ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KIỀU THỊ TRÀ GIANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI

VÀ TRÌNH TỰ VÙNG GEN matK/ITS CỦA MỘT SỐ MẪU CÂY
THUỘC CHI DƯƠNG ĐỒNG (Adinandra)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2019

 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KIỀU THỊ TRÀ GIANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI

VÀ TRÌNH TỰ VÙNG GEN matK/ITS CỦA MỘT SỐ MẪU CÂY
THUỘC CHI DƯƠNG ĐỒNG (Adinandra)

Ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hữu Quân

Thái Nguyên, năm 2019

 LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Mọi trích dẫn trong
luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là
trung thực và chưa được ai công bố.
Thái Nguyên, tháng 6 năm 2019
Tác giả luận văn

Kiều Thị Trà Giang

XÁC NHẬN XÁC NHẬN

CỦA KHOA CHUYÊN MÔN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm TS. Nguyễn Hữu Quân

i
 LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới
TS. Nguyễn Hữu Quân, giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại
học Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em
trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Em cũng xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS. Phạm Văn Khang, giảng viên
Khoa Hóa học đã hướng dẫn em về tách chiết và định tính các chất hóa học.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của cô Trần Thị Hồng, kỹ thuật viên
phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, cô Cao Thị Phương Thảo, kỹ thuật
viên phòng thí nghiệm Thực vật học và các thầy cô kỹ thuật viên các phòng thí
nghiệm Khoa Sinh học; phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường
Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện giúp em trong suốt
quá trình nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Sinh học hiện đại và
Giáo dục sinh học, bộ phận sau đại học thuộc Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư
phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá
trình học tập và hoàn thành luận văn.
Em xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, bạn bè đã động viên, khuyến khích và
giúp đỡ em trong tiến trình học tập và hoàn thành luận văn.
Em xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài KH&CN Quỹ NAFOSTED “Phân
tích thành phần hóa học và tìm kiếm các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng ung
thư và kháng viêm từ một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra) ở
Việt Nam” mã số 106.02-2018.338.
Thái Nguyên, tháng 6 năm 2019
Tác giả luận văn

Kiều Thị Trà Giang

ii
 MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .....................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... ii
MỤC LỤC .............................................................................................................. iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...............................................................................iv
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ v
DANH MỤC HÌNH ẢNH .......................................................................................vi
MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1
1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 1
3. Nội dung nghiên cứu............................................................................................. 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3
1.1. Giới thiệu về thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra ) ............................. 3
1.2. Tình hình nghiên cứu về chi Dương đồng (Adinandra) .................................... 5
1.2.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học............... Error! Bookmark not defined.
1.2.2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học ................................................................... 8
1.3. Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại thực vật .........................11
1.4. Các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của các loài cây thuốc ..................14
1.5. Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro ................................16
1.6. Vai trò của polyphenol, coumarin, dẫn xuất của flavon và flavonol...............18
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................21
2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................21
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................21
2.1.2. Hóa chất, thiết bị ...........................................................................................21
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.................................................................22
2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................22
2.2.1. Phương pháp phân loại hình thái ..................................................................22
2.2.2. Phương pháp giải phẫu thực vật ...................................................................22
2.2.3. Phương pháp sinh học phân tử .....................................................................24

iii
2.2.4. Phương pháp hóa sinh...................................................................................26
2.2.5. Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ................................28
2.2.6. Phương pháp xử lý và phân tích kết quả ......................................................29
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...............................................................30
3.1. Đặc điểm hình thái ngoài và phân bố của loài Adinandra lienii .....................30
3.2. Cấu tạo giải phẫu của loài Adinandra lienii ....................................................31
3.2.1. Đặc điểm giải phẫu cắt ngang thân cây ........................................................31
3.2.2. Đặc điểm giải phẫu cắt ngang phiến lá cây ..................................................32
3.3. Đặc điểm của vùng gen matK phân lập từ loài Adinandra lienii ....................34
3.4. Khảo sát các hợp chất có trong các phân đoạn dịch chiết của cây Adinandra
lienii ........................................................................................................................39
3.4.1. Định tính polyphenol ....................................................................................39
3.4.2. Định tính các flavonoid ................................................................................40
3.4.3. Định tính các coumarin.................................................................................40
3.4.4. Phân tích thành phần các hợp chất trong cao chiết của loài A. lienii ...........41
3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ loài Adinandra lienii ........................42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................46
1. KẾT LUẬN.........................................................................................................46
2. KIẾN NGHỊ ........................................................................................................46
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ...............47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................48
 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng việt
tắt
APG II An update of the Angiosperm Hệ thống phân loại thực vật
Phylogeny Group classification
for the ordors and families of
flowering plants
Bp Base pair Cặp bazơ nitơ
DMSO Dimethyl sulfoxide
DNA Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleic Axit (DNA)
EC50 Effective dose 50% Liều hiệu quả đáp ứng 50%
EDTA Ethylene diamine tetraa acid cetic Etylen diamin tetraxetic Axit
ELISA Enzyme linked Thử nghiệm miễn dịch gắn
immunosorbentassay enzyme
EtOH Ethyl acetatae
Hep G2 Hepatocellular carcinoma human Ung thư gan ở người

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% cá thể

ISSR Inter Simple Sequence Repea Đánh giá sự sai khác di truyền
ở thực vật.
ITS Internal transcribed space Vùng gen ITS
LB Luria Bertani Môi trường nuôi cấy chủng vi
sinh vật
matK matK maturase Gen matK
MCF-7 Ardeno carcinoma Ung thư vú
MeOH Methanol
MIC Minimalinhibitory concentration Nồng độ tối thiểu ức chế
MS/MS Mass spectrometry Phương pháp khối phổ
PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase
RAPD Random Amplification Đa hình DNA nhân bản ngẫu
of Polymorphic DNA nhiên
RNA Ribonucleic acid Ribonucleic Axit
rRNA RNA ribosome Riboxom RNA
TTC Triphenyl tetrazolium Chloride Chỉ thị màu

iv
 DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Danh sách các loài thuộc chi Adinandra ở Việt Nam ............................. 3
Bảng 1.2. Tác dụng chống ung thư của dịch chiết các hợp chất phenolic tự do trên
2 dòng tế bào Hep-G2 và MCF-7 ...........................................................................10
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm .................................................21
Bảng 2.2. Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm .........................................................22
Bảng 2.3. Thông tin về cặp mồi nhân gen matK....................................................25
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR nhân gen matK ..........................................25
Bảng 3.1. Các trình tự nucleotide của đoạn gen matK sử dụng trong phân tích ...36
Bảng 3.2. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly trình tự các nucleotide của đoạn gen
matK từ loài Adinandra lienii và các loài thuộc chi Adinandra.............................38
Bảng 3.3. Hoạt tính sinh học của dịch chiết từ cây A. lienii ..................................42

v
 DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra) ....................... 4
Hình 1.2. Các hợp chất flavonoid và triterpene saponins từ A. nitida ..................... 6
Hình 1.3. Các hợp chất triterpene saponins từ A. nitida .......................................... 7
Hình 1.4. Các hợp chất flavonoid từ A. nitida ......................................................... 8
Hình 1.5. Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro ..................17
Hình 1.6. Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro sinh tự ký .......18
Hình 2.1. Sơ đồ chiết phân đoạn các hợp chất từ cây A. lienii ..............................26
Hình 3.1. Hình thái ngoài của cây A.lienii (Ảnh chụp của tác giả thu tại Lào Cai,
tháng 3, năm 2018) .................................................................................................30
Hình 3.2. Giải phẫu cắt ngang thân cây A. lienii ...................................................32
Hình 3.3. Giải phẫu cắt ngang phiến lá cây A. lienii .............................................33
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ DNA tổng số của loài A. lienii ......34
Hình 3.5. Kết quả giải trình tự đoạn gen matK của loài A. lienii thu tại Lào Cai..35
Hình 3.6. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự đoạn gen matK của loài
A. lienii so với trình tự đoạn gen matK trên GenBank bằng BLAST trong NCBI 36
Hình 3.7. Trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ loài A. lienii thu tại
Lào Cai, Việt Nam và trình tự đoạn gen matK công bố trên GenBank..................37
Hình 3.8. Sơ đồ cây phân loại dựa trên trình tự các nucleotide của đoạn gen matK
.................................................................................................................................39
Hình 3.9. Phản ứng với muối sắt (III) (a) và với dung dịch H2SO4 đặc (b) ..........39
Hình 3.10. Định tính các flavonoid ........................................................................40
Hình 3.11. Định tính coumarin phản ứng với NaOH (a) và HCl đặc (b) ..............41
Hình 3.12. Sắc kí đồ cao chiết ethanol (A) và ethyl acetate (B) trong hệ dung môi
n-hexan : acetone tỉ lệ 1:1 .......................................................................................41
Hình 3.13. Sắc kí đồ cao chiết ethanol (A) và ethyl acetate (B) trong hệ dung môi
dichloromethane : n-hexan tỉ lệ 3:1 ........................................................................41
Hình 3.14. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn B. subtilis .................43
Hình 3.15. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn L. plantarum.............43

vi
Hình 3.16. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S. aureus...................44
Hình 3.17. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn E.coli ........................44
Hình 3.18. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S. marcescens ...........45
Hình 3.19. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S. lutea .....................45
 MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Vấn đề sức khỏe của con người ngày nay đang bị ảnh hưởng nghiêm trọng
trước các biến đổi của khí hậu, ô nhiễm môi trường và nguồn thực phẩm dẫn tới
xuất hiện các bệnh hiểm nghèo như ung thư. Do đó, việc tìm ra phương pháp hiệu
quả để điều trị các bệnh liên quan tới ung thư là vấn đề cấp bách và đặt ra nhiều
thách thức lớn cho các nhà khoa học. Trước thực trạng đó, những nghiên cứu để
phát hiện ra các chất có hoạt tính sinh học từ các loài thực vật để sử dụng làm thuốc
chữa bệnh cho người là cần thiết. Trong dự án sàng lọc hoạt tính sinh học của thực
vật Việt Nam, dịch chiết của một số loài thuộc chi Dương đồng (Adinandra), họ
Chè được dự báo có hoạt tính chống ung thư.
Trên thế giới, một số công trình nghiên cứu về các chất hóa học và tác dụng
sinh học của một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng đã thể hiện phổ hoạt tính
kháng viêm, chống độc và giảm đau, chống oxi hóa, diệt trừ các gốc tự do, chống
ung thư cũng như chống lại một số loài vi khuẩn gây bệnh. Ở Việt Nam, những
nghiên cứu về chi Adinandra mới chỉ tập trung ở việc thống kê danh sách thành
phần loài. Còn về đặc tính sinh học cũng như thành phần hóa học của chúng chưa
được nghiên cứu.
Hiện nay, một số loài thuộc chi Dương đồng như Adinandra bockiana,
Adinandra glischroloma và Adinandra lienii bước đầu được nghiên cứu về vị trí
phân bố địa lý. Những nghiên cứu về đặc điểm hình thái, hoạt tính sinh học cũng
như trình tự vùng gen matK/ITS của các loài trên chưa được tác giả nào thực hiện.
Vì vậy, nghiên cứu về các đặc tính sinh học cũng như xây dựng mã vạch DNA từ
một số loài thuộc chi Adinandra, trong đó có loài A. lienii là rất cần thiết. Xuất
phát từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm
hình thái và trình tự vùng gen matK/ITS của một số mẫu cây thuộc chi
Dương đồng (Adinandra)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Nhận diện được mẫu cây thuộc chi Dương đồng bằng phương pháp giải
phẫu, hình thái.
- Xác định được trình tự đoạn gen matK của loài Adinandra lienii thuộc chi
Dương đồng (Adinandra).

1
3. Nội dung nghiên cứu
- Xác định đặc điểm hình thái, giải phẫu của loài Adinandra lienii.
- Phân lập và giải trình tự nucleotide đoạn gen matK của loài A. lienii.
- Thu cao chiết, định tính thành phần các nhóm chất và xác định hoạt tính
kháng khuẩn từ cao chiết của loài A. lienii.

2
 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra )
Chi Adinandra (thuộc họ Chè Theaceae) thường là cây bụi hay cây nhỡ, có
khoảng 85 loài phân bố ở các nước Châu Phi, Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ,
Srilanka, Banglades và một số nước Đông Nam Á [39]. Ở Việt Nam, chi
Adinandra đã được tìm thấy có 13 loài, phân bố ở các tỉnh Lào Cai, Cao Bằng,
Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Quảng Trị, Kon Tum, Lâm Đồng và Gia Lai (Bảng 1.1)
[9]. Loài Sum Liên Adinandra lienii là loài bản địa được tìm thấy năm 1986
nhưng mới được công nhận vào năm 2012. Loài Sum Hòn Giao Adinandra
hongiaoensis mới được phát hiện ở Hòn Giao Lâm Đồng năm 2014 [34].
Bảng 1.1. Danh sách các loài thuộc chi Adinandra ở Việt Nam
TT Tên l ài Tên thường gọi Phân bố
1 Adinandra annaenzymesis Sum đỏ Quảng trị
2 Adinandra caudata Sum đuôi Bạch Mã
3 Adinandra donnaiensis Sum đồng nai Đồng Nai
4 Adinandra glischochroma Sum lông Sapa
5 Adinandra hainanensis Sum Hải Nam Hải Ninh
6 Adinandra integerrima Sum nguyên Miền Trung
7 Adinandra microcarpa Sum trái nhỏ Hòn Bà
8 Adinandra millettii Sum millett Sapa, Tam Đảo
9 Adinandra petelotii Sum petelot Sa a
10 Adinandra poilanei Sum poilan Lâm Đồng
11 Adinandra rubropunctata Sum điểm đỏ Tiên Yên, Quảng Trị
12 Adinandra lienii Sum Liên Lào Cai
13 Adinandra hongiaoensis Sum Hòn Giao Lâm Đồng
Chi Dương đồng Adinandra thuộc họ Theaceae, bộ Theales, lớp
Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta và giới thực vật [40].
Theo sách đỏ Việt Nam, các loài trong chi Adinandra là nguồn gen hiếm.
Các hợp chất có trong cây thuộc chi Adinandra có nhiều tác dụng chữa bệnh như
giảm huyết áp, kháng viêm, chống độc và giảm đau. Đặc biệt, flavonoid đã được

3
tìm thấy trong lá của loài Adinandra nitida, có hoạt tính chống oxi hóa, diệt trừ
các gốc tự do, chống viêm, chống trầm cảm, chống ung thư cũng như chống lại
một số loài vi khuẩn gây bệnh.
Ngoài ra, trong các cây thuộc họ Chè cũng chứa tinh dầu, một hợp chất có vai
trò quan trọng trong lĩnh vực y học. Nhờ các hợp chất có trong cây mà từ xưa y học
cổ truyền đã sử dụng các loài thuộc chi Adinandra được làm thuốc điều trị bệnh ung
thư vòm họng, đau dạ dày, rắn cắn,.... Cây Sum millett (A. millettii) được sử dụng
điều trị đau dạ dày; cây Sum nguyên A. integerrima được dùng để trị bong gân, rắn
cắn. Lá và thân cây Sum đỏ hay Sum Hải Nam A. Hainanensis (A. rubropunctata)
được dùng cho các trường hợp viêm, ung thư vòm họng [5].

A B

C D
Hình 1.1. Một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra)
A: A. hongiaoensis, B: A. millettii, C: A. dumosa, D: A. glischroloma

4
 Chi Adinandra là cây gỗ ít khi là cây bụi, nhánh non có lông nhung. Lá đơn,
mọc so le, có kích thước trung bình hay lớn. Hoa mọc đơn ở nách lá, lưỡng tính,
hoa mẫu 5. Lá đài có lông mềm hoặc lông ráp. Cánh hoa không lông hay chỉ có
lông ở mặt ngoài. Nhị nhiều, có khoảng 25 nhị. Bao phấn có lông ngắn hoặc dài
và có mũi nhọn. Bầu trên, không lông hoặc có lông mềm; noãn nhiều. Quả khô
không tự mở; hạt nhiều, nhỏ (Hình 1.1) [40].
1.2. Tình hình nghiên cứu về chi Dương đồng (Adinandra)
Ở Việt Nam hiện nay chưa có công bố nào về các loài thuộc chi Adinandra.
Trên thế giới, đặc biệt là Trung Quốc các nghiên cứu về chi Adinandra thường tập
trung ở loài Andinandra nitida. Loài A. nitida là cây thuộc vùng nam Trung Quốc,
lá cây được sử dụng lâu năm làm chè uống (Shiyacha) và thuốc dược liệu tốt cho
sức khỏe. Loài A. nitida có nhiều tác dụng điều trị như kháng khuẩn, giảm đau,
giảm huyết áp. Ở Trung Quốc, loài A. nitida còn được sử dụng trong nhiều công
thức bào chế, thang thuốc để điều trị ung thư, chống oxy hóa. Các nghiên cứu về
chi Adinandra tập trung vào 02 hướng: (1) Nghiên cứu về thành phần hóa học, (2)
Nghiên cứu về hoạt tính sinh học.
1.2.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học
Lá của cây A. nitida được sử dụng lâu năm làm chè uống và thuốc dược liệu
tốt cho sức khỏe, tuy nhiên chưa có nhiều các nghiên cứu khoa học về thành phần
hóa học và hoạt tính sinh học của loài A. nitida. Các nghiên cứu cho thấy thành
phần hóa học của loài A. nitida được phát hiện thuộc nhóm là flavonoid, flavonoid
glycoside và triterpene saponin [29], [30], [35], [37].
Năm 2003, Wang và cộng sự đã công bố phân lập được 6 hợp chất apigenin
(1), camellianin A (2), quercitrin (3), kajiichigoside F1 (4), nigaichigoside F2 (5),
và peduncloside (6) trên tạp chí Trung Quốc (Hình 1.2) [35].
Năm 2008, Liu và cộng sự đã phân lập được flavonoid thuộc loại
camellianin A từ lá của loài A. nitida Merr. ex Li bằng phương pháp HPLC và
chứng minh được khả năng chống oxy hóa cao từ dịch chiết flavonoid bằng
phương pháp làm sạch DPPH và các gốc tự do [28]. Cùng hướng nghiên cứu này,

5
Liu và cộng sự (2013) đã phân lập, tối ưu hóa phương pháp tách chiết flavonoid và
thu được camellianin A từ lá của loài A. nitida; đồng thời chứng minh được khả
năng chống oxy hóa của flavonoid ở nồng độ 0,02 mg/ml [27]. Như vậy, một số
nghiên cứu đã chỉ ra flavonoid như epicatechin, apigenin, quercitrin, camellianin
A và camellianin B có hoạt tính sinh học và có khả năng chống oxy hóa.

Apigenin (1) Camellianin A (2)

Quercitrin (3) Kajiichigoside F1 (4)

Nigaichigoside F2 (5) Peduncloside (6)

Hình 1.2. Các hợp chất flavonoid và triterpene saponins từ A. nitida
Bằng một số phương pháp sắc ký cột, thành phần hóa học của loài A. nitida đã
được Wang và cộng sự (2008) phân lập và xác định được cấu trúc của các hợp chất
saponin gồm 6 loại lần lượt là 2alpha, 3alpha, 19alpha-trihydroxy-olean-12 en-28-oic
acid-28-O-beta-D-glucopyranoside; arjunetin (7); sericoside (8); glucosyl tormentate
(9); nigaichigoside F1 (10) và arjunglucoside I (11). Trong đó chất 2alpha, 3alpha,

6
19alpha-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid-28-O-beta-D glucopyranoside là hợp
chất mới; các chất còn lại là chất lần đầu tiên được phát hiện trong loài A. nitida [36].

Arjunetin (7) Sericoside (8)

Nigaichigoside F1 (9) Glucosyl torenzymetate (10)

Arjunglucoside I (11)
Hình 1.3. Các hợp chất triterpene saponins từ A. nitida
Bên cạnh các nghiên cứu của Wang về thành phần hóa học, một số nhóm
nghiên cứu ở Trung Quốc như Liu B và cộng sự (2010), Zhang J và cộng sự
(2006) lại tập trung vào phân tích thành phần flavonoid, thành phần chiếm hàm
lượng lớn (> 20%) có trong lá A. nitida với camellianin A là thành phần chính
[30], [37]. Theo nghiên cứu của Liu B và cộng sự (2010) , hàm lượng camellianin
A, camellianin B và phần aglycon apigenin trong dịch chiết EtOH chiếm tỉ lệ
41,98; 2,67 và 1,73% tương ứng [30]. Hàm lượng flavonoid chiếm hơn 45% trong
dịch chiết EtOH.

7
 Sử dụng sắc ký lỏng 2 chiều (2D-LC) kết hợp phổ khối để phân tích thành
phần hóa học đã có hơn 57 chất đã được phát hiện trong dịch chiết MeOH lá A.
nitida, trong đó 5 hợp chất epicatechin (12), camellianin A (2), rhoifolin (13),
camellianin B (14) và apigenin (1) được phát hiện dựa trên thời gian lưu, khối
lượng phân tử và phổ MS/MS (Hình 1.4) [37].

Camellianin A (2) Rhoifolin (13)

Camellianin B (14) Epicatechin (12)

Hình 1.4. Các hợp chất flavonoid từ A. nitida
Một nghiên cứu khác từ Liu năm 2008 về phân tích thành phần hóa học bằng
phương pháp GCMS của dịch chiết siêu tới hạn CO2 lá của cây A. nitida và phát
hiện được 16 hợp chất với γ-sitosterol là thành phần chính (47,56%). Một số hợp
chất khác 3, 7, 11, 15-tetramethyl -2-hexadecen-1-ol, nonacosane, 9, 12-
octadecadienal, vitamin E, γ-tocopherol, stigmasterol được phát hiện với hàm
lượng từ 2,16-16,98%. Tuy nhiên dịch chiết MeOH thì tương tự như các nghiên
cứu khác, chủ yếu chứa các flavonoid như camellianin A (2), camellianin B (14)
và aglycon apigenin (1) [29].
1.2.2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học
Loài A. nitida đã được nghiên cứu các tác dụng sinh học khác nhau như
chống oxy hóa, ức chế enzyme chuyển (ACE giảm huyết áp) và chống ung thư
[24], [25], [29], [30].

8
 Năm 2010, Liu và cộng sự đã thử tác dụng chống oxy hóa, tác dụng ức chế
enzyme chuyển của dịch chiết EtOH, hợp chất chính camellianin A, camellianin B
và apigenin. Trong tác dụng chống oxy, kết quả cho thấy IC50 của dịch chiết
EtOH, camellianin A, camellianin B và apigenin tương ứng là 14,74 μg/ml, 1,62
mg/ml, 1,8 mg/ml, và 0,95 mg/ml. Tác dụng chống oxy hóa của các hợp chất
flavonoid kém hơn nhiều so với dịch chiết EtOH trong phép thử DPPH và
Rancimat (khoảng 100 lần). Kết quả cho thấy tác dụng chống oxy hóa của lá cây
A. nitida có thể phụ thuộc vào các thành phần hóa học khác [30].
Về tác dụng giảm huyết áp, ức chế enzyme chuyển (angiotensin converting
enzyme ACE) các hợp chất flavonoid camellianin A, camellianin B và apigenin có
tác dụng tốt hơn dịch chiết EtOH. Ở nồng 500 μg/ml, tác dụng ức chế enzyme
chuyển của dịch chiết EtOH, hợp chất camellianin A, camellianin B và apigenin
tương ứng là 29,7; 30,16; 40,68 và 30,27%. Hoạt tính ức chế enzyme chuyển của
dịch chiết EtOH có lẽ phụ thuộc nhiều vào các hợp chất flavonoid [30].
Do lá cây A. nitida được sử dụng để làm chè uống với tác dụng chống ung thư,
hợp chất chính camellianin A (hàm lượng được xác định chiếm 19,25% bằng HPLC
được thử nghiệm hoạt tính chống ung thư trên dòng tế bào ung thư Hep-G2 và ung
thư vú MCF-7. Ở nồng độ 200 μM, camellianin A ức chế 33,8% và 8,7% tế bào ung
thư MCF-7 và Hep-G2. Có thể thấy tác dụng độc tế bào của camellianin A là khá
yếu. Tuy nhiên, trong nghiên cứu chu trình tế bào, camellianin A làm tăng mật độ tế
bào ở giai đoạn G0/G1. Việc tăng mật độ các tế bào HepG-2 và MCF-7 trong giai
đoạn đầu của quá trình chết tế bào được phát hiện. Như vậy, camellianin A không
chỉ ảnh hưởng đến quá trình nhân lên của tế bào ung thư mà còn thúc đẩy các tế bào
đi vào chu trình chết tế bào (apoptosis) [25].
Nghiên cứu của Chen Y và cộng sự (2015) khi so sánh thành phần phenolic
của 4 loài thuộc chi Adinandra ở Trung Quốc là A. nitida, A. glischroloma var.
jubata, A. millettii và A. latifolia về tác dụng chống oxy hóa và so sánh chống ung
thư của 4 loài này trên các dòng ung thư HepG-2 và MCF-7 [24].
Hàm lượng các hợp chất phenolic trong A. nitida cao nhất là 140,54±1,04
mg/g, tiếp đến loài A. millettii (125,96±3,19 mg/g), loài A. glischroloma var.

9
jubata (84,14±2,97 mg/g). Loài A. latifolia có hàm lượng phenolic ít nhất (71,29 ±
2,69 mg/g). Tương tự, thành phần flavonoid có trong loài A. nitida là cao nhất
88,72±2,13 mg/g, tiếp đến là loài A. glischroloma var. jubata (44,74±1,79 mg/g)
và loài A. millettii (43,54±1,48 mg/g). Loài A. latifolia có hàm lượng flavonoid ít
nhất (19,13 ± 0,54 mg/g). Do vậy, trong 4 loài thuộc chi Adinandra nghiên cứu,
tác dụng chống oxy hóa và chống ung thư của loài A. nitida và A. millettii có tác
dụng tốt hơn so với loài A. jubata và A. latifolia. Điều này có thể được giải thích
là phù hợp với hàm lượng các hợp chất phenolic có trong các loài này. Dịch chiết
của các loài Adinandra có các hợp chất phenolic tự do có khả năng ức chế quá
trình nhân lên của tế bào ung thư. Các dịch chiết có thể ức chế với EC50 từ 1,05-
6,44 mg/ml trên tế bào ung thư gan Hep-G2 và EC50 từ 2,26-8,02 mg/ml trên tế
bào ung thư gan MCF-7 (Bảng 1.2).
Thành phần hợp chất flavonoid của loài A. nitida có chứa camellianin A,
camellianin B, apigenin, quercitrin trong khi thành phần flavonoid của loài
A. milettii chưa được phát hiện [24].
Bảng 1.2. Tác dụng chống ung thư của dịch chiết các hợp chất phenolic tự do
trên 2 dòng tế bào Hep-G2 và MCF-7
Loài EC50 (mg/ml)
Hep G2 MCF-7
A. nitida 1,49 ± 0,023 2,26 ± 0,19
A. millettii 1,05 ± 0,089 2,43 ± 0,23
A. jubata 1,85 ± 0,056 8,02 ± 0,32
A. latifolia 6,44 ± 0,46 4,01 ± 0,12

Như vậy, tác dụng sinh học và thành phần hóa học của các loài thuộc chi
Adinandra còn chưa rõ ràng, chưa được nghiên cứu sâu. Việc tiến hành nghiên
cứu về các loài thuộc chi này là rất cần thiết nhằm hiểu biết thêm về thành phần
hóa học cũng như hoạt tính sinh học. Dựa trên phương pháp hoạt tính dẫn đường,
kết hợp với phương pháp sắc kí phổ hiện đại, các hợp chất mới có tác dụng chống
ung thư trong chi Adinandra sẽ được phát hiện.

10
1.3. Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại thực vật
Theo phương pháp truyền thống, việc phân loại hay giám định sinh vật chủ
yếu dựa trên chỉ thị về hình thái hoặc các đặc tính sinh lý, sinh hóa bên trong nhờ
vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn. Phương pháp phân loại truyền thống này
trong nhiều trường hợp còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế như là nhiều sinh vật
có hình thái rất giống nhau nhưng thực tế lại rất khác nhau trong hệ thống phân
loại (hệ gen rất khác nhau). Ngược lại nhiều sinh vật có hình thái rất khác nhau
nhưng lại rất gần nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất giống nhau). Mặt khác,
phương pháp phân loại truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái rất khó phân
biệt được sự khác biệt giữa các biến dị dưới loài. Đặc biệt, đối với những mẫu vật
có nguồn gốc sinh vật đã bị biến đổi về hình thái như là những mẫu sinh vật đã
chết, bị chôn vùi dưới đất, ở các công trình xây dựng, đã qua chế biến thì không
thể xác định được bằng chỉ thị hình thái. Gần đây, nhờ vào sự phát triển của khoa
học công nghệ nói chung và các kỹ thuật sinh học phân tử nói riêng đã cho phép
các nhà nghiên cứu nhanh chóng xác định được sự khác biệt về vật chất di truyền
giữa các loài sinh vật, thậm chí giữa các cá thể sinh vật trong cùng loài. Từ đó có
thể định danh được sinh vật và xác định được mối quan hệ di truyền giữa các cá
thể, quần thể hay xuất xứ. Việc kết hợp giữa chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử
DNA sẽ nhanh chóng xác định được sự khác biệt giữa sinh vật này với sinh vật
khác một cách chính xác. Vì vậy, các kỹ thuật sinh học phân tử được xem là công
cụ hỗ trợ có hiệu quả cho việc phân tích di truyền ở các loài sinh vật. Trong đó,
mã vạch DNA được xem như là một công cụ để giám định sinh vật và xác định
mối quan hệ di truyền giữa các loài [38].
Mã vạch DNA là kỹ thuật sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong hệ gen
của sinh vật như một chuỗi kí tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau.
Vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) được phát hiện đầu tiên trên
cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) khi giải trình tự vùng gen matK mã hóa cho
tRNALys (UUU) của lục lạp. Nó gồm 1 đoạn ORF chứa 509 nucleotit nằm trong
intron của gen trnK và chưa rõ chức năng. Các nghiên cứu sử dụng trình tự gen

11
matK để xây dựng cây phát sinh loài cho thấy gen matK có tính đa dạng hơn
những gen khác có trong lục lạp. Do vậy gen matK trở thành gen chỉ thị quan
trọng để giúp phân loại thực vật [33].
Nhận thấy vai trò, ý nghĩa và sự cần thiết của việc xây dựng ngân hàng mã
vạch DNA, ở Việt Nam các nhà khoa học cũng như các nhà quản lý đã bước đầu
tiếp cận và quan tâm đến hướng nghiên cứu này, nhằm hướng tới xây dựng một
ngân hàng dữ liệu mã vạch DNA quốc gia cho các loài sinh vật (động vật, thực
vật, vi sinh vật,...) phục vụ phân loại, giám định, chẩn đoán bệnh, bảo tồn và quản
lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật ở nước ta.
Năm 2003, Paul Hebert đưa ra khái niệm đầu tiên về mã vạch DNA nhằm
giúp nhận diện các mẫu vật. Mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm
trong hệ gen của sinh vật như một chuỗi kí tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh
vật với nhau [26].
Ở Việt Nam, nghiên cứu về mã vạch DNA được triển khai ở một số cơ sở
nghiên cứu. Tuy nhiên, các nghiên cứu này còn nhỏ lẻ, tập trung trên một số đối
tượng sinh vật, chưa có tính hệ thống, đồng bộ nên chưa thể xây dựng được cơ sở
dữ liệu về mã vạch DNA. Vũ Thị Thu Hiền và Đinh Thị Phòng (2011) đã sử dụng
kỹ thuật DNA vào việc đánh giá mối quan hệ di truyền tập đoàn cây gỗ trắc đỏ
(Dalbergia cochinchinensis) ở Việt Nam đang có nguy cơ tuyệt chủng. Kết quả
nghiên cứu đã cho thấy, trong số 51 chỉ thị phân tử (28 chỉ thị RAPD và 23 chỉ thị
ISSR) phân tích cho 35 mẫu D. cochinchinensis thì có 31/51 chỉ thị (12/28 RAPD
và 19/23 ISSR) cho tính đa hình. Tổng số có 163 phân đoạn DNA được nhân bản
thì có 99 phân đoạn đa hình (chiếm 60,74%), số lượng các phân đoạn nhân bản
dao động từ 1 đến 8 với kích thước nhân bản trong khoảng 250 bp đến 2000 bp.
Mối quan hệ di truyền của 35 mẫu D. cochinchinensis được thể hiện trên sơ đồ
hình cây, đã phân ra làm 02 nhánh và có hệ số sai khác di truyền dao động trong
khoảng 5,1% (1-0,949) đến 29,3% (1-0,707). Nhánh chính I duy nhất là mẫu DC9
với hệ số sai khác di truyền với các mẫu còn lại khoảng 29,3% (1-0,707). Nhánh
chính II bao gồm 34 mẫu còn lại và có hệ số sai khác di truyền dao động trong
khoảng từ 5,1% (1-0,949) đến 26,0% (1-0,740) [7].

12
 Năm 2013, Trần Thu Hoa và cộng sự đã tiến hành “khảo sát đặc tính dược
liệu và bước đầu định danh bằng trình tự gen ITS và matK cho một mẫu Ngải mới
tìm thấy ở vùng núi Cấm - An Giang” nhằm hướng đến ứng dụng trong việc điều
chế các thuốc chữa bệnh, nhóm nghiên cứu đã thu thập được hơn 20 mẫu cây họ
Gừng có tên bắt đầu bằng chữ “Ngải” tại vùng núi Cấm. Đặc điểm chung của các
mẫu này là hình thái của chúng khá giống nhau. Trong đó, loài “Ngải sậy củ lớn”
(tên phổ thông thường gọi ở vùng núi Cấm, Tịnh Biên, An Giang) đã được chứng
minh là cây thuốc có tiềm năng trị ung thư. Nhóm nghiên cứu đã xây dựng cây
phát sinh loài [8].
Hà Văn Huân (2014) đã lựa chọn gen matK để làm mã vạch phục vụ cho các
nghiên cứu về đa dạng di truyền, phân loại và giám định loài góp phần nâng cao
hiệu quả bảo tồn nguồn gen và phát triển loài Sến mật ở Việt Nam. Trên cơ sở các
thông tin của gen matK đã công bố, một cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế để
nhân dòng gen matK từ DNA tổng số của 3 mẫu Sến mật trồng tại Thanh Hóa (S1,
S2 và S3). Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng: Trình tự nucleotit của gen matK
phân lập từ mẫu S1, S2 và S3 dài 1521 nucleotit, trong đó, trình tự nucleotit của
gen matK ở mẫu S1 và S3 giống nhau 100%, trình tự nucleotit của mẫu S2 có sai
khác với hai mẫu S1 và S3 duy nhất 1 nucleotit ở vị trí 877 (C được thay thế bằng
G). Trình tự nucleotit của gen matK phân lập từ mẫu S1, S2 và S3 (được ký hiệu
là Senthanhh) có sự tương đồng đến 98,43% so với trình tự nucleotit của gen
matK ở cây Sến lá to (Madhuca macrophyll) đã công bố trên GenBank (mã số:
DQ924091.1). “Senthanhh” có thể được sử dụng là cơ sở dữ liệu quan trọng phục
vụ cho các nghiên cứu về đa dạng di truyền, phân loại và giám định loài góp phần
nâng cao hiệu quả bảo tồn nguồn gen và phát triển loài Sến mật ở Việt Nam [10].
Năm 2015, Hà Văn Huân và cộng sự đã tiến hành “ Xác định đoạn mã vạch
DNA cho Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis) loài cây đặc hữu của
Việt Nam”. Nghiên cứu đã nhân bản thành công đoạn gen matK từ nguồn DNA
tổng số của loài Trà hoa vàng bằng kỹ thuật PCR. Đã xác định được trình tự
nucleotide của đoạn gen matK của các mẫu sản phẩm PCR có kích thước 951 bp.
So sánh cho thấy không có sự khác biệt về trình tự nucleotide của đoạn gen matK
ở các lần lặp lại và các mẫu trong cùng một loài. Kết quả so sánh cho thấy trình tự
nucleotide của đoạn gen matK ở cây Trà hoa vàng Tam Đảo so với ở cây Trà vàng

13
lá dày chỉ sai khác 1 nucleotide (thay A bằng G) ở vị trí 508, so với ở loài Trà
vàng petêlô thì có 1 nucleotide sai khác (thay C bằng A) ở vị trí 613. Trình tự
đoạn gen matK phân lập được có thể là một trong các chỉ thị dùng để phân loại các
loài Trà hoa vàng của Việt Nam [11].
Lê Thanh Hương và cộng sự (2017) đã nghiên cứu “ Ứng dụng mã vạch DNA
hỗ trợ định loại loài một số mẫu sâm thuộc chi nhân sâm (Panax L.)”. Trong nghiên
cứu này, 5 mã vạch phân tử tiềm năng là 18S, ITS, matK, psbA - trnH và rbcL được
sử dụng để đánh giá khả năng phân biệt loài của 11 mẫu sâm nghiên cứu. Phân tích
so sánh các trình tự nhận được với 41 trình tự của 9 loài thuộc chi Nhân sâm (Panax
L.) đã được công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế cho thấy vùng 18S có độ tương
đồng giữa các cặp trình tự cao nhất, trình tự của các loài tương đồng trung bình đạt
99,87 %. Tiếp đến là vùng rbcL, matK và psbA - trnH với tỷ lệ tương đồng trung
bình lần lượt là 99,27 %, 98,66 % và 96,82 %. Mức độ đa hình thể hiện rõ trên vùng
ITS với tỷ lệ tương đồng trung bình thấp nhất, chỉ đạt 96,50 %. Các biểu đồ hình
cây về mối quan hệ phát sinh loài cho thấy có 4 trong 11 mẫu sâm là Sâm Ngọc
Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) và 3 mẫu là Tam thất hoang (Panax
stipuleanatus). Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy 4 mẫu có hình thái của Sâm Vũ
diệp (Panax bipinnatifidus) được nhận dạng phân tử là loài Tam thất hoang. Ngoài
ra nghiên cứu cũng cho thấy, chỉ thị ITS và psbA - trnH là hai chỉ thị tiềm năng, hỗ
trợ định danh Sâm Ngọc Linh và Tam thất hoang [12].
Các nghiên cứu trên đã tạo tiền đề quan trọng cho hướng nghiên cứu ứng
dụng chỉ thị phân tử vào việc phân loại, giám định, đánh giá đa dạng di truyền,
bảo tồn và quản lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật ở nước ta.
1.4. Các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của các loài cây thuốc
Năm 1992, Nakatomi và cộng sự đã nghiên cứu về các hợp chất alkaloid có mùi
hăng của cây Cúc áo. Nghiên cứu nhận thấy cặn chiết từ cây Cúc áo có khả năng ức
chế được nhiều loại vi sinh vật: Staphylococcus albus, Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Salmonella gallinarum, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris và
nấm enzyme Candida albicans [31]. Năm 2006, Mai Sỹ Tuấn và cộng sự đã nuôi cấy
in vitro thành công được cây Cúc áo. Bước đầu công bố khả năng kháng tế bào ung thư

14
biểu mô vòm họng, tế bào ung thư vú ở người và kháng vi sinh vật kiểm định của cặn
chiết thô từ chồi cây Cúc áo nuôi trên môi trường thạch [22].
Võ Thị Mai Hương và Trần Thanh Phong (2013) đã nghiên cứu dịch chiết
của quả Nhàu (Morinda citrifolia L.) đều có khả năng kháng với 4 loại vi sinh vật
kiểm định gồm S. aureus, Salmonella typhi, E. coli và Bacillus pumilus. Trong đó,
loài S. aureu là chủng nhạy cảm nhất với dịch chiết [13]. Năm 2015, Bùi Thị Lê
Minh và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của tỏi (Allium sativum L.)
trên vi khuẩn E. coli và ảnh hưởng của tỏi lên sự sinh trưởng của gà được bổ sung
tỏi tươi vào khẩu phần thức ăn tại Đại học Cần Thơ. Kết quả nghiên cứu cho thấy
các khuẩn E.coli nhạy cảm với dịch chiết tỏi tươi với giá trị MIC 12,5-35 µg/ml;
sự tăng trọng và hệ số chuyển hóa thức ăn ở các khẩu phần ăn có bổ sung thêm tỏi
và không bổ sung thêm là khác nhau, việc bổ sung thêm tỏi tươi vào khẩu phần
thức ăn của gà phòng được bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E.coli gây ra [18].
Năm 2017, Bùi Kim Anh và cộng sự bước đầu nghiên cứu thành phần hóa
học và hoạt tính sinh học của Củ ngải đen. Từ dịch chiết methanol của thân rễ ngải
đen (Kaempferia parviflora) nhóm nghiên cứu đã phân lập được 6 hợp chất
tectochrysin (1), apigenin 7,4'-dimethyl ether (2) 3,5,7-trimethoxyflavon (3), 5,7-
dimethoxyflavon (4), β-sitosterol (5) và daucosterol (6). Cấu trúc của các hợp chất
được xác định bằng việc phân tích các dữ liệu phổ và so sánh với số liệu đã công
bố. Cặn chiết MeOH và hợp chất 4 thể hiện hoạt tính độc tế bào ở dòng ung thư
biểu mô-KB với giá trị IC50 lần lượt là 55,21 và 14,95 μg/ml [1].
Nguyễn Thị Hồng Anh và cộng sự (2017) đã phân lập các hợp chất phenolic từ
cặn ethyl acetate của cây Tỏa dương. Từ cặn ethyl acetate của cây Tỏa dương, 4
hợp chất đã được phân lập bao gồm epoxyconiferyl alcohol (1), salicifoliol (2),
5-(hydroxymethyl)-2-furaldehyd (3) và ethyl caffeat (4). Cấu trúc của các hợp chất
này được xác định bằng các phương pháp phổ như 1D - NMR, ESI - MS và so
sánh với các dữ liệu đã công bố. Các hợp chất này đều được phân lập lần đầu tiên
từ cây Tỏa dương. Hợp chất 1, 2 và 3 được công bố lần đầu tiên từ
chi Balanophora [2].

15
 Lê Việt Dũng và cộng sự nghiên cứu thành phần hóa học của phần trên mặt
đất cây Lấu thu hái tại Việt Nam vào năm 2017. Kết quả nghiên cứu cho thấy từ
dịch chiết ethanol 96% phần trên mặt đất của cây Lấu (Psychotria asiatica L.) đã
phân lập được 5 hợp chất β-sitosterol (1), 2 - [(N - benzoylphenylalanyl) - amino]
- 3 - phenylpropyl benzoat (2), asperglaucid (3), daucosterol (4) và catechin (5).
Cấu trúc các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ NMR, MS,
kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo. Trong đó, hai hợp chất (2) và (5) lần đầu
tiên được phân lập từ cây Lấu [6].
1.5. Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro
Với sự phát triển của khoa học công nghệ, hiện nay trên thế giới đã phát triển
nhiều phương pháp thử các hoạt tính sinh học in vitro có thời gian thực hiện ngắn
nhưng cho kết quả chính xác cao. Có thể phân loại các phương pháp này bằng kỹ
thuật đưa chất thử vào hệ thử [23].
Phương pháp dùng khoanh giấy trên môi trường đặc: Nguyên tắc của
phương pháp là xác định khả năng của chất nghiên cứu được tẩm vào khoanh giấy,
khuếch tán vào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh ống
trụ đựng chất. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh (Hình 1.5A).
Phương pháp đục lỗ thạch trên môi trường đặc: Nguyên tắc của phương
pháp là xác định khả năng của chất nghiên cứu được cho vào giếng thạch, khuếch
tán vào lớp thạch ức chế sự phát triển của vi khuẩn trên bề mặt thạch. Vùng ức chế
càng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh.
Phương pháp dùng ống trụ trên môi trường đặc: Nguyên tắc của phương
pháp là xác định khả năng của chất nghiên cứu được cho vào ống trụ, khuếch tán
vào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh ống trụ. Vùng
ức chế càng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh (Hình 1.5B).
Phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng: Nguyên tắc của phương
pháp là dùng hàng loạt ống nghiệm chứa môi trường lỏng, có chất dinh dưỡng
thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn định nghiên cứu. Thêm những nồng độ
khác nhau của chất nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn vào các ống. Xác định nồng

16
độ thấp nhất của chất nghiên cứu ức chế được sự phát triển của vi khuẩn. Nồng độ
này được gọi là nồng độ tối thiểu ức chế (MIC: minimal inhibitory concentration).
Phương pháp này còn được gọi là phương pháp hòa loãng 2 lần liên tiếp hoặc
phương pháp hệ nồng độ (Hình 1.5C).

A B

C D
Hình 1.5. Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro
(A) Phương pháp dùng khoanh giấy trên môi trường đặc; (B) Phương pháp
dùng ống trụ trên môi trường đặc; (C) Phương pháp hệ nồng độ trong môi trường
lỏng; (D) Phương pháp vi định lượng trong môi trường lỏng
Phương pháp vi định lượng trong vi môi trường lỏng: Nguyên tắc của
phương pháp này chủ yếu cũng như phương pháp hòa loãng 2 lần liên tiếp, nhưng
phải có dàn máy ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay: thử nghiệm miễn
dịch gắn enzyme), nên hiện đại hơn, nhạy hơn, nhanh hơn, tự động, tiết kiệm và
có tính định lượng cao hơn so với phương pháp hệ nồng độ thông thường ở chỗ:
(1) Kỹ thuật thông thường chỉ dùng một hoặc vài ba dãy thí nghiệm, trong khi ở
đây dùng 8 dãy thí nghiệm; (2) Kỹ thuật thông thường dùng 6-8 độ pha loãng khác
nhau của chất thử còn ở đây có thể dùng đến 11 độ pha loãng; (3) Kỹ thuật thông

17
thường đọc kết quả bằng mắt thường (có thể cho thêm chỉ thị TTC(Triphenyl
tetrazolium Chloride)), nhưng ở đây được xác định bằng cách đo mật độ quang
học ở bước sóng 492 nm của dàn máy ELISA (Hình 1.5D).
Phương pháp sinh tự ký (Bioautography): Phương pháp này sử dụng khi
đã xác định được dịch chiết toàn phần của một dược liệu nghiên cứu có tác dụng
kháng khuẩn trên một loại vi khuẩn nào đó và muốn xác định xem thành phần nào
trong dược liệu này có tác dụng. Nguyên tắc tương tự như các phương pháp sử
dụng môi trường đặc, sau khi chạy sắc ký dịch chiết tổng có hoạt tính trên bản
mỏng, tiến hành láng môi trường thạch đặc có chứa vi khuẩn nghiên cứu, ủ 18-24h
để xác định vùng vết chất làm vi khuẩn không mọc được; đó là chất có tác dụng
kháng khuẩn. Để phát hiện vi khuẩn mọc được dễ dàng nên dùng chỉ thị màu TTC
(Hình 1.6).

Hình 1.6. Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro sinh tự ký
1.6. Vai trò của polyphenol, coumarin, dẫn xuất của flavon và flavonol

Vai trò của polyphenol: (1) Các polyphenol là một chất vận chuyển điện tử
trong quá trình hô hấp. (2) Là chất điều khiển, chất đặc trưng cho mỗi loài về màu sắc,
mùi vị. (3) Polyphenol có vai trò như những kháng thể chống lại tác nhân gây bệnh. (4)
Nhiều polyphenol có hoạt tính của vitamin PP có tác dụng làm bền thành mạch, hạn
chế các hiện tượng chảy máu dưới da. (5) Polyphenol là chất chống oxy hóa. (6)
Polyphenol có khả năng chống ung thư, bảo vệ hệ tim mạch, chống lão hóa [4].
Vai trò của dẫn xuất của flavon và flavonol: Flavonol đã được chứng minh
là có một số các hoạt tính sinh học và dược lý như: chống dị ứng, chống viêm,

18
chống oxy hóa, chống vi khuẩn (kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus), chống
ưng thư, hoạt tính chống tiêu chảy, ức chế enzyme topoisomerase gây đột biến
DNA trong bạch cầu.
(1) Tác dụng chống oxy hóa: Dẫn xuất của flavon và flavonol sinh ra các gốc
tự do bền vững hơn các gốc tự do được hình thành trong quá trình bệnh lý (viêm
nhiễm, ung thư, lão hóa …). Các gốc tự do tạo bởi flavon và flavonol phản ứng
với các gốc tự do hoạt động và trung hòa chúng nên không tham gia vào dây
chuyền phản ứng oxy hóa tiếp theo.
(2) Tác dụng đối với enzyme: (i) Làm tăng hoạt tính của proline hydroxylase
là một enzyme quan trọng trong quá trình làm lành vết thương và tạo sẹo. (ii) Kìm
hãm các enzyme lypoxygenase và enzyme tổng hợp prostaglandin, chất chuyển
acid béo không no về các dạng dẫn xuất chứa oxy.
Nhờ các tác dụng sinh học đối với enzyme mà các dẫn xuất của flavon và
flavonol có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, mau chóng làm lành
vết thương, giảm các nguy cơ về tim mạch,…
(3) Tác dụng kháng sinh, chống viêm nhiễm: Hầu hết các flavon và flavonol
đều có tác dụng chống viêm nhiễm và kháng khuẩn bằng cách kìm hãm sự hô hấp
hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucose. Trong các dòng tế bào người,
Herpesvirus hominis bị kìm hãm bởi quercetin - một flavonol, khi thêm quercetin
vào virus gây bệnh ở người, virus sẽ bị kìm hãm nếu có vỏ bọc và chết nếu không
có vỏ bọc bảo vệ.
(4) Tác dụng đối với các bệnh tim mạch: Rối loạn tim mạch có thể bị ảnh
hưởng bởi chế độ ăn uống thực phẩm có chức của dẫn xuất flavon và flavonol.
Nghiên cứu về bệnh tim mạch đã cho thấy cơ chế tác dụng sau đây của dẫn xuất
flavon và flavonol: ức chế đông máu, giảm nguy cơ xơ vữa động mạch, giảm
huyết áp động mạch và giảm stress oxy hóa và đường dẫn hiệu có liên quan trong
tế bào mạch máu sửa đổi cơ chế viêm mạch máu.
(5) Tác dụng đối với ung thư: Trong các hướng nghiên cứu nhằm tìm ra các
hoạt chất chống ung thư, flavonoid là một trong những hợp chất được quan tâm

19
đặc biệt là flavon và flavonol bởi chúng là những chất có hoạt tính chống oxy hóa
cao, tác dụng đến nhiều hệ enzyme và ít độc đối với cơ thể sống. Các kết quả thực
nghiệm cho thấy một số flavon có tác dụng chống ung thư thông qua khả năng
hoạt hóa các enzyme trong gan có nhiệm vụ chuyển hóa các chất gây ung thư
thành những sản phẩm có tính gây ung thư thấp hơn. Lượng flavon và flavonol
chế độ ăn uống có liên quan với giảm nguy cơ ung thư dạ dày ở phụ nữ và giảm
nguy cơ ung thư đường tiêu ở người hút thuốc.
(6) Tác dụng kháng khuẩn: Dẫn xuất flavon và flavonol đã được chứng minh
là có tác động trực tiếp kháng khuẩn, khả năng kết hợp với các thuốc kháng sinh
và có khả năng ngăn chặn các yếu tố độc tính của vi khuẩn trong nhiều thí nghiệm
in vitro [15].
Vai trò của coumarin: (1) Chống co thắt, làm giãn động mạch vành với cơ
chế tương tự như papaverin. (2) Chống đông máu, làm bền và bảo vệ thành mạch.
(4) Chữa bệnh lang trắng, bệnh vảy nến. Tính chất này chỉ có ở những dẫn chất
furanocoumarin như psoralen, angelicin, xanthotoxin, imperatorin. (5) Nhiều dẫn
chất coumarin có tác dụng kháng khuẩn, đặc biệt nhất là novobiocin một chất
kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng có trong nấm Streptomyces niveus. (6) Một
số coumarin có tác dụng chống ung thư.

20
 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Mẫu Adinandra lienii sử dụng trong nghiên cứu được thu tại tỉnh Lào Cai,
Việt Nam.
Các loài vi khuẩn kiểm định: Bacillus subtilis, Serratia macescens,
Escherichia coli, Sarcina lutea, Lactobacillus plantanum, Staphynococcus aureus
do Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên cung cấp để nghiên cứu
hoạt tính kháng khuẩn bởi dịch chiết từ loài A. lienii.
2.1.2. Hóa chất, thiết bị
Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết và được cung cấp
bởi các hãng khác nhau được liệt kê ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm
Hóa chất Hãng sản xuất
Acrylamide, chloroform, isoamyl alcohol, EDTA Invitrogen
Mồi, Đệm, Taq DNA polymelase Invitrogen
Ethidium bromide Trung Quốc
Thang DNA Thụy Sỹ
Cao nấm enzyme, pepton mua Sigma
Thuốc thử DMSO, Javen, axit axetic, xanh metylen, Trung Quốc
carmine, Ethanol 70%, Diclomethan, Ethyl acetat
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn kiểm định: Môi trường LB có thành phần gồm
cao nấm enzyme 0,5%; NaCl 1,0%; pepton 1,0%. Môi trường LB đặc bổ sung
2,0% thạch agar..
Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm đều mới, hiện đại và có độ chính xác cao
thuộc các phòng thí nghiệm Hóa sinh, Vi sinh, Thực vật học và Công nghệ gen
thuộc Khoa Sinh học, phòng Hóa Hữu cơ thuộc khoa Hóa học, Trường Đại học Sư
phạm - Đại học Thái Nguyên (Bảng 2.2).

21
 Bảng 2.2. Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
Thiết bị Hãng sản xuất
Cân phân tích AB 240, Máy chuẩn pH tự động Thụy Sỹ
Máy li tâm lạnh Eppendof 524, Máy soi gel, Bể ổn nhiệt, Đức
Tủ ấm Binder, Máy PCR
Máy quang phổ UV-1800, Nồi khử trùng, Tủ lạnh Nhật Bản
Máy điện di, Máy cất nước 1, 2 lần Anh
Tủ cấy vô trùng Holten Safe Đan Mạch
Máy nuôi cấy lắc ổn nhiệt Mỹ
La men , lam kính, dao lam, pipet, ống eppendof, ống sinh Trung Quốc
hàn, phễu chiết, đĩa petri
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: Luận văn được thực hiện tại các phòng thí nghiệm Vi
sinh vật, Công nghệ gen, Thực vật học, Hóa sinh học thuộc Khoa Sinh học và
phòng Hóa hữu cơ thuộc Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư Phạm Thái Nguyên.
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3/2018 đến tháng 4/2019.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân loại hình thái
- Trước khi xác định tên khoa học của loài A. lienii, tiến hành điều tra thực
địa thu thập mẫu tiêu bản của loài này với đầy đủ các thông tin liên quan bao gồm:
Mẫu tiêu bản, ảnh màu, phân bố của loài, sinh thái.
- Xác định tên khoa học của các loài theo phương pháp hình thái so sánh sau:
+ Sử dụng các sách chuyên khảo phân loại thực vật về họ Chè (Theaceae) để
phân loại bao gồm: Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, tập 1; Tianlu
Min & Bruce Bartholomew (2015), Flora of China; Gagnepain (1908), Flore
Génera Indochina,…
2.2.2. Phương pháp giải phẫu thực vật
* Cấu tạo giải phẫu thân và lá của cây A. lienii được thực hiện theo hướng
dẫn của Hoàng Thị Sản và Nguyễn Phương Nga (2008) [19].

22
 - Các mẫu rễ, thân và lá sau khi thu về được cắt thành những lát mỏng bằng
dao lam. Các lát cắt được ngâm vào nước cất trong đĩa petri. Sau đó tiến hành
nhuộm lát cắt bằng phương pháp nhuộm kép với các bước như sau:
Bước 1: Lát cắt được ngâm vào dung dịch javen trong thời gian từ 15-30
phút để tẩy sạch nội chất của tế bào.
Bước 2: Rửa sạch lát cắt đã được ngâm trong javen bằng nước cất.
Bước 3: Tẩy sạch hết javen còn dính lại trên lát cắt bằng cách ngâm vào dung
dịch axit axetic.
Bước 4: Rửa sạch mẫu bằng nước cất (2 lần).
Bước 5: Nhuộm mẫu bằng dung dịch carmine trong khoảng 25-30 phút.
Bước 6: Rửa mẫu trong nước cất.
Bước 7: Mẫu được nhuộm trong dung dịch xanh metylen loãng khoảng 20 giây.
Bước 8: Rửa sạch mẫu bằng nước cất.
Bước 9: Nhỏ 1 giọt nước lên lam kính, đặt mẫu vật và đậy la men. Quan sát
lát cắt trên kính hiển vi ở vật kính có độ phóng đại 4-10 lần để thu kết quả.
- Phương pháp chụp ảnh: Ảnh được chụp trên kính hiển vi kết nối máy tính
sử dụng phần mềm Microscope manger tại Phòng thí nghiệm Thực vật học Khoa
Sinh học với các độ phóng đại khác nhau.
- Phương pháp mô tả, so sánh hình thái cấu tạo giải phẫu theo các tài liệu
của: Nguyễn Bá (Hình thái thực vật (tập 1) và Giải phẫu hình thái thực vật (tập 2)
[3]; Thực tập hình thái và giải phẫu thực vật của Trần Công Khánh (1981) [16];
Giải phẫu thực vật: Katheri Esau(1995) [14]; Giải phẫu và hình thái thực vật của
Kixeleva (1998) [17].
* Các chỉ tiêu nghiên cứu
- Đặc điểm hình thái ngoài: Dạng sống, kiểu thân và đặc điểm của thân, lá
(hình dạng phiến lá, chóp lá, gân lá, gốc lá, cuống lá, kích thước…); hoa (dạng
cụm hoa, vị trí cụm hoa, kích thước, lá bắc, bộ nhị, bộ nhụy…); quả và hạt (hình
dạng, màu sắc, kích thước…).
- Đặc điểm cấu tạo thân: Gồm phần vỏ sơ cấp và phần trụ giữa, xác định số
lớp tế bào, kích thước, tỷ lệ các phần, số lượng mạch/mm2, đo kích thước mạch,

23
xác định kiểu mạch. Những nhận xét về mối quan hệ giữa cấu tạo giải phẫu với
đặc điểm của môi trường sống.
- Đặc điểm cấu tạo giải phẫu của phiến lá: Cấu tạo biểu bì, số lượng lỗ khí,
kiểu lỗ khí, số lớp tế bào biểu bì. Đặc điểm mô đồng hóa: xác định số lớp tế bào
mô giậu, mô xốp, kích thước giữa các phần, tỷ lệ mô giậu/mô xốp.
2.2.3. Phương pháp sinh học phân tử
Mẫu được lựa chọn là mẫu lá bánh tẻ không bị sâu bệnh nấm mốc, lấy mẫu
từ các cây độc lập. Sau khi thu, mẫu được bảo quản trong túi nilon có chứa hạt
silicagel hút ẩm, ghi đầy đủ thông tin mẫu và được giữ ở -80°C để tách chiết DNA
phục vụ nghiên cứu.
Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá của loài A. lienii
(1) DNA tổng số được phân lập từ lá non dựa trên phương pháp của Shaghai
và đồng tác giả (1984) [32]. 0,8 g lá cây tươi mỗi giống được nghiền trong nitơ
lỏng sau đó bổ sung 6 ml đệm rửa (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0; EDTA 5 mM, pH
8,0; NaH2PO4 0,4%; sorbitol 350 mM; H2O) lắc đều và ly tâm 12.000 vòng/phút
trong 15 phút ở 4°C, loại dịch để thu cặn (lặp lại thao tác này 1 lần).
(2) Bổ sung 700µl đệm chiết (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0; EDTA 20 mM, pH
8,0; CTAB 4%; NaCl 1,4M; H20) vào mỗi ống, đảo đều và ủ 30-60 phút ở 65°C từ
5-10 phút đảo nhẹ ống 1 lần, để ở nhiệt độ phòng 5 phút và ly tâm 12.000
vòng/phút trong 15 phút ở 4°C, thu dịch sang ống mới.
(3) Bổ sung chloroform : isoamyl alcohol (24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích so
với dịch mẫu; đảo nhẹ ống 2-3 lần và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở
4°C, thu dịch pha trên sang ống mới.
(4) Bổ sung phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) với tỷ lệ 1:1 về
thể tích so với dịch mẫu; đảo nhẹ ống 2-3 lần và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15
phút ở 4°C, thu dịch pha trên sang ống mới.
(5) Tủa DNA với isopropanol tỷ lệ 1:1 về thể tích, giữ -20°C trong 2 giờ và
ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C thu tủa và rửa bằng 500µl ethanol
70%, sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C và thu tủa, để khô ở
37C. Sau đó, tủa được hòa trong 30 μl TE và 0,25 μl RNase và ủ 15 phút ở 37C.

24
 Nhân bản gen matK bằng phản ứng PCR: Gen matK được nhân bản với
cặp mồi đặc hiệu tương ứng (Bảng 2.3) bằng phản ứng PCR có thành phần như
trong bảng 2.4 và chương trình nhiệt bên dưới.

Bảng 2.3. Thông tin về cặp mồi nhân gen matK

Vùng Tên Trình tự mồi (5’  3’) Nhiệt độ Sản
gen mồi gắn mồi phẩm
dự kiến
matK P9F CGATCTATTCATTCAATATTTC 550C ~800pb
P9R TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR nhân gen matK
Thành phần Nồng độ Thể tích (µl)
2x PCR Master mix solution 10,0
Mồi xuôi 10 pmol/μl 1,0
Mồi ngược 10 pmol/ μl 1,0
DNA khuôn 50-100 ng/l 1,0
H2O khử ion vô trùng 7,0
Tổng thể tích 20,0
Chương trình phản ứng PCR: 94°C trong 3 phút; (94°C: 30 giây, 55°C: 30
giây, 72°C: 1 phút) lặp lại 40 chu kỳ; 72°C trong 5 phút; sau đó bảo quản sản
phẩm PCR ở 4°C. Nhiệt độ gắn mồi các phản ứng khác nhau phụ thuộc vào cặp
mồi sử dụng. Mỗi phản ứng PCR lặp lại 3 lần trên mỗi mẫu thí nghiệm. Kết quả
PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%, quan sát kết quả dưới đèn
cực tím (UV) và chụp ảnh. Sản phẩm PCR được tinh sạch theo hướng dẫn của kit
tinh sạch sản phẩm PCR của Norgen, Canada.
Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR được gửi đi để giải trình tự. Trình tự
nucleotide của đoạn DNA được xác định tại bằng máy giải trình tự, sử dụng bộ Kit
BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing.

25
2.2.4. Phương pháp hóa sinh
2.2.4.1. Phương pháp điều chế mẫu thử hoạt tính
Loài A. lienii sau khi thu hái về được thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy khô
ở nhiệt độ 50ºC đến khối lượng không đổi, sau đó đem nghiền nhỏ.

Hình 2.1. Sơ đồ chiết phân đoạn các hợp chất từ cây A. lienii
Mẫu nghiền được ngâm chiết 2 lần bằng ethanol trong thiết bị siêu âm ở
nhiệt độ phòng. Dịch tổng số được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ
<50ºC và thu được cặn cô ethanol. Cặn cô ethanol được chiết với các dung môi có
độ phân cực tăng dần lần lượt là ethyl axetate và dichlomethane. Sau khi cất đuổi
dung môi thu được cặn dịch dichlomethane, ethyl axetate và cặn chiết. Các cặn
dịch thu được sẽ đưa đi sấy khô ở nhiệt độ 50ºC và thu được cao sấy khô tương
ứng. Các cao chiết được cho vào bình thủy tinh, có ghi nhãn, đậy kín và bảo quản
ở nhiệt độ thường để sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo. Quy trình điều chế
mẫu được trình bày tóm tắt ở hình 2.1.

26
2.2.4.2. Định tính polyphenol
a/ Phản ứng với muối sắt (III)
- Sử dụng thuốc thử là dung dịch muối sắt (III).
- Tiến hành: Lấy 5ml dịch thử (dịch chiết bằng ethanol) cho vào 2 ống
nghiệm ký hiệu lần lượt là A và B. Cho thêm 0,5ml muối sắt (III) vào ống B và
quan sát hiện tượng. Tùy theo số lượng và vị trí nhóm hydroxyl trong phân tử
polyphenol mà cho màu lục, xanh hoặc nâu.
b/ Phản ứng với H2SO4 đặc
- Sử dụng thuốc thử là dung dịch H2SO4 đặc.
- Tiến hành: Lấy 2ml dịch thử (dịch chiết bằng ethanol) vào 2 ống nghiệm ký
hiệu lần lượt là A và B. Cho thêm 1-2 giọt H2SO4 đặc vào ống B và quan sát hiện
tượng. Khi nhỏ H2SO4 đặc lên các dẫn xuất của flavon và flavonol thì cho màu
vàng đậm; đối với chalcon và auron cho màu đỏ, đỏ thắm và đỏ tươi; flavanon cho
màu đỏ da cam do sự chuyển thành chalcon.
2.2.4.3. Định tính các flavonoid
- Sử dụng thuốc thử là dung dịch axit HCl đặc và bột Mg kim loại.
- Tiến hành: Lấy 0,05g cặn chiết ethanol vào ống nghiệm và thêm 10 ml
CH3OH lắc đều, đun nóng ống nghiệm cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2 ml dịch
đã lọc vào 2 ống nghiệm ký hiệu lần lượt là A và B. Thêm một ít bột Mg kim loại
vào cả 2 ống, lắc đều và cho 5 giọt HCl đặc vào ống B, đun trong bình cách thuỷ
vài phút và quan sát thấy dung dịch có màu từ vàng, đỏ đến xanh là dương tính với
các flavonoid.
2.2.4.4. Định tính các coumarin
- Sử dụng thuốc thử là dung dịch NaOH 10%.
- Tiến hành: Lấy 2ml dịch thử (dịch chiết bằng ethanol) vào 2 ống nghiệm ký
hiệu lần lượt là A và B. Cho vào ống B 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cả 2 ống
trên bếp cách thủy đến sôi, lấy ra để nguội cho thêm 4 ml nước cất vào cả 2 ống A và
B. Quan sát thấy chất lỏng ở ống B (có kiềm) trở lên trong suốt hoặc trong hơn ống
A (không kiềm) có thể xem là có coumarin. Nếu đem axit hoá ống nghiệm có kiềm
bằng một vài giọt HCl đặc mà làm cho dịch mất màu vàng đục hoặc xuất hiện kết tủa
bông (cũng có khi xuất hiện kết tủa) thì có thể kết luận có coumarin [15].

27
2.2.4.5. Phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng là kỹ thuật phân bố rắn - lỏng.
Trong đó, chất lỏng được đi xuyên qua một lớp chất hấp thụ trơ như silicagel hoặc
nhôm oxit, chất hấp thụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều phủ lên một nền
phẳng như tấm kính, tấm nhôm, hoặc tấm plastic được gọi là pha động.
Sử dụng bản mỏng TLC silicagel 60 F254 của hãng Merck được cắt bằng kéo
thành bản hình chữ nhật có kích thước 3,5 cm x 1,0 cm. Sử dụng ống mao quản
để đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng vạch. Ðường xuất phát cách mép dưới của
bản mỏng 0,7 cm. Bình khai triển là bình thủy tinh hình trụ cao 9 cm, đường kính
miệng 5 cm, có nắp đậy kín. Rót một lượng vừa đủ dung môi vào bình. Lượng
dung môi dày khoảng 3-5 mm ở đáy bình. Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với
bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển. Ðậy
kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung môi đã triển khai trên bản
mỏng được một đoạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm
bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng. Hiện màu bằng dung dịch H2SO4
10% rồi sấy khô trên bếp điện đến khi hiện màu [15].
Hệ dung môi triển khai sắc kí được sử dụng: n-hexan : acetone tỉ lệ 1:1;
Dichlomethane : n-hexan tỉ lệ 3:1.
2.2.5. Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết
Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bằng phương pháp đục lỗ
thạch của Bauer và cộng sự [20], [21].
(1) Chuẩn bị các đĩa petri chứa môi trường LB đặc. (2) Hút 70µl dịch nuôi
mỗi loài vi khuẩn trong môi trường LB lỏng đã được hoạt hóa bằng nuôi từ 4-8
giờ trong môi trường LB lỏng ở 28°C, lắc 200 vòng/phút, lên đĩa môi trường LB
đặc và trải đều trên mặt thạch cho đến khi khô. (3) Dùng khoan nút chai vô trùng
có đường kính 1cm đục 4 giếng trên đĩa thạch và nhỏ 100 µl cao chiết mỗi loại từ
cây A. lienii vào 3 giếng ở các nồng độ 2,0g; 6,0g và 20 g/100ml (giếng đối chứng
bổ sung DMSO). (4) Đặt các đĩa petri đã bổ sung dịch vào tủ lạnh 4°C khoảng
1-2h cho dịch chiết khuếch tán đều vào môi trường và đặt vào tủ ấm nuôi ở 30°C,
từ 18-24h. (5) Đo đường kính vòng kháng khuẩn, chụp hình và ghi lại kết quả.
Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Đường kính vòng kháng khuẩn được xác định theo công thức: H = D-d (mm)

28
 Trong đó: D là đường kính vòng vô khuẩn tính từ tâm đục lỗ (mm); d là
đường kính đục lỗ thạch (mm)
Quy ước: (D - d) ≥ 25 mm: Có hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh.
(D - d) ≥ 20 mm: Có hoạt tính kháng khuẩn mạnh.
(D - d) ≥ 15 mm: Có hoạt tính kháng khuẩn trung bình
(D - d) ≤ 15 mm: Có hoạt tính kháng khuẩn yếu.
2.2.6. Phương pháp xử lý và phân tích kết quả
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để thống kê số liệu và phần mềm
DNAStar, BioEdit và BLAST trong NCBI để phân tích hệ gen.

29
 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Đặc điểm hình thái ngoài và phân bố của loài Adinandra lienii
Loài Adinandra lienii là cây thân gỗ, thường xanh, cao khoảng 8-10 m. Thân
màu nâu, có lông bao phủ. Cuống lá dài khoảng 0,5-0,7 cm, thô ráp. Lá đơn, mọc
cách. Phiến lá bản to, hình thuôn dài, dài khoảng 25-30 cm và rộng 8-12cm. Lá có
màu xanh lục khi tươi, màu nâu khi khô, mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông bao phủ.
Gốc lá tròn hoặc nhọn, chóp lá có mũi nhọn, dài khoảng 1,2-1,4 cm. Gân lá hình
lông chim, gân bên rõ, có khoảng 20-25 cặp, gân giữa mặt trên có rãnh nông, mặt
dưới hơi lồi. Hoa mọc ở nách lá, cuống hoa dài 1-2 cm. Nụ hoa hình cầu, đường
kính khoảng 1,5 cm. Cây thường ra hoa vào mùa hè, thời gian từ tháng 5 đến
tháng 8 hàng năm. Cây mọc sâu trong rừng núi cao và phân bố ở tỉnh Hà Giang,
Lào Cai Việt Nam (Hình 3.1).

Hình 3.1. Hình thái ngoài của cây A.lienii (Ảnh chụp của tác giả thu tại Lào Cai,
tháng 3, năm 2018)

30
3.2. Cấu tạo giải phẫu của loài Adinandra lienii
3.2.1. Đặc điểm giải phẫu cắt ngang thân cây
Cấu tạo giải phẫu của thân đối xứng toả tròn và có sự chuyển hóa rất cao của
các mô. Trên lát cắt ngang thân non của loài A. lienii, có thể phân biệt 9 lớp cơ
bản từ ngoài vào trong, gồm: biểu bì, mô dày xốp, mô mềm vỏ, mô cứng, libe, gỗ,
mô mềm ruột và lông che chở (Hình 3.2).
Lớp biểu bì (1): Phủ ngoài thân là một lớp tế bào dày gồm những tế bào hình
trứng xếp xít nhau uốn lượn theo thân tạo thành vòng ngoài cùng, bắt màu xanh,
dày khoảng 10 µm, biểu bì đã hóa bần; có vai trò bảo vệ và che chở cho những
tầng trong của cây.
Mô dày xốp (2): Gồm 3-4 lớp tế bào xếp sít nhau, ít có khoảng gian bào, tế
bào hình tròn hoặc hình trứng. Trong tế bào mô dày gồm những tế bào sống, vách
dày bắt màu hồng, có chức năng nâng đỡ; có màng sơ cấp dày, không hóa gỗ, vẫn là
màng bằng xenluloz; mô dày xốp được coi là mô mềm có màng dày, chuyên hóa
với chức năng cơ học.
Mô mềm vỏ (3): Gồm 6-8 lớp tế bào hình trứng, không có diệp lục, to hơn
các tế bào mô dày, xếp thưa để lại nhiều khoảng gian bào, có các bào quan, thể
vùi; chức năng chính là dự trữ và dinh dưỡng.
Mô cứng (4): Là mô nâng đỡ những cơ quan đã trưởng thành không sinh
trưởng tiếp nữa. Mô cứng gồm những tế bào thứ cấp có màng dày hóa gỗ, các tế
bào rất khác nhau về hình dạng, cấu tạo và tính chất. Khi trưởng thành, nội chất
tiêu biến, gồm những tế bào chết. Các tế bào tập trung thành từng đám mô cứng
xếp gần như liên tục tạo thành một vòng, đảm nhiệm chức năng cơ học. Kích
thước của đám mô cứng không đều dày từ 22-50 µm.
Libe (5): Gồm những tế bào hình đa giác, xếp sít nhau, bắt màu hồng, có
màng mỏng; các tế bào libe phân hóa hướng tâm.
Tầng phát sinh (6): Gồm các tế bào sống, có hình chữ nhật hơi dài. Các tế
bào của tầng sinh trụ phân chia theo hướng tiếp tuyến trong cho gỗ thứ cấp và
phân chia theo hướng tiếp tuyến ngoài cho libe thứ cấp.
Gỗ (7): Gồm 5-6 lớp tế bào chết, bắt màu xanh, xếp thành vòng tròn liên tục.
Hệ dẫn của thân gồm gỗ và libe phát triển thành vòng liên tục, phần gỗ phát triển
với nhiều mạch gỗ và mô mềm gỗ, mạch có hình đa giác xen lẫn với các tế bào mô

31
mềm gỗ bao quanh (dạng mô mềm quanh mạch). Mạch gỗ có kích thước lớn với
đường kính 12µm.
Mô mềm ruột (8): Gồm các tế bào tròn cạnh, có kích thước khác nhau chiếm
phần lớn diện tích.
Lông che chở (9): Có tác dụng ngăn cản sự thoát hơi nước, màu trắng sáng
giúp phản tác một phần nhiệt, ánh sáng mạnh đốt nóng cơ thể. Ngoài ra, lông che
chở còn có tác dụng chống hạn bằng cách giữ ẩm ở các khoảng trống chân lông.

Hình 3.2. Giải phẫu cắt ngang thân cây A. lienii

1: Bần; 2: Mô dày; 3: Mô mềm vỏ; 4: Vòng mô cứng; 5: Libe;
6: Tầng phát sinh; 7: Gỗ; 8: Mô mềm ruột; 9: Lông che chở.
3.2.2. Đặc điểm giải phẫu cắt ngang phiến lá cây
Cấu tạo giải phẫu phiến lá của cây A. lienii gồm các lớp: Biểu bì trên, mô
giậu, mô xốp, biểu bì dưới, mô cứng, libe sơ cấp, gỗ sơ cấp, mô mềm vỏ, mô dày
và lông che chở (Hình 3.3).
Biểu bì trên (1): Là lớp ngoài cùng, được cấu tạo gồm những tế bào hình chữ
nhật nằm ngang, vách thẳng, xếp xít nhau, dày khoảng 9 µm và không có lục lạp,
có chức năng bảo vệ; phía ngoài biểu bì có lông.
Mô giậu (2): Gồm 2-3 lớp tế bào dài, xếp sít nhau, thẳng vuông góc với bề
mặt cơ quan, ít có khoảng gian bào, nằm tiếp giáp ngay dưới biểu bì trên, chứa

32
nhiều lục lạp, kích thước dày khoảng 11-15 µm, chuyên hóa với chức năng cơ học
và chỉ có ở mặt trên của lá.

Hình 3.3. Giải phẫu cắt ngang phiến lá cây A. lienii

1. Biểu bì trên; 2. Mô giậu; 3. Mô xốp; 4. Biểu bì dưới; 5. Libe cứng;
6. Gỗ; 7. Libe mềm ; 8. Mô mềm; 9. Tinh thể canxioxalat; 10. Lông che chở.
Mô xốp (còn gọi là mô khuyết) (3): Nằm ngay dưới mô giậu và trên biểu bì
dưới. Có 4 - 6 lớp tế bào mô mềm gồm các tế bào hình bầu dục, to hơn các tế bào
mô dày, xếp thưa hơn để lại nhiều khoảng gian bào, gồm các tế bào chứa ít hạt
diệp lục hơn ở mô giậu, kích thước dày khoảng 10 µm, có chức năng chính là dự
trữ và dinh dưỡng.
Biểu bì dưới (4): Các tế bào biểu bì dưới bé hơn và vách uốn cong hơn, có
kích thước dày khoảng 8µm. Lớp mô dày gồm 2-3 lớp tế bào sống, có hình đa
giác, vách dày, bằng xenlulose (bắt màu đỏ đậm); các tế bào nằm sát dưới biểu bì
chuyên hóa với chức năng cơ học, có nhiệm vụ bảo vệ các tế bào bên trong.
Libe cứng (5): Gồm những tế bào có vách dày, xếp liền nhau tạo thành vòng,
đảm nhiệm chức năng cơ học của lá.
Gỗ sơ cấp (6): Gồm 8-9 lớp tế bào chết, bắt màu xanh, có kích thước khác
nhau, nằm phía trong libe tạo nên bó xếp chồng.
Lớp libe mềm (7): Gồm các tế bào sống (bắt màu hồng của thuốc nhuộm
cacmin), có hình đa giác, nhỏ, xếp xít nhau tạo thành một vòng liên tục.

33
 Lớp mô mềm vỏ (8): Gồm 10-11 lớp tế bào có kích thước không đồng đều
chiếm phần lớn diện tích.
Tinh thể canxioxalat (9): Tinh thể được hình thành trong tế bào mô mềm,
tinh thể thường lấp đầy toàn bộ tế bào, thậm chí còn làm biến dạng tế bào. Tinh
thể này được coi như một nhà máy giải độc của lá. (Bắt màu xanh của thuốc
nhuộm xanh metylen).
Lông che chở (10): Là những tế bào mọc dài ra ngoài để tăng cường vai trò
bảo vệ, hoặc để giảm bớt sự thoát hơi nước.
3.3. Đặc điểm của vùng gen matK phân lập từ loài Adinandra lienii
Lá non của loài A. lienii thu tại Lào Cai sử dụng để tách DNA tổng số. Sản
phẩm DNA tổng số được điện di trên gel agarose 0,8% và đo quang phổ để kiểm
tra chất lượng tách. Kết quả kiểm tra cho thấy DNA tổng số thu được đảm bảo
chất lượng cho phản ứng nhân gen. Đoạn gen matK được phân lập bằng phản ứng
PCR từ DNA tổng số sử dụng cặp mồi đặc hiệu matK-F/matK-R. Sản phẩm PCR
được tiến hành điện di trên gel agarose 0,8%, kết quả điện di xuất hiện 1 băng có
kích thước khoảng 800 bp, ứng với đoạn gen matK theo lý thuyết (Hình 3.4).

Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ DNA tổng số của loài A. lienii
1: Gen matK, M: DNA marker

Đoạn gen matK được tiến hành tinh sạch và giải trình tự nucleotit trên máy
giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Kết quả giải trình
tự đã xác định được đoạn gen matK phân lập từ loài A. Lienii dài 867 nucleotit

34
(Hình 3.5). Đoạn gen matK đã phân lập từ loài A. Lienii thu tại Lào Cai được kí
hiệu là LC201904.
Sử dụng phần mềm BLAST trong NCBI để phân tích sự tương đồng giữa
trình tự của đoạn gen matK từ loài A. lienii với trình tự gen matK của một số loài
thuộc chi Adinandra trên GenBank. Kết quả phân tích cho thấy hệ số tương đồng
giữa trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ mẫu A. lienii thu tại Lào
Cai so với đoạn gen matK của các loài thuộc chi Adinadra trên GenBank dao động
từ 99,39-100% (Hình 3.6).

Hình 3.5. Kết quả giải trình tự đoạn gen matK của loài A. lienii thu tại Lào Cai
Tiến hành phân tích mối quan hệ di truyền giữa loài A. lienii với một số loài
Adinandra millettii, Adinandra sp. JH-2017, Adinandra nitida và Adinandra
dumosa thuộc chi Adinandra dựa trên trình tự đoạn gen matK. Kết quả so sánh đã
thống kê được trình tự đoạn gen matK thuộc loài Adinandra lienii và các trình tự
từ các loài Adinandra millettii (mã số HQ427369.1), loài Adinandra sp. JH-2017
(mã số MF418697.1, MF418698.1), loài Adinandra dumosa (mã số KU853076.1)
và loài Adinandra nitida (mã số KP093833.1) thuộc chi Adinandra có số lượng
nucleotide khác nhau (Bảng 3.1). Cụ thể, số nucleotide của loài A. lienii (trong

35
nghiên cứu này) là 867, loài Adinandra millettii là 830, loài Adinandra sp. JH-
2017 là 826-827, loài Adinandra nitida là 756 và loài Adinandra dumosa là 754
nucleotide. Kết quả này cho thấy, đoạn gen matK từ mỗi loài thuộc chi Adinandra
có kích thước khác nhau và đặc trưng cho từng loài.

Hình 3.6. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự đoạn gen matK của loài
A. lienii so với trình tự đoạn gen matK trên GenBank bằng BLAST trong NCBI

Bảng 3.1. Các trình tự nucleotide của đoạn gen matK sử dụng trong phân tích
TT Loài Mã số trên Tác Giả Năm Kích
GanBank thước
(bp)
1 Adinandra sp. JH- MF418698.1 Heckenhauer và cộng 2017 827
2017 sự
2 Adinandra sp. JH- MF418697.1 Hecken và cộng sự 2017 826
2017
3 Adinandra millettii HQ427369.1 Pei và cộng sự 2016 830
4 Adinandra nitida KP093833.1 Liu và cộng sự 2015 756
5 Adinandra dumosa KU853076.1 Srivathsan và cộng sự 2016 754

36
Hình 3.7. Trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ loài A. lienii thu tại
Lào Cai, Việt Nam và trình tự đoạn gen matK công bố trên GenBank

37
 Trình tự nucleotide của đoạn gen matK của loài A. lienii được so sánh với
các loài trong bảng 3.1 tại vị trí nucleotide thứ 113 đến 828 cho thấy trình tự các
nucleotide của 6 loài tương đối giống nhau, ngoại trừ một số điểm khác biệt tại
các vị trí nucleotide số 192, 193 (T thay bằng C), 663 (A thay bằng C) và 778 (G
thay bằng A). Các trình tự nucleotide còn lại liên quan tới sự sai khác số lượng
nucleotide (Hình 3.7).
Trình tự nucleotide của đoạn gen matK từ 6 loài được sử dụng phần mềm
MegAlign để xác định hệ số tương đồng, hệ số phân ly và cây phát sinh chủng
loại. Kết quả bảng 3.2 cho thấy hệ số tương đồng và hệ số phân ly trình tự của
đoạn gen matK từ loài A. lienii với các loài thuộc chi Adinandra dao động từ 95,9-
100% và hệ số phân ly từ 0-2,2%.
Bảng 3.2. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly trình tự các nucleotide của đoạn gen
matK từ loài Adinandra lienii và các loài thuộc chi Adinandra

Khi nghiên cứu về cây phát sinh chủng loại, trình tự nucleotide của đoạn gen
matK từ 6 loài được xếp vào các nhánh khác nhau. Loài Adinandra lienii
(LC201904.1) nằm một nhánh, gần với loài Adinandra nitida (KP093833.1). Kết
quả cho thấy, loài Adinandra lienii trong nghiên cứu không trùng lặp với các loài
đã công bố (Hình 3.8). Như vậy, thông qua hệ số tương đồng, hệ số phân ly và cây
phát sinh chủng loại của đoạn gen matK phân lập từ loài Adinandra lienii thu tại
Lào Cai (Việt Nam) trong nghiên cứu này đã bước đầu khẳng định được chính xác
loài nghiên cứu và là công bố đầu tiên bổ sung dữ liệu về sinh học phân tử của loài
Adinandra lienii thuộc chi Adinandra.

38
Hình 3.8. Sơ đồ cây phân loại dựa trên trình tự các nucleotide của đoạn gen matK
3.4. Khảo sát các hợp chất có trong các phân đoạn dịch chiết của cây
Adinandra lienii

Loài A. lienii sau khi thu hái về được thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy khô
ở nhiệt độ 50ºC đến khối lượng không đổi, sau đó đem nghiền nhỏ. Cao chiết phân
đoạn của cây A.lienii được điều chế theo sơ đồ hình 2.1 ở phần phương pháp.
3.4.1. Định tính polyphenol
Dịch chiết của loài A. lienii được định tính polyphenol bằng thuốc thử với
muối sắt (III), nhận thấy dung dịch trong ống nghiệm B chuyển sang màu xanh lục
(Hình 3.9a). Trong khi định tính bằng dung dịch H2SO4 đặc, dung dịch trong ống
nghiệm B chuyển sang màu vàng đậm (Hình 3.9b). Như vậy trong dịch chiết của
loài A. lienii có chứa các nhóm chất polyphenol.

a b
Hình 3.9. Phản ứng với muối sắt (III) (a) và với dung dịch H2SO4 đặc (b)
A. Dung dịch ban đầu; B. Dung dịch sau phản ứng

39
3.4.2. Định tính các flavonoid
Dịch chiết của loài A. lienii được định tính flavonoid bằng dung dịch axit
HCl đặc và bột Mg kim loại. Kết quả hình 3.10 nhận thấy, dung dịch trong ống
nghiệm B chuyển từ màu vàng sang màu đỏ đậm. Như vậy, trong dịch chiết của
loài A. lienii không chứa thành phần flavonoid.

Hình 3.10. Định tính các flavonoid

A. Dung dịch ban đầu; B. Dung dịch sau phản ứng
3.4.3. Định tính các coumarin
Cao chiết của loài A. lienii được định tính các coumarin bằng dung dịch
NaOH 10%. Kết quả nhận thấy, khi cho 0,5ml NaOH 10% vào ống nghiệm B,
đem đun cả 2 ống nghiệm trên bếp cách thủy, sau khi làm nguội và cho thêm 4ml
nước cất vào cả ống thì dung dịch ống B trở lên trong hơn (Hình 3.11a). Sau khi
cho vài giọt HCl đặc vào cả 2 ống nghiệm thì ống B mất màu vàng đục (Hình
3.11b). Như vậy, trong dịch chiết của loài A. lienii chứa thành phần coumarin.
Từ kết quả định tính cho thấy, trong dịch chiết của loài A. lienii có chứa
nhiều nhóm hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học như các nhóm chất polyphenol
và coumarin. Các nhóm hợp chất này có ý nghĩa trong việc ứng dụng làm thuốc
chữa bệnh và đây là cơ sở để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.

40
 a b
Hình 3.11. Định tính coumarin phản ứng với NaOH (a) và HCl đặc (b)
A. Dung dịch ban đầu; B. Dung dịch sau phản ứng

3.4.4. Phân tích thành phần các hợp chất trong cao chiết của loài A. lienii
Cao chiết ethanol và cao chiết ethyl acetate từ cây A. lienii được chạy TLC
sử dụng các hệ dung môi khác nhau, gồm hệ n-hexan : acetone tỉ lệ 1:1;
dichlomethane : n-hexan tỉ lệ 3:1 và hiện mầu bằng H2SO4 đặc để xác định số
lượng các chất có trong cao chiết.

A B A B
Hình 3.12. Sắc kí đồ cao chiết ethanol Hình 3.13. Sắc kí đồ cao chiết ethanol
(A) và ethyl acetate (B) trong hệ dung (A) và ethyl acetate (B) trong hệ dung
môi n-hexan : acetone tỉ lệ 1:1 môi dichloromethane : n-hexan tỉ lệ 3:1

41
 Cao chiết ethyl acetate từ loài A. lienii khi chạy TLC sử dụng hệ dung môi
n-hexan : acetone tỉ lệ 1:1 sau khi hiện bằng H2SO4 xuất hiện 7 vết; trong khi cao
chiết ethanol từ xuất hiện 6 vết (Hình 3.12).
Cao chiết ethyl acetate từ loài A. lienii khi chạy TLC sử dụng hệ dung môi
dichloromethane : n-hexan tỉ lệ 3:1 sau khi hiện bằng H2SO4 xuất hiện 7 vết; trong
khi cao chiết ethanol xuất hiện 3 vết (Hình 3.13).
Như vậy, qua quan sát trên sắc kí đồ TLC với hai hệ dung môi khác nhau cho
thấy các phân đoạn từ cao chiết của loài A. lienii đều có nhiều vạch băng với nhiều
màu sắc khác nhau.
3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ loài Adinandra lienii
Từ cao chiết ethanol (C1, C2, C3), cao ethyl acetate (C4, C5, C6) và cao
dichloromethane (C7, C8, C9) từ loài A. lienii được sử dụng để thử nghiệm hoạt
tính kháng khuẩn ở 3 nồng độ tương ứng là 2; 6 và 20 g/100ml. Kết quả thử hoạt
tính kháng khuẩn được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Hoạt tính sinh học của dịch chiết từ cây A. lienii
TT Chủng vi Đường kính vòng kháng khuẩn (D - d) (mm)
khuẩn C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9
1 S.aureus 0 0 7 0 0 12 10 20 31
2 B. subtilis 0 4 10 0 9 16 14 0 21
3 S. macessen 0 0 3 0 4 7 5 13 11
4 S. lutea 0 0 3 0 0 8 0 14 3
5 L. plantarum 0 0 12 0 9 22 19 22 25
6 E. coli 0 0 0 0 0 0 6 0 9
Ghi chú:
- ĐC là DMSO.
- Dịch C1 là cao ethanol nồng độ 2g/100ml; dịch C2 là cao ethanol nồng độ
6g/100ml; Dịch C3 là cao ethanol nồng độ 20g/100ml.
- Dịch C4 là cao ethyl acetate nồng độ 2g/100ml; dịch C5 là cao ethyl acetate
nồng độ 6g/100ml; dịch C6 là cao ethyl acetate nồng độ 20g/100ml.
- Dịch C7 là cao dichloromethane nồng độ 2g/100ml; dịch C8 là cao
dichloromethane nồng độ 6g/100ml; dịch C9 là cao dichloromethane nồng độ
20g/100ml.

42
 Đối với vi khuẩn B. subtilis, cao chiết ethanol, cao ethyl acetate và cao
dichloromethane ở nồng độ 2g/100ml không có hoạt tính kháng khuẩn. Hoạt tính
kháng B. subtilis có được ở nồng độ 6g và 20g/100ml. Trong đó, cao chiết
dichloromethane ở nồng độ 20g/100ml có hoạt tính kháng B. subtilis cao nhất,
đường kính vòng kháng khuẩn là 21 mm (Hình 3.14).

Hình 3.14. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn B. subtilis
Đối với vi khuẩn L. plantarum, cao chiết ethanol nồng độ 2g và 6g/100 ml và
cao ethyl acetate nồng độ 2g/100ml không có hoạt tính kháng khuẩn. Hoạt tính
kháng vi khuẩn L. plantarum có được ở nồng độ 6g/100 ml đối với cao ethanol và
nồng độ 6g; 20g/100ml đối với cao ethyl acetate. Trong khi, cao dichloromethane
ở cả 3 nồng độ đều có khả năng kháng L. plantarum và nồng độ 20g/100ml có
hoạt tính kháng khuẩn cao nhất, đường kính vòng kháng khuẩn là 25 mm (Hình
3.15).

Hình 3.15. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn L. plantarum
Đối với vi khuẩn S.aureus, cao chiết ethanol và cao ethyl acetate nồng độ 2g
và 6g/100 ml không có hoạt tính kháng khuẩn. Hoạt tính kháng vi khuẩn S.aureus
có được ở nồng độ 20g/100 ml đối với cao ethanol và cao ethyl acetate. Trong khi,
cao dichloromethane ở cả 3 nồng độ đều có khả năng kháng mạnh vi khuẩn

43
S.aureus và nồng độ 20g/100ml có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất, đường kính
vòng kháng khuẩn lên tới 31 mm (Hình 3.16).

Hình 3.16. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S. aureus
Đối với vi khuẩn E. coli, cao chiết ethanol và cao ethyl acetate ở 3 nồng độ
khảo sát và cao dichloromethane nồng độ 6g/100ml đều không có hoạt tính kháng
khuẩn. Trong khi, cao dichloromethane ở 2 nồng độ còn lại có khả năng kháng vi
khuẩn E. coli, đường kính vòng kháng khuẩn chỉ đạt 9 mm (Hình 3.17).

Hình 3.17. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn E.coli
Đối với vi khuẩn S. marcescens, cao chiết ethanol nồng độ 2g; 6g/100 ml và
cao ethyl acetate nồng độ 2g/100 ml không có hoạt tính kháng khuẩn. Hoạt tính
kháng vi khuẩn S. marcescens có được ở nồng độ 20g/100 ml đối với cao ethanol
và nồng độ 6g; 20g/100 ml đối với cao ethyl acetate. Đối với cao dichloromethane
ở cả 3 nồng độ đều kháng vi khuẩn S. marcescens và nồng độ 6 g/100ml có hoạt
tính kháng khuẩn cao nhất, đường kính vòng kháng khuẩn đạt 13 mm (Hình 3.18).
Đối với vi khuẩn S. lutea, cao chiết ethanol và ethyl acetate nồng độ 2g;
6g/100 ml và cao dichloromethane nồng độ 2g/100 ml không có hoạt tính kháng
khuẩn. Hoạt tính kháng vi khuẩn S. lutea có được rất yếu ở nồng độ 20g/100 ml

44
đối với cao ethanol và cao ethyl acetate. Cao dichloromethane ở nồng độ
6g/100ml có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất, đường kính vòng kháng khuẩn đạt
14 mm (Hình 3.19).

Hình 3.18. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S. marcescens

Hình 3.19. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S. lutea
Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ cây A. lienii với 6 chủng
vi khuẩn kiểm định cho thấy: (1) cao chiết bằng dung môi ethanol và ethyl acetate
có khả năng ức chế 5 chủng vi khuẩn: S. aureus, B. subtilis, S. marcessens,
S. lutea, L. plantarum. (2) Cao chiết bằng dung môi dichloromethane có khả năng
ức chế cả 6 chủng vi khuẩn: S. aureus, B. subtilis, S. marcessens, S. lutea,
L. plantarum, E. coli. (3) Cao chiết bằng dichloromethane có khả năng ức chế tốt
hơn cao chiết bằng ethanol và ethyl acetate. Như vậy, hoạt tính sinh học của cao
chiết bằng dichloromethane tốt hơn so với hoạt tính sinh học của cao chiết bằng
dung môi ethanol và ethyl acetate.

45
 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. KẾT LUẬN
(1) Nghiên cứu mô tả được đặc điểm hình thái và giải phẫu của loài A. lienii
thu tại tỉnh Lào Cai, Việt Nam.
(2) Đoạn gen matK từ loài A. lienii thu tại tỉnh Lào Cai, Việt Nam đã được
phân lập dài 867 nucleotide và chỉ ra được loài A. lienii thuộc chi Adinandra thông
qua phần mềm BLAST trong NCBI. Cây phát sinh chủng loại và mối quan hệ di
truyền của đoạn gen matK giữa các loài thuộc chi Adinandra đã được xây dựng
dựa trên phần mềm MegAlige.
(3) Cao chiết từ loài A. lienii thu được có chứa một số nhóm chất polyphenol
và coumarin thông qua phương pháp định tính. Cao chiết ethanol, cao ethyl
acetate và cao dichloromethane từ loài A. lienii có hoạt tính ức chế vi khuẩn
S. aureus, B. subtilis, S. marcessens, S. lutea, L. plantarum và E. coli ở nồng độ
20 g/100ml.
2. KIẾN NGHỊ
- Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các đặc điểm sinh học của loài A. Lienii.
- Tiếp tục tinh sạch, phân lập được các hợp chất của cây A. lienii để đánh giá
hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất đã tìm được.

46
 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
1. Nguyễn Hữu Quân, Kiều Thị Trà Giang (2019), “Sử dụng mã vạch DNA
matK để định danh mẫu Sum liên thu tại tỉnh Lào Cai, Việt Nam”, Tạp chí
Khoa học và Công nghệ , 197(04), tr. 205-210.

47
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bùi Kim Anh, Đoàn Duy Tiên, Phạm Gia Điền, Hồ Đắc Hùng, Phạm Quang
Dương, Vũ Đình Hoàng (2017), “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học của Củ ngải đen”, Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 1/2017,
tr.24-29.
2. Nguyễn Thị Hồng Anh, Nguyễn Thị Thu, Đỗ Thị Hà, Nguyễn Thùy Dương,
Lê Việt Dũng (2017), “Các hợp chất của phenolic phân lập từ cặn ethyl acetate
của Tỏa dương”, Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 1/2017 ,tr. 29 - 33.
3. Nguyễn Bá (1974 - 1975), Hình thái thực vật (tập 1) và Giải phẫu hình thái
thực vật (tập 2), Nxb Đại học và Trung học chuyên nghiệp.
4. Đái Duy Ban (2008), Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học phòng
chống một số bệnh cho người và vật nuôi, Nxb Khoa học tự nhiên và công
nghệ, Hà Nội.
5. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam (Bộ mới), Nxb Y học.
6. Lê Việt Dũng, Vũ Thị Diệp, Võ Công Đức, Trần Thanh Hà, Hà Vân Oanh, Đỗ
Thị Hà, Trần Minh Ngọc (2017), “Thành phần hóa học của phần trên mặt đất
cây Lấu thu hái tại Việt Nam”, Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 1/2017, tr. 20 -24.
7. Vũ Thị Thu Hiền, Đinh Thị Phòng (2011), “Ứng dụng kĩ thuật DNA vào việc
đánh giá mối quan hệ di truyền tập đoàn cây gỗ trắc đỏ (Dalbergia
cochinchinensis) ở Việt Nam đang có nguy cơ tuyệt chủng”, Tạp chí Khoa học
và Công nghệ, 49(3), tr. 57-64.
8. Trần Thu Hoa, Trần Hoàng Dũng, Nguyễn Lê Huyền Thanh, Nguyễn Thị Ngọc
Tuyết, Nguyễn Thị Phương Thảo, Trần Hồng Bảo Quyên, Trần Công Luận
(2013), “Khảo sát đặc tính dược liệu và bước đầu định danh bằng trình tự ITS và
matK cho một mẫu Ngải mới tìm thấy ở vùng núi Cấm - An Giang”, Tạp chí
Dược học, 2, tr. 53.
9. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây Cỏ Việt Nam 2, Nxb trẻ, Tp Hồ Chí Minh.
10. Hà Văn Huân (2014), “Phân lập gen matK từ cây Sến mật (Madhuca
pasquierii) làm ADN mã vạch (DNA barcode) phục vụ giám định loài”, Tạp
chí Nông nghiệp và PTNT, 13, tr.130-136.

48
11. Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong (2015), “ Xác định đoạn mã vạch DNA cho
Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis): loài cây đặc hữu của Việt
Nam”, Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, 5, tr. 123-130.
12. Lê Thanh Hương, Nguyễn Nhật Linh, Bùi Mạnh Minh, Hà Hồng Hạnh, Huỳnh
Thị Thu Huệ , Nông Văn Hải , Hà Văn Huân , Lê Thị Thu Hiền (2017), “ Ứng
dụng mã vạch DNA hỗ trợ định loại loài một số mẫu sâm thuộc chi Nhân sâm
(Panax L.)”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 15(1), tr. 63-72.
13. Võ Thị Mai Hương, Trần Thanh Phong (2013), “Một số đặc trưng hóa sinh và
khả năng kháng khuẩn của dịch chiết quả Nhàu (Morinda citrifolia L.)”, Hội
nghị Khoa học toàn quốc về Sinh thái và Tài nguyên sinh vật lần thứ 5, Nxb
Trường đại học khoa học, Đại học Huế.
14. Katheri Esau(1995), Giải phẫu thực vật, Nxb Khoa học Kỹ thuật.
15. Phạm Văn Khang, Nguyễn Thị Thanh Hương, Mai Thanh Nga, Phạm Văn
Thỉnh (2019), Hợp chất thiên nhiên, Nxb Đại học Thái Nguyên.
16. Trần Công Khánh (1981), Thực tập hình thái và giải phẫu thực vật, Nxb Đại
học và trung học chuyên nghiệp.
17. N.X.Kixeleva (1998), Giải phẫu và hình thái thực vật, Nxb Giáo dục, Hà Nội.
18. Bùi Thị Lê Minh, Võ Ngọc Duy và Hồ Thị Bảo Trân (2015), “Tác dụng kháng
khuẩn của tỏi (Allium sativum L.) trên Escherichia coli và ảnh hưởng tỏi lên sự
sinh trưởng của gà được bổ sung tỏi tươi vào khẩu phần thức ăn” , Tạp chí
khoa phần B: Nông nghiệp, thủy sản và Công nghệ Sinh học, số 40(2), Nxb
Trường đại học Cần Thơ.
19. Hoàng Thị Sản, Nguyễn Phương Nga (2008), Hình thái - giải phẫu học thực
vật, Nxb Đại học Sư phạm Hà Nội, Tr. 14.
20. Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, Nxb Giáo dục.
21. Trần Linh Thước (2007), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực
phẩm và mĩ phẩm, Nxb Giáo dục.
22. Mai Sỹ Tuấn, Mai Thị Hằng, Phạm Hồng Tính, Đào Thị Sen, Đào Thị Hải Lý,
Tống Thị Mơ (2006), Nuôi cấy mô tế bào cây cúc áo (Spilanthes acmella L.
Murr.) để thu chất ức chế sinh trưởng tế bào và kháng tế bào ung thư, Nghiệm
thu đề tài khoa học cấp bộ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội.
23. Viện Dược liệu- Bộ Y tế (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý
của thuốc từ dược thảo, Nxb Khoa học và kỹ thuật- Hà Nội.

49
2. TÀI LIỆU TIẾNG ANH
24. Chen Y., Chen G., Fu X., Liu R. H. (2015), Phytochemical Profiles and
Antioxidant Activity of Different Varieties of Adinandra Tea (Adinandra
Jack), Journal of Agricultural and Food Chemistry, 63 (1), pp. 169-176.
25. Gao H., Liu B., Liu F., Chen Y. (2010), Anti-proliferative effect of
camellianin A in Adinandra nitida leaves and its apoptotic induction in human
Hep G2 and MCF-7 cells, Molecules, 15(6), pp. 3878-3886.
26. Hebert P. D., Cywinska A., Ball S. L., de Waard J. R. (2003), Biological
identifications through DNA barcodes, Proceedings Biological Sciences/The
Royal Society, 270, pp. 313-321.
27. Liu B., Ma Y., Liu Y., Yang Z., Zhang L. (2013), Ultrasonic-assisted
extraction and antioxidant activity of flavonoids from adinandra nitida leaves,
Trop J Pharm Res 12, pp. 1045 – 1051.
28. Liu B. G., Ning Z., Zhan Y., Xu K., Gao J. (2008), Characterization and
Antioxidant Activity of Flavonoid Extract from Leaves of Adinandra nitida
Merr, Chemistry and Chemical Engineering, 28(1), pp. 6-10.
29. Liu B., Ning Z., Zhan Y., Xu K., Gao J. (2008), Characterization and 1,1-
diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging activity of methanol and
supercritical carbon dioxide extracts from leaves of Adinandra nitida, Journal
of Food Biochemistry 32, pp. 431-442.
30. Liu B., Yang J., Ma Y., Yuan E., Chen C. (2010), Antioxidant and
angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory activities of ethanol extract
and pure flavonoid from Adinandra nitida leaves, Pharmaceutical biology,
48(12): 1432-1438.
31. Nakatomi N., Nagashima M. (1992), Pungent alkamides from Spilanthes
acmella L. var. oleracea. Clarke, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry,
56 (5), pp. 759-762.
32. Saghai-Maroof M. A., Soliman K. M., Jorgensen R. A., Allard R. W.
(1984), Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley:
enzymedelian inheritance, chromosomal location, and population
dynamics, Proc Natl Acad Sci USA, 81(24), pp. 8014-8018.
33. Sharma P. 2002. Effect of incorporation of full fat and defatted legume flours
on the acceptability and nutritional quality of maize products. M.Sc. Thesis .
Depff of Food Sciences and Nutrition, CSK.HPKV, Palampur (H.P).

50
34. Hoang Thanh Son, Luong Van Dung (2014), Adinandra hongiaoensis (Theaceae)
a New Species from Lam Dong, Vietnam, J. Jpn. Bot. 89, pp. 331-334.
35. Wang Y., Chen S., Ni J., Yao X., Ye W., Zhao S. (2003), Chemical studies on
the Adinandra nitida, Zhongguo Yaoke Daxue Xuebao, 34(5), pp. 407-409.
36. Wang Y., Ye W., Yin Z., Zhao S. (2008), Triterpene saponins from Adinandra
nitida, YaoXue XueBao, 43(5), pp. 504-508.
37. Zhang J., Tao D., Duan J., Liang Z., Zhang W., Zhang L., Huo Y., Zhang Y.
(2006), Separation and identification of compounds in Adinandra nitida by
comprehensive two-dienzymesional liquid chromatography coupled to
atmospheric pressure chemical ionization source ion trap tandem mass
spectrometry, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 386(3), pp. 586-593.
3. TÀI LIỆU WEBSITE
38. Hà Văn Huân (2015), “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử DNA (mã vạch
DNA) trong phân tích đa dạng di truyền và giám định sinh vật ở Việt Nam”,
http://dnabank.vn/publication?id=28, ngày 13/2/2019.
39. Thực vật chí Trung Quốc, http://www.efloras.org/, 10/4/2019.
40. Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam,
http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=edir&v=Adinandra&list=genus,
10/5/2019.

51