WESTERN BLOTTING

Ова е молекуларна техника која се корсити во имунологијата,така и го дале името бидејки првично
постоела SOUTHERN BLOTTING техника која е развиена од наученик чие презиме му било SOUTHERN
јужен и таа била за анализа на ДНА но понатаму се развиле слични техники кои се базираат на
сличен принцип за слични работи биле анализите и го ставиле име по полови northen blotting за
РНА потоа WESTERN BLOTTING за протеини е и EASTERN BLOTTING која е за анализа на
посттранслациони анализи на протеини.Сите се слични и се базираат на техники со гелови со
електрофорези. Првично имаме епрувета со раствор со смеса од протеини различни добиени од
клетка некоја од цитоплазма од јадро,и сега сакаме да одредиме дали има одреден протеин и освен
тоа ке одредиме и колкава му е молекулска маса во однос на должина колку аминокиселини има.За
да го направиме тоа треба да спремиме еден гел од 2 супстанци кој се спрема од акриламид и
бисакриламид и со тек на време ке направат како желе гел структура но пред да се стврдне од
горната страна се става како чешел кој има запчаници со цел да се направат мали каналчиња во
гелот пред да се стврдне и она кое ке го добиеме е гел со бунарчиња дупки во него во кои ке може
да ставаме одредени проби и не се многу длабоки тие.Во овој гел структура е како скелеста
структура во 3 димензии од различни протеини но има и простор меѓу нив каде би можеле да се
протне нешто,иако изгледа солидно како гел сепак е мрежа на различни молекули и ова е битно
бидејки ако имаме таква мрежеста структура таква скелеста структура ако имаме помали протеини
тие лесно ке може да се протнат низ сите овие просотори и да стигне до крајот.големинаДодека ако
имаме некој голем протеин ке му биде потешко ке треба да се врти и ке му треба време дур ја
помине мрежата да стигне до доле.Освен што е важна големина на протеинот важен е и полнежот а
знаеме протеините имаат позитивен негативен полнеж зависно од тоа кои аминокиселини ги имаат
повеќе или помалце.Поентата е колкав е полнежот ке зависи бидејки овој гел ке го ставиме во
електрично поле,има доста фактори кои влијаат врз брзина на движење на овие протеини низ
гелот.И форма на протеин има улога како клопче ке се движи брзо како конец форма ке се движи
бавно бидејки конец ке се заплеткува низ скелетеста структура.Полнеж големина и форма се главни
кои ја одредуваат брзината на движење миграција со која ке иде надолу протеин.Ова се стандардни
фактори од кои зависи брзина при нативен WESTERN BLOTTING.PAGE=ПОЛИ АКРИЛАМИДЕН ГЕЛ
ЕЛЕКТРОФОРЕЗА.Но ние во оваа техника често не ни е битен полнеж и форма на молекулите битно
ние само големината нивна.Со цел да ги елиминираме фактори на полнеж и форма се третираат
проби со SDS sodium duodeceum sulfat соединение кое ке ни ги денатурира протеините.Кога ке ги
третираме со ова соединение сите протеини ке ни денатурираат без разлика на форма,и ке станат
како конци и сега ке може да ги довоиме само врз база на нивна маса така што форма и полнеж на
сите ке им го направиме ист и ке станат главно негативни како конци.Само од маса ке зависи
брзина.Полиакриламид електрофореза:имаме кадичка во која имаме пуферски раствор и ке го
потопиме гелот внатре и имаме бунарчиња во гелот 4 каде во првото ставаме раствор од протеини
во кој ни е позната маса на сите протеини во другите ставаме непознати примероцци раствори од
протеини со серуми од пациенти.Десно има место акде струја се става позитивен и негативен
полнеж и откога ке се постави горен крај од гел ке биде негативен додека долниот ке е позитивен и
ке пуштиме струја а сите протеини ке ни се негативни плус гравитација и полнеж ке се движат
надоле.Е сега што се случува со оние на кои ја знаеме маса ке се појават надоле 5 линии и имаме
протеини со големина 150 кда 120 кда 50 кда 60 кда 30 кда тие ни се познати е сега со другите каде
незнаеме какви протеини имаме се појавуваат повеќе линии и секоја од нив е протеини со одредена
маса но тие што се со поголема маса потешки се горе бидејки поспоро одат надоле потешки се и
повеќе време им треба низ гел да мигрираат.И сега се прават некои методи кои ни овозможуваат да
добиеме обојување на сите линии и битно е дека овие линии одбиени врз база на добиените лево
за протеини за кои ја знаеме големина според тоа до каде стигнале и колкави се може да ја
одредиме масата на непознатите проби каде незнаеме какви протеини имаме во кда. Е сега откако
ке одредиме колкава маса имаат сите непознати протеини во 3те раствори базирано на најлевиот
каде сите знаевме колкава големина се протеините.Сега ги имаме протеините на полиакриламиден
гел и ке го извадиме гелот и ке го поставиме легнато и линиите и сега сакаме да видиме кој од овие
протеински ленти ни е даден протеин од интерес и тоа може да го направиме ставјќи одредено
антитело кое ако се врзе за соодветна линија ке знаеме дека е таму но тоа сеуште неможеме да го
направиме бидејки антителата ке почнат да се врзуваат за гелот едноставно и тој е леплив направен
да држи протеини на него и затоа прво се става нитроцелулозна мембрана врз гелот и се местат на
посебен начин и се пушта струја и сите протеини кои лежеа доле на гелот ке се импрегнираат
вметнат во нитроцелулозната мембрана и тоа што ке се добие кога ке ја тргнеме е мембрана каде
како препишани ги добиваме линии од протеините и уште неможеме да ставиме антитела бидејки
тие пак може да се поврзат неспецифично кај што нетреба и затоа првин ставаме протеински прашок
казеин кој ке се испозалепи секаде каде нема протеини и откога тоа ке го направиме додаваме
антитело и го ставаме во раствор заедно со целата мембрана и антитела ке се врзат таму каде се
специфични за дадените протеини на некоја линија и ке има и вишок антитела и затоа по некое
време промиваме со пуфер и тоа што ке остане се само тие антитела кои се врзале со специфичните
протеини и додаваме секундарно антитело на кое може да има некој ензим и поентата е пак да го
потопиме во раствор сето тоа во кој има секундарно антитело и тоа ке се врзе за Fc регионот на
примарното антитело и ке промиеме бидејки има многу секуднарни антитела кои не се врзале кои
лебдат наоколу и по измивање потопуваме во безбоен супстрат кој на места каде што ги има
ензимите на секуднарните антитела ке се појави обојување и може да биде флуоресцентно и ова ни
кажува дали во раствор 1 и 3 ги има антигени или протеини кои на нас ни се од интерес и освен што
ги има сега може да дознаеме и колкава маса се пример 60кда.Служи значи за нализа на протеини
оваа техник користејќи ги имунотехниките и со тоа можеме да видиме дали одреден протеин е
присутен во одреден раствор и колкав бил протеинот.Има нативна и SDS полиакриламиден гел
електрофореза.