TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC – KHOA Y DƯỢC

Báo cáo thực hành Lý Sinh

Nhóm
Thành viên: Phạm Trung Kiên
Bùi Diệu Linh
Nguyễn Thái Hoàng
Văn Trọng Minh
Đào Việt Nam
 MỤC LỤC
Bài 1. Xác định năng lượng hoạt hóa của quá trình co bóp tim ếch tách 3
rời ……………………………………………………….................................
1.1.Lý thuyết…………………………………………………………….. 3
1.2.Mục tiêu……………………………………………………………... 4
1.3.Thực 5
hành……………………………………………………………
1.4.Kết quả………………………………………………………………. 7
1.5.Giải thích……………………………………………………………. 7
1.6.Tài liệu tham khảo………………………………………………….. 8
Bài 2. Tính thấm một chiều của da ếch……………………………………. 9
2.1.Lý thuyết…………………………………………………………….. 9
2.2.Mục tiêu……………………………………………………………... 10
2.3.Thực 11
hành……………………………………………………………
2.4.Kết quả………………………………………………………………. 13
2.5.Giải thích……………………………………………………………. 13
2.6.Tài liệu tham khảo………………………………………………….. 13
Bài 3. Xác định độ bền của màng tế bào hồng cầu ……………………….. 14
3.1.Lý thuyết…………………………………………………………….. 14
3.2.Mục tiêu……………………………………………………………... 16
3.3.Thực 16
hành……………………………………………………………
3.4.Kết quả………………………………………………………………. 16
3.5.Giải thích……………………………………………………………. 17
3.6.Tài liệu tham khảo………………………………………………….. 17
Bài 4. Đo kích thước tế bào trên kính hiển vi……………………………... 18
4.1.Lý thuyết…………………………………………………………….. 18
4.2.Mục tiêu……………………………………………………………... 20
4.3.Thực 20
hành……………………………………………………………
4.4.Kết quả………………………………………………………………. 21
4.5.Tài liệu tham khảo………………………………………………….. 22
Bài 5. Xác định thế Dzeta của tế bào bằng phương pháp vi điện di …….. 23
5.1.Lý thuyết…………………………………………………………….. 23
1
 5.2.Mục tiêu……………………………………………………………... 25
5.3.Thực hành…………………………………………………………… 26
5.4.Kết quả………………………………………………………………. 28
5.5.Giải thích……………………………………………………………. 28
5.6.Tài liệu tham khảo………………………………………………….. 28
Bài 6. Định lượng protein bằng phương pháp quang phổ hấp thụ……… 29
6.1.Lý thuyết…………………………………………………………….. 29
6.2.Mục tiêu……………………………………………………………... 29
6.3.Thực hành…………………………………………………………… 30
6.4.Kết quả………………………………………………………………. 30
6.5.Tài liệu tham khảo………………………………………………….. 31
Bài 7. Quan sát hiện tượng huỳnh quang…………………………………. 32
7.1.Lý thuyết…………………………………………………………….. 32
7.2.Mục tiêu……………………………………………………………... 34
7.3.Thực hành…………………………………………………………… 34
7.4.Kết quả………………………………………………………………. 34
7.5.Giải thích……………………………………………………………. 36
7.6.Tài liệu tham khảo………………………………………………….. 36

2
 Bài 1
XÁC ĐỊNH NĂNG LƯỢNG HOẠT HÓA CỦA QUÁ TRÌNH
CO BÓP TIM ẾCH TÁCH RỜI

1.1. LÝ THUYẾT
Động học nghiên cứu tốc độ của phản
ứng (hay quá trình) và sự phụ thuộc của nó
vào các yếu tố như nhiệt độ, nồng độ và sự
có mặt của chất xúc tác hoặc ức chế.
Để một phản ứng hóa học xảy ra thì các
nguyên tử, phân tử của chất tham gia phải
thay đổi, sắp xếp lại cấu trúc của nó và hình
thành nên một trật tự cấu trúc mới trong sản
phẩm của phản ứng. Muốn vậy, nguyên tử
hoặc phân tử phải có một năng lượng tối
thiểu để vượt qua hàng rào lực đẩy giữa các
lớp vỏ điện tử để liên kết với nhau, do đó
năng lượng hoạt hóa là năng lượng tối
thiểu cần thiết để nguyên tử, phân tử có
thể tham gia vào phản ứng. Kí hiệu là Ehh
Theo Maxwell – Boltzmann, sự phân bố phân tử theo năng lượng có dạng
như trên hình 1. Những phân tử nào có năng lượng bằng hoặc lớn hơn Ehh (là
những phân tử có năng lượng nằm bên phải đường thẳng Ze) là có khả năng tham
gia vào phản ứng tạo thành sản phẩm.
Khi nhiệt độ thay đổi, làm thay đổi động năng do chuyển động nhiệt của các
phân tử. Do đó tổng năng lượng của các phân tử cũng thay đổi. Chẳng hạn khi
nhiệt độ tăng lên (T2 > T1) thì năng lượng của các phân tử tăng lên, phân tử có
năng lượng bằng hoặc lớn hơn Ehh sẽ nhiều hơn, thể hiện ở đường cong phân bố
Maxwell – Boltzmann dịch sang bên phải, do vậy chúng có khả năng tham gia
vào phản ứng nhiều hơn làm cho tốc độ phản ứng tăng lên.Để tăng tốc độ của
phản ứng hoá học, ta thường tăng nhiệt độ. Mối liên quan giữa tốc độ và phản
ứng và nhiệt độ được biểu diễn qua phương trình Arhenius.
− Ehh
K= pze RT (1.1)

3
trong đó: K – tốc độ của phản
ứng; Ehh – năng lượng hoạt
hóa; P – yếu tố lập thể; R –
hằng số khí; Z – hệ số va chạm;
T – nhiệt độ tuyệt đối.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc

1
của lnK vào đại lượng T được
thể hiện trên hình 2. Đồ thị này
có ý nghĩa quan trọng, dựa vào
nó chúng ta có thể xác định
được giá trị năng lượng hoạt
hóa của một quá trình:
Ehh
tgα= (1.2)
R
Năng lượng hoạt hóa còn có thể được xác định thông qua một đại lượng
khác, đại lượng Q10. Đại lượng Q10 hay còn được gọi là hệ số Van’t Hoff. Đại
lượng này là tỷ số giữa hai hằng số tốc độ của phản ứng ở điều kiện chênh lệch
nhau 10 độ Censius (10oC).
K 2 KT +10
Q 10= = (1.3)
K1 KT
Trong đó: K1 – hằng số tốc độ của phản ứng ở nhiệt độ ban đầu T1; K2 –
hằng số tốc độ của phản ứng ở nhiệt độ T2 = T1 +10;
Đại lượng Q10 có nghĩa quan trọng. Nó cho biết hằng số tốc độ của phản ứng
tăng hay giảm bao nhiêu lần khi nhiệt độ thay đổi 10oC. Biểu thức toán học thể
hiện mối liên quan giữa năng lượng hoạt hóa của quá trình đại lượng Q10 như
sau:
Ehh=0,46. T 1. T 2. lgQ 10 (1.4)
Trong hệ sinh học Q10 chính là tốc độ của phản ứng hoá học của một cơ quan
trong cơ thể .Trong thí nghiệm này. Q10 chính là tần số co bóp của tim ếch.
Trong hệ sinh học, Q10 xấp xỉ 1,7; trong hệ hoá học Q10 từ 2-4 bởi vì mọi phản
ứng trong cơ thể chỉ xảy ra trong một phạm vi giới hạn nhiệt độ nhất định. Nếu
tăng nhiệt độ vượt ngưỡng cho phép thì thành phần các enzim xúc tác các phản
ứng bị biến đổi làm cho phản ứng không thể xảy ra.
Trong thực nghiệm chúng ta có thể xác định đại lượng Q10 và do vậy việc tính giá
trị năng lượng hoạt hóa của một quá trình (nhất là quá trình sinh học) trở nên dễ
dàng. Mục đích của bài thực tập là xác định năng lượng hoạt hóa của quá trình co
bóp tim ếch tách rời.

4
1.2. MỤC TIÊU:
1. Xác định được đối tượng nghiên cứu của động học;
1. Nắm vững năng lượng hoạt hóa của một phản ứng (một quá trình);
2. Mô tả mối liên quan giữa hằng số tốc độ của phản ứng với nhiệt độ;
3. Nắm vững bản chất của đại lượng Q10 và ý nghĩa của nó;
4. Thành thạo phương pháp cô lập tim ếch và tính năng lượng hoạt hóa
của một quá trình sinh học.
1.3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HÀNH:
1.3.1. Dụng cụ, hóa chất và vật liệu:
- 1 kéo to - 1 bàn xốp để ghim ếch
- 1 kéo con - 2 công tơ hút
- 1 chọc tủy - 3 bình tam giác có nút cao su
- 1 khay mổ dài hai lỗ
- 10 đinh ghim - 1 nồi cách thủy
- 4 cốc thủy tinh - 1 khay (chậu) nước đá
- 4 canuyl - 2 nhiệt kế loại 0 – 50oC
- 1 cuộn chỉ - 1 lít dung dịch Ringer dung cho
- 2 khăn lau dùng để mổ động vật biến nhiệt
- 4 con ếch / nhóm - 1 đồng hồ bấm giây
1.3.2. Các bước tiến hành:
1. Tách rời tim ếch:
Bước 1: Gây tê ếch
Dùng kim chuyên dụng chọc tủy ếch
Bước 2: Cách mổ ếch
- Đặt ếch lên bàn mổ, dung ghim cố định bốn chi ếch vào bàn mổ.
- Dùng kéo to mở rộng xoang ngực ếch, cẩn
thận cắt bỏ màng bao tim sẽ thấy tim ếch cùng hai
động mạch: một rẽ sang trái, một rẽ sang phải từ
động mạch chủ. Nhẹ nhàng lật tim ếch lên sẽ thấy
tĩnh mạch chủ phía dưới.
- Dùng kéo panh nhỏ, luồn sợi chỉ dài
chừng 15-20cm xuống dưới hai động mạch và tĩnh
mạch chủ. Cẩn thận trong khi luồn chỉ qua tĩnh
mạch vì thành tĩnh mạch rất mỏng nên dễ bị rách.
- Thắt chặt tĩnh mạch chủ và động mạch
phía phải của ếch.
Nhẹ nhàng kéo sợi chỉ để nâng động mạch
trái lên, cắt vát một đường, tạo một lỗ nhỏ để luồn
canuyl có chứa dung dịch Ringer (dung dịch sinh
lý máu lạnh) vào sâu trong tâm thất. Sự xuất hiện
5
cột máu trong canuyl khi tim co bóp đẩy lên chứng tỏ canuyl đã đưa vào đến
tâm thất.
- Dùng ống hút rút bỏ máu trong canuyl, tiếp tục cho dung dịch Ringer
vào canuyl để rửa tim cho đến khi toàn bộ máu trong tim đã được thay thế hết
bằng dung dịch Ringer.
- Thắt chặt chỉ, buộc động mạch trái vào canuyl rồi dung kéo
con cắt rời tim ra khỏi lồng ngực ếch, quả tim sau khi tách rời khỏi cơ
thể mà vẫn đập, đẩy cột dung dịch sinh lý trong canuyl lên xuống nhịp nhàng
thì việc tách rời (hay cô lập) tim ếch mới đạt yêu cầu.
- Gắn canuyl có tim ếch và nhiệt kế vào hai lỗ nhỏ của nút bình tạo ẩm
sao cho bầu thủy ngân của nhiệt kế và mỏm tim ở một độ cao như nhau. Bình
ẩm là bình tam giác thủy tinh có chứa dung dịch sinh lý để tạo độ ẩm cho tim
cô lập hoạt động tốt hơn. Nếu kỹ thuật tách tốt ta có một quả tim cô lập đập
nhịp nhàng tới 8 giờ liên tục.
1. Xác định đại lượng Q10 và năng lượng hoạt động của quá trình
co bóp tim ếch tách rời
- Chuẩn bị ba bình ẩm chứa khoảng 50ml dung dịch Ringer ở 3 nhiệt
độ khác nhau.
Bình 1. Đặt ở nhiệt độ của phòng thí nghiệm.
Bình 2. Đặt trong máy điều nhiệt có nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng
o
10 C.
Bình 3. Đặt vào chậu nước đá để hạ nhiệt độ xuống thấp hơn nhiệt độ
phòng 10oC
- Khi nhiệt độ đã ổn định, đặt tim ếch cô lập vào bình ẩm ở nhiệt độ
phòng, đếm số nhịp đập của tim trong thời gian 1 phút, đó chính là hằng số tốc
độ của quá trình co bóp tim ếch tách rời (KT) đếm ít nhất 3 lần để lấy giá trị
trung bình.
Lưu ý: Có thể xác định hằng số tốc độ của quá trình bằng cách xác
định thời gian mà tim đập được 20 nhịp. Suy ra 60 giây đập được bao nhiêu
nhịp. Làm như vậy có thể tiết kiệm được thời gian hơn.
- Tiến hành tương tự như trên ở nhiệt độ cao hơn và thấp hơn 10oC so
với nhiệt độ phòng để xác định được KT+10 và KT-10. Cần chú ý mỗi lần thay
đổi nhiệt độ phải chờ 3 phút cho tim thích ứng với điều kiện nhiệt độ mới
trong bình ẩm.
- Áp dụng công thức để tính đại lượng Q10 trong điều kiện tăng nhiệt
độ :
KT +10
Q 10=
KT
Từ đó tính năng lượng hoạt hóa của quá trình co bóp tim ếch tách rời
trong điều kiện này là:

6
 Ehh=0,46. T 1. T 2. lgQ 10[kcal]

(T1, T2 chuyển thành nhiệt độ tuyệt đối)

Còn ở điều kiện giảm nhiệt độ thì:
KT
Q ' 10=
KT −10
Và năng lượng hoạt hóa là:
Ehh=0,46. T 1. T 2. lgQ ' 10[kcal]

1.4. KẾT QUẢ THỰC HÀNH:

Đo ở nhiệt độ phòng T=28 độ C ta được kết quả như sau:
Bảng tổng hợp số liệu trung bình

Thời gian (s) Năng

Đại
Số nhịp Hằng số lượng
Lần Lần Lần Trung lượng
đập tốc độ K hoạt hóa
1 2 3 bình Q10
Ehh
20 25 22 23 23.3 52
( T1= 28oC)
20 22 23 21 22 55 1.06 0.26
( T2= 38oC)
20 25 26 27 26 46 1.13 0.51
( T3= 18oC)

1.5. Kết luận- Giải thích:

Tim ếch ở nhiệt độ 38oC đập mạnh hơn ở tim ếch nhiệt độ 28oC và đập yếu
hơn ở nhiệt độ 18oC. Như vậy ta thấy khi tăng nhiệt độ thì tốc độ đập của tim ếch
cũng tăng lên do năng lượng của các phân tử tăng lên, số phân tử có năng lượng
bằng hoặc lớn hơn Ehh nhiều hơn.

7
1.6. Tài liệu tham khảo:
1. Phan Sỹ An (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005.
2. Lương Duyên Bình (Chủ biên), Vật lý đại cương (3 tập), NXB Giáo
dục Việt Nam, Hà Nội, 2010.
3. Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học và kỹ
thuật, Hà Nội, 2002.

8
 Bài 2
TÍNH THẤM MỘT CHIỀU CỦA DA ẾCH
2.1.LÝ THUYẾT

Màng tế bào là một hệ thống mở vì vậy mà chúng có khả năng trao đổi các
chất từ trong ra ngoài và ngược lại , đồng thời đào thải các chất cặn bã ra ngoài
môi trường.

Da ếch là một trong những đối tượng kiểm tra tính thấm 1 chiều

Hình 2-1. Cấu tạo mô da ếch

1. Màng cutin; 2. Lớp tế bào sừng; 3. Các lớp tế bào sinh trưởng biểu mô; 4.
Lớp tế bào màng nền; 5. Các sắc tố; 6. Lớp mô liên kết

Da ếch cấu tạo từ 2 lớp:

Lớp ngoài : Là tế bào biểu mô cấu tạo từ 3-8 lớp tế bào, lớp ngoài cùng lớp màng
cutin có nguồn gốc ở tuyến nhầy của da ếch.

Lớp thứ 2 : Là lớp tế bài sừng.

Lớp thứ 3: Là lớp tế bào hình tròn xếp thưa nhau nhờ đó tạo nên khoảng gian bào.

Lớp thứ 4:Là lớp tế bào hình lăng trụ, có nhân hình ovan, sắp xếp 1 cách xít nhau.

9
Lớp tế bào biểu ô luôn luôn phát triển để thay đổi, chngs có khả năng hấp thụ
ạnh,phản ứng axit yếu.

Lớp trong:Là lớp mô liên kết chứa các sắc tố màu đen, chúng có đặc điểm hấp thụ
yếu, phản ứng kiềm yếu,đặc biệt với một số chất nhuộm có tính kiềm yếu như xanh
methylen, da ếch chỉ cho thấm từ trong da ngoài.

Ngày nay ngoài thực bào, uống bào (còn gọi là ẩm bào) có hai cơ chế vận chuyển
vật chất qua màng tế bào đã được làm sáng tỏ, đó là:

Cơ chế vận chuyển thụ động

Là cơ chế vận chuyển vật chất qua màng theo tổng các loại gradient, không tiêu tốn
năng lượng. Quá trình vận chuyển này diễn ra như một quá trình khuếch tán, tuân
theo định luật Fick

Cơ chế vận chuyển tích cực

Cơ chế vận chuyển tích cực là cơ chế vận chuyển vật chất qua màng ngược tổng
gradien có tiêu phí năng lượng của quá trình trao đổi chất. Cơ chế này gắn liền với
hoạt động của các chất mang là các phân tử lypoprotein trong thành phần cấu trúc
màng.

2.2.MỤC TIÊU

1. Nắm vững thế nào là tính thấm của tế bào mô.

2. Nắm vững cơ sở của hiện tượng màng có tính thấm chọn lọc.

3. Mô tả hai cơ chế vận chuyển vật chất qua màng tế bào.

4. Giải thích được hiện tượng thấm một chiều của tế bào và mô.

5. Nắm vững phương pháp dùng chất màu để nghiên cứu tính thấm.

10
2.3.THỰC HÀNH

2.3.1.Dụng cụ, hóa chất và vật liệu

- 1 kim chọc tủy

- 1 kéo to sắc

- 1 cuộn chỉ
- 1 khay mổ hoặc bàn mổ
- 4 ống thủy tinh hình trụ có chiều dài 7-8 cm
-  4 nắp đậy lá nhôm hoặc nhựa, ở giữa được đục một lỗ có đường kính bằng
đường kính ống thủy tinh
-  6 cốc thủy tinh loại 100ml

2.3.2.Chuẩn bị túi da ếch

- 1 máy so màu để xác định mật độ quang học của dung dịch

- 100ml cồn 900

- 100ml dung dịch xanh methylen 0.05% trong dung dịch sinh lý
- 100ml dung dịch sinh lý dùng cho động vật biến nhiệt
- 2 pipet loại 5-10ml và giá để pipet
- 2 khăn lau dùng để mổ
- 2 con ếch
2.3.3.Cách tiến hành

Mỗi nhóm bắt hai con ếch, dung kim chọc tủy ếch cho ếch bất động. Cẩn
thận lấy da của bốn bắp chân ếch sao cho không bị thủng để làm các túi da ếch.
Dùng hai chiếc, một để nguyên, chiếc kia lộn ngược lại cho biểu mô vào trong rồi
ngâm vào dung dịch sinh lý cho da ếch giữ nguyên trạng thái sinh lý bình thường.
o
hai chiếc còn lại làm như trên nhưng ngâm trong cồn 96 với thời gian là 120 phút
nhằm giết chết da ếch.

Dùng chỉ buộc một đầu của những túi da ếch đã chuẩn bị trên vào các ống
thủy tinh hình trụ, còn đầu kia buộc túm lại. cho dung dịch sinh lý vào túi để kiểm
tra xem túi có bị rò rỉ không. Nếu không, đổ dung dịch sinh lý đi rồi cho 5ml dung
dịch xanh methylen 0,1% vào và nhúng các túi này vào các cốc đựng một lượng
100ml dung dịch sinh lý bằng nhau.

11
 Chú ý sao cho mức xanh methylen trong túi cao bằng mức dung dịch sinh lí
trong cốc.

Quan sát hiện tượng thấm của xanh methylen qua các túi ếch

o
Đặt các cốc có túi da ếch trên vao bình ổn nhiệt độ 22 C trong 40 phút. Sau
đó nhận xét bằng mắt thường xem Xanh methylen khuyếch tán từ trong ra ngoài
theo chiều nào: từ mô liên kết ra biểu mô hay ngược lại từ biểu mô ra mô liên kết.
Đồng thời so sánh với những túi đã ngâm trong cồn xem có nhận xét gì, ghi các
nhận xét vào vở và báo cáo kết quả với cán bộ hướng dẫn thực hành.
Định lượng Xanh methylen đã thấm qua da ếch

 Dựng đồ thị chuẩn

Sau khi đặt các túi da ếch vào bình ổn nhiệt, trong khi chờ đợi kết quả,
nhanh nhóng chuẩn bị các dung dịch xanh methylen có các nồng độ: 0,002; 0,004;
0,006; 0,008; 0,01; 0,02% trong dung dịch sinh lí. Dung máy so màu xác định mật
độ quang học (D) của các dung dịch vừa pha. Dựng đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc
mật độ quang học vào nồng độ, ta có đồ thị chuẩn.

 Xác định lương xanh methylen đã thấm qua da

Sau 40 phút (hoặc lâu hơn nếu có thời gian) nhấc bỏ các túi da ếch ra khỏi
các cốc, dung đũa thủy tinh khuấy đều dung dịch trong cốc rồi đêm xác định mật
độ quang học trên máy so màu, Dựa vào đồ thị chuẩn xác định nồng độ xanh
methylen đã thấm qua da ra ngoài.

12
2.4.KẾT QUẢ THỰC HÀNH

 Bình 1: Màu xanh nhiều . methylen thấm qua khá nhiều

 Bình 2: Màu xanh nhiều . lượng methylen thấm qua nhiều
 Bình 3: Màu xanh ở lớp da, có methylen thấm qua
 Bình 4: Màu trắng trong, Không có methylen thấm qua
2.5.GIẢI THÍCH
Với cấu tạo của da ếch , lớp tế bào biểu mô ở ngoài là lớp có tính hấp thụ cao và có
tính axit yếu. Ngược lại, lớp mô liên kết có tính chất hấp thụ yếu và kiềm kiém.Với
dung dịch kiềm yêu methylen nên lớp tế bào biểu mô và lớp liên kết có tính hấp
thụ khác nhau . Vì tế bào biểu mô có tính hấp thụ cao và axit yếu sẽ hấp thụ mạnh
dung dịch kiềm yếu methylen và đưa dung dịch ra ngoài .Còn lớp mô liên kết có
tính hấp thụ yếu và kiềm yếu nên hấp thụ tốt đưa dung dịch methylen và lớp mô
liên kết sẽ hấp thụ và giữ lại.
Bình 1 bị lộn ngược lại nên lớp mô liên kết sẽ ở ngoài và chúng có tính hấp thụ
yếu nên bình k có màu xanh.
Bình 2 lớp da ếch giữ nguyên nên lớp tế bào biểu mô ở ngoài và hấp thụ tốt
methylen nên bình có màu xanh.
Đối với bình 3 và 4: Cồn đã giết chết tế bào trên da ếch. Làm cho dung dịch tự do
khuếch tán theo 2 chiều
Như vậy tính thấm của da ếch từ trong ra ngoài tế bào cao hơn tính thấm từ ngoài
vào trong
2.6.TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Phan Sỹ An (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005.
2. Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học và kỹ
thuật, Hà Nội, 2002.

13
 Bài 3
XÁC ĐỊNH ĐỘ BỀN CỦA MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU

3.1. LÝ THUYẾT
Chúng ta biết màng tế bào có
một ý nghĩa đặc biệt quan trọng
trong đời sống của tế bào. U.B.Frank
– một nhà lý sinh nổi tiếng đã nói
rằng: “Mọi hoạt động sống đều diễn
ra trên “sân khấu” – màng”. Màng ở
đây được hiểu theo một ý nghĩa
rộng, gồm các loại màng có mặt ở
bên trong tế bào (màng nội bào) và
màng sinh chất, màng bao quanh tế
bào.
Màng sinh chất giữ nhiệm vụ Hình 3.1 - Tế bào hồng cầu người quan sát qua kính
bảo vệ, trao đổi thông tin và vật chất hiển vi điển tử
giữa tế bào với môi trường bên ngoài.
Tế bào hồng cầu là một đối tượng điển hình để chúng ta nghiên cứu cấu tạo, tính
chất và chức năng của màng tế bào.
Trên hình 3.1 là hình ảnh chung về tế bào hồng cầu người quan sát qua kính
hiển vi điện tử. Tế bào có bề mặt lõm để tăng diện tích tiếp xúc với môi trường
ngoài. Hồng cầu trưởng thành là một loại tế bào không nhân. Cấu tạo màng tế bào
hồng cầu, nhìn chung giống như màng sinh chất của các loại tế bào khác, gồm các
protein màng tế bào – lớp lipit kép – protein khảm vào nhau. Có một điểm khác
biệt là ở bề mặt bên trong màng tế bào hồng cầu tồn tại một mạng lưới vật chất có
nguồn gốc là protein dạng sợi và được gọi là spectrin. Spectrin chiếm một tỉ lệ là
30% tổng số protein của màng và là phức hợp của hai sợi polypeptit có trọng lượng
phân tử khoảng 220.000 – 240.000Da (dalton) . Cùng với một vài loại protein khác,
spectrin tham gia vào quá trình biến đổi hình dạng hồng cầu thông qua việc co
ngắn hay duỗi dài dạng sợi của mình. Bằng cách đó tế bào hồng cầu có thể biến đổi
hình dạng giúp cho nó đi qua được các mao mạch nhỏ li ti, ở khắp cơ thể. Đặc biệt
là ở lách, những tế bào hồng cầu đã già hoặc bị thoái hóa chức năng, khả năng đàn
hồi co giãn các sợi spectrin kém, không có khả năng đi qua mao mạch kiểm soát
của cơ quan màng và bị lách tiêu hủy.

14
 Ở trạng thái sinh lí
bình thường, màng hồng
cầu khá bền vững. Thể tích
của tế bào thường không
thay đổi và được điều tiết
bởi tỉ lệ lượng các chất hòa
tan bên trong và bên ngoài
tế bào. Chúng ta biết, lượng
các ion của các muối hòa
tan trong tế bào là một
hằng số ổn định. Do đó thể
tích tế bào phụ thuộc vào
lượng ion của môi trường
bên ngoài. Chúng ta biết có ba loại môi trường: môi trường ưu trương, môi trường
đẳng trương và môi trường nhược trương.
Màng tế bào hồng cầu bền trong môi trường đẳng trương. Trong môi trường
ưu trương, tế bào nhăn nhúm lại do chịu tác động của áp suất thẩm thấu từ bên
ngoài vào. Còn trong môi trường nhược trương thì tế bào trương phồng lên và
màng của nó bị bung ra do chịu tác động của một lực gây ra bởi áp suất thẩm thấu
từ bên trong làm cho lượng nước trong tế bào ngày càng tăng cao và cuối cùng giải
phóng các chất từ nội bào ra bên ngoài. Độ bền của màng hồng cầu chính là nồng
độ dung dịch muối trong môi trường nhược trương, tại đó không xảy ra hiện tượng
tế bào hồng cầu bị huyết tiêu.
Trong bài thực tập này, chúng ta tìm hiểu phản ứng khác nhau của tế bào

động vật (hồng cầu) khi tiếp xúc với ba môi trường nêu trên và xác định độ bền của
màng hồng cầu.
15
 3.2. MỤC TIÊU
1. Phân biệt môi trường ưu, nhược và đẳng trương.
2. Phản ứng của tế bào động vật trong các loại môi trường đó.
3. Thành phần cấu trúc nào của màng tế bào hồng cầu giúp nó có thể thay
đổi thể tích trong một giới hạn nhất định.
4. Nắm được khái niệm độ bền của màng tế bào hồng cầu và ý nghĩa.
5. Thành thạo phương pháp sử dụng dung dịch nhược trương xác định độ
bền của màng tế bào hồng cầu.
3.3. THỰC HÀNH
1.Dụng cụ, hóa chất và vật liệu
- 10 ống nghiệm loại 10ml - 3 pipet loại 5 ml
- 1 máy so màu - Tế bào hồng cầu động vật máu
- 250 ml dung dịch NaCl 2% nóng
- 500 ml nước cất - 1 pipetman 100μl , giấy thấm,
- 250 ml dung dịch sinh lý máu nóng pH = 7,4 khăn lau.

2.Các bước tiến hành

i. Lấy mẫu tế bào hồng cầu
Dùng citrat natri hoặc heparin để lấy máu chống đông. Rửa tế bào hồng cầu
bằng cách quay li tâm (1200 vòng/phút trong 5 phút) máu chống đông trong dung
dịch sinh lý PBS 90/00 (có pH = 7,4) ba lần.
Trước khi li tâm dùng ống hút sục nhẹ nhàng cho hồng cầu phân bố đều
trong dung dịch, tránh bị vỡ. Sau lần li tâm thứ ba, phân tán đều hồng cầu trong
dung dịch PBS nói trên sao cho có mật độ là 5.106 tế bào/ml.
ii. Xác định độ bền của màng tế bào hồng cầu
Chuẩn bị 10 ống li tâm, đánh số từ 0 đến 10. Pha vào mỗi ống nghiệm 5ml
dung dịch muối NaCl tương ứng với các nồng độ 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7;
0,8; 0,9%, sau đó thêm vào mỗi ống nghiệm 500μl dịch hồng cầu đã chuẩn bị trên.
Để các ống nghiệm vào tủ ấm 370C trong 15 phút rồi li tâm 3000 vòng/phút. Sau
khi li tâm, quan sát màu của dịch. Màu đỏ là màu của huyết sắc tố thoát ra sau khi
màng tế bào hồng cầu bị vỡ. Nồng độ thấp nhất của các ống không có màu đỏ là
giới hạn bền của màng tế bào hồng cầu.

3.4. KẾT QUẢ THỰC HÀNH:

Nồng độ (%) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
Màu sắc Hồng
Đỏ Đỏ Trắng Trắng Trắng Trắng Trắng Trắng Trắng
nhạt

16
 3.5. GIẢI THÍCH
Do nồng độ NaCl trong môi trường nhiều hơn so với trong tế bào hồng cầu
làm cho nước đi vào làm thề tích tế bào tăng, chúng trương phồng lên rồi bị vỡ ra,
và giải phóng các chất ra ngoài môi trường gây ra hiện tượng huyết tiêu.
Lượng nước đi vào các ống nghiệm giảm dần từ ống 1 đến ống 10 (vì nồng
độ NaCl tăng dần từ ống 1 đến ống 10 và thể tích ở mỗi ống nghiệm không đổi)
nên các tế bào trong ống 1 bị vỡ nhiều nhất làm cho dung dịch có màu đậm nhất.
Ngược lại ở ống 4 tuy nước đi từ môi trường vào trong tế bào nhưng chưa đủ để
gây ra hiện tượng huyết tiêu tức là tế bào hồng cầu trương lên tới mức tối đa nhưng
chưa vỡ.
 Nồng độ nhược trương lớn nhất chưa đủ gây ra hiện tượng huyết tiêu là 0,4%
Các ống 4,5,6,7,8,9,10 hồng cầu không bị vỡ ra lắng xuống đáy dung dịch
trong suốt dần.
Khi ly tâm, tế bào hồng cầu nguyên vẹn và tế bào hồng cầu bị vỡ sẽ bị lắng
xuống dưới đáy. Tuy nhiên tế bào hồng cầu bị vỡ có kích thước nhỏ dễ khuyếch
tán nên tạo ra màu đỏ của dung dịch. Càng nhiều tế bào hồng cầu bị vỡ, lượng tế
bào khuyếch tán càng nhiều và dung dịch có màu càng đậm. Trong khi tế bào hồng
cầu nguyên vẹn lắng đọng dưới đáy và không khuyếch tán được do quá trình ly
tâm.
3.6. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Phan Sỹ An (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005.
2. Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học và kỹ
thuật, Hà Nội, 2002.
Bài 4
ĐO KÍCH THƯỚC TẾ BÀO TRÊN KÍNH HIỂN VI
4.1. LÝ THUYẾT
Muốn đo kích thước của những vạch nhỏ đang quan sát dưới kính hiển vi
như hạt phấn hoa, tế bào hay kích thước sợi bông, sợi tóc… thì không thể đo
trực tiếp bằng cách dùng những thước đo chiều dài bình thường, mà phải đo một
cách gián tiếp thông qua một thước đo khác được gắn vào thị kính của kính hiển
vi. Thước đo đó được gọi là trắc vi thị kính (thước đo thị kính).
4.1.1. Thước đo thị kính
Thường gặp hai loại :

17
 - Loại đơn giản là một miếng kính hình tròn, ở giữa có một vạch dài 5mm
được chia ra làm 50 khoảng cách đều nhau. Khi sử dụng được đặt vào một
cái gờ giữa hai thấu kính của thị kính.
- Loại cải tiến được dùng phổ biến trong các phòng thí nghiệm là loại AM-9-
2. Nó được cấu tạo từ một thị kính 15x và một hệ thống chia vạch để đo. Hệ
thống chia vạch gồm một kính phẳng cố định, trên đó khắc các vạch cách
đều nhau đánh số từ 0 đến 8. Ngoài ra, còn một kính di động có khắc hai
vạch chéo nhau đi kèm với hai vạch song song. Kính di động này được gắn
liền với một trống chia độ bên ngoài. Xung quanh vòng tròn trống chia độ
được chia thành 100 vạch bằng nhau. Khi vặn trống chia độ hết một vòng
(đi hết 100 vạch) thì sẽ làm dịch chuyển 1 vạch trên kính cố định (dịch được
1mm). Như vậy mỗi vạch trên trống chia độ tương ứng với 1/100 vạch ở
kính cố định.
-

4.1.2. Thước đo vật kính

18
 Thước đo vật kính là một phiến kính có kích thước 26 x 76 x15mm. Ở
chính giữa phiến kính có khắc một thước đo dài 1mm thành 100 vạch bằng nhau.
Chiều dài mỗi vạch là 0,01mm (10µm). Thước đo này được bảo vệ bởi một
miếng kính nhỏ, tròn bằng cách gắn lên trên thước đo. Xung quanh thước đo
được đánh dấu bằng một vòng tròn màu đen. Thước này đặt lên bàn kính hiển vi
để xác định độ dài của mỗi vạch chia trên thước đo thị kính đã được dùng để
đánh dấu khoảng cách, hoặc kích thước vật muốn đo.
Cách đo
Muốn đo kích thước của bất kỳ vật hiển vi nào dưới kính hiển vi ở độ
phóng đại nào đó, người ta phải xác định chiều dài (tính ra µm) của mỗi khoảng
cách trên thước đo thị kính khi quan sát ở độ phóng đại ấy. Muốn vậy, người ta
đặt thước đo vật kính vào bàn kính hiển vi, sau đó điều chỉnh sao cho vạch đầu
tiên của thước đo thị kính trùng với vạch đầu tiên của thước đo vật kính, sau đó
đếm xem có bao nhiêu khoảng của thước đo thị kính vừa vặn trùng với bao
nhiêu khoảng của thước đo vật kính.
Ví dụ 1
Ở độ phóng đại 32 (thị kính 10x, vật kính 3,2) thì 5 khoảng cách ở thước đo thị
kính (ký hiệu là a) trùng khít hoàn toàn với 22 khoảng cách của thước đo vật kính
(ký hiệu b). Như vậy, mỗi khoảng cách của thước đo vật kính có độ dài 10µm, thì
chiều dài một khoảng cách trên thước đo thị kính ở độ phóng đại trên là :
10 b 10 µm x 22 vạch
= =44 µm
a 5 vạch

Khi đã biết độ dài một khoảng của thước đo thị kính, lấy thước đo vật kính
ra và thay bằng tiêu bản vật cần đo lên bàn kính hiển vi, xác định xem vật đó có
độ dài là mấy khoảng của thước đo thị kính.
Ví dụ 2
Vật cần đo hoặc tế bào vi sinh vật có độ dài là ba khoảng của thước đo thị
kính ở cùng độ phóng đại nêu trên (là 32) thì giá trị độ dài của nó là :

44µm x 3 = 132µm

19
 Muốn đo được chính xác, người ta thường đo nhiều lần rồi lấy giá trị trung
bình.

- Nếu dùng thước đo thị kính loại AM-9-2 ta làm như sau : Nhìn vào thị
kính, điều chỉnh trống chia độ cho giao điểm của vạch chéo chạy về số 0.
Đồng thời điều chỉnh cho giới hạn thứ nhất của vật cần đo rơi vào trùng
giao điểm trên. Tiếp theo, vặn trống chia độ cho giao diểm của vạch chéo
chạy sang điểm giới hạn thứ hai của vật đo. Đọc số chẵn trên thước đo cố
định của thị kính và số lẻ trên trống chia
độ.

Ví dụ 3
Chiều dài của vật cần đo ứng với ba vạch trên thước cố định và 25 vạch trên
trống chia độ. Giả sử độ phóng đại đang đo hệ số một khoảng trên thướsc đo cố
định của thị kính là 44µm thì độ dài của vật đo sẽ là :
44 µm x 25
44 µm x 3+ =143 µm
100

4.2.MỤC TIÊU
1 .Quan sát thước đo vật kính và biết được giá trị độ dài của mỗi vạch
2. Cách đo kích thước tế bào trên kính hiển vi
3. Xác định được hệ số dài của một khoảng thị kính và kích thước trung bình
của tế bào hồng cầu

4.3. THỰC HÀNH

4.3.1. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị
- Kính hiển vi
- Thước đo thị kính AM-9-2
- Thước đo vật kính
- Tiêu bản tế bào ung thư sarcoma
180 nhuộm eosin hoặc giemsa.
4.3.2. Các bước tiến hành
Bước 1 : Quan sát tế bào trên tiêu bản.

20
Bước 2 : Tiến hành đo kích thước của 40 tế bào ở các vị trí khác nhau trên tiêu
bản bằng cách đo sử dụng máy đo gắn với máy vi tính (cách 1) và cách đo trực
tiếp (cách 2).
Bước 3 : Sử dụng quy tắc toán thống kê tính kích thước trung bình của tế bào.

4.4. KẾT QUẢ THỰC HÀNH

Tính kích thước trung bình của tế bào theo quy tắc của toán thống kê sinh học
1. Đo bằng máy tính
Lần đo 1 2 3 4 5 6
Số liệu 33,06px 117,8px 50,33px 35,23px 32,2px 30,48px
Lần đo 7 8 9 10 11 12
Số liệu 36,5px 34,93px 35,9px 33,96px 42,54px 33,3px
Lần đo 13 14 15 16 17 18
Số liệu 31,06px 48,09px 34,93px 31px 23,02px 32,76px
Lần đo 19 20 21 22 23 24
Số liệu 23,02px 36px 40,25px 38,18px 35,36px 31,89px
Lần đo 25 26 27 28 29 30
Số liệu 40,25px 42,54px 48,09px 25,02px 2,08px 33,24px

Quy đổi sang μm:

Lần đo 1 2 3 4 5 6
Số liệu 14,69 52,36μm 22,37μm 15,66μm 14,31μm 13,55μm
μm
Lần đo 7 8 9 10 11 12
Số liệu 16,22μm 15,53μm 15,96μm 15,09μm 18,91μm 14,8μm
Lần đo 13 14 15 16 17 18
Số liệu 13,80μm 21,37μm 15,52μm 13,78μm 10,23μm 14,56μm
Lần đo 19 20 21 22 23 24
Số liệu 10,23μm 16μm 17,89μm 16,97μm 15,72μm 14,17μm
Lần đo 25 26 27 28 29 30
Số liệu 17,89μm 18,91μm 21,37μm 11,12μm 0,92μm 14,77μm

2. Đo trực tiếp (Thị kính 15x, vật kính 40x, 4,44 vạch = 100 μm)

Lần đo 1 2 3 4 5
Số liệu 1 vạch 1,5 vạch 0,8 vạch 1,2 vạch 1 vạch

21
 Lần đo 6 7 8 9 10
Số liệu 0,9 vạch 1,1 vạch 0,8 vạch 2 vạch 1,5 vạch

Quy đổi sang μm:

Lần đo 1 2 3 4 5
Số liệu 22,53 μm 33,795 μm 18,024 μm 27,036 μm 22,53 μm
Lần đo 6 7 8 9 10
Số liệu 20,277 μm 24,783 μm 18,024 μm 45,06 μm 33,795 μm

3. Các thông số thống kê:

40
k
a. Kích thước tế bào trung bình: x́ = ∑ =19,013 μm
k=1
40
40

b. Phương sai mẫu hiệu chỉnh: s2 = ∑ ( k−x́ )2 =82.51851

k=1
40−1
c. Độ lệch chuẩn: σ = √ s = 9.08397
2

4.5. TÀI LIỆU THAM KHẢO:

1. Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội,
2002.

22
 BÀI 5:
XÁC ĐỊNH THẾ DEZTA CỦA TẾ BÀO BẰNG PHƯƠNG
PHÁP VI ĐIỆN DI

5.1. LÝ THUYẾT

Trong các hệ dị thể - đặc biệt là trong các đối tượng sinh vật luôn xảy ra quá trình
chuyển động tương đối giữa các pha phân tán so với môi trường phân tán dưới dạng tác
dụng của điện trường không đổi. Hay có sự chênh lệch về áp suất thủy tĩnh hoặc gradient
trọng lực thường xuất hiện hiệu điện thế giữa các pha phân tán với môi trường phân tán.
Những hiện tượng này được gọi là các hiện tượng điện động học. Một trong các hiện
tượng điện động học là điện di.

Điện di là sự chuyển động của pha phân tán so với môi trường phân tán dưới tác
dụng của điện trường không đổi. Chẳng hạn trong hệ dị thể gồm các tế bào nấm men và
môi trường sống của chúng thì các tế bào được coi là pha phân tán, nó sẽ chuyển động khi
có tác dụng của dòng điện một chiều bên ngoài so với môi trường sống của nó – môi
trường phân tán. Sở dĩ tế bào có thể di chuyển định hướng được vì chúng có điện tích bề
mặt. Nếu trên bề mặt tích điện dương thì chúng sẽ chuyển động về phía cực âm của điện
trường ngoài, ngược lại nếu tích điện âm thi chúng sẽ chuyển động về phía cực dương.
Như vậy một cách cụ thể hơn có thể nói rằng vi điện di là sự chuyển động của các pha
phân tán về phía điện cực có dấu trái với dấu điện tích bề mặt của chúng.

Sở dĩ trên bề mặt của pha phân tán có điện tích là do 2 nguyên nhân cơ bản sau:

1. Do chúng có khả năng hấp phụ các ion lên bề mặt;

2. Do chúng có khả năng ion hóa các nhóm phân li của phân tử cấu thành nên
chúng

Những ion bám chặt trên bề mặt hạt được gọi là ion tạo thế. Chúng có ái lực đối với
các ion khác dấu phân bố trong môi trường phân tán. Loại ion này được gọi là ion nghịch.
Càng xa bề mặt các ion tạo thế, lượng ion phân bố càng thưa dần.

23
 Do lực hút tĩnh điện giữa hai loại ion tạo thế và ion nghịch đã tạo nên trên bề mặt
hạt một lớp điện kép. Chiều dày lớp điện kép này phụ thuộc vào nồng độ của dung dịch,
điện tích của hạt và nhiệt độ môi trường, nó có thể biến thiên từ vài A0 đến vài μm.

Cấu trúc lớp điện tích kép khá phức tạp, có thể cho rằng ngoài các ion tạo thế gắn
chặt trên bề mặt hạt còn có một số các ion nghịch bám xung quanh do lực hút tĩnh điện.
Lớp chất lỏng của môi trường có các ion nghịch bám quanh bề mặt hạt, chuyển động cùng
với hạt dưới tác động của điện trường ngoài được gọi là lớp hấp phụ. Lớp chất lỏng của
môi trường ion nghịch còn lại được gọi là lớp khuếch tán. Khi hạt chuyển động trong điện
trường giữa lớp hấp phụ và lớp khuếch tán xuất hiện một bước nhảy điện thế. Điện thế này
được gọi là thế điện động hay thế Dzeta, ký hiệu là ζ.

Dấu của thế ζ do dấu của ion tạo thế quyết định, còn giá trị của thế ζ tỷ lệ với hiệu
số điện thế do ion tạo thế với ion nghịch trong lớp hấp thụ. Nói một cách khác, giá trị của
thế ζ bằng giá trị thế do các ion nghịch trong lớp khuếch tán tạo nên. Vì vậy lượng ion
nghịch trong lớp khuếch tán càng lớn thì thế ζ càng cao.

ζ - điện thế của mỗi loại tế bào ở trạng thái sinh lý bình thường là một đại lượng cố
định. Khi bị tổn thương hay biến đổi trạng thái thì giá trị thế ζ thay đổi. Dựa vào giá trị ζ
điện thế có thể đánh giá về trạng thái chức năng của tế bào.

Không có một phương pháp nào có thể đo giá trị thế ζ một cách trực tiếp. Người ta
thường sử dụng phương pháp vi điện di để xác định giá trị ζ một cách gián tiếp.

Nguyên lý của phương pháp vi điện di là sử dụng nguồn điện một chiều (80-100V) làm
cho tế bào chuyển động. Quan sát sự chuyển động của tế bào dưới kính hiển vi và xác
định tốc độ di động (v) của chúng để tính giá trị thế ζ.

Đối với một hạt tích điện q dưới tác động của điện trường E lực f1 làm cho hạt chuyển
động là: f1= q.E

Khi chuyển động, hạt chịu tác dụng của lực cản f2, theo định luật Stocxơ thì:

f2 = 6πηvr (đối với hình cầu)

f2 = 4πηvr (đối với hạt có dạng gần giống với hình cầu)

trong đó: η – độ nhớt của môi trường trong đó hạt chuyển động (puazơ);

v - tốc độ chuyển động của hạt (μm/s);

24
 r – bán kính của hạt.

Khi hạt chuyển động đều thì f1=f2 nghĩa là q.E=6πηvr

Đối với một hạt hình cầu có thể xem:

q = ζεr

trong đó: ζ – điện thế trên bề mặt hạt hình cầu;

ε – hằng số điện môi;

r – bán kính của hạt.

Ta có thể viết: ζεrE = 6πηvr

6 πηv 6 πηv
ζ = εE (hay ζ = εE )

Để cho đơn giản, coi môi trường phân tán là nước thì hằng số điện môi ε = 81; η = 0,01
puazơ. Theo công thức trên thì thế ζ được tính bằng đơn vị tĩnh điện (đvtđ). Thay các
giá trị vào ta sẽ được biểu thức để tính giá trị thế ζ đối với các tế bào nấm men:
v
ζ = 140 E (mV)

S
Ta biết tốc độ v = t (s- quãng đường, t-thời gian hạt đi được quãng đường S) gradient
u
điện thế E = l (V/cm) (u- hiệu điện thế giữa hai đầu cầu aga hình chữ L trong buồng
đo, l-khoảng cách giữa hai đầu cầu đó).
S.l
Từ đó: ζ = 140 ut

5.2. MỤC TIÊU

1. Hiểu được khái niệm vi điện di

2. Giải thích được tại sao một số tế bào rời và đa số các đại phân tử sinh vật lại
chuyển động được dưới tác dụng của điện trường.
3. Hiểu được nguồn gốc điện tích trên bề mặt tế bào.

25
 4. Phân biệt được các khái niệm: ion tạo thế, ion nghịch, lớp hấp phụ và lớp
khuyếch tán.
5. Hiểu được bản chất và ý nghĩa của thế điện động (thế Dzeta)
6. Thành thạo phương pháp xác định thế Dzeta điểm đẳng điện của loại tế bào
rời và dấu của điện tích bề mặt.
5.3.THỰC HÀNH

1. Dụng cụ, hóa chất và vật liệu

- 1 kính hiển vi quang học có trắc vi vật kính và trắc vi thị kính

- Nguồn điện một chiều 150 von + điện cực bằng đồng và dây dẫn

- 1 khóa 6 chốt để đảo mạch - Giấy thấm, khăn lau thấm nước

- 2 cầu agar hình chữ U - 1 ống tế bào nấm men

- 1 panh - 250ml dung dịch KCl bão hòa

- 1 buồng đo điện di - 250 ml dung dịch CuSO4 10%

- 2 cầu agar hình chữ L - 250ml sacharose 8%

- 2 công tơ hút - 250ml Na2HPO4

- 2 pipet loại 2ml và 5 ml

- 250 ml dung dịch axit citric 0,1M - 1 đèn cồn

- 10 ống nghiệm loại 10ml - 1 dũa thủy tinh
- 1 giá pipet - 1 đồng hồ bấm giây
- 1 giá ống nghiệm - 1 đồng hồ đo điện vạn năng
- 2 đĩa đồng hồ loại to - 1 mẩu giấy kẻ oli dài 5-> 7cm

2. Các bước tiến hành

1. Mắc mạnh điện theo hình :

26
2. Pha dung dịch Măc-in-ven và dung dịch đệm Măc-in-ven

Pha dung dịch Măc-in-ven có các pH = 2,4; 4,0; 5,2; 6,2; 7,0 bằng cách trộn hai dung
dịch Na2HP04 0.2M và dung dịch acid citric 0,1M theo tỉ lệ. Lấy dung dịch pH vừa pha
trên trộn với dung dịch glucose 8% tỉ lệ 1:9 sẽ được dung dịch đệm măc-in-ven có pH
tương ứng.

pH Na2HPO4 0,2M (μl) Acid Citric 0,1M (μl) Glucose 8% (μl)

2,4 31 469 4500
4,0 192,5 307,5 4500
5,2 268 232 4500
6,2 330,5 169,5 4500
27
 7,0 412 88 4500

3. Xác định dấu điện tích bề mặt tế bào và giá trị thế dezta của chúng

4. Xác định điểm đẳng điện của tế bào

5.4. KẾT QUẢ

STT pH S(cm) L(cm) V(v) t(s) ζ Kết luận về điểm đẳng điện
1 3.0 0,005 3,5 1,54.10-3 3,25 0,03
Với pH càng tăng thì thì tế bào di
2 4.2 0,005 3,5 1,25.10-3 4 0,0245 chuyển càng chậm và thế ζ của chúng
3 6.0 0,005 3,5 7,7.10-4 6,5 0,015 càng nhỏ.Vì vậy điểm đẳng điện của
4 7.0 0,005 3,5 3,67.10-4 13,6 0,007 chúng là pH >= 7.0

5.5. GIẢI THÍCH

pH của dung dịch càng tăng thì thế ζ của tế bào càng giảm do vời pH càng
thấp tức nồng độ ion H+ càng cao thì điện tích Q chạy qua tế bào càng nhiều. Trong
khi khoảng cách giữa 2 lớp hấp phụ và lớp khuyếch tán không đổi, điện thế Q được
chuyển đến tế bào giảm dần từ pH thấp đến pH cao do vậy thế ζ của giảm dần.
5.6 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Phan Sỹ An (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005.
2. Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học và kỹ
thuật, Hà Nội, 2002.

28
 BÀI 6:
ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD
(PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ)

6.1. NGUYÊN TẮC:

Phương pháp Bradford là phương pháp xác định protein dựa vào sự tạo
phức hợp với protein của thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue (Bradford
1976). Thuốc nhuộm tồn tại ở 3 dạng: cation (đỏ), trung tính (xanh lá), và
anion (xanh dương) (Compton và Jones 1985). Trong môi trường acid, thuốc
nhuộm tồn tại chủ yếu ở dạng cation proton hóa kép có màu đỏ (Amax =
470nm). Tuy nhiên, khi thuốc nhuộm gắn với protein, nó bị biến đổi thành
dạng ổn định chưa proton hóa có màu xanh (Amax = 595nm) (Reisner et al.
1975, Fazekes de St. Groth et al. 1963, Sedmack and Grossberg 1977). Chính
ở dạng màu xanh này nó bị phát hiện với bước sóng 595 nm ở phương pháp
này bằng quang phổ kế hoặc đầu đọc microplate. Các thí nghiệm với acid
polyamino tổng hợp chỉ ra rằng thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue G-250
gắn chủ yếu với amino acid đơn giản (đặc biệt là arginine) và amino acid thơm
(Compton và Jones 1985). Spector (1978) phát hiện ra rằng hệ số tận diệt của
dung dịch phức hợp thuốc nhuộm albumin là không đổi trong phạm vi nồng độ
10 lần. Do đó, định luật Beer có thể được áp dụng để định lượng protein một
cách chính xác bằng cách chọn tỉ lệ thích hợp của thể tích thuốc nhuộm để lấy
mẫu nồng độ. Một vài loại tương tác giữa protein hóa học và thuốc nhuộm hóa
học làm ảnh hưởng đến thí nghiệm. Các chất không phải protein cũng có thể
ảnh hưởng đến thí nghiệm nếu làm thay đổi cân bằng giữa ba dạng của thuốc
nhuộm. Một vài loại chất tẩy rửa, chất tạo mùi, một số chất kích thích protein
đơn giản làm ổn định màu xanh lá cây của thuốc nhuộm bằng cách gắn trực
tiếp hoặc làm thay đổi pH (Compton và Jones 1985, Fanger 1987). Mặc dù vậy
29
nhiều tác nhân hóa học không ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của màu
thuốc nhuộm khi sử dụng trong quy trình chuẩn.

6.2. MỤC TIÊU

1. Hiểu được phản ứng của thuốc nhuộm Commasie xanh và ứng dụng
trong xét nghiệm nồng độ.
2. Biết được thao tác sử dụng máy và đọc kết quả quang phổ kế.
3. Hiểu được áp dụng định luật Lambert-Beer trong việc xác định
nồng độ chất.

6.3. THỰC HÀNH

6.3.1. Dụng cụ,hóa chất:
- Dung dịch BSA (1mg/ml)
- Dung dịch thuốc nhuộm xanh Commasie 1x
- protein với nồng độ chưa xác định
- quang phổ kế
6.3.2. Cách thức thí nghiệm:
- B1: Pha dung dịch protein chuẩn (BSA) có nồng độ 10mg/ml trong PBS.
- B2: Pha dung dịch thuốc thử Bradford.
+ Pha 0,1g G250 và 50ml methanol rồi pha loãng đến 500ml được
dung dịch A
+ Pha 100ml 85% H3PO4 được dung dịch B
+ Trộn dung dịch A với B rồi lọc ta được dung dịch Bradford
- B3: Dùng pipet hút 0; 0.2 ml dung dịch BSA vào ống falcon up tới 1ml
PBS.
- B4: Thêm dung dịch nhuộm vào ống falcon theo tỉ lệ 1:9.
- B5: Tắt đèn, để phản ứng diễn ra. Tối thiểu 5 phút và không quá 20 phút.
- B6: Đo bằng quang phổ kế ở 595nm để xác định độ hấp thụ A (absortion)
6.3.3. Phân tích số liệu:
- Nếu quang phổ kế trả ra kết quả khác không ở mẫu trắng, ta lấy giá trị
trung bình của mẫu trắng này và trừ giá trị mẫu chuẩn và mẫu cần đo với giá trị
này.
- Xây dựng đường chuẩn với độ hấp thụ ở bước sóng 595nm ở trục y và
nồng độ ở trục x. Xác định nồng độ dung dịch mẫu chưa biết bằng đường
30
chuẩn. Nếu mẫu đã được pha loãng ta xác định nồng độ mẫu bằng cách nhân
với hệ số pha loãng đã dùng.

6.4. KẾT QUẢ

Dung dịch Mức độ hấp thụ quang (Absortion) Giá trị trung bình

Trắng (Blank) 0 0,007 0,004 0,004

Mẫu (Sample) 0,057 0,058 0,060 0,058

Chuẩn(Standard) 0,358 0,360 0,364 0,36

Đường chuẩn nồng độ BSA

0.4
Độ hấp thụ quang ở bước sóng 595nm

0.35 f(x) = 0.04 x + 0

0.3 R² = 1

0.25
Đường chuẩn nồng độ BSA
0.2 Linear (Đường chuẩn nồng độ
BSA )
0.15
0.1
0.05
0
0 2 4 6 8 10 12
Nồng độ dung dịch (mg/ml)

Dựa vào kết quả trên, ta xây dựng được đường chuẩn có công thức
y= 0,0357x+ 0,0026 với hệ số tương quan = 0,9999

Với y = 0,058 thay vào phương trình trên ta dc x = 1,552. Như vậy nồng độ
dung dịch trong mẫu được đo là 1,552 mg/ml.

6.5. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Phan Sỹ An (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005.

31
 2. Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội,
2002.
3. Bradford, Marion (1976). "A Rapid and Sensitive Method for the Quantification of
Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye
Binding" (PDF). Analytical Biochemistry. 72: 248–254. doi:10.1006/abio.1976.9999 – via
Google Scholar.
4. https://en.wikipedia.org/wiki/Bradford_protein_assay

Bài 7
QUAN SÁT HIỆN TƯỢNG HUỲNH QUANG
7.1. LÝ THUYẾT
Nguồn năng lượng chủ yếu của sinh vật trên trái đất là năng lượng bức xạ
mặt trời. Dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời sự sống đã phát sinh, duy trì và phát
triển. Để tồn tại và tiến hóa, sinh vật thu nhận năng lượng từ ánh sáng mặt trời rồi
chuyển hóa nó sang dạng năng lượng khác cần thiết cho sự sống qua những phản
ứng đặc hiệu.
Ánh sáng là bức xạ điện từ trường lan truyền trong không gian với vận tốc
vô cùng lớn (trong chân không vận tốc ánh sáng đạt 300,000 km/s). Ánh sáng được
chia thành 3 vùng cơ bản:
- Vùng nhìn thấy (vùng khả kiến) có bước sóng (λ) từ 400 – 700nm.
- Vùng tử ngoại có λ = 200 – 400nm.

32
- Vùng hồng ngoại có λ = 700 – 1000nm.

Trong hệ sinh vật, các loài có vùng khả kiến không giống nhau. Ví dụ, với
người vùng khả kiến có λ = 400 – 700nm nhưng với côn trùng vùng khả kiến lại có
λ – 320 – 500nm.
Quá trình hấp thụ ánh sáng của vật chất có phương trình : A + hv A* là quá
trình vật lý lượng tử thuần túy với cơ sở là sự tương tác giữa vectơ điện của lượng
tử ánh sáng với nguyên tử hoặc phân tử.Nguyên tử (phân tử) chỉ hấp thụ lượng tử
có bước sóng xác định với năng lượng tương ứng với hiệu năng lượng (E) giữa
hai trạng thái, trạng thái cơ bản và trạng thái kích thích của nguyên tử (phân tử).
E = hc/λ
Trong đó: h: hằng số Plan
c: tốc độ ánh sáng
λ: bước sóng của ánh sáng
- Giai đoạn hấp thụ lượng tử ánh sáng và giai đoạn khử trạng thái kích thích điện tử
của phân tử, đặc trưng chung cho tất cả các phản ứng quang sinh học:

33
 Sơ đồ biểu diễn các mức năng lượng của phân tử và các bước chuyển giữa các
mức năng lượng đó.
Mô tả
- Đường A, a: Khi phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng để chuyển từ mức năng
lượng cơ bản ban đầu (S0) lên mức năng lượng cao hơn (S1 hoặc S2)
- Theo cơ học lượng tử thì không có bước chuyển phát xạ (phát sóng ánh sáng) khi
phân tử chuyển từ mức S2 về mức S0 và cũng không có bước chuyển thẳng từ mức
S0 lên mức triplet (bước cấm).
- Khi phân tử chuyển từ mức S1 về mức cơ bản S0 sẽ phát huỳnh quang (b) hoặc
chuyển từ mức triplet về mức cơ bản S0 sẽ phát lân quang (c).
- Các đường 1, 2, 3, 4 là phân tử thải hồi năng lượng dưới dạng tỏa nhiệt ra môi
trường.
Quá trình phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng để chuyển lên trạng thái kích thích
và sau đó trở về trạng thái ban đầu là một quá trình bất thuận nghịch.
Cảm giác màu sắc là một chuỗi của quá trình sinh lý và tâm lý phức tạp khi
bức xạ trong vùng khả kiến chiếu vào võng mạc của mắt. Ánh sáng chiếu vào một
chất nào đó nó đi qua hoàn toàn thì đối với mắt ta chất đó không màu (thí dụ, thủy
tinh hấp thụ các bức xạ với bước sóng nhỏ hơn 360 nm nên nó trong suốt với các
bức xạ khả kiến). Một chất hấp thụ hoàn toàn tất cả các tia ánh sáng thì ta thấy chất
đó có màu đen Nếu sự hấp thụ chỉ xảy ra ở một khoảng nào đó của vùng khả kiến
thì các bức xạ ở khoảng còn lại khi đến mắt ta sẽ gây cho ta cảm giác về một màu
nào đó. Chẳng hạn, một chất hấp thụ tia màu đỏ (λ = 610 – 730) thì ánh sáng còn
lại gây cho ta cảm giác lục.
34
 7.2. MỤC TIÊU
1. Nắm được bản chất ánh sáng.
2. Hiểu được quy luật hấp thụ ánh sáng
7.3. THỰC HÀNH
7.3.1. Dụng cụ, hóa chất:
- Giấy lọc
- 2 dịch chiết thực phẩm
- Đèn UV
- Kính lọc với các chiết suất khác nhau
7.3.2. Cách thức thực hiện:
- Nhỏ 2 giọt dịch chiết thực phẩm lên giấy lọc
- Tắt đèn phòng, bật đèn UV pha quan sát giấy lọc thấm dịch chiết qua kính
lọc với các chiết suất khác nhau.
7.4. KẾT QUẢ

Kính lọc Hình ảnh

420

35
440

460

480

36
550

620

37
 7.5. GIẢI THÍCH
Mỗi kính lọc chỉ cho bước song trong dải cho phép đi qua (ví dụ kính
lọc 420nm cho phép bước song từ 410nm đến 430nm đi qua). Do vậy ta thu được
dải hình ảnh ứng với dải bước sóng chiếu đến. 2 giọt dịch chiết thực phẩm hấp thụ
ánh sáng khác giấy lọc hấp thụ ánh sáng nên khi chiếu lên tia UV ta thu được bước
song phát ra là khác nhau. Với kính lọc 650nm ta không thu được gì nữa vì ánh
sáng không lọt qua.
7.6. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Phan Sỹ An (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005.
2. Bài giảng Lý Sinh học chương 6, thầy Đỗ Minh Hà.

38