‫מעבדה בקורס פורמולציה של תרופות‬

‫הנדסת ביוטכנולוגיה‬

‫מעבדה מס' ‪1‬‬

‫מיקרואנקפסולציה בשיטת‬
‫‪Complex Coacervation‬‬

‫שם המדריך‪ :‬פרופ' רוזה אזהרי‬ ‫שם הסטודנטים‪ :‬שרית בר ‪039467196‬‬

‫יסמין נשרי ‪300092491‬‬

‫תאריך ביצוע המעבדה‪28.05.12 :‬‬

‫תאריך הגשה‪:‬‬
 ‫‪ .1‬מבוא‪:‬‬
‫מיקרואינקפסולציה ‪ -‬כליאה של מוצקים‪ ,‬נוזלים או גזים בתוך מעטפת (אחת או יותר) פולימרית‬

‫‪ -Complex Coacervation‬הינה שיטת מיקרואנקפסולציה תלוית ‪ ,pH‬במהלכה נעשית‬

‫מניפולציית מטענים מנוגדים של פולימרים בתמיסה‪ .‬כאשר תמיסה צלולה של פולימר עם מטען‬
‫חיובי מעורבבת עם תמיסה צלולה של פולימר בעל מטען שלילי‪ ,‬כתוצאה מאינטראקציה בין‬
‫המטענים המנוגדים נוצר קומפלקס פולימרי כמשקע בתמיסה מופיעה עכירות בעקבותיה‬
‫מתרחשת הפרדת פאזות‪.‬‬
‫ג'לטין ‪ -‬נגזרת חלבונית הנוצרת בתהליך ההידרוליזה של קולגן‪ ,‬כאשר קולגן מופק מרקמות‬
‫חיבור של בע"ח‪ .‬הג'לטין בעל ‪ pI=6.5‬ולכן בכל ‪ pH‬הנמוך מכך יקבל מטען חיובי‪.‬‬

‫כונדרואיטין סולפט (‪ - )CS‬פוליסכריד הנמצא ברקמות החיבור בגוף‪ ,‬מורכב מיחידות חוזרות של‬
‫‪ glucuronic acid‬ו‪ .N-acetyl-D-galactosamine -‬בטווח רחב של ‪ pH‬טעון שלילית כיוון‬
‫שמורכב מקב' קרבוקסיליות וסולפט‪.‬‬
‫המוגלובין‪ -‬חלבון רבעוני המצוי בתאי דם אדומים‪ ,‬מורכב מ‪ 4 -‬מולקולות חלבון (שרשרת‬
‫גלובולין) המחוברות יחד‪ .‬מולקולת המוגלובין אחת מכילה ארבעה יוני ברזל‪ ,‬לאלה תפקיד מרכזי‬
‫בפעילות ההמוגלובין וכן מקנים להמוגלובין צבע חום אדמדם‪ .‬ההמוגלובין בדומה לג'לטין מקבל‬
‫מטען חיובי ב‪ pH-‬נמוך מ‪ .pI=6.8-‬אורכי הגל עבור הפיקים המותאמים לבליעה של המוגלובין‬
‫מתקבלים ב‪ 280nm :‬ו‪ ,405nm -‬כאשר הפיק ‪ 280nm‬הוא אופייני לכל חלבון‪.‬‬

‫איור ‪ :1‬תחום אורכי הגל לבליעה מקסימלית עבור חלבון המוגלובין‬

‫גלוטר אלדהיד‪ -‬מולקולות הגלוטאלדהיד גורמת ליצירת קשרי צילוב (קשרים קוולנטיים) בין קב'‬
‫האלדהיד לבין קב' אמין חופשיות ב‪ pH-‬נייטרלי‪.‬‬

‫אתנול אמין ‪ -‬חומר נוזלי אלכוהולי הנמס במים במסיסות טובה‪ ,‬מכיל קב' אמין לכן מגיב עם‬
‫עודפי גלוטר אלדהיד בתמיסה‪.‬‬
 ‫‪ .2‬תרשים זרימה למהלך הניסוי‪:‬‬

‫הכנת ‪ 30ml‬תמיסת קונדרואיטין סולפט בריכוז ‪ 0.3%‬במים‬ ‫הכנת ‪ 20ml‬תמיסת ג'לטין בריכוז ‪ 5%‬במים‬

‫המסה מוחלטת‬

‫הכנסה לאמבט חימום בטמפ' ‪ 39°C‬עד להמסה מוחלטת‬ ‫מיהול‬

‫מיהול‬
‫‪10ml‬‬
‫‪10ml‬‬ ‫‪10ml‬‬ ‫‪10ml‬‬ ‫תמיסת‬
‫‪ 10ml‬תמיסת‬ ‫‪ 10ml‬תמיסת ג'לטין‬ ‫‪ 10ml‬תמיסת ג'לטין‬ ‫תמיסת‬ ‫תמיסת‬ ‫תמיסת‬
‫‪CS‬‬
‫ג'לטין ‪5%‬‬ ‫מהולה ‪2.5%‬‬ ‫מהולה ‪1%‬‬ ‫‪CS‬‬ ‫‪CS‬‬ ‫‪CS‬‬
‫מהולה‬ ‫מהולה‬ ‫מהולה‬ ‫‪0.3%‬‬
‫‪0.05%‬‬ ‫‪0.1%‬‬ ‫‪0.2%‬‬
‫שמירה בטמפ' ‪37-39°C‬‬
‫‪ 1ml‬מכל מבחנה‬
‫המסת ‪ 20mg‬המוגלובין בכל אחת מהתמיסות‬
‫סדרת מבחנות זכוכית מסומנות‬ ‫‪ 1ml‬מכל מבחנה‬
‫לריכוז המוגלובין סופי של ‪2mg/ml‬‬
‫ורטקס‬
‫‪15min ,20°C‬‬ ‫מיהול פי ‪2‬‬ ‫סדרת‬
‫לשארית‬ ‫מדידת ספקטרום הבליעה‬ ‫מיהולים‬
‫‪ 1ml‬תרחיף‬ ‫באורכי גל ‪250-280nm‬‬
‫איפיון במיקרוסקופ‪:‬‬ ‫מכל מבחנה‬ ‫מדידת אורכי גל‬
‫כמות מיקרוספירות‪,‬‬ ‫למבחנת‬ ‫ויצירת גרף כיול‬
‫גודל ממוצע‪ ,‬פיזור‬ ‫אפנדורף‬ ‫הוספת ‪ 20µl‬גלוטר‬ ‫קביעת אורך גל‬ ‫לריכוז המוגלובין‬
‫גדלים‪ ,‬נוכחות גושים‬ ‫אלדהיד‬ ‫מקסימלי לבליעת‬
‫צנטריפוגה‬
‫‪30min‬‬ ‫ההמוגלובין‬
‫‪10,000rpm,‬‬
‫הוספת ‪20°C1ml‬‬
‫אתנול‪15min,‬‬
‫אמין מטוטר ל‪pH8.5-‬‬

‫משקע‬ ‫נוזל עליון‬

‫‪30min‬‬ ‫מיד עם סיום‬ ‫הוספת ‪1ml PBS‬‬
‫ההרחפה‬
‫המסת המשקע ע"י‬
‫העברת ‪ 1ml‬למבחנת‬ ‫איפיון לאחר‬ ‫מדידת בליעה באורך גל‬ ‫חימום לטמפ' ‪37°C‬‬
‫אפנדורף שקולה‬ ‫צילוב‬ ‫‪ ,405nm‬קביעת כמות‬ ‫מדידת בליעה באורך גל‬
‫במיקרוסקופ‪:‬‬ ‫ההמוגלובין‬ ‫‪ 405nm‬וקביעת כמות‬
‫כמות‪ ,‬גודל‪,‬‬ ‫המוגלובין‬
‫צנטריפוגה‬
‫פיזור גדלים‬

‫נוזל עליון‬ ‫משקע‬

‫קביעת משקל המשקע‬

 ‫‪ .3‬תוצאות‪:‬‬
‫‪ .3.1‬מיקרואנקפסולציה‬

‫באמצעות ג'לטין וכונדרואיטין סולפט (‪ )CS‬ביצענו מיקרואנקפסולציה של המוגלובין‪ ,‬המדמה‬

‫חומר פעיל‪ ,‬בשיטת ‪ complex coaservation‬לקבלת מיקרוספירות‪ .‬תחילה עורבב המוגלובין בעל‬
‫מטען חיובי עם מיהולים שונים של ‪ CS‬בעל מטען שלילי‪ ,‬בהמשך עורבבה התמיסה עם מיהולים‬
‫שונים של ג'לטין מומס‪ .‬היווצרות המיקרוספירות אופיינה והוערכה ע"י בדיקת עכירות לאחר ‪15‬‬
‫דקות‪ ,‬וכן התבוננות במיקרוסקופ‪ .‬התוצאות מובאות בטבלה מס' ‪.1‬‬
‫טבלה מס' ‪ :1‬אפיון מיקרוספרות לפני צילוב‬

‫‪CS‬‬
‫‪0.05%‬‬ ‫‪0.10%‬‬ ‫‪0.20%‬‬ ‫‪0.30%‬‬ ‫אפיון‬
‫‪GE‬‬
‫‪-/+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫עכירות‬
‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫מיקרוספרות‬
‫מקרא‪:‬‬
‫ביינוני‬ ‫בינוני‬ ‫הרבה‬ ‫‪ +‬הרבה‬
‫תכונה קיימת‬ ‫כמות‬
‫גדולים‪ ,‬לא קיימת‬
‫‪ -‬תכונה‬ ‫‪5%‬‬
‫קטנים‬ ‫בינוניבאופן חלקי‬
‫קטנים‬ ‫תכונה קיימת‬ ‫פיזור גדלים ‪-/+‬‬
‫בינוניים‬
‫וקטנים‬
‫וקטנים‬

‫עגולים סימטריים‪ -‬ספירות‬ ‫צורה‬

‫‪-/+‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫צברים‬
‫‪-/+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫עכירות‬
‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫מיקרוספרות‬
‫מעט‬ ‫הרבה‬ ‫בינוני‬ ‫הרבה‬ ‫כמות‬
‫גדולים‪,‬‬ ‫‪2.50%‬‬
‫בינוני‬ ‫בינוני‬
‫בינוניים‬ ‫בינוניים‬ ‫פיזור גדלים‬
‫וקטנים‬ ‫וקטנים‬
‫וקטנים‬
‫עגולים סימטריים‪ -‬ספירות‬ ‫צורה‬
‫‪-‬‬ ‫‪-/+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫צברים‬
‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫עכירות‬
‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫מיקרוספרות‬
‫הרבה‬ ‫מעט‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫כמות‬ ‫‪1%‬‬

‫קטנים‬ ‫קטנים‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫גודל ממוצע‬

‫עגולים סימטריים‪ -‬ספירות‬ ‫צורה‬
 ‫‪-‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫צברים‬

‫ברוב המבחנות התקבלה עכירות וכן נראו מיקרוספירות‪ ,‬במיעוט מהמבחנות (ריכוזי ‪CS:GE‬‬
‫‪ )0.3:1, 0.2:1‬לא נצפתה עכירות וכן לא נראו מיקרוספרות כלל‪ .‬ככל שגודל המיקרוספרות עולה‬
‫כך גם פיזור הגדלים עולה‪ .‬עבור ריכוז ג'לטין של ‪ 5%‬ככל שהשילוב בריכוז ‪ CS‬יותר גדול כך‬
‫מתקבלות יותר מיקרוספירות‪ ,‬בריכוז ג'לטין ‪ 1%‬בשילוב ריכוז ‪ CS‬העולה על ‪ 0.1%‬לא מתקבלות‬
‫מיקרוספירות‪.‬‬

‫הדגימות עברו צנטריפוגה והתקבלו שתי פאזות‪ ,‬נמדדה בליעה באורך גל ‪ 405nm‬עבור הנוזל‬
‫העליון אשר הכיל המוגלובין חופשי‪ ,‬נקבעה הכמות של ההמוגלובין שנארזה במיקרוספירות וכן‬
‫ניצולת האריזה‪ .‬התוצאות מובאות בטבלה מס' ‪.2‬‬
‫טבלה מס' ‪ :2‬כמות המוגלובין נארזת ויעילות האריזה‬

‫‪CS‬‬
‫‪0.05%‬‬ ‫‪0.10%‬‬ ‫‪0.20%‬‬ ‫‪0.30%‬‬ ‫המאפיין‬
‫‪GE‬‬

‫‪0.504‬‬ ‫‪0.505‬‬ ‫‪0.730‬‬ ‫‪0.825‬‬ ‫כמות המוגלובין שנארזה [‪]mg‬‬

‫‪5%‬‬
‫‪50.4‬‬ ‫‪50.5‬‬ ‫‪73.0‬‬ ‫‪82.5‬‬ ‫ניצולת האריזה [‪]%‬‬

‫‪0.516‬‬ ‫‪0.780‬‬ ‫‪0.757‬‬ ‫‪0.508‬‬ ‫כמות המוגלובין שנארזה [‪]mg‬‬

‫‪2.50%‬‬
‫‪51.6‬‬ ‫‪78‬‬ ‫‪75.7‬‬ ‫‪50.8‬‬ ‫ניצולת האריזה [‪]%‬‬

‫‪0.697‬‬ ‫‪0.514‬‬ ‫‪0.439‬‬ ‫‪0.447‬‬ ‫כמות המוגלובין שנארזה [‪]mg‬‬

‫‪1%‬‬
‫‪69.7‬‬ ‫‪51.4‬‬ ‫‪43.9‬‬ ‫‪44.7‬‬ ‫ניצולת האריזה [‪]%‬‬

‫בצהוב מסומנות חריגות בתוצאות‬ ‫‪‬‬

 ‫‪5.28‬‬
‫‪37‬‬
‫‪87‬‬ ‫‪7.57‬‬ ‫‪09‬‬
‫‪08‬‬
‫‪4.05‬‬ ‫‪8.05‬‬ ‫‪07‬‬
‫‪7.96‬‬
‫‪06‬‬
‫‪4.15‬‬ ‫‪05‬‬
‫‪04‬‬
‫‪03‬‬
‫‪]%[ ɳ‬‬

‫‪02‬‬
‫‪5‬‬ ‫‪01‬‬
‫‪0‬‬
‫‪5.2‬‬
‫‪3.0‬‬
‫‪1‬‬ ‫‪2.0‬‬
‫‪1.0‬‬
‫‪50.0‬‬

‫‪]%[ EG‬‬
‫‪]%[ SC‬‬

‫גרף ‪ 1‬א'‪ :‬ניצולת האריזה כתלות בריכוזי ‪ CS‬ו‪ GE-‬מוצגת בתוכנת אקסל‬

‫‪08‬‬

‫‪07‬‬

‫‪001‬‬ ‫‪06‬‬

‫‪08‬‬ ‫‪05‬‬

‫‪06‬‬ ‫‪04‬‬

‫‪04‬‬ ‫‪03‬‬
‫‪% dlieY‬‬

‫‪02‬‬ ‫‪02‬‬
‫‪5‬‬
‫‪0‬‬ ‫‪4‬‬
‫‪3‬‬ ‫‪01‬‬
‫‪3.0‬‬
‫‪52.0‬‬
‫‪2.0‬‬ ‫‪2‬‬
‫‪51.0‬‬ ‫‪0‬‬
‫‪1.0‬‬ ‫‪1‬‬
‫‪50.0‬‬ ‫‪% EG‬‬
‫‪% SC‬‬

‫גרף ‪ 1‬ב'‪ :‬ניצולת האריזה כתלות בריכוזי ‪ CS‬ו‪ GE-‬מוצגת בתוכנת מטלב‬

‫ניצולת האריזה הגבוה ביותר מתקבלת בריכוזי ‪ ,CS:GE=0.3:5‬בריכוז ‪ GE‬של ‪ 5%‬נראית עלייה‬
‫בניצולת האריזה עם העלייה בריכוז ‪ ,CS‬בריכוז ‪ GE‬של ‪ 1%‬עבור ריכוזי ‪ CS‬העולים על ‪0.1%‬‬
‫לא מתקבלת אריזה (לא נוצרת אנקפסולציה)‪ .‬ניתן לראות כי גם עבור שילוב של הריכוזים‬
‫הנמוכים ביותר ‪ CS:GE=0.05:1‬התקבלה ניצולת אריזה משמעותית‪.‬‬
 ‫‪ .3.2‬צילוב‬

‫לאחר צילוב בעזרת גלוטראלדהיד וניטרול עודפי האלדהיד ע"י אתנול אמין‪ ,‬התבצע אפיון איכותי‬
‫של המיקרוספרות במיקרוסקפ‪ .‬התוצאות מוצגות בטבלה מס' ‪.2‬‬
‫טבלה מס' ‪ :3‬אפיון מיקרוספרות לאחר צילוב‬

‫‪CS‬‬
‫‪0.05%‬‬ ‫‪0.10%‬‬ ‫‪0.20%‬‬ ‫‪0.30%‬‬ ‫אפיון‬
‫‪GE‬‬
‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫עכירות‬
‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫מיקרוספרות‬
‫הרבה‬ ‫הרבה‬ ‫הרבה‬ ‫הרבה‬ ‫כמות‬
‫גדולים‪,‬‬ ‫‪5%‬‬
‫בינוניים‬
‫קטנים‬ ‫קטנים‬ ‫בינוניים‬ ‫פיזור גדלים‬
‫וקטנים‬
‫וקטנים‬

‫עגולים סימטריים‪ -‬ספירות‬ ‫צורה‬

‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-/+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫צברים‬
‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫עכירות‬
‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫מיקרוספרות‬
‫מעט‬ ‫הרבה‬ ‫בינוני‬ ‫בינוני‬ ‫כמות‬
‫גדולים‪,‬‬ ‫‪2.50%‬‬
‫בינוני‬ ‫בינוני‬
‫בינוניים‬ ‫בינוניים‬ ‫פיזור גדלים‬
‫וקטנים‬ ‫וקטנים‬
‫וקטנים‬

‫עגולים סימטריים‪ -‬ספירות‬ ‫צורה‬

‫‪-‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫צברים‬
‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫עכירות‬
‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫מיקרוספרות‬
‫הרבה‬ ‫מעט‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫כמות‬
‫‪1%‬‬
‫קטנים‬ ‫קטנים‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫גודל ממוצע‬

‫עגולים סימטריים‪ -‬ספירות‬ ‫צורה‬

‫‪-‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫צברים‬

‫מקרא‪:‬‬
‫‪ +‬תכונה קיימת‬
‫‪ -‬תכונה לא קיימת‬
‫‪ -/+‬תכונה קיימת באופן‬
‫חלקי‬
 ‫בדומה לטבלה מס' ‪ 1‬ברוב המבחנות התקבלה עכירות וכן נראו מיקרוספירות‪ ,‬במיעוט‬
‫מהמבחנות (ריכוזי ‪ )CS:GE 0.3:1, 0.2:1‬לא נצפתה עכירות וכן לא נראו מיקרוספרות כלל‪ .‬ככל‬
‫שגודל המיקרוספרות עולה כך גם פיזור הגדלים עולה‪ .‬בריכוז ג'לטין ‪ 1%‬בשילוב ריכוז ‪ CS‬העולה‬
‫על ‪ 0.1%‬לא מתקבלות מיקרוספירות‪.‬‬

‫הדגימות המצולבות עברו צנטריפוגה ונקבע משקל משקע‬

‫טבלה מס' ‪ :4‬משקל המשקע שהתקבל לאחר צילוב [‪]mg‬‬

‫‪CS‬‬
‫‪0.05%‬‬ ‫‪0.10%‬‬ ‫‪0.20%‬‬ ‫‪0.30%‬‬
‫‪GE‬‬

‫‪72.3‬‬ ‫‪67.3‬‬ ‫‪71.3‬‬ ‫‪61.8‬‬ ‫‪5%‬‬

‫‪39.2‬‬ ‫‪52‬‬ ‫‪68.3‬‬ ‫‪82.7‬‬ ‫‪2.50%‬‬

‫‪53.6‬‬ ‫‪68.8‬‬ ‫‪19.8‬‬ ‫‪14.7‬‬ ‫‪1%‬‬

‫משקל המשקע הגבוה ביותר התקבל בריכוזי ‪ ,CS:GE=0.3:2.5‬ניתן לראות שעבור ריכוז ‪ GE‬של‬
‫‪ 5%‬בכל טווח ריכוזי ‪ CS‬התקבל משקע בתחום שבין ‪ ,61.8-72.3‬וכי בריכוזי ‪CS:GE=0.1:1‬‬
‫התקבל ערך באותו תחום‪ .‬בנוסף ניתן לראות משקל משקע נמוך בריכוז ‪ GE‬של ‪ 1%‬וריכוזי ‪CS‬‬
‫גבוהים מ‪.0.1%-‬‬
‫‪ .3.3‬אפיון מיקרוספירות‬
‫מנת ההעמסה נקבעה מתוך משקל המשקע לאחר צילוב המיקרוספרות‬

‫טבלה מס' ‪ :5‬מנת ההטענה‪]%[ Loading -‬‬

‫‪CS‬‬
‫‪0.05%‬‬ ‫‪0.10%‬‬ ‫‪0.20%‬‬ ‫‪0.30%‬‬
‫‪GE‬‬

‫‪0.349‬‬ ‫‪0.375‬‬ ‫‪0.512‬‬ ‫‪0.667‬‬ ‫‪5%‬‬

‫‪0.658‬‬ ‫‪0.75‬‬ ‫‪0.554‬‬ ‫‪0.307‬‬ ‫‪2.50%‬‬

‫‪0.650‬‬ ‫‪0.374‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪1%‬‬

‫מנת ההטענה הגבוה ביותר התקבלה עבור ריכוזי ‪ ,CS:GE=0.1:2.5 0‬בריכוזי ‪CS:GE 0.3:5,‬‬
‫‪ ,0.05:2.5, 0.05:1‬התקבלו מנות הטענה בתחום ‪ ,0.650-0.667‬וכן לא התקבלו מנות הטענה עבור‬
‫ריכוז ‪ GE‬של ‪ 1%‬וריכוזי ‪ CS‬הגבוהים מ‪.0.1%‬‬
 ‫נמדדו הקטרים של המיקרוספירות שעברו צילוב בריכוז ‪ CS:GE=0.2:5‬ונקבע פילוג הגדלים‬
‫בעזרת התוכנה ‪ .Nis-elements‬התוצאות מובאות בטבלה מס' ‪.6‬‬

‫טבלה מס' ‪ :6‬פילוג הגדלים של המיקרוספירות עבור ריכוז ‪ CS:GE 0.2:5‬בעזרת‬

‫תוכנת ]‪Nis-elements [µm‬‬

‫‪Maximum‬‬ ‫‪Minimum‬‬ ‫‪St.Dev‬‬ ‫‪Mean‬‬ ‫‪Feature‬‬

‫‪36.59‬‬ ‫‪2.25‬‬ ‫‪6.52‬‬ ‫‪7.59‬‬ ‫קוטר‬

‫ערכי המינימום והמקסימום רחוקים מהממוצע וכן סטיית התקן שהתקבלה גבוהה מאוד‪.‬‬

‫התמונה שנותחה לקביעת פילוג הגדלים מוצגת באיור ‪.2‬‬

‫איור ‪ :2‬תצלום מיקרוספירות בריכוז ‪ CS:GE 0.2:5‬ממיקרוסקופ בהגדלה ‪x40‬‬

‫ניתן לראות מיקרוספירות עגולות סימטריות בצורת ספירה בטווח רחב של גדלים‪ .‬התקבלו‬
‫צברים במיקרוספירות הבינוניות והגדולות יותר‪ ,‬וכן ניתן לראות מיקרוספירות בודדות קטנות‬
‫יותר‪.‬‬
 ‫משקע המיקרוספירות שלא עברו צילוב הומס בחלקו ע"י הוספת ‪ PBS‬וחימום ‪ 37ºC‬למשך‬
‫שעתיים‪ ,‬נקבע אחוז ההמוגלובין שהשתחרר בהמסת המשקע‪ .‬התוצאות מובאות בטבלה מס' ‪.7‬‬
‫טבלה מס' ‪ :7‬שחרור המוגלובין ממיקרוספירות ללא צילוב‬

‫‪CS‬‬
‫‪0.05%‬‬ ‫‪0.10%‬‬ ‫‪0.20%‬‬ ‫‪0.30%‬‬ ‫המאפיין‬
‫‪GE‬‬

‫‪0.504‬‬ ‫‪0.505‬‬ ‫‪0.730‬‬ ‫‪0.825‬‬ ‫כמות המוגלובין שנארזה [‪]mg‬‬

‫‪0.290‬‬ ‫‪0.368‬‬ ‫‪0.487‬‬ ‫‪0.280‬‬ ‫כמות המוגלובין במשקע [‪]mg‬‬ ‫‪5%‬‬

‫המוגלובין שהשתחרר בהמסת‬
‫‪57.7‬‬ ‫‪72.9‬‬ ‫‪66.7‬‬ ‫‪33.9‬‬
‫המשקע [‪]%‬‬

‫‪0.516‬‬ ‫‪0.780‬‬ ‫‪0.757‬‬ ‫‪0.508‬‬ ‫כמות המוגלובין שנארזה [‪]mg‬‬

‫‪0.204‬‬ ‫‪0.479‬‬ ‫‪0.252‬‬ ‫‪0.295‬‬ ‫כמות המוגלובין במשקע [‪]mg‬‬ ‫‪2.50%‬‬

‫המוגלובין שהשתחרר בהמסת‬
‫‪39.5‬‬ ‫‪61.4‬‬ ‫‪33.2‬‬ ‫‪58.1‬‬
‫המשקע [‪]%‬‬

‫‪0.697‬‬ ‫‪0.514‬‬ ‫‪0.439‬‬ ‫‪0.447‬‬ ‫כמות המוגלובין שנארזה [‪]mg‬‬

‫‪0.488‬‬ ‫‪0.210‬‬ ‫‪0.080‬‬ ‫‪0.063‬‬ ‫כמות המוגלובין במשקע [‪]mg‬‬ ‫‪1%‬‬

‫המוגלובין שהשתחרר בהמסת‬
‫‪70.05‬‬ ‫‪40.8‬‬ ‫‪0.18‬‬ ‫‪0.14‬‬
‫המשקע [‪]%‬‬

‫בצהוב מסומנות תוצאות חריגות‬ ‫‪‬‬

‫טווחי שחרור החומר הפעיל (המוגלובין) נעים בין ‪33.2-72.9‬‬

 ‫‪ .4‬דיון‬
‫איפיון האנקפסולציה על פי עכירות ומיקרוסקופ לפני צילוב (טבלה ‪ )1‬ולאחר צילוב‬ ‫‪‬‬
‫(טבלה ‪ ) 3‬היה כמעט זהה‪ ,‬אך ניתן היה לראות את התוצאות שלאחר הצילוב באופן ברור‬
‫יותר כמצופה‪ .‬בשני המקרים נראה כי ככל שמס' המיקרוספירות ופיזור הגדלים עולה כך‬
‫גם כמות הצברים‪ .‬ריכוזי ‪ CS:GE 0.2:1, 0.3:1‬לא אופטימליים ואינם מאפשרים‬
‫אנקפסולציה כלל‪ ,‬ניתן לראות זאת גם במבדק העכירות וגם במיקרוסקופ‪.‬‬
‫יעילות‪/‬ניצולת האריזה נמצאה גבוהה עבור מגוון שילובי ריכוזים (טבלה ‪ ,2‬גרף ‪ ,)1‬תמיד‬ ‫‪‬‬
‫נחפש את השילוב בו הריכוזים הם הנמוכים ביותר ועדיין מתקבלת יעילות אריזה גבוה‬
‫לכן הריכוזים האופטימאליים ליעילות אריזה גבוה הם ‪ CS:GE 0.05:1‬ו‪ .0.1:2.5 -‬על‬
‫מנת לבחור מבינהם יש להתחשב גם בגודל המיקרוקפסולות הנדרש‪ ,‬כאשר בריכוז‬
‫‪ CS:GE 0.05:1‬מיקרוקפסולות קטנות בלבד ובריכוז ‪ CS:GE 0.1:2.5‬נראים‬
‫מיקרוקפסולות גדולות בינוניות וקטנות‪ .‬בנוסף ניתן לראות מגמה ביעילות האריזה עבור‬
‫‪ ,GE=5%‬כאשר ככל שריכוז ‪ CS‬עולה כך גם יעילות האריזה עולה‪ ,‬לכן במקרים בהם‬
‫יעילות האריזה של החומר הפעיל חייבת להיות גבוה ניתן להשתמש במגמה זו‪.‬‬
‫בהתייחסות לתוצאות החריגות בריכוזי ‪ CS:GE 0.2:1, 0.3:1‬המסומנות בצהוב‬ ‫‪‬‬
‫(טבלאות ‪ ,)7 ,2‬הן נובעת‪ ,‬ככל הנראה‪ ,‬מהצורך במקרים של ריכוז גבוה במבחנה למהול‬
‫אותה לפני קריאת ‪ .O.D.405nm‬החריגה נובעת כתוצאה מיציאה מהתחום הליניארי‬
‫בעקומת הכיול‪ .‬בנוגע למדידת כמות מסוימת של המוגלובין במשקע‪ ,‬ייתכן וכן נוצרו‬
‫מיקרוספירות בריכוזים אלה אך הן קטנות מאוד ולכן לא הבחנו בעכירות ובנוסף גם לא‬
‫ניתן היה לזהות אותן במיקרוסקופ‪.‬‬
‫משקל המשקע לאחר צילוב נותן אינדיקציה לגבי כמות המיקרוספירות הנוצרות‪ ,‬אך יש‬ ‫‪‬‬
‫לציין כי לעיתים נוצר משקע שאינו בצורת מיקרוספירות וכן אינו מכיל חומר פעיל‬
‫(המוגלובין) כלל‪ .‬בתהליך אופטימיזציה נחפש שילוב של משקל משקע גדול עם מנת‬
‫הטענה גדולה‪ .‬לדוגמא (טבלאות ‪ )4,5‬בריכוזי ‪ CS:GE=0.1:2.5‬התקבל משקל משקע‬
‫נמוך עד בינוני אך מנת ההטענה‪ ,‬המעידה על כמות החומר הפעיל (חלבון) במיקרוספירות‪,‬‬
‫הוא גבוה‪ .‬לעומת זאת בריכוזי ‪ CS:GE=0.3:2.5‬התקבל הרבה משקע אך מנת ההעמסה‬
‫נמוכה‪ .‬במקרה הזה נמליץ על השילוב ‪ CS:GE=0.3:5‬בו גם כמות המשקע היא גבוה וגם‬
‫מנת ההטענה גבוה‪ ,‬כאשר ראינו (טבלה ‪ ,2‬גרף ‪ )1‬כי בריכוז זה ניצולת האריזה גבוה גם‬
‫היא‪.‬‬
‫פילוג הגדלים (טבלה ‪ ,6‬איור ‪ )2‬הוא רחב מאוד וכך הוא התקבל עבור רוב שילובי‬ ‫‪‬‬
‫הריכוזים‪ .‬לכן ברוב המקרים‪ ,‬כיוון שאין אחידות בגודל ומפה שכמות החומר הפעיל‬
‫הנטען במיקרוספירות משתנה‪ ,‬לא ניתן להמליץ על שילוב של ריכוזים‪ .‬ניתן לראות‬
‫(טבלאות ‪ )1,3‬כי דווקא כאשר המיקרוספירות היו קטנות ולא היו הרבה גושים התקבלה‬
‫אחידות יפה בגדלים (כולם קטנים)‪ ,‬לכן לתהליך אופטימיזציה נמליץ להשתמש בשילוב‬
‫הריכוזים ‪ =0.05:1CS:GE‬המניב אחידות של גדלים קטנים ‪ ,‬יעילות אריזה טובה ומנת‬
‫הטענה גבוה‪.‬‬
‫בתנאי תוספת ‪ PBS‬וחימום ל‪ -37ºC‬ציפינו לראות כי כל המשקע התמוסס‪ ,‬הדבר לא‬ ‫‪‬‬
‫התקבל כמצופה גם לאחר שתי שעות (טבלה‪.)7‬‬
 ‫‪ .5‬מסקנות‬
‫על פי הניסוי הזה נמצא כי שילוב הריכוזים הנמוכים ביותר והאופטימאליים ביותר הן‬ ‫‪‬‬
‫עבור ניצולת אריזה‪ ,‬אחידות גודל ומנת הטענה הוא ‪ ,=0.05:1CS:GE‬זאת‬
‫למיקרוקפסולות קטנות ויש לעשות עוד מס' חזרות על מנת לאמת עובדה זו‪.‬‬
‫ניתן להמשיך ולבדוק בניסוי המשך את העלייה בניצולת האריזה ומנת ההטענה כתלות‬ ‫‪‬‬
‫בעלייה בריכוז ‪ CS‬כאשר עבור ריכוז ‪ GE‬קבוע של ‪.5%‬‬
‫לא הצלחנו בניסוי זה לקבל אחידות גדלים במיקרוקפסולות בינוניות וגדולות‪.‬‬ ‫‪‬‬
‫לא הצלחנו להמיס את החומר הפעיל (המוגלובין) מהמיקרוספירות גם לאחר שעתיים‬ ‫‪‬‬
‫בטמפ' ‪.37ºC‬‬
‫יצירת המיקרוספירות תלוית יחסי ריכוזים ולא מגמתית‪.‬‬ ‫‪‬‬

‫‪ .6‬מקורות מידע‬
‫‪28.05.12‬‬
‫‪http://jcp.bmj.com/content/57/4/355.long‬‬
‫‪30.05.12‬‬
‫?‪http://www.bioscience.org/2005/v10/af/1559/fulltext.asp‬‬
‫‪bframe=figures.htm&doi=yes‬‬
‫‪30.05.12‬‬
‫‪http://www.biotechniques.com/multimedia/archive/00037/BTN_A_04375RV01_O_3‬‬
‫‪7190a.pdf‬‬
 ‫‪ .7‬נספחים‪:‬‬
‫טבלה מס' ‪ :8‬ערכי ‪ O.D.405nm‬עבור ריכוזי המוגלובין משתנים‬

‫‪O.D.405nm‬‬ ‫ריכוז המוגלובין [‪]mg/ml‬‬

‫‪2.145‬‬ ‫‪0.5‬‬
‫‪1.129‬‬ ‫‪0.25‬‬
‫‪0.63‬‬ ‫‪0.125‬‬
‫‪0.308‬‬ ‫‪0.0625‬‬
‫‪0.161‬‬ ‫‪0.0313‬‬

‫‪5.2‬‬

‫‪60.0 + x 22.4 = )x(f‬‬

‫‪1 = ²R‬‬

‫‪5.1‬‬

‫‪1‬‬
‫‪mn504.D.O‬‬

‫‪5.0‬‬

‫‪0‬‬
‫‪0‬‬ ‫‪1.0‬‬ ‫‪2.0‬‬ ‫‪3.0‬‬ ‫‪4.0‬‬ ‫‪5.0‬‬ ‫‪6.0‬‬
‫‪]m/gm[ C‬‬

‫גרף ‪ :1‬עקומת כיול לריכוז המוגלובין‬

‫טבלה מס' ‪ :9‬תוצאות קריאת ‪ O.D.405nm‬בנוזל העליון‬

‫‪CS‬‬
‫‪0.05%‬‬ ‫‪0.10%‬‬ ‫‪0.20%‬‬ ‫‪0.30%‬‬
‫‪GE‬‬

‫‪2.146‬‬ ‫‪2.141‬‬ ‫‪1.197‬‬ ‫‪0.796‬‬ ‫‪5%‬‬

‫‪2.094‬‬ ‫‪0.983‬‬ ‫‪1.080‬‬ ‫‪2.128‬‬ ‫‪2.50%‬‬

‫‪1.334‬‬ ‫‪2.103‬‬ ‫‪2.417‬‬ ‫‪2.383‬‬ ‫‪1%‬‬

 ‫טבלה מס' ‪ :10‬תוצאות קריאת ‪ O.D.405nm‬במשקע המומס באופן חלקי‬

‫‪CS‬‬
‫‪0.05%‬‬ ‫‪0.10%‬‬ ‫‪0.20%‬‬ ‫‪0.30%‬‬
‫‪GE‬‬

‫‪1.282‬‬ ‫‪1.606‬‬ ‫‪2.105‬‬ ‫‪1.238‬‬ ‫‪5%‬‬

‫‪1.462‬‬ ‫‪2.072‬‬ ‫‪1.117‬‬ ‫‪1.3‬‬ ‫‪2.50%‬‬

‫‪2.112‬‬ ‫‪0.941‬‬ ‫‪0.398‬‬ ‫‪0.325‬‬ ‫‪1%‬‬

‫דוגמא לחישובים‪ :‬עבור ריכוזי ‪CS:GE=0.3:5‬‬

‫כמות המוגלובין בנוזל העליון‬

‫‪O D‬‬
‫‪. 504‬‬
‫‪. mn =6102‬‬
‫‪4.‬‬ ‫‪⋅C +5060‬‬
‫‪0.‬‬

‫‪gm‬‬
‫‪697‬‬
‫‪0 . =6102‬‬
‫‪4.‬‬ ‫‪⋅C +5060‬‬
‫‪0.‬‬ ‫‪→ C= 571‬‬
‫‪0.‬‬
‫‪lm‬‬
‫‪gm‬‬
‫עליון‪M‬‬ ‫=‪ = C⋅V‬נוזל‪−‬‬ ‫‪0.‬‬
‫‪571‬‬ ‫‪⋅1lm = 0571‬‬
‫‪. gm‬‬
‫‪lm‬‬
‫כמות המוגלובין התחלתית‬

‫‪gm‬‬
‫‪M‬‬
‫‪ = 1‬התחלתי‬ ‫‪⋅1lm‬‬
‫‪lm‬‬
‫כמות המוגלובין שנארזה‬

‫‪ =M‬נארז‪M‬‬
‫עליון‪ −M‬התחלתי‬ ‫= נוזל‪−‬‬ ‫‪1− 571‬‬
‫‪0 . = 528‬‬
‫‪0 . gm‬‬
‫ניצולת האריזה‬

‫נארז‪M‬‬ ‫‪528‬‬
‫‪0.‬‬
‫‪η‬‬
‫אריזה‬ ‫=‬ ‫=‬ ‫‪001‬‬
‫‪⋅ =28 .5%‬‬
‫‪M‬‬
‫התחלתי‬ ‫‪1‬‬

‫כמות ההמוגלובין במשקע (השתחרר)‬

‫‪gm‬‬
‫‪832‬‬
‫‪1 . =6102‬‬
‫‪4.‬‬ ‫‪⋅C +5060‬‬
‫‪0.‬‬ ‫‪→ C= 082‬‬
‫‪.‬‬
‫‪lm‬‬
‫‪gm‬‬
‫‪ = C⋅V= 082‬משקע‪M‬‬
‫‪.‬‬ ‫‪⋅1lm = 082gm‬‬
‫‪.‬‬
‫‪lm‬‬
‫אחוז המוגלובין משתחרר מתוך המוגלובין נארז‬
 ‫‪M‬‬
‫שוחרר‬ ‫‪082‬‬
‫‪.‬‬
‫= ‪η‬‬
‫שחרור‬ ‫=‬ ‫‪001‬‬
‫‪⋅ =33 49‬‬
‫‪. %‬‬
‫נארז‪M‬‬ ‫‪0.‬‬
‫‪528‬‬

‫טבלה מס' ‪ :11‬קביעת מסת המשקעים שהתקבלה לאחר צילוב‬

‫‪CS‬‬
‫‪0.05%‬‬ ‫‪0.10%‬‬ ‫‪0.20%‬‬ ‫‪0.30%‬‬ ‫המאפיין‬
‫‪GE‬‬

‫‪956.6‬‬ ‫‪972.3‬‬ ‫‪950.4‬‬ ‫‪963.5‬‬ ‫משקל אפינדורף [‪]mg‬‬

‫‪1028.9‬‬ ‫‪1039.6‬‬ ‫‪1021.7‬‬ ‫‪1025.3‬‬ ‫משקל אפינדורף ‪ +‬משקע [‪]mg‬‬ ‫‪5%‬‬

‫‪72.3‬‬ ‫‪67.3‬‬ ‫‪71.3‬‬ ‫‪61.8‬‬ ‫משקל המשקע [‪]mg‬‬

‫‪965.2‬‬ ‫‪959.3‬‬ ‫‪965.9‬‬ ‫‪960.9‬‬ ‫משקל אפינדורף [‪]mg‬‬

‫‪1004.4‬‬ ‫‪1011.3‬‬ ‫‪1034.2‬‬ ‫‪1043.6‬‬ ‫משקל אפינדורף ‪ +‬משקע [‪]mg‬‬ ‫‪2.50%‬‬

‫‪39.2‬‬ ‫‪52‬‬ ‫‪68.3‬‬ ‫‪82.7‬‬ ‫משקל המשקע [‪]mg‬‬

‫‪958.9‬‬ ‫‪963.2‬‬ ‫‪959.1‬‬ ‫‪960.4‬‬ ‫משקל אפינדורף [‪]mg‬‬

‫‪1012.5‬‬ ‫‪1032.5‬‬ ‫‪978.9‬‬ ‫‪975.1‬‬ ‫משקל אפינדורף ‪ +‬משקע [‪]mg‬‬ ‫‪1%‬‬

‫‪53.6‬‬ ‫‪68.8‬‬ ‫‪19.8‬‬ ‫‪14.7‬‬ ‫משקל המשקע [‪]mg‬‬

‫דוגמא לחישוב‪ :‬עבור ריכוזי ‪CS:GE=0.3:5‬‬

‫משקל המשקע‬

‫‪ =M‬משקע‪M‬‬
‫אפינדורף‬ ‫משקעי‬
‫‪+‬‬ ‫‪ 5201‬אפינדורף‬
‫‪−M‬‬ ‫=‬ ‫‪.3−‬‬
‫‪369‬‬ ‫‪.5=16 .g8m‬‬

‫חישוב ‪loading‬‬

‫המוגלוביןנארז‪M‬‬
‫‪−‬‬
‫‪gnidaol‬‬
‫‪%‬‬ ‫=‬ ‫‪001‬‬
‫‪⋅ %‬‬
‫‪M‬‬
‫מיקרוספירות‬

‫‪0528‬‬
‫‪.‬‬
‫‪gnidaol‬‬
‫‪%‬‬ ‫=‬ ‫‪001‬‬
‫‪⋅ = 766‬‬
‫‪0. %‬‬
‫‪2⋅16 .8‬‬
‫תוכנת‬ ‫טבלה מס' ‪ :12‬קטרי המיקרוספירות עבור ריכוז ‪ CS:GE 0.2:5‬בעזרת‬
‫]‪Nis-elements [µm‬‬
‫מס'‬ ‫מס'‬ ‫מס'‬
‫קוטר‬ ‫סידורי‬ ‫קוטר‬ ‫סידורי‬ ‫קוטר‬ ‫סידורי‬
‫‪7.32‬‬ ‫‪35‬‬ ‫‪4.5‬‬ ‫‪19‬‬ ‫‪2.25‬‬ ‫‪1‬‬
‫‪7.32‬‬ ‫‪36‬‬ ‫‪5.07‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪2.81‬‬ ‫‪2‬‬
‫‪7.32‬‬ ‫‪37‬‬ ‫‪5.07‬‬ ‫‪21‬‬ ‫‪2.81‬‬ ‫‪3‬‬
‫‪7.88‬‬ ‫‪38‬‬ ‫‪5.07‬‬ ‫‪22‬‬ ‫‪2.81‬‬ ‫‪4‬‬
‫‪8.44‬‬ ‫‪39‬‬ ‫‪5.07‬‬ ‫‪23‬‬ ‫‪3.38‬‬ ‫‪5‬‬
‫‪8.44‬‬ ‫‪40‬‬ ‫‪5.07‬‬ ‫‪24‬‬ ‫‪3.94‬‬ ‫‪6‬‬
‫‪8.44‬‬ ‫‪41‬‬ ‫‪5.07‬‬ ‫‪25‬‬ ‫‪3.94‬‬ ‫‪7‬‬
‫‪10.13‬‬ ‫‪42‬‬ ‫‪5.07‬‬ ‫‪26‬‬ ‫‪3.94‬‬ ‫‪8‬‬
‫‪12.38‬‬ ‫‪43‬‬ ‫‪5.07‬‬ ‫‪27‬‬ ‫‪3.94‬‬ ‫‪9‬‬
‫‪16.89‬‬ ‫‪44‬‬ ‫‪5.63‬‬ ‫‪28‬‬ ‫‪3.94‬‬ ‫‪10‬‬
‫‪18.01‬‬ ‫‪45‬‬ ‫‪5.63‬‬ ‫‪29‬‬ ‫‪3.94‬‬ ‫‪11‬‬
‫‪20.26‬‬ ‫‪46‬‬ ‫‪5.63‬‬ ‫‪30‬‬ ‫‪3.94‬‬ ‫‪12‬‬
‫‪24.2‬‬ ‫‪47‬‬ ‫‪5.63‬‬ ‫‪31‬‬ ‫‪4.5‬‬ ‫‪13‬‬
‫‪25.33‬‬ ‫‪48‬‬ ‫‪6.19‬‬ ‫‪32‬‬ ‫‪4.5‬‬ ‫‪14‬‬
‫‪36.59‬‬ ‫‪49‬‬ ‫‪6.19‬‬ ‫‪33‬‬ ‫‪4.5‬‬ ‫‪15‬‬
‫‪7.32‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪6.19‬‬ ‫‪34‬‬ ‫‪4.5‬‬ ‫‪16‬‬
‫‪7.32‬‬ ‫‪51‬‬ ‫‪6.75‬‬ ‫‪35‬‬ ‫‪4.5‬‬ ‫‪17‬‬
‫‪6.75‬‬ ‫‪36‬‬ ‫‪4.5‬‬ ‫‪18‬‬

‫גרף ‪ :2‬אורכי גל לבליעת המוגלובין‬