Antifungal Duyarlılık Testleri

Dr Macit İlkit
 Neden AFDT?
• Uygulanan antifungal duyarlılık testi (AFST) miktarı, son
yıllarda sayısız nedenden dolayı artmıştır.
• (1) 21 yy. da bağışık baskılı konak sayısında ve invazif
mantar enfeksiyonların (İMH)’da artış
• (2) Ender görülen mantar cins/türlerinin İMH etkeni
olarak ortaya çıkması (C. auris vb.)
• (3) Uzun süreli geniş spektrumlu antibiyotiklere maruz
kalma, implante edilmiş tıbbi cihazlara maruz kalma
 Neden AFDT?
• (4) Yeni antifungallerin geliştirilmesi/etkinliğinin araştırılması
• (5) Antifungal ilaçlara primer direnç yanında sekonder direnç
olduğunun fark edilmesi
• (6) Ekinokandin sınıfı antifungaller eklendi ve klinik olarak
mevcut triazollerin sayısı artarak antifungal silahlanmayı
genişletti.
• (7) C. glabrata ve A. fumigatus gibi mantar türlerinde
kazanılmış direnç ortaya çıkmıştır.
• (8) Hasta popülasyonundaki bu değişiklikler ve antifungal
tedavi seçeneğinin mevcut olmasıyla, doğru in vitro duyarlılık
verilerine duyulan ihtiyaç her zamankinden daha büyüktür.
 Neden AFDT?
• Antifungal ilacın in vitro etkinliğinin belirlenmesi
• Antifungal tedavinin doğru yönlendirilmesi
• Klinik yanıtın öngörülebilmesi
• Duyarlı popülasyonda direnç gelişiminin izlemi
 AFST
• AFST genellikle klinik mikrobiyoloji laboratuvarları tarafından
optimal antifungal ilacın seçimine yardımcıdır.

• Tanım gereği, bir organizmayı belirli bir dereceye kadar inhibe

etmek için gereken ilaç konsantrasyonunu belirleyerek, bir in vitro
duyarlılık ve direnç ölçümü sağlar, bu MIC olarak tanımlanır.

• İdeal olarak, daha sonra tedaviye göre hasta sonucuna ilişkin

güvenilir bir tahmin yapılabilir.

• Antifungal ilaçlar için in vitro duyarlılık testi talebi, birkaç on yıl önce
antibakteriyel ilaçlar için benzer testler zaten yapılır iken yoktu.
Antifungal tedavide gelişmeler

Mikafungin
Anidulafungin
Posakonazol
ABLC
Griseofulvin Ketokonazol Terbinafin Caspofungin
Nistatin Flusitozin Flukonazol Vorikonazol
Amfoterisin B Mikonazol İtrakonazol
ABCD
L-AmB
 İnvazif Mantar Hastalıkları-Tedavi neden
başarısız?
• İn vitro direnç
• Konağa ait faktörler
• Mantara ait faktörler
• Klinik yanıtsızlık
• Candida dışı mantarlarda AFDT’lerin yapılmasının
geçerliliği?
 AFST?
• İlk antifungal ilaç olan amfoterisin B (AmB), ilk antibakteriyel
ajanların keşfinden yaklaşık 30 yıl sonra 1950'lerde piyasaya
sürüldü.

• AmB, uzun bir süredir mantar enfeksiyonları için tek terapötik

seçenekti ve bu nedenle, klinik izolatlara karşı aktivitesini test
etme gerekliliği mevcut değildi.

• Takip eden on yıllar, 5-Flusitozin, imidazol ve triazol antifungal

sınıfları ve son olarak ekinokandinler gibi daha az toksik
antifungallerin piyasaya sürüldü.
 AFST
• Daha fazla terapötik seçenek ortaya çıktıkça, hem intrinsik
hem de kazanılmış antifungal direncin saptanmasının değeri
ve antifungal seçimin optimizasyonuna duyulan ihtiyaç
artmıştır.

• Hangi mantar enfeksiyonlarının tedaviye yanıt verip

vermeyeceğini tahmin etme ihtiyacının artmasıyla,
laboratuvar için standartlaştırılmış test yöntemlerinin
gerekliliği ortaya çıktı.

• Antifungal duyarlılık testi için tekrarlanabilir teknikler, sonucu

güvenilir bir şekilde tahmin etmek, raporlamada tekdüzelik
oluşturmak ve laboratuvarlar arası karşılaştırmaları ve
anlaşmaları kolaylaştırmak için çok önemlidir.
 AFST
• Organizmanın inokülum boyutu, inkübasyon süresi,
inkübasyon sıcaklığı ve test için kullanılan besiyeri dahil
birçok faktör in vitro duyarlılık testinin sonucunu etkiler.

• Bu tür faktörlerin değişkenliğinin nihai MIC değeri

üzerindeki etkisini en aza indirmek, standardizasyonun
arkasındaki temel mantıktı.

• Standardizasyon olmadan önce, MİK değerlerinin ilk

laboratuarlar arası karşılaştırmaları optimalin altındaydı.
 AFST
• Daha önce Ulusal Klinik Laboratuvar Standartları Komitesi (NCCLS)
olan Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI), tüm
patojenler için kalite kontrolünü (QC) ve duyarlılık testini
standardizasyonu uyumlu hale getirmek amacıyla 1968 yılında
oluşturulmuştur.

• ABD’nde antifungal duyarlılığın laboratuvar testinin durumu

hakkındaki ilk rapor olan M20-CR 1985 yılında tamamlanmış ve
antifungal duyarlılık testi için laboratuvar içi UYUMSUZLUĞUN kabul
edilemez olduğu sonucuna varmıştır.

• Bu raporun ardından, antifungal alt komite, duyarlılık testinin

standardizasyon sürecine başladı ve M-27 belgesinin
oluşturulmasıyla sonuçlandı.
 AFST
• CLSI gibi, Avrupa Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Komitesi (EUCAST),
in vitro antimikrobiyal duyarlılık testinin teknik yönlerini
standartlaştırmak ve sınır değerleri geliştirmek için oluşturulmuştur.

• Başlangıçta Avrupa Klinik Mikrobiyoloji ve Bulaşıcı Hastalıklar

Derneği (ESCMID), Avrupa Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri
(ECDC) ve Avrupa ulusal sınır komiteleri tarafından ortaklaşa
oluşturulan EUCAST, hem Avrupa içindeki hem de dışındaki ülkeler
için standartları uyumlu hale getirdi.

• 1997'de, EUCAST antifungal duyarlılık testi alt komitesi kuruldu ve

hem mayalar hem de küfler için yayınlanmış ilk duyarlılık testi
standardı 2008'de yayınlandı.
 AFST
• Bazı patojenler için tercih edilen antifungal ilaç, patojenin
uygun şekilde tanımlanmasıyla ampirik olarak başlanabilir ve
klinik başarısızlık dışında duyarlılık testi gerektirmeyebilir.

• Vorikonazolün ampirik olarak kullanıldığı ve direncin geniş

çapta olmadığı ABD'deki A. fumigatus buna bir örnek olabilir.

• Ek olarak, yorumlayıcı kriterleri (sınır noktası veya

epidemiyolojik sınır değeri) olmayan mantar patojenleri için
bir MİK değeri elde edilebilir, ancak net bir klinik yorumu
olmayabilir.
 AFST
• Mantar enfeksiyonu invazif olduğunda, edinilmiş ilaç
direncinden şüphelenildiğinde veya hasta beklenmedik bir
şekilde tedavide başarısız olduğunda AFST en fazla değer
kazanır.

• Bu senaryoların her biri için, in vitro duyarlılık modelini

bilmek, terapötik seçimler veya değişiklikler yaparken
klinisyeni bilgilendirecektir.

• Bu rutin test endikasyonları yalnızca bazı Candida türleri için

tanımlanmıştır.
 AFST
• Diğer klinik olarak önemli mantar patojenleri için rutin
AFST'nin geçerliliği ve potansiyel faydası henüz geniş ölçüde
karakterize edilmemiştir, ancak Aspergillus'un duyarlılık testi
için sınır değerlerin belirlenmesinin ardından bazı öneriler
vardır.

• CLSI tarafından A. fumigatus'a karşı vorikonazol ve EUCAST

tarafından bir dizi Aspergillus türüne karşı amfoterisin B,
izavukonazol, itrakonazol, posakonazol ve vorikonazol için
kabul edilmiş sınır değerler vardır.
 SONUÇ OLARAK

• Duyarlılık testleri rutin değil endikasyon dahilinde kullanılmalı

– Epidemiyolojik nedenler
– Steril vücut bölgelerinden izole edilen kökenler
– Ampirik tedavi protokolleri hazırlanması
– Tedaviye yanıtsızlık
– Aynı etkenle tekrarlayan enfeksiyon
– Nadir kökenler
– Direnç olasılığı yüksek durumlar (FLU-C. glabrata)

16/35
 In vitro-in vivo uyumsuzluk
• 90-60 kuralı
• Enfeksiyon etkeni ilaca in vitro duyarlı bulunmuş ise, tedaviye
%90 oranında yanıt alınacağını
• Dirençli bulunmuş ise de %60 oranında yanıt alınacağını
açıklar
 KONAK

MANTAR İLAÇ

• Düşük MİK ≠ Klinik Başarı

• 90/60 kuralı unutulmamalı*
• Konağa ve ilaca bağlı faktörler daha önemlidir

* Rex, J.H., Pfaller, M.A., Clin. Infect. Dis. 2002, 35, 982–989 18/42
 AFST
• Etken organizma mutlaka tür düzeyinde tanımlanmalıdır
• Bilinen dirençlerde rutin test gerekli değildir.
– AMB - A. terreus
– FLU - C. krusei
• Test sonuçları kıyaslanırken yöntem farklılıkları dikkate
alınmalıdır.
 GİRİŞ
• Duyarlılık test çalışmalarında artış var.
• İdeal yöntem nedir?
• Eşik değerleri tanımlanmış

20/42
UYGULANMAKTA OLAN YÖNTEMLER
• Sıvı dilüsyon
• Disk difüzyon
• E-test
• Agar dilüsyon
• Hazır paneller
– Sensititre Yeast One (TREK Diagnostic Systems, ABD)
– ASTY (Kyokuto Inc., Japonya)
– ATB Fungus 3 (Bio Me´rieux, Fransa)
– VITEK 2 (Bio Me´rieux, ABD)
– Neo-sensitabs (Rosco Diagnostica, Danimarka)
• Deneysel
– MTT/XTT redoks ölçümleri
– “Flow cytometriy”
– Ergosterol düzey ölçümü

21/42
Antifungal duyarlılık testleri

• Mayalar için CLSI M27-A3, CLSI M44-A2

• Küfler için CLSI M38-A2, CLSI M51-A

 Mayalar için EUCAST EDEF 7.2

 Küfler için EUCAST E.DEF 9.1
Referans yöntemler;
• Emek yoğun
• Uzun inkübasyon süreleri
• Değerlendirmede uzmanlık

İhtiyaç;
 Basit
 Kolay uygulanabilir/değerlendirilebilir
 Yüksek performanslı TİCARİ
 Düşük maliyetli SİSTEMLER
 Hızlı
 Manuel, otomatize/yarı otomatize
 Standardizasyon
• Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI),
eski adı ile National Committee for Clinical
Laboratory Standards, 1982’de ABD’de
kurulmuştur.
• European Committee for Antimicrobial
Susceptibility Testing (EUCAST) ise Avrupa
merkezlidir.
CLSI
 Duyarlılık testleri
• Duyarlılık test çalışmalarında artış var
– Mikoz insidansı ve mortalite artışı
– Yeni antifungallerin geliştirilmesi
– Klinik baskılar
• İdeal yöntem
– Tekrarlanabilir
– Standardize edilmiş
• İnokulum, besiyeri, inkübasyon şartları
– Klinik ile uyumlu
• Eşik değerleri tanımlanmış

26/35
 YÖNTEMLER
• Sıvı dilüsyon
• Disk difüzyon
• Diğer yöntemler
– E-test
– Agar dilüsyon
• Hazır paneller
– Sensititre Yeast One (TREK Diagnostic Systems, ABD)
– ASTY (Kyokuto Inc., Japonya)
– ATB Fungus 3 (Bio Me´rieux, Fransa)
– VITEK 2 (Bio Me´rieux, ABD)
– Neo-sensitabs (Rosco Diagnostica, Danimarka)
• Deneysel
– MTT/XTT redoks ölçümleri
– “Flow cytometriy”
– Ergosterol düzey ölçümü

27/35
 MEVCUT STANDARTLAR
MAYALAR KÜFLER
YÖNTE CLSI EUCAST CLSI EUCAST
M
SIVI M27-A3 E.DEF.7.1 M38-A2 E.DEF.9.1
DİLÜSYO (1995-2008) (2008) (2002-2008) (2008)
N
DİSK M44-A2 YOK M51-A YOK
DİFÜZYO (2004-2009) (2010)
CLSI : Clinical and Laboratory Standards Institute
N
EUCAST : The European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing/
Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing (AFST)
European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID)

28/35
MAYALAR İÇİN
SIVI DİLÜSYON

29/35
 YÖNTEM ÖZELLİKLERİ
M27 A3 (CLSI) E.DEF.7.1 (EUCAST)
Candida spp. ve Cryptococcus Fermentatif mayalar
neoformans
Makrodilüsyon/mikrodilüsyon Mikrodilüsyon
RPMI- %0,2 Glukoz/ U tabanlı RPMI- %2 Glukoz/ Düz tabanlı
mikroplak mikroplak
0.5-2.5x103 CFU/ml 0.5-2.5x105 CFU/ml
35 oC 35 ± 2 oC
Görsel okuma 530 nm de spektrofotometrik okuma
Candida spp. 24 saat- Candida spp. 24 saat
Ekinokandinler
24/48 saat-AMB, FLC,
FLU 48 h diğer triazoller
C.neoformans 72 saat
AMB, FLC, AZOLLER, KANDİNLER AMB, FLC, AZOLLER, KANDİNLER
Kırılma noktası: AMB %100 Kırılma noktası: AMB %90 30/35
 EŞİK DEĞERLER (μg/ml)
M27 S3 (CLSI) E.DEF.7.1 (EUCAST)
Candida spp. Candida spp.
S S-DD R S S-DD R

Flukonazol 8 16-32 64 2 4 >4

Itrakonazol 0,12 0,25- 1

0,5
Vorikonazol 1 2 4 0,12 >0,125
5 *
Flusitozin 4 8-16** 32

Kandinler
* C.albicans,
2**
C.parapsilosis ve C.tropicalis dışındaki Candida türleri için yeterli bilgi birikimi yoktur.
* çıkan izolatlarda tekrarlanan testte aynı sonuç alınması durumunda
Duyarlılık sınırının üzerinde MIK değeri
dirençli olarak rapor verilebilir.
** “Intermediate” olarak ifade edilir
*** Ekinokandinler (CAS, ANF, MYC) için “dirençli” kategorisi yoktur. >2 μg/ml “Duyarlı değil” olarak ifade
edilir.
31/35
 VURGULANACAK NOKTALAR
• AMB için eşik değerler belirlenmiş değildir. Antibiotic
medium-3 kullanılması MIK aralığını genişletebilir.
Ancak lot farklılıkları vardır.
• Eşik değerler sadece Candida türleri içindir.
• Candida türlerinde yapılan FLU duyarlılık testinde 24
ve 48 okumalarında duyarlıdan dirençliye bir değişim
olması durumunda, izolatın duyarlı olarak
raporlanmasının daha uygundur.
• FKS1 mutasyonu olan Candida kökenleri
ekinokandinlere 2 μg/ml değerinin üzerinde MIK
değerleri göstermeyebilirler. Tür bazında
epidemiyolojik eşik değerler uygulanabilir.
32/35
 VURGULANACAK NOKTALAR
• “Trailing” gösteren kökenlerin 24 saat sonundaki MIK
okuma değerleri, in vivo duyarlılık durumuyla daha iyi
uyum gösterir.
• “Trailing” açısından
– EUCAST yöntemi
– spektrofotometrik okuma
– E-test kullanılması
– ergosterol ölçümü
– pH<5.0 olan besiyeri kullanılması faydalı olabilir.

33/35
 KÜFLER İÇİN
SIVI DİLÜSYON

34/35
 YÖNTEM ÖZELLİKLERİ
M38 A2 (CLSI) E.DEF.9.1 (EUCAST)
Aspergillus spp., Fusarium spp., Rhizopus Konidya oluşturan küfler
spp., Pseudallescheria boydii, Sporothrix
schenkii’ nin miçelyal formu, dermatofitler *
Makrodilüsyon/mikrodilüsyon Mikrodilüsyon
RPMI- %0,2 Glukoz/ U tabanlı mikroplak RPMI- %2 Glukoz/ Düz tabanlı
0.2-2.5x104 CFU/ml (530 nm 1-2.5x105 CFU/ml
spektrofotometrik) ** (Hemositometrik)
35 oC (Alternaria spp. ve dermatofitler 30 oC) 35 ± 2 oC
Görsel okuma Görsel okuma
Rhizopus spp. 24 h Mucorales 24 h
Aspergillus, Fusarium, S.schenkii 48 h*** Diğerleri 48 h
Scedosporium spp. 72 h***
Dermatofitler 4 gün
Kırılma noktası: %50-100 Kırılma noktası:
Ekinokandinler MEK!!!! %100
* Dimorfikler, dermatofitler/ekinokandinler, diğer küfler/siklopiroks-terbinafin-griseofulvin
Ekinokandinler
değerlendirilmemiştir. ** Dermatofitler için hemositometrik ve 1-3x10 3 CFU/ml.

*** Ekinokandinler için üreme görülür görülmez, genelde 24 h daha MEK!!!!

kısa süreler uygulanır. 35/35
 M38-A2 Kırılma Noktaları
• AMB: %100
• ITC, VOR, POS, RAV : %80
• KET, FLU, FLC: %50 (dermatofit %80)
• Siklopiroks, girseofulvin, terbinafin: %80

36/35
 Ekinokandinler ve MEK
• Makroskobik: Mikrokoloniler ve granüler üreme
• Mikroskobik: Dallanmayan kısa hifler
Kaspofungin
Aspergillus spp.

37/35
 EPİDEMİYOLOJİK EŞİK
DEĞERLER (μg/ml)
M38 A2 (*) E.DEF.9.1
Cins/türler S I R
AMB Aspergillus spp.
Zygomycetes
ITC Aspergillus spp.
Alternaria, B.sipicifera
VOR Aspergillus Henüz
S.apiospermum-P.lilacinus 1 2 4 Tanımlanmamış
Alternaria, B.sipicifera tır

POS Aspergillus spp.

S.apiospermum-P.lilacinus
Alternaria, B.sipicifera
Zygomycetes
CAS Aspergillus spp.

* Mevcut değerlerin klinik uyumu hiçbir ilaç için gösterilmediğinden epidemiyolojik

eşik değerler olarak kabul edilmelidir 38/35
KÜF VE MAYALAR İÇİN
DİSK DİFÜZYON

39/35
 CLSI
MAYALAR (M44 A2) KÜFLER (M51 A)
Candida spp.
Müller Hinton agar plakları Müller Hinton agar plakları
+%2 glukoz ve 0.5 μg/ml metilen
mavisi
0,5 McFarland standardı OD 530: 0,09-0,30
(1-5 x 106 CFU/ml) ( 0,4-5,5 x 106 CFU/ml)
35 oC 35 oC
Diğer Candida spp. 24 h Zygomecetes 16-24 h
C.parapsilosis, C.krusei ve A.fumigatus, A.flavus, A.niger
C.glabrata: genellikle 48 h 24 h
Diğer küfler 24-72 h
FLU (25 μg), VOR (1 μg), CAS (5 μg) AMB (10 μg), ITC (10 μg), VOR (1
POS (5μg) için sadece kalite kontrol μg),
CAS (5 μg), POS (5 μg)
Zon sınırındaki mikrokoloniler ve Azoller için zonu aşan hifler,
zon içindeki iri koloniler göz ardı CAS için zon içi mikrokoloniler
40/35
 M44 DİSK DİFÜZYON
Candida spp. eşik değerleri (mm)
M-44S2
S S-DD R
FLU 19 15-18 ≤14
VOR 17 14-16 ≤13
CAS 11 - -
C.krusei kökenleri FLU’a intrensek dirençli olarak kabul edilirler
C.tropicalis ATCC 750 için VOR kalite kontrol değerleri yoktur

41/35
 M51 DİSK DİFÜZYON
eşik değerler (mm)

KÜFLER (M-51A)
S I R
AMB 15 13-14 ≤12

TRİAZOLLA
R 17 14-16 ≤13
CAS
AMB testi sadece zigomiçetler için önerilirken, ITC’nin zigomiçetlerde testi önerilmez

42/35
 VURGULANACAK NOKTALAR
• M44A DİSK DİFÜZYON
– Candida türleri için standardize edilmiştir
– FLU disk duyarlılık sonucu VOR ve muhtemelen POS
ve RAV için belirteçtir.
– Dirençli izolatlar mikrodilüsyon ile doğrulanmalıdır
– 24 h sonuçları, mikrodilüsyon MIK değerleri ve klinik
başarı ile daha uyumludur.

43/35
E-TEST

44/35
 E-TEST (MAYA)
• AMB, FLC, FLU, ITC, VOR, POS ve CAS
• RPMI+%2 glukoz (AM3, Casitone agar, YNB ve MHA-
GMB)
• İnokulum: Candida türleri 0.5 McFarland,
C.neoformans 1 McFarland
• 35 oC; Candida türleri 24-48 h, C.neoformans 48-72h
• AMB %100, FLC %90, diğerleri %80 inhibisyon
• AMB için MIK aralığı daha geniş
• M27 ile uyumu ±1-2 dilüsyon içerisindedir. Türlere
göre değişebilir (C.glabrata, C.tropicalis hariç)
45/35
 E-TEST

Mikrokoloniler “Trailing” Makrokoloniler %100 inhibisyon Mikrokoloniler

Tekrar üreme
AZOLLAR, FLC AMB EKİNOKANDİNLER

46/35
 E-TEST (KÜF)
• RPMI+%2 glukoz
• İnokulum: Aspergillus spp. 0.5 McFarland;
Fusarium ve Rhizopus spp. 1 McFarland
• 35 oC; Aspergillus ve Rhizopus türleri 16-24 h,
Fusarium spp. 24-48 h + oda ısısında 24-48 h
• AMB %100, azollar %80 inhibisyon
• Elipsi aşan hifler göz ardı edilir
• Yorum kriterleri henüz YOK
47/35
 Neo-sensitabs
• Rosco Diagnostica, Danimarka
• RPMI
• MHA (%2 glukoz ve 0.5 μg/ml metilen mavisi eklenmiş)

• AMB(10) • CICLO(50)
• CAS(5) • CTRIM(10)
• FLU(25) • ECONZ(10)
• FLC(1 ve 10) • KET(15)
• ITC(8) • MICO(10)
• POS(5) • NYS(50)
• VOR(1) • TER(30)

http://rosco.dynamicweb.dk
48/35
 AGAR DİLÜSYON
• Standardize değil
• Özellikle Malassezia spp. için uygun
• Candida, Aspergillus ve C.neoformans
ile ilgili çalışmalar var

49/35
TİCARİ HAZIR PANELLER

50/35
 Sensititre Yeast One
• Kolorimetrik, sıvı dilüyon
• TREK Diagnostic Systems, ABD
• AMB, ITC, FLU, FLC, VOR, POS,
RAV, CAS ve ANF panelleri
mevcuttur
• RPMI + %2 glukoz + Alamar
mavisi
+
• Mayalarda 35 oC, 24 saat www.mycology.adelaide.edu.au

– AMB 48 saat
• Küflerde 35 oC, 72 saat
• Candida türlerinde (C.glabrata ve C.tropicalis dışında)
M27 ile uyumlu
• Aspergillus, Fusarium, Scedosporium spp. için
denenmiş, M38 ile uyumlu 51/35
 Fungitest
• Sanofi Diagnostics,
Pasteur, Fransa
• 6 antifungalın ikişer
konsantrasyonu
• AMB (2 ve 8 μg/ml)
www.mycology.adelaide.edu.au
• FLU (8 ve 64 μg/ml)
• ITC (0.5 ve 4 μg/ml)
• KET (0.5 ve 4 μg/ml)
• Mikonazol (0.5 ve 8 μg/ml)
• FLC (2 ve 32 μg/ml)
52/35
• Kolorimetrik ASTY
• Kyokuto Inc., Japonya
• AMB, FLU, ITC, VOR, FLC, mikonazol ve
mikafungin panelleri mevcuttur
• Candida türleri ve Trichosporon asahii için CLSI
referans yöntemi ile kıyaslanabilir başarıya
sahip

Resimler
Dr.Ayşe Kalkancı
53/35
tarafından sağlanmıştır
 ATB Fungus 3
• BioMe´rieux, Fransa
• AMB: 6 konsantrasyon (0.5-16)
• FLC: 2 konsantrasyon (4,16)
• FLU: 8 konsantrasyon (1-128)
• ITC: 6 konsantrasyon (0.125-4)
• VOR: 8 konsantrasyon (0.06-8)
• Görsel/otomatik okuma
• Candida türleri 24 h, C.neoformans 48 h
• M27 ile %97.5, E.Def.7.1 ile %94.3 uyum

54/35
 VITEK 2 AST YS01
• BioMe´rieux, ABD
• 4 antifungalın 4 farklı konsantrasyonu
– FLU (1, 64)
– AMB (0.25, 16)
– FLC (1, 64)
– VOR (0.12, 8)
• Spektrofotometrik okuma
• M27 ile uyum 2 dilüsyon içi*

* J Clin Mic 2007; 45(11):3522-28. 55/35

 DENEYSEL YÖNTEMLER
• XTT/MTT redoks potansiyel ölçüm
yöntemleri
– Metabolik aktivite ile sarı-mor renk değişimi
• ”Flow cytometry”
– FUN-1, propidium iyodid,
dimetiloksakarbosiyanin iyodid veya akridin
oranj gibi vital boyalar
• Ergosterol düzeyi ölçümü
– “Trailing”

56/35
 MEVCUT STANDARTLAR
MAYALAR KÜFLER
YÖNTE CLSI EUCAST CLSI EUCAST
M
SIVI M27-A3 E.DEF.7.1 M38-A2 E.DEF.9.1
DİLÜSYO (1995-2008) (2008) (2002-2008) (2008)
N
DİSK M44-A2 YOK M51-A YOK
DİFÜZYO (2004-2009) (2010)
CLSI : Clinical and Laboratory Standards Institute
N
EUCAST : The European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing/
Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing (AFST)
European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID)

57/42
 MAYA SIVI DİLÜSYON
M27 A3 (CLSI) E.DEF.7.1 (EUCAST)
Candida spp. ve Cryptococcus Fermentatif mayalar
neoformans
Makrodilüsyon/mikrodilüsyon Mikrodilüsyon
RPMI- %0,2 Glukoz/ U tabanlı RPMI- %2 Glukoz/ Düz tabanlı
mikroplak mikroplak
0.5-2.5x103 CFU/ml 0.5-2.5x105 CFU/ml
35 oC 35 ± 2 oC
Görsel okuma 530 nm de spektrofotometrik okuma
Candida spp. 24 saat- Candida spp. 24 saat
Ekinokandinler
24/48 saat-AMB, FLC,
FLU 48 h diğer triazoller
C.neoformans 72 saat
AMB, FLC, AZOLLER, KANDİNLER AMB, FLC, AZOLLER, KANDİNLER
Kırılma noktası: AMB %100 Kırılma noktası: AMB %90 58/42
 EŞİK DEĞERLER (μg/ml)
M27 S3 (CLSI) E.DEF.7.1 (EUCAST)
Candida spp. Candida spp.
S S-DD R S S-DD R

Flukonazol 8 16-32 64 2 4 8

Itrakonazol 0,12 0,25- 1

0,5
Vorikonazol & 1 2 4 0,125 >0,125*

Flusitozin 4 8-16** 32

Kandinler 2***
* C.albicans, C.parapsilosis ve C.tropicalis dışındaki Candida türleri için yeterli bilgi birikimi yoktur.
Duyarlılık sınırının üzerinde MIK değeri çıkan izolatlarda tekrarlanan testte aynı sonuç alınması durumunda
dirençli olarak rapor verilebilir.
** “Intermediate” olarak ifade edilir
*** Ekinokandinler (CAS, ANF, MYC) için “dirençli” kategorisi yoktur. >2 μg/ml “Duyarlı değil” olarak ifade
edilir.
CLSI: C.glabrata için 32 μg/ml S-DD olarak ele alınmalıdır (Epidemiyolojik eşik değer). 59/42
 Kandinler/Candida Eşik
Değerleri
FKS1 mutasyonuna rağmen MIK <2 μg/ml !!.

Anidulafungin C.albicans, C.tropicalis, >0.5

Kaspofungin C.krusei
Mikafungin C.parapsilosis >4
Anidulafungin >0.5
Kaspofungin C.glabrata
Mikafungin >0.12
Pfaller MA ve ark. J Clin Microbiol 2010, 48:1592–1599.
Pfaller MA ve ark. Testing TCSfA (2010c) Clinical breakpoints for the echinocandins and
Candida revisited: integration of molecular, clinical, and microbiological data to arrive at
species-specific interpretive criteria. Drug Resist Updat (In press).

60/42
 VURGULANACAK NOKTALAR
• AMB
– Eşik değerler ?
– MIK aralığı dar. Antibiotic medium-3’de lot
farklılıkları !!.
• Eşik değerler sadece Candida türleri içindir.
• Candida türleri/FLU için 24 saat sonucu.
• “Trailing” durumunda 24 saat sonucu.
– EUCAST yöntemi
– E-test kullanılması
– spektrofotometrik okuma ergosterol ölçümü
– pH<5.0 olan besiyeri
61/42
 KÜF SIVI DİLÜSYON
M38 A2 (CLSI) E.DEF.9.1 (EUCAST)
Aspergillus spp., Fusarium spp., Rhizopus Konidya oluşturan küfler
spp., Pseudallescheria boydii, Sporothrix
schenkii’ nin miçelyal formu, dermatofitler *
Makrodilüsyon/mikrodilüsyon Mikrodilüsyon
RPMI- %0,2 Glukoz/ U tabanlı mikroplak RPMI- %2 Glukoz/ Düz tabanlı
0.2-2.5x104 CFU/ml (530 nm 1-2.5x105 CFU/ml
spektrofotometrik) ** (Hemositometrik)
35 oC (Alternaria spp. ve dermatofitler 30 oC) 35 ± 2 oC
Görsel okuma Görsel okuma
Rhizopus spp. 24 h Mucorales 24 h
Aspergillus, Fusarium, S.schenkii 48 h*** Diğerleri 48 h
Scedosporium spp. 72 h***
Dermatofitler 4 gün
Kırılma noktası: %50-100 Kırılma noktası:
Ekinokandinler MEK!!!! %100
* Dimorfikler, dermatofitler/ekinokandinler, diğer küfler/siklopiroks-terbinafin-griseofulvin
Ekinokandinler
değerlendirilmemiştir. ** Dermatofitler için hemositometrik ve 1-3x10 3 CFU/ml.

*** Ekinokandinler için üreme görülür görülmez, genelde 24 h daha MEK!!!!

kısa süreler uygulanır. 62/42
 M38-A2 Kırılma Noktaları
• AMB: %100
• ITC, VOR, POS, RAV : %80
• KET, FLU, FLC: %50 (dermatofit %80)
• Siklopiroks, griseofulvin, terbinafin: %80

63/42
 Ekinokandinler ve MEK
• Makroskobik: Mikrokoloniler ve granüler üreme
• Mikroskobik: Kısa, künt, şişkin, çok dallanan hifler
MEK
32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.13 0.06 0.03 No

MEC
A B

Kaspofungin/Aspergillus
64/42
Kurtz et al. Antimicrob Agents Chemother. 1994;38(7):1480–1489.
 KÜFLERDE EŞİK DEĞERLER

HENÜZ TANIMLANMAMIŞTIR
EPİDEMİYOLOJİK EŞİK DEĞER?
• VAHŞİ TİP OLARAK ADLANDIRILABİLEN
POPÜLASYONUN EN AZ %95’İNİ KAPSAYAN EŞİK MİK
DEĞERİDİR.

65/42
 DİSK DİFÜZYON
MAYALAR (CLSI, M44 A2) KÜFLER (CLSI, M51 A)
Candida spp.
Müller Hinton agar plakları Müller Hinton agar plakları
+%2 glukoz ve 0.5 μg/ml metilen
mavisi
0,5 McFarland standardı OD 530: 0,09-0,30
(1-5 x 106 CFU/ml) ( 0,4-5,5 x 106 CFU/ml)
35 oC 35 oC
Diğer Candida spp. 24 h Zygomecetes 16-24 h
C.parapsilosis, C.krusei ve A.fumigatus, A.flavus, A.niger
C.glabrata: genellikle 48 h 24 h
Diğer küfler 24-72 h
FLU (25 μg), VOR (1 μg), CAS (5 μg) AMB (10 μg), ITC (10 μg), VOR (1
POS (5μg) için sadece kalite kontrol μg),
CAS (5 μg), POS (5 μg)
Zon sınırındaki mikrokoloniler ve Azoller için zonu aşan hifler,66/42
zon içindeki iri koloniler gözardı CAS için zon içi mikrokoloniler
 M44 DİSK DİFÜZYON
Candida spp. eşik değerleri (mm)
M-44S2
S S-DD R
FLU 19 15-18 ≤14
VOR 17 14-16 ≤13
CAS 11 - -

C.krusei kökenleri FLU’a intrensek dirençli olarak kabul edilirler

67/42
 VURGULANACAK NOKTALAR
• Candida türleri için standardize edilmiştir
• FLU disk duyarlılık sonucu VOR ve
muhtemelen POS ve RAV için belirteçtir.
• Dirençli izolatlar mikrodilüsyon ile
doğrulanmalıdır.
• 24 h sonuçları mikrodilüsyon MIK değerleri ve
klinik başarı ile daha uyumludur.

68/42
 M51 DİSK DİFÜZYON
Eşik değerleri (mm)
KÜFLER (M-51A)
S I R
AMB 15 13-14 ≤12

TRİAZOLLA
R 17 14-16 ≤13
CAS
AMB testi sadece zigomiçetler için önerilir.
ITC’nin zigomiçetlerde testi önerilmez
69/42
ETEST

70/42
 ETEST
RPMI+Glukoz+MOPS
– RPMI 1640 (L-glutamin’li) 8.4 g 450 ml dH2O-Fitrasyon
– MOPS tamponu 34.5 g
– Bacto agar 15.0 g 450 ml dH2O-Otoklav
– D- Glucose 20.0 g
– 1M NaOH 80 – 90 mL
– Deiyonize su
ad 1000 mL 45°C’ de birleştir
pH 7.0 ayarla (1 N NaOH)
1000 ml tamamla
Petriye dök (4-5 mm)

• AM3, Casitone agar, YNB ve MHA-GMB

71/42
 ETEST-MAYA YÖNTEM
• SDA kültürü
• SF ile inokulum ayarla
– Candida türleri: 0.5 McFarland
– C.neoformans: 1 McFarland
• RPMI+%2 glukoz+MOPS
• Torba içinde, 35 oC’de inkübasyon
– Candida türleri 24-48 h
– C.neoformans 48-72 h

72/42
 ETEST-KÜF YÖNTEM
• SDA/PDA 3-7 günlük yatık kültür
• SF ile (Aspergillus için + %1 Tween 20) süspansiyon
• Steril tüpe aktar, 15 dk partiküller çöksün
• İnokulum ayarla
– Aspergillus spp. 0.5 McFarland
– Fusarium ve Rhizopus spp. 0.5-1 McFarland
• RPMI+%2 glukoz+MOPS (Taze plaklar kurutulmalı)
• Torba içinde, 35 oC’de inkübasyon
– Aspergillus ve Rhizopus türleri 18-24 h
– Fusarium spp. 24-48 h , sonra oda ısısında ilave 24-48 h

73/42
 Amfoterisin B

• %100
inhibisyon
• Tüm üremeler
dikkate alınır

Zon içi iri koloniler Zon içi küçük koloniler 74/42

Flusitozin
• %90 inhibisyon
• Silik üremeler
ve
mikrokoloniler
gözardı edilir

75/42
 AZOLLER

Mikrokoloniler “Mikrokoloni Trailing” Makrokoloniler

Dar elips Geniş elips
• %80 inhibisyon
• Üremede ilk değişiklik dikkate alınır
• “Mikrokoloni trailing” durumunda elips dikkate alınır.
76/42
EKİNOKANDİNLER
• %80 inhibisyon
• Üremede ilk
değişiklik
dikkate alınır
• Paradoksal
üreme gözardı
edilir

77/42
 ETEST-EŞİK DEĞERLER
MAYALAR İÇİN;
S S-DD I R
AMB 1* - - -
ANI, CAS 2 - - -
FLU 8** 16-32 - 64
ITC 0.125 0.25-0.5 - 1
VOR 1 2 - 4
FLC 4 - 8-16 32

* >1 ise olası dirençli ** C.krusei hariç

78/42
 MAYALARDA ETEST UYUM DEĞERLENDİRMELERİ
(2 dilüsyon)

% Uyumluluk değerleri AMB FLC FLU ITC VOR CA ANF

S
Dannaoui E ve ark. Clin
Microbiol Infect 2010
EUCAST 75 90 - 71 87 - -
Negri M ve ark. J Clin
Lab Analysis 2009
CLSI 83 - 64 63 - - -
Pfaller MA ve ark. J Clin
Microbiol 2010
CLSI 90. 93,2
2
Espinel Ingrof A ve ark.
Antimicrob Agents
CLSI - - - - - - 54-82a
Chemother 2010 88-
100b
Claudino AL ve ark.
Pharmazie 2008
CLSI 100 96,6 - - - - -
Matsumoto FE ve ark.
a:C.parapsilosis,
Can J Microbiol 2007
CLSI
C.guilliermondii;100 100 C.glabrata,
b: C.albicans, 67-100 45-90 88- -
C.krusei, C.tropicalis -
c
c: ITC ve FLU için düşük değerler C.glabrata ve C.tropicalis’ de c 100
gözlenmiştir.
79/42
 KÜFLERDE ETEST

Aspergillus/vorikonazol 80/42
 KÜFLERDE ETEST UYUM
DEĞERLENDİRMELERİ
Araştırma Detaylar % Not
Martos AI ve ark. CLSI, 82.4-100 A.niger ve A.glaucus
Med Mycol 2010 Aspergillus, hariç
CAS, ANF, MCF

Araujo J, Espinel CLSI, 92 24 saat

Ingrof I. A.fumigatus, 90 48 saat
Antimicrobial POS
Agents Chemother
2009

81/42
 ETEST AVANTAJ
• Kontaminasyon kolay fark edilir (Dilüsyon)
• AMB için MIK aralığı daha geniş
• İnokulüm düzeyi değişkenliklerine tolerans
gösterir
• MIK, mikroorganizma üreme hızlarından
etkilenmez
• 15 dilüsyonluk skalası vardır

82/42
 PİYASA BİLGİSİ (2010)
• 30’luk ambalaj: 270 Euro
Bütçe: 25,8 TL
• 100’lük ambalaj: 780 Euro

MEVCUT ANTİFUNGAL STRİPLER

Amphotericin B AP {0.002-32 μg/ml}
Anidulafungin AND {0.002-32 μg/ml}
Caspofungin CS {0.002-32 μg/ml}
Fluconazole FL {0.016-256 μg/ml}
Flucytosine FC {0.002-32 μg/ml}
Itraconazole IT {0.002-32 μg/ml}
Ketoconazole KE {0.002-32 μg/ml}
Posaconazole POS {0.002-32 μg/ml}
Voriconazole VO {0.002-32 μg/ml}
83/42
KOMBİNASYON TESTLERİ

84/42
 Fraksiyonel İnhibitör Konsantrasyon (FİK)
indeksi
MİK A -kombinasyon MİK B-kombinasyon
∑FİKİ=
MİK A
+ MİK B
∑FİKİ: ≤0.5 sinerji
>0.5-4.0 fark yok
> 4.0 antagonizma

• Her bir ilaç kendi kriterlerine göre önce tek olarak okunur
• Kombinasyon MİK değerinin okunması farklılıklar gösterir
• Meletiadis J ve ark. Antimicrobial Agents Chemother 2010, 54(2):602.
FİKİ: 0.5 sinerji ; >0.5-2.0 fark yok ; >2.0 Antagonizma
• Fothergill AW ve ark. Infect Dis Clin N Am 2006, 20:699.
FİKİ: 0.5 sinerji ; >0.5-1.0 fark yok ; >1.0 Antagonizma
85/42
 FİKİ HESAPLAMA YÖNTEMLERİ
1
2

4
3 2

0.25
86/42
2 0.25
 MİKRODİLÜSYON KOMBİNASYON TESTİ
A
16

8 ∑FİKİ= 1.7 + 0.7 = 0.39

8 4
4

2
∑FİKİ= 0.5 + 0.25 = 0.13
1 8 4

0.5

.25

0
B 16 8 4 2 1 0.5 .25 .13 .06 .03 .02 0
87/42
 ETEST KOMBİNASYON TESTİ
Yöntem 1
A A

MİK B

B
B

35 oC-48 saat MİK B(Kombi)

MİK A

MİK A (Kombi)

88/42
ETEST KOMBİNASYON TESTİ
Yöntem 2
A
B 3

1 saat
35 oC

1
2 3
35 oC-48 saat

MIK-Kombi B

MIK-A
MIK-B

4
89/42
ETEST KOMBİNASYON TESTİ
Sadece FL için MİK değeri
Kombinasyonda FL için MİK değeri

∑FİKİ= 0.125 + 8 = 0.66

0.38 24

YORUM: FARK YOK

Sadece CS için MİK değeri

Kombinasyonda CS için MİK değeri

Kiraz N, ve ark. Antimicrob Agents Chemother. 2010

90/42
 ETEST KOMBİNASYON TESTİ
Alternatif Değerlendirme Yöntemi

Sinerji 3 dilüsyon MİK azalması

Additif etki 2 dilüsyon MİK azalması
Fark yok <2 dilüsyon MİK azalması
Antagonizma 3 dilüsyon MİK artışı

Lewis RE ve ark. J Antimicrob Chemother 2002; 49:345-51,

91/42
Sıvı bazlı ticari sistemler
Sıvı bazlı ticari sistemler
 Sensititre YeastOne (TREK Diagnostic Systems)

• Kolorimetrik mikrodilüsyon testi (alamar blue)

• Antifungal ajanların liyofilize seri dilüsyonları
• MIK okuma kolaylığı (maviden kırmızıya renk değişikliği)
• 24 saat inkübasyon
• Düşük maliyet?
• Oda sıcaklığında 2 yıl
• Candida spp., Cryptococcus spp., Aspergillus spp. ve hızlı üreyen diğer
maya türleri

Sıvı bazlı ticari sistemler

 Sensititre YeastOne Pleytleri
Dilüsyon aralıkları (µg/ml)
Antifungaller
YO2 IVD YO9 (RUO) YO10 (CE)
Amfoterisin B 0.12-8 0.12-8

5-Fluorositozin 0.03-32 0.06-64 0.06-64

Anidulafungin 0.015-8 0.015-8

Kaspofungin 0.015-8 0.008-8 0.008-8

Mikafungin 0.008-8 0.008-8

Flukonazol 0.25-64 0.12-256 0.12-256

Itrakonazol 0.03-2 0.015-16 0.015-16

Posakonazol 0.008-8 0.008-8

Vorikonazol 0.008-4 0.008-8 0.008-8

Sıvı bazlı ticari sistemler
 ASTY colorimetric antifungal panel

• Kolorimetrik mikrodilüsyon testi (resazurin)

• Antifungal ajanların liyofilize seri dilüsyonları
• MIK okuma kolaylığı (maviden kırmızıya renk değişikliği)
• 24 saat inkübasyon
• Candida spp.

Sıvı bazlı ticari sistemler

24 saatte kategorik uyum %91.7, %0.7 BH, %7.6 ÇBH
48 saatte kategorik uyum %92.6, %5.1 BH, %2.3 ÇBH

Sıvı bazlı ticari sistemler

 CANDİFAST ES TWİN: Kolorimetrik antifungal duyarlılık testi
Yüzeyel mikoz tedavisindeki
CANDİFAST: antifungaller;
Kolorimetrik amfoterisin
identifikasyon B, nistatin,
ve antifungal flukonazol,
duyarlılık ketokonazol,
bir arada (2 in 1)
mikonazol,
Candida, Trichosporon, ekonazol,Rhodotorula,
Cryptococcus, flusitozin Saccharomyces
FUNGİFAST: Kolorimetrik identifikasyon ve antifungal duyarlılık bir arada (2 in 1)
Tek kritik konsantrasyon
Yüzeyel mikoz tedavisindeki antifungaller; amfoterisin B, nistatin, flukonazol, ketokonazol,
Candida spp., Cryptococcus neoformans, Saccharomyces cerevisiae
Her pleytte iki test,
mikonazol, inkübasyon
24 saat flusitozin
ekonazol,
Yüzeyel ve sistemik mikoz tedavisindeki antifungaller; amfoterisin B, flukonazol,
24 saat inkübasyon
itrakonazol ve flusitozin 2 konsantrasyon, vorikonazol tek konsantrasyon
24 saat inkübasyon

Sıvı bazlı ticari sistemler

 FUNGİFAST AFG
(ELITech Microbiology Reagents, France)

Yüzeyel ve sistemik mikoz

tedavisindeki 5 antifungal;
Amfoterisin B (3) Flukonazol
(4)
Itrakonazol (4)
Vorikonazol (3)
Flusitozin (4)

• Mayalar için kolorimetrik sıvı mikrodilüsyon testi

• Hızlı ve kolay kullanım
• 24 saat inkübasyon

Sıvı bazlı ticari sistemler

 Fungitest Kit (Bio-Rad Laboratories, France)

5 FC ➩ 2-32 μg/ml
AB ➩ 2-8 μg/ml
MCZ ➩ 0.5-8 μg/ml
KET ➩ 0.5-4 μg/ml
ITR ➩ 0.5-4 μg/ml
FLU ➩ 8-64 μg/ml

• Maya mantarları için kolorimetrik duyarlılık testi (IVD,CE)

• 2 farklı konsantrasyon
• 48-72 saat inkübasyon

Sıvı bazlı ticari sistemler

 Dirençli
suşlarda
uyum ?

Sıvı bazlı ticari sistemler

• Tüm merkezlerin CLSI ile uyumu %56-100
• Duyarlı izolatlarda uyum daha yüksek; dirençli izolatlar???
Sıvı bazlı ticari sistemler
 ATB FUNGUS (API-BioMerieux, France)
• Standardize sıvı mikrodilüsyon testi
– ATB FUNGUS; flusitozin ve amfoterisin B
– ATB FUNGUS 2; flusitozin, amfoterisin B, flukonazol, itrakonazol
– ATB FUNGUS 3; flusitozin, amfoterisin B, flukonazol, itrakonazol ve vorikonazol
• Candida spp. ve Cryptococcus neoformans
• 24-48 saat inkübasyon
• Bulanıklık değerlendirme

Sıvı bazlı ticari sistemler

Sıvı bazlı ticari sistemler
Sıvı bazlı ticari sistemler
 Integral Systems Yeasts (Liofilchem Diagnostics, Italy)

• Maya mantarları için kolorimetrik identifikasyon ve duyarlılık (2 in 1)

• Amfoterisin B, nistatin, flusitozin, flukonazol, vorikonazol,
itrakonazol, ketakonazol, mikonazol, klotrimazol, ekonazol
• 48 saat inkübasyon
• Tek konsantrasyon
Sıvı bazlı ticari sistemler
Sıvı bazlı ticari sistemler
Agar bazlı ticari sistemler
 Etest (Epsilometer test)
(AB Biodisk, Solna, Sweden)
• Dilüsyon ve difüzyon kombinasyonu
• Sürekli konsantrasyon gradyanı
• Standart iki katlık dilüsyonlara göre ara
değerler
• Daha hassas MİK değerleri
• Uygulama kolaylığı (disk difüzyon testi)

Agar bazlı ticari sistemler

Etest
• İnce, sağlam, gözeneksiz plastik
şeritler (5x60mm)
• Bir yüzünde ilaç
konsantrasyonlarını ve ilacın
kimliğini gösteren işaretler
• Diğer yüzde kurutulmuş stabil ilaç
konsantrasyonları
• Standardize yöntemdeki 15 farklı
iki katlık konsantrasyon aralığına
eşit

Agar bazlı ticari sistemler

• Hem maya hem de küfler
• RPMI 1640 agar (MOPS, %2
glukoz, %1.5 agar)
• 0.5 McFarland
• 24-48 saat inkübasyon

Agar bazlı ticari sistemler

 Paradoksal üreme
Trailing etki
Mikrokoloniler

Havasal miçeller

Homojen olmayan üremeler

Agar bazlı ticari sistemler

 Çok büyük hata;
AmB (%2.9-3.7) Flusitozin
(%0.2-0.4) 24 saatte daha
belirgin

Referans yöntemle muhtemel AmB dirençli 15 izolat (9 C. glabrata

and 6 C. krusei) Etest ile saptanamadı
Agar bazlı ticari sistemler
• AmB MİK >1µg/ml olan 2 C. albicans, 10 non-albicans Candida, Etest
saptayamadı
• ±2 dilüsyonluk esas uyum azoller için ≥%91, AmB için ≥%82
• Kategorik uyum FLU ve VORI için ≥%93, IT için ≥%80, AmB için ≥%88
• En iyi uyum oranları FLU ve VORI için C. albicans izolatlarıyla
• Çok büyük hatalar sadece AmB’de

Agar bazlı ticari sistemler

Etest ve M38-A arasında 48 saatte uyum oranları;
IT için %42.62, AmB için %73.8

Agar bazlı ticari sistemler

• Etest ve EUCAST sıvı mikrodilüsyon
• 54 izolat; F.proliferatum, F.verticilloides, F.solani, F.oxysporum, F.dimerum
• Itrakonazol, vorikonazol, posakonazol, amfoterisin B
• ±2 dilüsyonluk esas uyum;
– Itrakonazol ve vorikonazol için %100
– Amfoterisin B ve posakonazol için %96

Agar bazlı ticari sistemler

M38-A2 ve Etest için kategorik uyum
(sınır değer ≥1µg/ml)
AmB ile %87,
POS ile %67

Agar bazlı ticari sistemler

 Ticari disk difüzyon testleri
• Agar difüzyon; CLSI M44-A2 ve M51-A
• Belirli bir konsantrasyonda antifungal emdirilmiş kağıt diskler
• %2 glukoz, 0.5 µg/ml metilen mavili Mueller-Hinton agar
– Neo-Sensitabs tablet (A/S Rosco Diagnostica,
Denmark),
– Abtek Biological antifungal disks (Abtek Biologicals,
Liverpool, UK),
– BBL Sensi-Disc (BD Diagnostics, New Jersey, US),
– Fungdisc (Mast Group Ltd., Merseyside, UK)

Agar bazlı ticari sistemler

• BMD - disk difüzyon arası uyum M44-A Neo-sensitab
– FLU
%96.4 %95.5
– VOR
%95.5 %95.5
– ITRA
%95.5 %92.7
– CAS
≥%97.2 %94.5
– AmB
%100 %98.2

Agar bazlı ticari sistemler

• 483 izolat, M38-A ile uygun şartlar altında DD
• Çok büyük hata %0-1.8 ve büyük hata oranı %0.2-4.6
• Genel kategorik uyum %73-96 (AmB-CAS)

Agar bazlı ticari sistemler

• EUCAST ile uyum

– Sensititre YeastOne %50.5-90 (C.tropicalis %56, C.albicans

%90, AmB %50.5, FLU %90)
– Etest %87-92

– Neo Sensitab -0.89-0.93 (Negatif korelasyon)

– Fungitest 0.86-0.95 (Pozitif korelasyon)
• Uyumsuzluk
– Çok büyük hata; Neo Sensitab %5.4 FLU, %1.1 ITRA
– Büyük hata; Sensititre YeastOne %13 AmB; Etest Flusitozin ve ITRA %3.2;
Neo Sensitab %5 Flusitozin

Agar bazlı ticari sistemler

• Zigomiçetler için referans yöntemle
– Etest POS %95.7, AmB %96.5
– Sensititre YeastOne POS %100, AmB %99.3
• Aspergillus spp. için referans yöntemle
– Etest POS %97, AmB %96
– Sensititre YeastOne POS %99, AmB %95
• Mayalar için referans yöntemle
– Etest POS %83 (24 sa) - %94 (48 sa)
– Sensititre YeastOne POS %98 (24 sa) - %82(48 sa)
• Disk difüzyon için korelasyon katsayısı
– Küfler için POS disk 0.8, AmB disk 0.7-0.8; POS tb 0.8, AmB tb 0.75
– Mayalar için POS disk 0.6-0.8, POS tb 0.4-0.7

Agar bazlı ticari sistemler

Tam otomatize ticari sistemler
Otomatize sistemler
 VITEK 2 (Biomerieux)

 Tam otomatize, standardize ve hızlı (13 sa)

 Spektrofotometrik tespite dayalı ilk ticari otomatize antifungal duyarlılık
test sistemi
 Candida türlerinin yedi farklı antifungal ilacın iki katlık azalan
konsantrasyonlarına karşı duyarlılık testi
 64 kuyucuklu, küçültülmüş mikrodilüsyon
 Amfoterisin B, flukonazol, posakonazol, vorikonazol, kaspofungin,
mikafungin ve flusitozin
 Eş zamanlı olarak tam otomatize maya identifikasyonu

Otomatize sistemler
Otomatize sistemler
Çok büyük
hata %2
Otomatize sistemler
Otomatize sistemler
 Sonuç

• Riskli hasta sayısı artışı

• Invaziv fungal enfeksiyonlarda artış
• Yeni antifungallerin keşfi
• Dirençli mantar enfeksiyonları
• Antifungallerin yaygın kullanımı
• Tedavi kararına duyarlılık testlerinin katkısı

Tekrarlanabilirliği
. ve klinikle
uyumu yüksek ANTİFUNGAL
DUYARLILIK TESTLERİ
 Sonuç
Ticari sistemlerde;

• Test yöntemi
• Test edilen fungal tür
• Test edilen antifungalETKİLEYEBİLİR
• İnkübasyon süresi
• Kullanılan besiyeri
Genellikle referans yöntemlerle uyum oranları yüksek
 Antifungal susceptibility testing of Yeasts

Etest® is a stable gradient of different antibiotic

concentrations on a plastic strip. Etest® is used to
determine the Minimum Inhibitory Concentration
E-TEST (AB-Biodisk) (MIC) of antibiotics, antifungal agents and anti-
mycobacterial agents.

Media:
RPMI 1640 + 2% glucose + MOPS + 1.5 % bacto-agar
all antifungal agents
Modified Casitone agar
azoles only
Antibiotic Medium 3
amphotericin B only
 E-TEST (AB-Biodisk)

agar diffusion method for yeasts

Media: RPMI 1640 + 2% glucose + MOPS + 1.5 % bacto-agar

Method: Candida spp. 24 h culture

C. neoformans 48/72 h culture
Inoculum: 0.5 McFarland in NaCl (Candida spp.)
1.0 McFarland in NaCl (C.neoformans)

Inoculation: sterile swab

Incubation: 35°C (in plastic bag)

Reading: Candida spp. 24/48 h

C. neoformans 48/72 h
Reading: Amphotericin B 100%
Flucytosine 90%
Azoles 80%
Echinocandins 80%
 AZOLES

Figure 1: Figure 2:
Candida spp., Figure 3:
C. albicans, Figure 4: Figure 5:
slim ellipse with C. tropicalis,
clear endpoint C. albicans, C. parapsilosis,
trailing colonies discernable
MIC: 0.047 discernable trailing colonies
MIC: 0.094 ellipse
μg/mL ellipse MIC: 0.25 μg/mL
μg/mL with a lawn of
with a lawn of
microcolonies
microcolonies
MIC: 0.38 μg/mL
MIC: 0.19 μg/mL
AMPHOTERICIN B

Figure 11: Figure 12:

Figure 10: Candida spp.,
Candida spp., Candida spp.,
macrocolonies in slim ellipse and
clear endpoint microcolonies
MIC: 0.094 the ellipse
MIC: 3 μg/mL MIC: 3 μg/mL
μg/mL
FLUCYTOSINE

Figure 15:
Figure 14: C. albicans,
Figure 13: C. albicans, higher MIC with
C. tropicalis, macrocolonies in trailing colonies
trailing colonies the ellipse MIC: 8 μg/mL
MIC: 1 μg/mL MIC: ≥ 32 μg/mL
CASPOFUNGIN (ECHINOCANDINS)

Figure 16: Figure 17:

C. albicans, C. tropicalis, ellipse
"dip effect" - read with regrowth at the
the MIC at the higher concentration
bottom of the dip range ignore re-growth
MIC: 0.064 μg/mL MIC: 0.125 μg/mL
Antifungal susceptibility testing of moulds

E-TEST (AB-Biodisk)

Media:
RPMI 1640 + 2% glucose + MOPS + 1.5 % bacto-agar
all antifungal agents
Modified Casitone agar
azoles only
 E-TEST (AB-Biodisk)

agar diffusion method for filamentous fungi

Media: RPMI 1640 + 2% glucose + MOPS + 1.5 % bacto-agar

Method: culture 5/7 days, NaCl + Tween 80

Inoculum: species McF %T

Aspergillus 0.5 78-82%
Fusarium 0.5-1 68-70%
Rhizopus 0.5-1 68-70%

Inoculation: sterile swab

Incubation: 35°C (in plastic bag)

Reading: Aspergillus spp. 16/24 h

Fusarium spp. 24/48 h
Rhizopus spp. 16/24 h
Reading: Amphotericin B 100%
Azoles 80%
Echinocandins 80%
 CLSI EUCAST
M-27-A-3 protocol Document EDeF 7.2

Method: Candida spp. 24 h

Cryptococcus spp. 48 h

Inoculum: 0.5 McFarland

T= 75-77% (1-5 x106 CFU/ml)
1:1000 dilution in RPMI 1640 (0.2%) 2%
inoculate the plate with 100 ul
suspension (1-5 103 CFU/ml) 1-5 105 CFU/ml
Incubation: 35°C

Reading: Candida spp. 24/48 h 24h

Cryptococcus spp. 48/72 h
reading: Amphotericin B 100%
visual 5-FC 50% spectrophotometer
Azoles 50%
Echinocandins 50%
 CLSI M38-A2 protocol EUCAST
Document E.def 9.1
Method: Mould 5/7 days
Inoculum: ± 106 CFU/ml T%
Aspergillus spp. 80-82
S. apiospermum 68-71
Rhizopus spp. 68-71
Fusarium spp. 68-70
2%
1:50 dilute in RPMI 1640 inoculate the plate with
100 ul suspension (0.2-1 x105 CFU/ml)
Incubation: 35°C 1-5 105 CFU/ml

Reading: Zygomycetes 21-26 h

Aspergillus/ Fusarium/
Scedosporium 46-50 h
24/48 h
Reading: Amphotericin B 100%
visual Azoles 100% visual
Echinocandins MEC
C.parapsilosis E-test CLSI EUCAST
ATCC 22019
Amphotericine B 1-0.25 4-0.5 0.5-0.125
Anidulafungin 4-0.5
Caspofungin 2-0.25 4-0.5
Fluconazol 1-4(8) 4-1 4-1
Flucytosine 0.25-0.064 0.5-0.125 0.5-0.125
Itraconazol 0.25-0.064 0.5-0.125 0.125-0.031
Posaconazol 0.25-0.032 0.25-0.063
Voriconazol 0.064-0.016 0.125-0.063 0.125-0.031
C.krusei E-test CLSI EUCAST
ATCC 6258
Amphotericine B 2-0.5 4-1 0.5-0.12
Anidulafungin 0.125-0.016
Caspofungin 1-0.25 1-0.25
Fluconazol 64-16 128-16 32-8
Flucytosine 16-4 32-8 4-1
Itraconazol 1-0.25 1-0.25 0.25-0.063
Posaconazol 0.5-0.125 1-0.125
Voriconazol 1-0.25 1-0.125 0.25-0.063
 1 ml in 9 ml RPMI

100 ul
200 ul in 20ml RPMI

48/72 h 37°C
AMT

5FC

FLC

ITC

VOR

TERB

ANID

POSA

16 8 4 2 1 0.5 0.25 0,125 0.062 0.031 0.016 GC mg/l

 MEC for caspofungin in moulds

Growth control MEC

 YeastOne® Sensititre

Antifungal Agent Dilution Range

dilution rangeµg/ml
Amphotericin B 0.008 - 16
Caspofungin 0.008 - 16
Fluconazole 0.125 - 256
Itraconazole 0.008 - 16
Ketoconazole 0.008 - 16
Posaconazole 0.008 - 8
5-Flucytosine 0.03 - 64
Voriconazole 0.008 - 16
INOCULATION PROCEDURE (Candida and Cryptococcus spp.)

Density of approximately 1.5 - 8 X 103 CFU/ml is recommended.

1. Pick several colonies of >1mm diameter from a 24-hour culture.

2. Make a suspension into sterile water.
3. Vortex 15 seconds.
4. Adjust density to a 0.5 McFarland standard.
5. Transfer 20 µl of the suspension into 11 ml of YeastOne® inoculum broth, to give an
inoculum of 1.5 - 8 X 103 CFU/ml. Steps 1 and 2 should be completed in 15
minutes.
6. Transfer 100μl in to the plate.
INOCULATION PROCEDURE (Aspergillus spp.)

1. Subculture from Sabouraud dextrose agar on to Tasashio or

potato dextrose agar. Incubate for 7 days at 35° C to obtain
adequate sporulation.
2. Collect conidia with a cotton swab and suspend in sterile saline with
Tween.
3. Allow heavy particles to settle for 3 to 5 minutes.
4. Collect supernatant and mix with a vortex mixer.
5. Adjust turbidity of supernatant to 80 to 82% transmittance at 530nm
measured with a spectrophotometer equivalent to an inoculum of 0.6
– 5 x 106 CFU/ml. Alternatively, adjust to a 0.5 McFarland Standard .
6. Add 100µl to 11ml of YeastOne® inoculum broth to give a final
inoculum of 0.5-5 x 104 CFU/ml.
7. Transfer 100μl in to the plate
INCUBATION

Minimally incubate the plates for 24-25 hours at 35° C in a non-CO2 incubator.

Cryptococcus spp. should be incubated for 72 hours.

Aspergillus spp. should be incubated for 48 to 72 hours.

 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A pos PZ PZ PZ PZ PZ PZ PZ PZ PZ PZ PZ
0.008 0.015 0.03 0.06 0.12 0.25 0.5 1 2 4 8
B AB AB AB AB AB AB AB AB AB AB AB AB
0.008 0.015 0.03 0.06 0.12 0.25 0.5 1 2 4 8 16
C FZ FZ FZ FZ FZ FZ FZ FZ FZ FZ FZ FZ
0.12 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256
D IZ IZ IZ IZ IZ IZ IZ IZ IZ IZ IZ IZ
0.008 0.015 0.03 0.06 0.12 0.25 0.5 1 2 4 8 16
E KZ KZ KZ KZ KZ KZ KZ KZ KZ KZ KZ KZ
0.008 0.015 0.03 0.06 0.12 0.25 0.5 1 2 4 8 16
F FC FC FC FC FC FC FC FC FC FC FC FC
0.03 0.06 0.12 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64
G VOR VOR VOR VOR VOR VOR VOR VOR VOR VOR VOR VOR
0.008 0.015 0.03 0.06 0.12 0.25 0.5 1 2 4 8 16
H CAS CAS CAS CAS CAS CAS CAS CAS CAS CAS CAS CAS
0.008 0.015 0.03 0.06 0.12 0.25 0.5 1 2 4 8 16
Amphotericin B.
The first well showing a distinct color change as compared to the positive
growth well is the MIC.

Echinocandins.
The MIC should be read as the first well showing a less intense color
change as compared to the positive control well.
Flucytosine and Azole Antifungals.
flucytosine and azoles, may give endpoints that are typically less sharp
because of trailing growth, and may be a significant source of variability.
Trailing occurs when a slight colour change persists and it is often identical
for all drug concentrations above the MIC. The MIC should be read as the
first well showing a less intense color change compared to the positive
growth control well.

Itraconazole:
Itraconazole can occasionally come out of solution at concentrations
of ≥4 μg/ml. This can result in the affected well exhibiting growth
and turning red.
Contamination/ Skips
Alternatively, a pink (growth) well between blue (no growth) wells could
be indicative of contamination. Sub-culture well contents to ascertain the
cause. A blue well in a series of red growth wells indicates a “skip” and
should be ignored. The MIC should be read above any skip wells. If there
is more than one skipped well, the antifungal should not be reported.
ITRA 4 mg/l VOR 1 mg/l

POSA 0,5 mg/l Controle

VIPcheckTM