni niz); zbog specifičnosti adsorpcijskih efekata
adsorpcijska kromatografija služi za razdjeljivanje različitih spojeva
• Prednost razdjelne kromatografije: uže kromatografske vrpce
bez "repova"
• Nepogodnost adsorpcijske kromatografije: SF često reaktivna
• U praksi: često istodobnost adsorpcijskih i razdjelnih procesa (PC)

23
8.7.5. Odabir MF i SF u adsorpcijskoj kromatografiji

SF MF ANALIT

Al2O3 petroleter RH
aktivna SiO2 cikloheksan RX
Mg-silikat CCl4 ROR
ClCH=CCl2 RCOOR
CaO benzen RCOR
srednje CH2Cl2
aktivna MgO polarnost
CaCO3 CHCl3 (bez EtOH) RCHO
Et2O RCONHR
talk EtOAc RNH2
nereaktivna škrob piridin ROH
celuloza Me2CO
EtOH ArOH
MeOH RCO2H
MeCN
H2O

24
 STAHLOV TROKUT

aktivna polarna (hidrofilna)

SF MF

nepolarna (lipofilna)
neaktivna
polarna (hidrofilna)
nepolarna (lipofilna)
SMJESA

25