PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ CHỦ ĐỀ

1. Đặt vấn đề:

Chất lượng của các sản phẩm thực phẩm không chỉ bao gồm giá trị về mặt dinh
dưỡng mà còn cả giá trị về mặt cảm quan cũng như vệ sinh an toàn thực phẩm. Trong
đó, màu sắc là chỉ tiêu bắt buộc và rất quan trọng khi đánh giá chất lượng của bất kỳ
một sản phẩm thực phẩm nào. Một sản phẩm có màu sắc đẹp sẽ góp phần lôi kéo sự chú
ý của khách hàng. Hơn nữa, màu sắc của các sản phẩm thực phẩm còn có tác dụng sinh
lý rất rõ rệt. Màu sắc thích hợp sẽ góp phần giúp cơ thể đồng hóa thực phẩm đó dễ dàng
hơn.
Do đó, trong kỹ thuật sản xuất thực phẩm người ta không chỉ quan tâm đến việc
bảo vệ màu sắc tự nhiên mà còn tạo ra và bổ sung vào thực phẩm những chất màu mới
thích hợp với tính chất và trạng thái sử dụng của chúng.
Tuy nhiên, vấn đề sử dụng chất màu thực phẩm hiện nay đang tồn tại rất nhiều
bất cập. Việc vô ý hay cố ý bổ sung vào thực phẩm những chất màu không được phép
hoặc sử dụng vượt quá liều lượng quy định đã và đang gây ảnh hưởng nghiêm trọng
đến vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm, làm ảnh hưởng đến sức khoẻ và gây hoang mang
tâm lý người tiêu dùng.
Chính vì điều đó mà hiện nay trên thế giới, người ta đang tập trung nhiều nghiên
cứu để tìm cách hạn chế tối đa những tổn thất của sắc tố trong quá trình bảo quản, chế
biến đồng thời tách chiết các nhóm sắc tố từ những loại nguyên liệu tự nhiên rẻ tiền hay
tận dụng các phế phụ phẩm để thu nhận các nhóm sắc tố làm chất màu tổng hợp và ứng
dụng vào ngành công nghệ thực phẩm. Đó là do sắc tố tự nhiên có ưu điểm vượt trội
hơn, chúng không gây độc tính cho con người, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm hơn
so với các sắc tố tổng hợp nhân tạo (phẩm màu), mặc dù các nhóm sắc tố tự nhiên lại
có nhược điểm là rất dễ bị biến đổi và tổn thất trong các điều kiện môi trường…
2. Tổng quan về sắc tố trong thực vật:
Sắc tố là những hợp chất hóa học quy định màu sắc của nguyên liệu hoặc sản
phẩm. Mỗi loại nguyên liệu rau quả thì có một màu sắc đặc trưng khác nhau, đó là do
thành phần và tỷ lệ hàm lượng cũng như cường độ màu của các loại sắc tố có trong
nguyên liệu đó. Khi ăn uống, màu sắc của sản phẩm sẽ gây ấn tượng tốt, tạo cho con
người cảm giác hấp dẫn, dễ chịu, ăn uống thấy ngon hơn, thích thú hơn nhờ đó tăng
đươc mức độ tiêu hóa và làm tăng giá trị dinh dưỡng của thực phẩm. Chính vì vậy, sắc
tố được xem như một chỉ tiêu để đánh giá chất lượng cảm quan về màu sắc của các sản
phẩm thực phẩm đặc biệt là trong các sản phẩm rau quả.
Màu sắc của thực phẩm trước hết dùng để đánh giá nguồn gốc của nguyên liệu.
Mỗi loại nguyên liệu thường có màu sắc đặc trưng để nhận biết, ví dụ như cà chua có
màu đỏ, rau có màu xanh, bắp cải có màu trắng hoặc tím… Như vậy màu sắc là chỉ tiêu
cảm quan để xem xét chất lượng của sản phẩm.
Mặt khác, màu của sản phẩm cũng được hình thành trong quá trình chế biến hoặc
phối trộn nhiều nguyên liệu với nhau tạo thành dưới tác động của các yếu tố kĩ thuật
như nhiệt độ, pH …Ví dụ bánh mì luôn có màu vàng nâu do phản ứng caramen, xôi gấc
luôn có màu đỏ của gấc… Khi chế biến đúng kĩ thuật, màu sắc của sản phẩm thường
rất đặc trưng, thường những màu sắc nổi bật sẽ thu hút được người tiêu dùng.
Ngoài tác dụng tạo màu sắc thì các sắc tố còn có nhiều tác dụng sinh lý đáng quý
khác như khả năng chống oxy hóa, ngăn ngừa ung thư, chữa bệnh tim mạch, cải thiện
chức năng mắt và rất nhiều các bệnh khác, tùy theo từng nhóm sắc tố mà có chức năng
riêng.
PHẦN HAI: CHLOROPHYLL
1. Tổng quan về Chlorophyll:
1.1. Đặc tính của Chlorophyll:
Chlorophyll hay còn gọi là chất diệp lục hoặc diệp lục tố; có sắc tố màu xanh lá. Lượng
chlorophyll có trong tế bào phụ thuộc vào lượng sinh khối. Chlorophyll là thành phần
cực kỳ quan trọng của lá cây, là sắc tố quang tổng hợp màu xanh lá cây được tìm thấy
trong tất cả các cây xanh cũng như các loại tảo xanh, vi khuẩn lam. Chính nhờ
có chlorophyll mà lá cây có được màu xanh lục đặc trưng của mình, đồng thời đây cũng
là sắc tố chịu trách nhiệm cho quá trình quang hợp ở thực vật, là nguồn chủ yếu tạo ra
hợp chất hữu cơ và là nguồn duy nhất sinh ra oxy tự do.
Chlorophyll hấp thụ mạnh ánh sáng màu xanh dương, tiếp đến màu đỏ nhưng kém hấp
thụ ánh sáng màu lục trong dải quang phổ ánh sáng. Do đó, màu các mô chứa
chlorophyll có màu xanh lá cây.
1.2. Cấu trúc của Chlorophyll:
Chlorophyll có công thức phân tử là C55H70O6N4Mg . Gồm có chất diệp lục a, b, c, d
nhưng ở thực vật chiếm chủ yếu là chất diệp lục a, b.
Mỗi dạng diệp lục hấp thụ các bước sóng ánh sáng khác nhau. Chlorophyll a có màu
xanh lam, chlorophyl b có màu xanh vàng. Tỷ lệ của hai loại là 3/1. Hàm lượng chất
diệp lục càng cao thì màu xanh càng đậm. Thực vật có cả hai dạng chất diệp lục, cho
phép chúng hấp thụ hầu hết các bước sóng xanh lam và hầu hết các bước sóng đỏ. Sự
sụt giảm lớn ở giữa đồ thị gần các bước sóng màu xanh lục là do chất diệp lục phản xạ,
thay vì hấp thụ ánh sáng màu lục.

Trong đồ thị dưới đây, chlorophyll a hấp thụ các bước sóng màu xanh lam đậm và các
bước sóng màu đỏ sẫm. Chlorophyll b hấp thụ bước sóng ánh sáng màu lam và bước
sóng màu đỏ da cam.

Hình1:(Nguồn:
https://biologydictionary.net/)
Sự khác nhau giữa chlorophyll a và chlorophyll b là tại vị trí C7 ở chlorophyll a là nhóm
-CH3, còn ở chlorophyll b là nhóm -CHO.

Cấu trúc chlorophyll a Cấu trúc chlorophyll b

Hình 2. Cấu trúc các phân tử chlorophyll

1.3. Một số cấu trúc khác nhau của chlorophyll được tóm tắt dưới bảng sau:

Diệp lục tố a Diệp lục tố b Diệp lục tố c1 Diệp lục tố c2 Diệp lục tố d

Công
thức C55H72O5N4 C55H70O6N4 C35H30O5N4 C35H28O5N4 C54H70O6N4
phân Mg Mg Mg Mg Mg
tử

Nhóm
-CH=CH2 -CH=CH2 -CH=CH2 -CH=CH2 -CHO
C3

Nhóm
-CH3 -CHO -CH3 -CH3 -CH3
C7
 -CH2CH3 -CH2CH3 -CH2CH3 -CH=CH2 -CH2CH3
Nhóm
C8

- - - - -
Nhóm
CH2CH2COO CH2CH2COO CH=CHCOO CH=CHCOO CH2CH2COO
C17
-Phytyl -Phytyl H H -Phytyl

Liên
kết
Đơn Đơn Kép Đơn Kép
C17-
C18

Vi khuẩn lam
Tần Đa số thực Các loại tảo Các loại tảo
Phổ biến (cyanobacteri
suất vật khác nhau khác nhau
a)

Bảng 1: Các cấu trúc khác nhau của phân tử chlorophyll

2. Hàm lượng và thành phần chlorophyll trong rau quả:

Trong các phần xanh của cây, chlorophyll có trong tổ chức đặc biệt, phân tán trong
nguyên sinh chất gọi là lục lạp ( Chloroplast ) hay hạt diệp lục.
Hàm lượng của chlorophyll trong cây xanh chiếm khoảng 1 chất khô.
3. Ứng dụng của Chlorophyll trong thực phẩm:
3.1. Trong y dược:
Trong tự nhiên, chất diệp lục đóng vai trò quan trọng như vậy thế nhưng mãi đến đầu
thế kỷ 20 người ta mới có những nghiên cứu chi tiết về nó. Kết quả là đã có 2 giải Nobel
được trao cho những nghiên cứu về chlorophyll từ năm 1915 đến năm 1935. Qua đó
người ta đã xây dựng được cấu trúc hóa học của Chlorophyll và hiểu hơn về công dụng
của Chlorophyll đối với sức khỏe con người.
3.1.1. Chlorophyll thải độc tố cơ thể:
Chlorophyll có khả năng ngăn cản độc tố hấp thu vào cơ thể qua ruột non theo cơ thể
tạo phức. Một số độc tố (bao gồm các kim loại nặng) bị bất hoạt do tạo phức với
chlorophyll tạo nên chất có phân tử lượng lớn không hấp thu qua đường tiêu hóa và cơ
thể được, từ đó bị thải trừ.
Chlorophyll hỗ trợ , kích thích men gan hỗ trợ chức năng gan thải độc tố. Vì những lý
do trên, Chlorophyll được cho rằng sử dụng hàng ngày có tác dụng bảo vệ cơ thể khỏi
những chất độc hại, phòng ngừa bệnh tật.
3.1.2. Chlorophyll khử mùi hôi cơ thể;
Chlorophyll có khả năng khử mùi hôi cơ thể hiệu quả. Chlorophyll là một thành phần
quen thuộc trong singgum (kẹo cao su), nước xúc miệng để phòng ngừa hôi miệng.
Chlorophyll cũng có mặt trong một số loại xà phòng khử mùi. Hiện nay chlorophyll
dạng uống (viên nén, viên nang, bột) khá phổ biến do tính thuận tiện của nó.
3.1.3. Chlorophyll kháng khuẩn, rút ngắn thời gian làm lành vết thương:
Chất diệp lục (chlorophyll) trong lá cây góp phần quan trọng trong việc điều trị các vết
thương nhiễm trùng do có đặc tính kháng khuẩn, ức chế sự phát triển của vi trùng.
Trước khi phát minh ra kháng sinh, đặc tính kháng khuẩn của chlorophyll đã từng tạo
nên cơn sốt. Người ta kỳ vọng chlorophyll sẽ cứu giúp hàng triệu người thoát khỏi cái
chết do vết thương nhiễm trùng. Cho đến ngày nay, chlorophyll dạng thuốc mỡ vẫn
đang được sử dụng.
3.1.4. Chlorophyll kích thích tiêu hóa:
Các trường hợp táo bón cấp hay mãn tính có thể cải thiện tình trạng của mình khá rõ rệt
bằng cách sử dụng chlorophyll đường uống do có khả năng cải thiện chức năng đường
tiêu hóa. Ngoài ra, Chlorophyll còn hữu ích đối với các trường hợp trào ngược dạ dày-
thực quản hay hở tâm vi.
3.1.5. Chlorophyll phòng chống ung thư:
Hiện tại đã có nhiều bằng chứng cho thấy những người có chế độ ăn giàu chlorophyll có
tỷ lệ nhiễm ung thư thấp hơn rõ rệt so với thông thường. Các nghiên cứu về công dụng
phòng chống ung thư của chlorophyll vẫn đang tiếp diễn. Những kết quả ban đầu cho
thấy tiềm năng của chlorophyll ở khía cạnh phòng chống ung thư là rất sáng sủa.
3.1.6. Chlorophyll hỗ trợ điều trị thiếu máu:
Chlorophyll có cấu trúc hóa học tương đồng đặc biệt với hemoglobin, huyết sắc tố hồng
cầu máu. Từ đặc điểm đó, người ta đã thử nghiệm và đưa chlorophyll vào sử dụng để
điều trị thiếu máu và cho kết quả rất tốt.
3.2. Trong công nghiệp:
Trong thực phẩm Chlorophyll cũng là một chất màu thực phẩm được sử dụng để bổ
sung trong một số sản phẩm bánh kẹo, súp, sốt, các sản phẩm trái cây, nước chấm, mứt,
nước giải khát hoặc dầu thực vật để tăng giá trị cảm quan.
Chlorophyll được bổ sung trong kem đánh răng (chống hôi miệng, chống sâu răng), xà
phòng (kháng nấm, kháng khuẩn), nhuộm màu nước hoa, mỹ phẩm...
Chlorophyll tạo màu tự nhiên cho sản phẩm thu hút người tiêu dùng.
 Hình 3: Các sản phẩm tiêu dùng có chứa Chlorophyll

4. Tách chiết màu xanh (Chlorophyll) từ thực vật (lá cây

Vật liệu tách chiết thông thường của các phương pháp tách chiết nói chung.

• Lá cây màu xanh • Cốc nhựa, bình chia độ, pipet

• Cối và chày • Bút, thước,..
• Giấy lọc cắt thành các dải 2,5 cm • Phễu chiết thủy tinh
x 10 cm • Máy cô quay chân không
• Dung môi hữu cơ • Hệ thống lọc chân không.
• Giấy sắc ký

Hình 4: Vật liệu tách chiết

 Hình 5: Máy cô quay chân không và hệ thống lọc được dùng để thu cao tổng và
cao phân đoạn
4.1. Phương pháp chạy sắc ký:
4.1.1. Cơ sở lý thuyết:
Lá xanh chứa một hỗn hợp của hai hoặc nhiều sắc tố sau: diệp lục a, diệp lục b,
xanthophylls, carotene và phaeophytin. Do cấu trúc phân tử của chúng, mỗi loại phân
tử sắc tố sẽ liên kết với dung môi ở các vị trí khác nhau khi nó chạy trên giấy lọc. Kỹ
thuật này được gọi là chạy sắc ký. Trong giấy sắc ký, bạn sẽ thấy các màu khác nhau
tương ứng với các sắc tố cụ thể. Chất diệp lục a có màu xanh lam đậm, chất diệp lục b
có màu xanh lục vàng nhạt, carotene có màu vàng tươi và xanthophyll có màu xanh lục
vàng nhạt.
Dựa vào màu sắc và tốc độ chạy của các chất khác nhau trong một dung môi cụ thể nào
đó, chúng ta sẽ tách chiết riêng biệt Chlorophyll với các chất khác từ dung dịch tách
chiết lấy từ thực vật.
Phương pháp này chỉ áp dụng trong phạm vi phòng thí nghiệm, dùng trong định tính
Chlorophyll, không phù hợp trong sản xuất màu trong công nghiệp với quy mô lớn.
4.1.2. Quy trình tách chiết bằng sắc ký giấy:

Hình 6: Quy trình tách chiết trên giấy sắc ký

1. Dùng bút chì và thước kẻ để đánh dấu một đoạn thẳng cách một đầu sắc ký giấy
2 cm.
 2. Đặt một chiếc lá cây lên đường bút chì trên giấy sắc ký vừa kẻ. Sử dụng một
đồng xu vạch trên đầu chiếc lá để tạo ra một mảng màu sẫm của lá ngay đường
bút chì trên giấy sắc ký. (Thao tác này trong quy trình có thể thay thế bằng việc
cắt nhỏ lá cây, nghiền lá cây trong dung môi hữu cơ và dùng ống mao quản để
chấm lên giấy sắc ký).
3. Đổ 10-15 mL ethanol vào 1 cốc nhựa.
4. Dựng giấy sắc ký vào trong cốc lên sao cho vạch màu sẫm ở gần ethanol. Không
để vạch màu tiếp xúc trực tiếp với ethanol. Để ethanol đi lên trên giấy sắc ký và
đi qua vạch màu. Gấp phần trên của sắc ký qua vành cốc để giúp nó thẳng đứng.
(như hình 3).
5. Quan sát kỹ vạch sắc tố trong 10 phút tiếp theo.
6. Sử dụng bút chì màu để phác thảo các quan sát của bạn trên sơ đồ giấy sắc ký và
xác định vị trí các chất có trên giấy sắc ký.
4.2. Phương pháp tách chiết dùng dung môi hữu cơ:
4.2.1. Cơ sở lý thuyết:
Do nhân Mg trong vòng pyron mang tính tan trong nước và kết hợp với protein màng,
trong khi đó đuôi dài cacbon của gốc rượu phytol lại mang tính kị nước và hướng tới
cấu trúc lipid của màng tilacoit, nên phân tử chlorophyll chủ yếu hòa tan trong các dung
môi hữu cơ. Tuy nhiên để tách tốt chlorophyll ra khỏi lá, người ta không dùng ether
petrol hay benzen mà dùng cồn hoặc acetone, methanol, ethanol, DMSO (dimethyl
sunfoxide), pha với một ít nước để tách được hết phân tử chlorophyll từ lá do
chlorophyll tan trong các dung môi hữu cơ này.
4.2.2. Quy trình tách chiết bằng dung môi hữu cơ
a. Chiết rút sắc tố từ lá:
1. Dùng kéo cắt nhỏ lá cây thành những miếng nhỏ vào cối sứ. Bỏ phần cuống lá
và gân lá.
2. Dùng chày để nghiền mẫu lá với một ít dung môi (cồn hoặc acetone 80%) thành
một thể đồng nhất.
3. Thêm một ít dung môi để rửa cối và chày, lọc dung dịch qua hệ thống giấy lọc
vào ống nghiệm, thu được dung dịch màu xanh lục.
b. Tách sắc tố Chlorophyll ra khỏi các sắc tố thành phần:
4. Lấy một lượng benzen gấp đôi lượng dung dịch tách chiết sắc tố, lắc đều và để
yên trong vài phút và quan sát hiện tượng.
5. Dung dịch phân thành 2 lớp màu khác nhau:
- Nhóm Chlorophyll có màu xanh lục nằm phía trên phần dung dịch do tan trong
acetone.
 - Nhóm Carotene có màu vàng nằm phía trên phần dung dịch do tan trong benzen.

Hình 7: Các nhóm sắc tố đã được phân tách riêng.

c. Thu nhận màu xanh của Chlorophyll từ dung dịch tách chiết tạo cao tổng:
Thu nhận phần dung dịch phía trên có màu xanh có chứa chlorophyll, sau đó đem ly
tâm dung dịch 6000 vòng/phút trong 10 phút. Dịch trong được thu hồi để cô đặc bằng
máy cô quay chân không để tạo thành chlorophyll dạng cao tổng.
4.3. Phương pháp ngâm dầm:
4.3.1. Cơ sở lý thuyết:
Phương pháp ngâm dầm (phương pháp tách rắn-lỏng) là phương pháp ngâm vật liệu
thực vật(lá cây) đã được xay nhuyễn trong dung môi EtOH hoặc MeOH trong khoảng
thời gian nhất định(24-48h). Sau đó lọc dịch chiết có chứa Chlorophyll bằng hệ thống
lọc. Tiếp tục ngâm vật liệu thực vật (lá cây) trong dung môi mới (thực hiện 3 lần) để
đảm bảo toàn bộ chất tan trong vật liệu được chiết kiệt, thu được dung dịch chiết rút sắc
tố từ lá. Tiến hành cô quay chân không để thu được cao tổng.
Trong thành phần của cao tổng có nhiều chất, do trong lá có thể có nhiều chất tan trong
dung môi hữu cơ ngoài chlorophyll, mỗi chất có độ phân cực khác nhau. Ta cần thu
riêng từng chất để kiểm tra hoạt tính sinh học.
Để thu riêng từng chất, ta dùng phương pháp phân tách lỏng-lỏng, phương pháp này
hoạt động dựa trên cơ sở sự phân bố của các chất vào 2 pha lỏng không trộn lẫn được
vào nhau. Các chất phân cực sẽ tan trong dung môi phân cực và ngược lại.
Từ cao phân đoạn tiến hành xác định hoạt tính sinh học để xác định các chất.
4.3.2. Quy trình tách chiết:
a. Chiết rút sắc tố từ lá:
Ngâm lá cây được giã nhuyễn trong dung môi hữu cơ EtOH để chiết rút sắc tố từ lá, do
chlorophyll tan được trong EtOH. Thu dịch chiết bằng hệ thống lọc. Ngâm thêm khoảng
2-3 lần để đảm bảo tách được toàn bộ sắc tố của lá.
b. Thu nhận cao tổng:
Dùng máy cô quay chân không để cô đặc dung dịch chiết rút sắc tố từ lá, thu được cao
tổng EtOH
c. Thu nhận cao phân đoạn:
Từ cao tổng EtOH ta thêm khoảng 40ml H20 khuấy đều và thêm 40ml hexan vào phễu
chiết thủy tinh, lắc đều và để yên trong khoảng 30 phút. Sau 30 phút, dung dịch tách
thành 2 phần: phần cao nước phía dưới và phần cao hexan phía trên, do hexan nhẹ hơn
nước. Cô quay phần dung dịch hexan thu được cao hexan có chứa các chất không phân
cực tan được trong hexan.
Phần nước cho thêm 40ml ethyl acetate vào phễu chiết thủy tinh, lắc đều và để yên trong
30 phút. Sau 30 phút, dung dịch cũng tách thành 2 phần: phần cao nước phía dưới và
phần cao ethyl acetate phía trên, do ethyl acetate nhẹ hơn nước. Cô quay phần dung
dịch ethanol thu được cao ethanol có chứa những chất phân cực tan trong ethyl acetate,
bao gồm chlorophyll do có nhóm cacbonyl.
Tiến hành thử hoạt tính sinh học để xác định các chất có trong các cao phân đoạn.
5.Tài liệu tham khảo:
1. https://www.pasco.com/resources/lab-experiments/633
2. https://biologydictionary.net/
3. Fleming Ian, (14 October 1967), Absolute Configuration and the Structure of
Chlorophyll, nature 216 (5111), 151–152
4. Tài liệu môn học thực tập sinh học đại cương 2, khoa Công nghệ Sinh học, trường
ĐH Khoa học tự nhiên.