Professional Documents
Culture Documents
Chương 1. Kỹ Thuật Chiết Xuất Các HCHCTN
Chương 1. Kỹ Thuật Chiết Xuất Các HCHCTN
Chương 1. Kỹ Thuật Chiết Xuất Các HCHCTN
TỰ NHIÊN
I. Giới thiệu hợp chất tự nhiên
• Khái niệm
• Phân loại
• Vai trò
II. Quy trình nghiên cứu các hợp chất tự nhiên
• Xử lý nguyên liệu
• Dung môi
• Các phương pháp chiết xuất
I. GIỚI THIỆU HỢP CHẤT TỰ NHIÊN
KHÁI NIỆM
Hợp chất thiên nhiên: các chất hóa học có nguồn
gốc từ thiên nhiên hoặc được con người chiết
tách từ các loài động vật, thực vật trong tự
nhiên.
Có hoạt tính sinh học cần cho sự sống và phát
triển của sinh vật hoặc có tác dụng dược học
dùng để làm thuốc chữa bệnh cho người, vật
nuôi hoặc cây trồng.
Ngành hóa học nghiên cứu tính chất và cấu trúc
của các hợp chất thiên nhiên được gọi là hóa học
các hợp chất thiên nhiên
Lịch sử nghiên cứu
Từ hàng ngàn năm trước trong quá trình phát
triển của loài người đã phát hiện ra các thảo
mộc có khả năng chữa bệnh.
Ai Cập (3000 BC)
• Hieratic Papyri, Ebers Papyrus, and the
Gynecologic Papyrus
• Ebers Papyrus (1500 BC) chứa 811
đơn thuốc và 700 thuốc, phần lớn từ
thực vật.
• Hành tây, rau mùi, dưa, lô hội, nhựa
cây, thuốc phiện, thầu dầu, hoa hồi Ebers Papyrus (Wikipedia)
1. Các bộ phận của cây thuốc: toàn cây, phần trên mặt
đất, lá, rễ,….
2. Các chất chiết xuất từ dược liệu: morphin, taxol,
quinin,….
3. Các loại thực phẩm chức năng
Tình hình sử dụng dược liệu và thuốc từ dược liệu
• Thị trường toàn thế giới: $83 tỷ (2009)
• UK: 20–33% dân số, $700 triệu (2007).
• USA: 72% dùng TPCN. Thị trường 5 tỷ USD (2009).
• Châu Âu: 7,5 tỷ USD. Germany (27%), France (24%) Italy
(12%), UK (9%).
• Indian healthcare market $7.3 billion, (60% pharmaceutical drug
manufacturers, 30% Ayurvedic medicine)
• China: $8 billion.
• Nhật: 126 USD/ người / năm (TPCN)
M. Heinrich. 2012. Fundamentals of Pharmacognosy and Phytotherapy 12
Impactvietnam.com (truy cập 6‐Nov‐2016)
Việt Nam
• Thuốc Nam:
Là thảo mộc có nguồn gốc ở
phương Nam (Việt Nam). Có
tri thức sử dụng làm thuốc
chữa bệnh ở Việt Nam (y
học cổ truyền chính thống
và nền y học dân gian)
• Thuốc Bắc
Là thảo mộc có nguồn gốc ở phương Bắc (Trung
Quốc). Có tri thức sử dụng làm thuốc chữa bệnh
ở Trung Quốc, theo hệ thống lý luận của Trung y
và phần lớn đã được tư liệu hóa
TÁC PHẨM THUỐC NAM TIÊU BIỂU
• Nam dược thần hiệu (11 quyển) – Tuệ Tĩnh
Ghi chép 580 vị thuốc nam, 3873 bài thuốc, chữa 182
chứng bệnh của 10 khoa lâm sàng
• Hồng nghĩa giác tư y thư – Tuệ Tĩnh
Tóm tắt tác dụng của 630 vị thuốc (bài phú thuốc nam) 13
phương gia giảm
• Hải thượng y tông tâm lĩnh (28 tập, 66 quyển)- Hải
Thượng Lãn Ông Lê Hữu Trác
- Quyển 10, 11 Dược phẩm vậng yếu. Viết về dược tính của
150 vị thuốc Bắc, Nam phân loại theo ngũ hành
- Quyển 12, 13 Lĩnh nam bản thảo. Quyển thượng viết 496
vị thuốc Nam thừa kế của Tuệ Tĩnh, quyển hạ viết 305 vị
thuốc bổ sung về công dụng hoặc mới phát hiện thêm
Tình hình sử dụng dược liệu và thuốc từ dược liệu
• Việt Nam: $526 triệu (10% ASEAN market)
Hà Nội 56% dùng TPCN, TpHCM 48%
Pyrethrin
N CH3
MeO O OH
Morphine
Plasmodium
falciparum
Soát reùt
Anthocyanidins
OH
OH
+
HO O
OH
OH
Vincristine
24
21 23 26
O O
22 25
HO O
18 20 27
12 17
11 OH
19
13
1 9
10 15
3 30
4
5'
O O
6
Xyl
4' OH 29
1' 28
NaO3SO 2'
6'' CH3
Qui
O O
Holothurin A (0.06%)
Hải sâm: Holothuria scabra
4''
OH 1''
6'''
CH2OH
O O 2''
4'''
Glc OH
6'''' O
CH2OH 1'''
O
MeGlc OH
OH
2''' Có tác dụng gây độc tế
4'''' 1''''
OH
OCH3
2''''
bào
OH
30
Hợp chất thiên nhiên
Phân loại theo chức năng sinh học (2)
31
Hợp chất thiên nhiên
Phân loại theo cấu trúc hóa học (3)
• Các hợp chất phenolic (flavonoid, lignan, quinon, catechin)
• Các hợp chất carbon hydrat (monosaccharid, oligosaccharid,
polysaccharid)
• Các hợp chất isoprenoid (carotenoid, steroid, terpenoid)
• Các hợp chất nitơ (alkaloid, acid amin, acid nucleic, protein,
porphyrin, pteridin)
• Coumarin
• Tinh dầu (terpenoid, dẫn xuất phenol)
• Chất tiết từ thực vật (gôm, nhựa thơm, dầu nhựa, nhựa)
• Thuốc trừ sâu thảo mộc (pyrethrin, rotenon)
• Kháng sinh thực vật
32
• Các vitamin
Hợp chất thiên nhiên
Phân loại theo tác dụng điều trị (4)
• Bệnh tim mạch, cao huyết áp, xơ vữa động mạch,…
• Bệnh rối loạn chuyển hóa (đái tháo đường, tăng lipid máu, tăng
acid uric máu)
• Bệnh đường tiêu hóa: bệnh gan mật, bệnh loét dạ dày-tá tràng
• Bệnh đường hô hấp
• Bệnh về thận và đường tiết niệu
• Bệnh về máu (thiếu máu)
• Bệnh do nhiễm virus, nhiễm khuẩn, ký sinh trùng
• Tăng cường hoạt tính hormon, các bệnh về nội tiết
• Tăng cường chức năng miễn dịch
• Kháng oxy hóa
33
• Kháng ung thư
VAI TRÒ CỦA HỢP CHẤT
THIÊN NHIÊN
1. Bảo vệ thực vật trước
sự tấn công của động vật,
mầm bệnh: gây ngán ăn,
nguỵ trang, xua đuổi côn
trùng.
Urushiol
H 3C COOH
COOH COOH
Ibuprofen
HO H3C O
CH 3
Thu hái dược liệu
Hoạt chất của dược liệu thay đổi bởi nhiều yếu
tố: trồng trọt, thu hái, phơi sấy, bảo quản.
Nguyên tắc chung định kz thu hoạch cho từng
bộ phận của cây:
1.Rễ và thân nên thu hoạch vào thời kz sinh dưỡng,
thường là vào thời kz thu đông. Tuy nhiên có trường
hợp đặc biệt như rễ bồ công anh cần hái vào giữa
mùa hè vì khi ấy chứa nhiều hoạt chất.
2. Vỏ cây thường thu hoạch vào mùa đông, là thời kz
nhựa cây hoạt động mạnh.
3. Lá và ngọn cây có hoa phải hái vào thời kz quang
tổng hợp mạnh nhất thường là thời kz cây bắt đầu ra
hoa, không nên hái khi quả và hạt đã chín.
4. Hoa phải hái lúc trời nắng ráo, trước hoặc đúng
vào thời kz hoa thụ phấn. Trừ vài trường hợp như nụ
hoè, nụ đinh hương.
5. Quả thì tuz loại, hái khi quả đã già như tiểu hồi, sà
sàng, có khi hái trước khi quả chín như quả mơ, hồ
tiêu. Cũng có trường hợp khi quả còn xanh thì hoạt
chất nhiều, khi chín thì hoạt động rất thấp ví dụ cây
Conium maniculatum L. chứa alcaloid coniin.
QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU
CÁC HỢP CHẤT TỰ NHIÊN
• 12–15 years
• 1 in 10,000 drug leads
• Development of Taxol (US$300 million)
‐> sale = USD $1 billion/year
• Lipitor: Sale of Atorvastatin (Lipitor) =
$13.3 billion (2009)
Việc lựa chọn, thu hái, xác định nguyên liệu mẫu cây cần
nghiên cứu là những giai đoạn đầu tiên cần phải tiến
hành trong quá trình khảo sát hóa thực vật.
Khi thu hái mẫu cây, cần kết hợp với nhà thực vật học để
xác định tên khoa học (vì cây thường được gọi bằng tên
địa phương rất dễ gây nhầm lẫn).
Phải ghi rõ cây thu hái ở vùng nào, thời gian thu hái, độ
tuổi của cây.
Phải ghi rõ người hái hoặc cơ quan giám định cây, và cây
hiện được lưu mẫu ở đâu.
Khi thu hái nguyên liệu phải chú ý loại bỏ các cây sâu
bệnh.
Đối với các bộ phận vỏ, thân, rễ chú ý xem xét kỹ, tránh
thu hái cây có mang những sinh vật ký sinh. Nhiều trường
hợp đã có kết luận sai về thành phần hóa học vì cây có
mang những loại nấm ký sinh.
Xử lý dược liệu
1. Phương pháp phơi
• Phơi nắng trên sân: có thể áp dụng cho nhiều dược liệu
và rẻ tiền
• Phơi trong bóng râm: dược liệu dễ biến màu, dễ hỏng,
chứa tinh dầu
• Phơi trên giàn: dược liệu quí, hoa, số lượng ít
• Phơi tránh bụi, ruồi nhặng: giàn cao, che vải màng, áp
dụng cho dược liệu có đường: long nhãn, thục địa
• Ưu điểm của pp phơi: đơn giản, ít tốn kém,
• Nhược điểm:
lệ thuộc thời tiết,
dễ nhiễm bụi bặm, ruồi nhặng...,
một số hoạt chất có thể bị biến đổi bởi tia tử ngoại.
2. Phương pháp sấy
• Sấy là phương pháp làm khô dược liệu bằng nhiệt lượng
nhân tạo trong các lò sấy, buồng sấy có lỗ thông hơi.
• Có nhiều kiểu lò sấy, buồng sấy từ quy mô thủ công đến
công nghiệp với nhiệt độ sấy có thể điều chỉnh được.
Khi sấy cần lưu ý:
• Dược liệu cần được chia nhỏ và trải mỏng trên khay,
• Nhiệt độ thích hợp với từng dược liệu, tăng từ thấp lên
cao,
• Thường xuyên trở đảo dược liệu.
Nên duy trì từ 40‐700C, chia làm 3 giai đoạn theo nhiệt độ
tăng dần
+ Giai đoạn đầu: 40‐500C
+ Giai đoạn giữa: 50‐600C
+ Giai đoạn cuối: 60‐700C
•Lưu ý: DL chứa tinh dầu nhiệt độ không quá 400C
3. Đông khô
• Dùng nhiệt độ thấp và áp suất thấp để nước thăng hoa.
• Áp dụng cho các sản phẩm sinh học, (e.g. bacteria,
yeasts), y sinh (biomedical, e.g. surgical transplants), thực
phẩm (e.g. coffee) và bảo quản (preservation)
Bảo quản
1. Độ ẩm không khí
60‐65%, nhà kho, đảo kho, phơi sấy, bao bì, chống ẩm …
2. Nhiệt độ
Thích hợp ở 250C, nhiệt độ cao làm tinh dầu bay hơi, dược
liệu biến chất. Kho chứa thông thoáng, đúng quy cách, đảo
kho và thông gió.
3. Côn trùng
Kiểm tra thường xuyên, sâu mọt cần xử lý như phơi sấy,
xông sinh, chloropicrin. Phòng mối bằng cách kê cao, thuốc
chống mối
4. Bao bì đóng gói
Chọn bao bì đóng gói thích hợp với từng loại dược liệu
và tiến hành đóng gói đúng quy cách
5. Thời gian bảo quản
Có kế hoạch mua bán và sử dụng dược liệu hợp lý,
tránh để dược liệu quá hạn
2. DUNG MÔI
Đây là quá trình chiết liên tục, dung môi sau khi đã bão
hòa hoạt chất sẽ được liên tục thay thế bằng dung môi
mới. Tuy vậy người ta không thực hiện liên tục mà mẫu
cây được ngâm trong dung môi khoảng 1-2 ngày, cho
dung môi bão hòa chảy ra rồi mới cho dung môi mới vào
tiếp tục thực hiện quá trình trích ly. Để khảo sát sự chiết
xuất hoàn toàn chưa, người ta thường theo dõi bằng cách
lấy dịch trích ly thử với các thuốc thử đặc trưng của hoạt
chất cần trích.
Trích ngấm kiệt Trích lỏng – lỏng
(Vận tốc dung môi chảy vào bình đựng (Hai loại dung môi không
bột cây bằng vận tốc chảy ra) hoà tan vào nhau)
Bình chiết ngấm kiệt ở quy mô công nghiệp
88
Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng
• Trong chiết xuất, chiếu xạ vi sóng (bức xạ điện từ ở tần số 2450 MHz)
vào môi trường có chứa các tiểu phân dược liệu và dung môi phân cực,
các phân tử này sẽ chịu đồng thời 2 tác động: sự dẫn truyền ion và sự
quay lưỡng cực dưới tác dụng của điện trường → làm sinh ra nhiệt trong
lòng khối vật chất, làm tăng khả năng hòa tan các chất vào dung môi.
• Vi sóng cũng phá hủy cấu trúc vách tế bào thực vật làm các chất tan giải
phóng trực tiếp vào dung môi chiết → quá trình chiết chuyển thành hòa
tan đơn giản → chiết xuất nhanh hơn nhưng cũng làm dịch chiết nhiều
tạp chất hơn.
• Đặc biệt thích hợp cho cất tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn theo hơi
nước → Thời gian chưng cất rút ngắn, hàm lượng tinh dầu thu được cao
hơn và chất lượng tốt hơn do thời gian tiếp xúc với nhiệt ngắn. 89
Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng
90
Hệ thống chưng cất hơi nước tinh dầu dưới sự hỗ trợ cuả vi sóng
trong phòng thí nghiệm
Sự tẩm trích sử dụng Sự tẩm trích dùng hệ thống
lò vi sóng gia dụng cải tiến Soxhlet – vi sóng
Sơ đồ chưng cất hơi nước tinh dầu
dưới sự hỗ trợ cuả vi sóng trong điều kiện sản xuất thử nghiệm (pilot)
Chiết xuất bằng chất siêu tới hạn
(Super-critical fluid extraction, SFE)
• Trong điều kiện áp suất bình thường, khi nâng nhiệt độ một chất
lỏng tới điểm sôi của nó, chất lỏng sẽ hóa hơi. Tuy nhiên, nếu tiếp
tục tăng nhiệt độ và đồng thời tăng áp suất của hệ lên quá một
nhiệt độ và một áp suất nhất định nào đó, người ta sẽ thu được
một “chất lỏng” đặc biệt gọi là chất lỏng siêu tới hạn. Chất lỏng này
không giống với trạng thái lỏng thông thường mà mang cả đặc tính
của cả chất khí và chất lỏng.
• Do mang cả đặc tính của chất khí và chất lỏng nên chất lỏng siêu tới
hạn có khả năng hòa tan các chất đồng thời có độ nhớt thấp và khả
năng khuếch tán cao có thể dùng để hòa tan các chất và ứng dụng
vào chiết xuất các chất trong dược liệu. 94
Chiết xuất bằng chất lỏng siêu tới hạn
• Khi chiết xuất hoạt chất từ dược liệu, CO2 lỏng siêu tới hạn có lợi hơn các
dung môi hữu cơ thông thường (có điểm tới hạn thấp, rẻ tiền, không độc
hại và thân thiện với môi trường, có thể thu hồi), hiệu suất chiết cao và
không để lại dư lượng dung môi trong cao chiết. Ngoài ra quá trình chiết
xuất có thể tiến hành ở nhiệt độ thấp nên không làm biến đổi những
thành phần kém bền với nhiệt độ.
• Một trong những nhược điểm của SFE là tính phân cực của CO2 lỏng quá
tới hạn. Ở các điều kiện chiết thông thường, CO2 lỏng siêu tới hạn là một
dung môi kém phân cực, do đó chỉ có thể dùng để chiết các chất kém
phân cực. Để cải thiện khả năng hòa tan các chất phân cực hơn, trong
quá trình chiết xuất, người ta thêm vào CO2 lỏng siêu tới hạn một lượng
nhất định một dung môi phân cực (như methanol). 95
Chiết xuất bằng chất lỏng siêu tới hạn
(Super-critical fluid extraction, SFE)
• Các nhóm hợp chất thích hợp nhất để chiết bằng chất lỏng siêu tới
hạn là tinh dầu, chất béo, carotenoid và các chất kém phân cực khác.
• Với tinh dầu, việc chiết bằng CO2 lỏng siêu tới hạn cho hiệu suất chiết
cao, thời gian chiết ngắn và không làm hư hỏng các chất nhạy cảm với
nhiệt độ. Tinh dầu thu được có hương thơm gần với tự nhiên nhất.
Người ta dùng carbon dioxid và nitrogen oxid hóa lỏng để chiết xuất
nhiều loại hoạt chất trong cây như hiệu suất pyrethrin trong hoa Cúc
trừ sâu – Pyrethrum cinerariifolium được nâng lên đến 50% so với
97
Chiết dưới áp suất cao
(Pressurized liquid extraction – PLE)
• Khi nhiệt độ tăng, khả năng hòa tan các chất tăng → giảm lượng dung môi sử dụng
và giảm thời gian chiết. Tuy nhiên, trong điều kiện bình thường, việc tăng nhiệt độ
để chiết có giới hạn của nó là nhiệt độ sôi của dung môi. Khi hóa hơi, dung môi
không còn khả năng hòa tan các chất nữa. Để khắc phục điều này, người ta tiến
hành chiết các chất dưới áp suất cao dựa vào nguyên tắc: nhiệt độ sôi của chất
lỏng tăng khi áp suất tăng.
• Khi nhiệt độ tăng lên 10 oC, khả năng hòa tan của dung môi tăng lên gấp rưỡi.
Trong chiết dưới áp suất, dung môi chiết được đưa tới nhiệt độ và áp suất gần với
vùng tới hạn. Nhiệt độ và áp suất cao làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán của
dung môi để cho việc chiết xuất hiệu quả hơn.
• Nhiệt độ có thể thay đổi từ 80 – 200 oC và áp suất có thể tới 150 bar tùy theo loại
dung môi và chất cần chiết. 98
Chiết dưới áp suất cao
(Pressurized liquid extraction – PLE)
• So với SFE, PLE có sự linh hoạt hơn trong việc lựa chọn dung môi
do đó có thể chiết các chất trong một giới hạn rộng hơn về độ
phân cực. Các thiết bị cũng không cần đạt áp suất cao nghiêm ngặt
như SFE nên dễ dàng áp dụng thực tế trên quy mô lớn.
• Trong nghiên cứu và sản xuất dược liệu, PLE đã được sử dụng để
chiết ở quy mô phòng thí nghiệm, chuẩn bị mẫu phân tích hay
chiết các chất ở quy mô lớn. Ví dụ, chiết dioxin bằng toluen hoặc
toluen + 5% acid acetic (150 oC, 150 bar), chiết chất béo trong các
hạt dầu bằng n-hexan (100 oC, 100 bar), chiết hypericin trong
Hypericum perforatum bằng acetonitril (100 oC, 100 bar). 99
Chiết dưới áp suất cao
(Pressurized liquid extraction – PLE)
100
Chiết bằng nước nóng dưới áp suất
(Pressurized hot water extraction, PHWE)
• Một biến thể của PLE cũng được áp dụng trong chiết xuất
dược liệu là chiết bằng nước nóng dưới áp suất (pressurized
hot water extraction, PHWE).
• Do điểm tới hạn của nước khá cao nên trong PHWE người ta
dùng áp suất thấp hơn nhiều (chỉ vào khoảng 20 bar) ở nhiệt
độ thay đổi từ trên 100 – 200 oC. Đặc tính (độ phân cực) của
nước thay đổi rất nhiều trong điều kiện này làm cho nước có
thể chiết được các chất kém phân cực hơn. Trong PHWE, sự
phân hủy các chất có thể xảy ra. 101
Những điều cần lưu ý khi chiết xuất:
Khi chiết xuất các hợp chất thiên nhiên,
người ta thường trích luôn các tạp chất hay hiện
diện trong cây như chất béo, chất màu. Những
tạp chất này sẽ làm cản trở quá trình cô lập tinh
chế các hoạt chất muốn khảo sát.
Chất béo (lipid):
Thường được loại bằng dung môi không phân cực nhưng
chúng cũng có thể được chiết xuất bằng những dung môi
phân cực.
Các loại hợp chất này có thể được nhận thấy khi sắc ký lớp
mỏng và hiện màu bằng hơi iod sẽ cho những vết màu nâu.
Muốn loại bỏ chất béo và sáp, có thể thực hiện theo những
cách sau:
Bột cây trước tiên phải được ly trích bằng ether dầu hỏa
cho thật kiệt, sau đó phơi khô bột cây rồi mới trích tiếp
bằng dung môi khác.
Dùng sắc ký cột nhanh (flash – chromatography): dung
môi giải ly là ether dầu hỏa hoặc hexan
Chất màu (pigment): rất khó bị loại. Ở nhiệt độ phòng, có
thể dùng than hoạt tính, acetat chì hoặc kết tủa trong tủ
lạnh.
Các chất polyphenol – tanin: thực vật thường chưá tanin
với hàm lượng cao. muốn loại bỏ tanin ra khỏi dịch chiết
nước, người ta thường cho dung dịch ly trích đi qua cột
hấp phụ có chứa Polyamid, Sephadex LH-20…
Các chất dẻo như phtalat dialkyl, tri n-butyl acetyl citrat,
tributylphosphat…thường là các tạp chất lẫn trong dung
môi hoặc phụ gia chất dẻo trong các thùng chứa làm bằng
chất dẻo…
Trong chloroform và methanol thường có chứa phtalat
di-2-ethyl hexyl mà trước đây nhiều người lầm tưởng là
hợp chất tự nhiên cô lập từ cây cỏ.
Ngoài ra, khi chiết xuất cần lưu ý đến các chất bôi trơn
như silicon chân không ở thiết bị cô quay chân không,
các chất artefact là chất chỉ được thành lập trong quá
trình chiết xuất, thường là những dẫn xuất của các hợp
chất tự nhiên. Muốn hạn chế những trường hợp này cần
phải sử dụng các điều kiện chiết xuất, cô lập êm dịu, tại
mỗi giai đoạn của quá trình chiết xuất đều có thể tạo ra
những artefact này.