Οι βιοχημικοί αναλυτές και η

βαθμονόμηση τους

Πέτρος Καρκαλούσος
Επίκουρος καθηγητής κλινικής χημείας
Τμήμα Bιοϊατρικών Επιστημών
Πανεπιστήμιο Δυτικής Αττικής
Oι πρωτεργάτες
 O νόμος Lambert-Beer
O Ολλανδός Johan Heinrich Lambert O Γερμανός August Beer
(1728 – 1777) (1825 – 1863)

H απορρόφηση του φωτός είναι ανάλογη H απορρόφηση του φωτός είναι ανάλογη
με την απόσταση που διανύει μέσα σε με την συγκέντρωση της διαλυμένης
διάλυμα ουσίας 3
Ο Τhomas Young προσδιόρισε για πρώτη
φορά τα μήκη κύματος του φωτός

4
Το πρώτο φωτόμετρο

Arnord Berckmann
Ο εφευρέτης του φωτομέτρου (1940)
5
O πρώτος βιοχημικός αναλυτής

Ο πρώτος μονοκάναλος αναλυτής

(Technikon, 1954)

Leonard Skeggs, 1918 – 2002

Οι βαθμονομητές
Πολλοί όροι για το ίδιο πράγμα …

Calibration Βαθμονομώ

Βαθμονόμηση
Καμπύλη
Κάνω καμπύλη
Καλιμπράρω
 Γιατί είναι απαραίτητοι
Οι συγκεντρώσεις ουσιών δεν είναι αντιληπτές
με τις αισθήσεις μας …
… είναι όμως αντιληπτές από φυσικές
μεθόδους.
Οι βαθμονομητές μεσολαβούν στη μετατροπή
του σήματος της φυσικής μεθόδου σε
συγκέντρωση.
 Από τι είναι κατασκευασμένοι;
• Οφείλουν να είναι βιολογικά δείγματα
ανθρώπινα ή έστω ζωικά.
• Στους βιοχημικούς αναλυτές δεν υπάρχουν
πια χημικοί βαθμονομητές.
Παραδείγματα σύνθεσης
βαθμονομητών
Πως επιδρούν οι βαθμονομητές στην
ποιότητα της ανάλυσης

Ποιότητα καμπύλης και ποιότητα βαθμονομητή:

Ανεξάρτητοι παράμετροι
 Πως επιλέγονται οι βαθμονομητές
• Οφείλουν να έχουν πιστοποίηση IVDs.
• Nα είναι πιστοποιημένοι (Certified Reference
materials).
• Nα προτείνονται από τον κατασκευαστή.

ISO 15189:2012 5.3.1.4

 Μπορούμε να αγοράσουμε
βαθμονομητές από ανεξάρτητο
προμηθευτή;
H απάντηση είναι Όχι

Ακόμα και στους «ανοικτούς αναλυτές» ο

κατασκευαστής του αναλυτή είναι
υπεύθυνος για τους βαθμονομητές του.
 Η ιχνηλασιμότητα των
βαθμονομητών
• Τα CRM:
– Παράγονται με συγκεκριμένο πρότυπο
– Οι τιμές τους συγκρίνονται με μέθοδο αναφοράς
– Έχει υπολογιστεί η αβεβαιότητα τους
Τα διεθνή πρότυπα βαθμονομητών
Κοινοί βαθμονομητές και CRM
H αβεβαιότητα των βαθμονομητών

Είναι υπολογισμένη από την κατασκευάστρια εταιρεία ύστερα

από μετρήσεις του βαθμονομητή με πρότυπο μέθοδο.
Παράδειγμα αλυσίδας υλικών και
μεθόδων αναφοράς
 Το πιστοποιητικό ιχνηλασιμότητας
Συνοδεύει κάθε CRM και περιέχει:
• Περιέχει τον κωδικό του πρωτογενούς υλικού αναφοράς
• Την πρότυπη μέθοδο
• Την διευρυμένη αβεβαιότητα που έχει υπολογιστεί για κάθε
βαθμονομητή

Αβεβαιότητα βαθμονομητή Ucal = 0,87/2% για το επίπεδο 2

 Θέματα χειρισμού των
βαθμονομητών (1 από 2)
Συντήρηση βαθμονομητών
• Διαβάστε προσεκτικά τις οδηγίες συντήρησης.
Συνήθως συντηρούνται στους 2 – 8ο C.
• Προσοχή στο ράφι τοποθέτησης του ψυγείου.
Οι πόρτες των ψυγείων δεν πιάνουν χαμηλές
θερμοκρασίες και θα πρέπει να
αποφεύγονται.
 Θέματα χειρισμού των
βαθμονομητών (2 από 2)
Πιπέττα και βαθμονομητής
• Έχουν πολύ στενή σχέση.
• Αν ο βαθμονομητής είναι λυοφιλοποιημένος η
ανασύσταση του θα πρέπει να γίνεται με
πιπέττα αρίστης ποιότητας και διακριβωμένη.
 Η αβεβαιότητα της πιπέττας
Αν ο βαθμονομητής είναι λυοφιλοποιημένος η αβεβαιότητα της πιπέττας
θα προστεθεί στην αβεβαιότητα του βαθμονομητή Π.χ.

Αβεβαιότητα πιπέττας Upip = 1,0/2 = 0,5

Σχετική αβεβαιότητα πιπέττας Upipr = 0,5/1000 = 5 x 10-4
Tι στοιχεία θα πρέπει να διατηρούμε
από κάθε βαθμονόμηση
• Την ημερομηνία βαθμονόμησης
• Το lot number του βαθμονομητή
• To lot number του αντιδραστηρίου
• Αν ο βαθμονομητής διαμοιράζεται σε
μερίδες:
– Tην ημερομηνία ανασύστασης
– Τον α/α της μερίδας
• Στοιχεία για την ποιότητα της βαθμονόμησης
ISO 15189:2012 4.13 5.3.1.4
 Κάθε πότε πρέπει να γίνεται
βαθμονόμηση
• Όταν αλλάζει η μέθοδος ανάλυσης.
• Όταν συντηρείται η μονάδα μέτρησης του
αναλυτή.
• Όταν υπάρχουν συστηματικά σφάλματα στις
μετρήσεις μας (σύμφωνα με τον εσωτερικό και
εξωτερικό έλεγχο ποιότητας).
• Όταν αλλάζει το lot του αντιδραστηρίου.
• Προληπτικά όταν η καμπύλη του αντιδραστηρίου
έχει περάσει το χρονικό όριο σταθερότητας.
 Πόσες φορές μετριέται ένας
βαθμονομητής
Δύο φορές ή περισσότερο.
Π.χ. στους βιοχημικούς αναλυτές γίνονται δύο
λήψεις βαθμονομητή και σε αυτές από δύο
μετρήσεις.
Σκοπός: Nα ληφθεί υπόψη η επαναληψιμότητα
και αναπαραγωγιμότητα της μεθόδου.
 H βαθμονόμηση των
βιοχημικών αναλυτών
 Ποιες εξετάσεις βαθμονομούνται;
Tώρα πλέον βαθμονομούνται όλοι οι αναλύτες
(υποστρώματα, ιόντα, ένζυμα, ειδικές
πρωτεΐνες).
Δεν χρησιμοποιούνται πλέον προϋπολογισμένοι
φάκτορες.
 Νόμος Lambert-Beer
Η απορρόφηση του φωτός ενός διαλύματος είναι ανάλογη με τη
συγκέντρωση της έγχρωμης ουσίας και την απόσταση που
διανύει το φως μέσα στο διάλυμα.

Α (Absorbance): Απορρόφηση
Po: Ενέργεια ακτινοβολίας προσπίπτοντος φωτός
P1: Ενέργεια ακτινοβολίας που πέρασε μέσα από το διάλυμα
b: Απόσταση που διανύει το φώς δηλ. το μήκος της κυβέττας, συνήθως
είναι 1 cm
C: Συγκέντρωση
α: Απορροφητικότητα
ε: Μοριακή απορροφητικότητα

29
Αναλύσεις τελικού σημείου (end point)
(1 από 5)

ODstd
ODspl

Η εξίσωση Α = e b C ή αλλιώς Α = f(C) ισχύει μόνο στο

γραμμικό μέρος της καμπύλης όπου ισχύει η γραμμική
σχέση: y = bx + α
30
 Αναλύσεις τελικού σημείου (end point)
Η γραμμική παλινδρόμηση (2 από 5)
Η βαθμονόμηση βασίζεται στις εξισώσεις της γραμμικής
παλινδρόμησης δηλ. την μέθοδο ελαχίστων
τετραγώνων.
Η βασική εξίσωση είναι:
ODsample

Όπου:
y = [Δείγματος]
x = Abs
α α = το σημείο τομής με τον
b
Csample άξονα του y
b = η κλίση της ευθείας
31
 Αναλύσεις τελικού σημείου (end point)
Η γραμμική παλινδρόμηση(3 από 5)
Η κλίση (b) εκφράζει το αναλογικό σφάλμα
Η τομή (α) εκφράζει το σταθερό σφάλμα

ODsample

α
b
Csample

32
Αναλύσεις τελικού σημείου (end point)
(4 από 5)
Oι βασικοί factors (φάκτορες) στους βαθμονομητές
χρωματομετρίας

Στους βιοχημικούς αναλυτές τα Intercept (b) και slope = εφ(α)

δηλώνονται στα «πρωτόκολλα» των εξετάσεων.
Συνήθως b = 0 και α = 1.
33
Αναλύσεις τελικού σημείου (end point)
(4 από 5)
Yπολογισμός άγνωστης συγκέντρωσης με τη καμπύλη αναφοράς

Astd – Ablank = α b Cstd

Asample – Ablank = α b Csample

Csample =
(A − A blank )
ή
sample
Cstd
(A std − A blank )

Α sample
Εάν Αblank = 0 Csample = Cstd
Astd

34
Η βαθμονόμηση στις κινητικές
αντιδράσεις

A3

A2

A1

∆Αsample
E sample = E std
∆Αstd
 Η θολωσιμετρία
Στη θολωσιμετρία προσδιορίζεται ο βαθμός
θόλωσης προσδιορίζοντας την μείωση της
απορρόφησης μέσα από το θολό διάλυμα.

I = Io e-bt
Εδώ έχουμε εκθετική παλινδρόμηση
Η βαθμονόμηση στη θολωσιμετρία

x: Η μέση τιμή του σήματος των μετρήσεων

y: Η συγκέντρωση του αναλύτη
 Εξίσωση Nernst

• Eo: Τυπικό δυναμικό του ηλεκτροδίου σε volts, δηλαδή η τιμή του Ε όταν
οι μοριακές συγκεντρώσεις του οξειδωτικού και του αναγωγικού είναι
ίσες με την μονάδα.
• R: Παγκόσμια σταθερά των αερίων (8,31441 volt coulomb oK-1 mol-1
• T: Απόλυτη θερμοκρασία (σε οΚ)
• F: Σταθερά του Faraday (96485,38 coulombs/eq)
• n: Aριθμός των ηλεκτρονίων που συμμετέχουν στην αντίδραση (eq/mol)
• Aαν: Ενεργότητα της ανηγμένης μορφής του οξειδοαναγωγικού ζεύγους
• Aοξ: Ενεργότητα της οξειδωμένης μορφής του οξειδοαναγωγικού ζεύγους

38
 Πόσοι βαθμονομητές χρειάζονται;
(1 από 2)
Για την γραμμική παλινδρόμηση χρειάζονται
τουλάχιστον δύο σημεία.
Στην βαθμονόμηση end point χρησιμοποιούνται
τουλάχιστον δύο βαθμονομητές.
• Ο βαθμονομητής μηδενικής συγκέντρωσης
• Ο βαθμονομητής γνωστής συγκέντρωσης
 Πόσοι βαθμονομητές χρειάζονται;
(2 από 2)
Πολλοί κατασκευαστές χρησιμοποιούν ακόμα και στη
χρωματομετρία πάνω από δύο βαθμονομητές για να
εξασφαλιστεί καλύτερης ποιότητας καμπύλη.

Βαθμονόμηση Ca στον αναλυτή Dimension

Στη θολωσιμετρία χρησιμοποιούνται
περισσότεροι από δύο βαθμονομητές

Η βαθμονόμηση του CRP

Πως εξασφαλίζεται η ποιότητα
της βαθμονόμησης;
 Πως εξασφαλίζεται η ποιότητα της
βαθμονόμησης (1 από 4);
• Mε την πολλαπλή μέτρηση της απορρόφησης κάθε
βαθμονομητή πάνω στο ίδιο ή διαφορετικό διάλυμα
ανάλυσης.
• Με την σύγκριση κάθε νέας καμπύλης με την
προηγούμενη.
• Με την σύγκριση κάθε νέας καμπύλης με
συγκεκριμένα όρια ανοχής.
 Πως εξασφαλίζεται η ποιότητα της
βαθμονόμησης (2 από 4);
Οι αναλυτές αυτόματα συγκρίνουν κάθε νέα καμπύλη
με:
• την προηγούμενη καμπύλη
• πρότυπη καμπύλη που εισάγεται αυτόματα με
barcode

H σύγκριση γίνεται με την στατιστική δοκιμασία r2

 Πως εξασφαλίζεται η ποιότητα της
βαθμονόμησης (3 από 4);
Mε διπλές μετρήσεις κάθε βαθμονομητή. Οι διπλές
μετρήσεις μπορούν να γίνονται:
• πάνω στο ίδιο διάλυμα εργασίας (έλεγχος
επαναληψιμότητας)
• πάνω σε διαφορετικό διάλυμα εργασίας (έλεγχος
αναπαραγωγιμότητας).

Το μέτρο σύγκρισης είναι το CV% των μετρήσεων

Παράδειγμα φύλλου βαθμονόμησης
με διπλές μετρήσεις
Πως εξασφαλίζεται η ποιότητα της
βαθμονόμησης (4 από 4);

Σύγκριση της νέας

καμπύλης με την
προηγούμενη

Σύγκριση της νέας καμπύλης με όρια ανοχής

 «Μεγάλες» και «μικρές»
βαθμονομήσεις στους βιοχημικούς
αναλυτές
 Βαθμονόμηση προσαρμογής
Σε πολλούς αναλυτές εκτός από την κανονική
βαθμονόμηση υπάρχει και η βαθμονόμηση
«προσαρμογής».

Πρόκειται για την μέτρηση ενός συγκεκριμένου

βαθμονομητή και επακόλουθο έλεγχο για τον
βρίσκεται μέσα σε συγκεκριμένα όρια ανοχής.
 Η βαθμονόμηση του τυφλού
Η βαθμονόμηση του τυφλού (calibration blank) γίνεται
στα υγρά αντιδραστήρια των οποίων το χρώμα
μεταβάλλεται συχνά π.χ. σίδηρος, κρεατινίνη κ.α.

Μετριέται μόνο η απορρόφηση του τυφλού

(αντιδραστήριο χωρίς βαθμονομητή) και μεταβάλλεται
αντίστοιχα η εξίσωση βαθμονόμησης.
Η βαθμονόμηση στους
αναλυτές ELISA
 Διαφορές βαθμονόμησης ELISA από
αυτόματους αναλυτές (2 από 2)
Η βαθμονόμηση μπορεί να παραλειφθεί για
ανάλυση ίδιων μετρήσεων μέσα στην ημέρα εάν:

• Τα kits είναι της ίδιας παρτίδας

• Τα διαλύματα αντιδραστηρίων (wash, diluent κ.α.
• είναι κοινά)
• Εκτός των controls θα αναλυθεί και ένας βαθμονομητής
για τον έλεγχο προσαρμογής της καμπύλης
βαθμονόμησης.
 Διαφορές βαθμονόμησης ELISA από
αυτόματους αναλυτές (1 από 2)
Η βαθμονόμηση χρειάζεται κάθε ημέρα.
Οι βαθμονομητές είναι πολλοί.
Υπάρχουν πολλοί διαφορετικοί τρόποι υπολογισμού.
 H γραμμική παλινδρόμηση
Συνήθως οι μη ανταγωνιστικές ανοσοενζυμικές μέθοδοι είναι
ευθεία γραμμή σε αντίθεση με τις ανταγωνιστικές που πολλές
φορές είναι σιγμοειδείς.
 Οι καμπύλες point to point
Χρησιμοποιούνται όταν η καμπύλη βαθμονόμησης δεν είναι
ευθεία γραμμή. Πρόκειται για διαδοχικές ευθείες
παλινδρόμησης με τις αντίστοιχες καμπύλες.

55
 Οι καμπύλες spline
Πρόκειται για καμπύλες που προκύπτουν από την ένωση
επιμέρους καμπυλών.
Στην πράξη πρόκειται για μια καμπύλη βαθμονόμησης που
περνά από όλα τα σημεία.
 Οι καμπύλες logit
Χρησιμοποιούνται για την μετατροπή σιγμοειδών καμπύλων σε
ευθείες καμπύλες βαθμονόμησης για να εξασφαλιστεί
μεγαλύτερη ευαισθησία.

Μετά την λογαριθμοποίηση των

Αρχική καμπύλη
συγκεντρώσεων των βαθμονομητών
Η βαθμονόμηση στη
χημειοφωταύγεια
 Η συνάρτηση Rodbard (1 από 2)
H εξίσωση Rodbard μετατρέπει όλες τις σιγμοειδείς εξισώσεις
(y = ax3 + bx2 + cx + d) σε γραμμικές.

Η εξίσωση είναι η:

y: σήμα (RLU)
x: συγκέντρωση
a, b, c, d: παράμετροι καμπύλης βαθμονόμησης
a, d: παράμετροι που ορίζουν τη θέση της καμπύλης
b, c: παράμετροι που ορίζουν τη μορφή της καμπύλης
 Η συνάρτηση Rodbard (2 από 2)
Η συγκέντρωση υπολογίζεται από την εξίσωση:

Oι παράμετροι a και d υπολογίζονται σε κάθε

βαθμονόμηση.
Οι παράμετροι b και c δίνονται μαζί με το αντιδραστήριο
και τον βαθμονομητή.
Ο φάκτορας
Σε κάθε βαθμονόμηση υπολογίζεται
ένας φάκτορας
Έχοντας ως αρχική τιμή το ένα (1) η τιμή του
επαναϋπολογίζεται μετά από κάθε βαθμονόμηση.

Π.χ.
αν γίνει 1,15 οι τιμές ανέβηκαν κατά 15%
αν γίνει 0,78 οι τιμές κατέβηκαν κατά 2,2%
Ευχαριστώ, Kαλό καλοκαίρι