Thuc-Hanh-Hoa-Sinh-Hoc - (Nxb-Dai-Hoc-Quoc-Gia-2001) - Nguyen-Van-Mui,-172-Trang - (Cuuduongthancong - Com)

Đ A I H O C Q U Ố C G I A HA NÔI
NGU YẾN V À N MÙI
ffia !
(Ị}G NHÀ XUẢT B á n đại học q uố c g ia hà nội
Hểl NỌI
CuuDuongThanCong.com https://fb.com/tailieudientucntt
ĐẠI
• HỌC
• QUỐC GIA HÀ NỘI
•
NGUYỄN VẢN MỪI
THỰC HÀNH
■
HOÁ SINH HỌC
NHÀ XUẤT B Ả N ĐẠI HỌC QUOC GIA HÀ NỘI - 2001
Lời n ó i d ầ u ...................................................................................................................................... ~
C h ương 1. Hoá c h ấ t và d u n g d ị c h .............................................................................................9
I. Khái niệm vê hoá c h ấ t ................................................................................................................ 9
II. Dung dịch................................................................................................................................. 13
III. Nồng độ dung dịch................................................................................................................ 14
IV. Pha dung dịch tiêu chuẩn để chuẩn độ.............................................................................. 22
V. Cách tính hệ số điều c h ỉn h .....................................................................................................25
VI. Bài t ậ p ....................................................................................................................................... 26
C h ư ơ ng 2. P h ư ơ n g p h á p lấy m ẩu p h ả n t í c h .....................................................................29
I. Lấy m ẫ u ....................................................................................................................................... 29
II. Chuẩn bị mẫu phán tích.......................................................................................................... 31
III Cỏ định m ẫ u .............................................................................................................................. 31
C h ư ơ ng 3. P h ư ơ n g p h á p s o m a u ............................................................................................ 34
I . Phương pháp so m àu .................................................................................................................34
II. Định luật L am bert-B eer......................................................................................................... 35
III. Màu dung dịch và chọn hước sóng ánh sáng (hay chọn kinh lọc m à u )...................... 37
C h ư ơ ng 4. P h ư ơ n g p h á p q u a n g p h ố k ế ................................................................................43
I. Hấp thụ tử ngoại của các loại cuvet khác n h a u ................................................................ 44
II. Quang phổ hấp thụ tử ngoại của NAD* và N A D H .......................................................... 44
III. Ước tính khôi lượng NADH...................................................................................................45
C h ư ơ n g 5. Đ in h lư ợ n g g l u x i t .....................................................................................................46
I. Định lượng đường khứ theo phương pháp B e rtra n d ......................................................... 46
II. Định lượng đường khử theo phương pháp vi lượng của Rodzevich..............................50
III. Định lượng glucozd trong máu bằng phương pháp N e lso n ......................................... 52
rv. Định lượng fructozd trong (lung dịch có lản đường khử khác................................................ 53
V. Định lượng đường khử bằng phường pháp axit. dinitro-salicylic (DNS)......................55
VI. Định lượng sacarozd theo phương pháp thuỷ phân bằng axit........................................56
VII. Đinh lượng tinh bột theo phương pháp thuỷ phân bằng a x i t .......................................57
VIII. Định lượng xenlulozơ.......................................................................................................... 59
IX. Định lượng pectin bằng phương pháp canxi p e c ta t....................................................60
X. Định lượng dextrin bằng phương pháp kết tủ a vối cồn................................................. 61
C h ư ơng 6. Đ ịn h lư ợng lipĩt.................................................................................................... 63
I. Định lượng lipit bằng máy Soxhlet...................................................................................... 63
II. Xác định các chỉ sô của lip it................................................................................................ 6 6
Chương 7. Đ ịn h lư ơ ng a x ỉt am in và p r o t e i n ................................................................... 72
I. Định lượng axit amin bằng phương pháp chuẩn độ íbrmol (phương pháp Sorensen)
................................................... .............. ............................*................. ......................................... 72
II. Định lượng axit amin bằng n in h iđ n n ................................................................................74
III. Định lượng axit amin nhờ tạo thành phức chất vối đồng (Phương pháp Pope và
Stevens).........................................................................................................................................76
IV. Định lượng nitd bằng phương pháp Kjeldahl.................................................................. 78
V. Định lượng protein bằng phương pháp Lowrv.................................................................83
VI. Định lượng protein tỏng sỏ, albumin và globulin trong huyêt thanh máu hằng
phương pháp Biure......................................................................................................................84
VII. Định lượng protein bằng Coomasie Brilliant Blue G-250......................................... 86
VIII. Định lượng protein bằng phương pháp quang p h ô .....................................................89
C hương 8. Đ ịn h lư ợ n g a x it n u c l e i c ......................................................................................92
I. Phương pháp Schimidt và T h ann hauser............................................................................ 92
II. Phương pháp Schneider........................................................................................................ 94
III. Phương pháp Ogur và R osen............................................................................................. 95
IV. Phướng pháp quang phố...................................................................................................... 97
V. Định lượng hợp chất photpho trong mô ruột theo phương pháp Schmidt và
T hannhauser có sửa đ ổ i.............................................................................................................98
VI. Định lượng photpho theo phương pháp Horecker và các cộng sự..............................101
VII. Định lượng photpho vỏ cơ có nguồn gốc từ photpholipit theo phường pháp Delorv
..................... ......... ......................ĩ................. ........................... .............................101
VIII. Định lượng ARN bằng orxinol........... ........................................................................... 102
IX. Định lượng ADN bằng phướng phấp điphenylam in.................................................. 104
C h ư ơng 9. Xáo đ ịn h h o ạ t đô củ a m ộ t sô e n z i m ............................................................106
I. Định nghĩa (lơn vị hoạt độ của enzim ...............................................................................106
II. Chú ý khi xác định hoạt độ enzim.................................................................................... 106
III. Xác định hoạt độ của ascorbat oxidaza.......................................................................... 107
IV. Xác định hoạt độ của a- amylaza theo Rukhliadeva Geriacheva........................................108
V. Xác định hoạt độ của c a talaza...........................................................................................112
VI. Xác định hoạt độ cholinesteraza của huyết thanh (ChE) - phương pháp sửa đổi của
H estrin......................................................................................................................................... 113
VII. Xác định hoạt độ của glucoamylaza...............................................................................114
VIII . Xác định hoạt độ lip aza.................................................................................................116
IX. Xác định hoạt độ papain.................................................................................................... 118
X. Xác định hoạt độ pepsin bằng phương pháp A nson...................................................... 121
4
XI. Xác định hoạt độ peroxidaza............................................................................................ 123
XII. Xác định hoạt độ photphataza kiếm và photphataza axit theo phương pháp King -
Armstrong................................................................................................................................... 125
XII ỉ. Xác định hoạt độ proteinaza theo phương pháp Anson cai tiên......................................... 127
XIV. Xác định hoạt độ ureaza theo phương pháp chuân đ ộ ............................................... 130
C hương 10. Đ ịn h lư ợ ng v i t a m i n ..........................................................................................132
I. Định lượng vitamin c theo phương pháp chuẩn đ ộ ........................................................132
II. Định lượng vitamin B2 bằng phương pháp huỳnh quang........................................... 135
III. Định lượng vitamin B 1 bằng phương pháp huỳnh quang............................................ 142
Chương 11. Đ ịn h lư ợng m ộ t sô" n g u y ên t ô ...................................................................... 144
I. Định lượng photpho.............................................................................................................. 144
II. Định lượng Kali tổng sô của thực vật bằng Natri Cobantinitrit............................................ 150
III. Định lượng Canxi và Magie tống sô của thực vật bằng trilon B ............................... 151
IV. Định lượng Canxi trong mô cơ theo phương pháp R etinxki......................................152
V. Định lượng sắt....................................................................................................................... 154
("hương 12, Phụ lục.................................................................................................. 155
I. Các dung dịch đệm ................................................................................................................ 155
II. Dung dịch pH c h u ẩn ............................................................................................................163
III. Nồng độ axit và amoniac thường g ặ p .............................................................................163
IV. Pha dung dịch phần trăm axit và amoniac....................................................................164
V. Khỏi lượng mol phân tử và tỷ khôi của một sô" a x i t ...................................................... 165
VI. Kiêm tra nồng r*\ các dung dịch chuẩn độ đã pha bằng dung dịch chát gốc có nồng
độ chính x ác................................................................................................................................ 165
VII. Chỉ thị màu axit - bazơ .................................................................................................... 166
VIII. Cách pha và sử dụng một số thuốc thử chỉ thị màu thông thường........................ 167
IX. Các dung dịch rửa dụng cụ bẩn trong phòng thí nghiệm ......................................... 168
X. Nguyên tử khôi của một sô" nguyên tô"..............................................................................169
XI. Nồng độ dung dịch amoni sunfat băo hoà ở nhiệt độ khác nhau.......................................... 170
XII. Cách tính lực li t â m ..........................................................................................................170
XIII. Các ký hiệu quy định kích thưóc và các phần thập p h â n ........................................170
XIV. Các chữ cái Hy L ạ p .......................................................................................................... 171
XV. Các tính chất của một sô đồng vị phóng xạ ứng dụng trong ysinh học.................171
XVI. Sự phụ thuộc của tỷ khổi và chỉ sô" khúc xạ vào nồng độ dung dịch.......................172
Tài liệ u t h a m k h ả o .................................................................................................................... 173
Lời nói đ ầ u
Giáo trình "Thực hành hoá sinh học” dùng cho sinh viên năm thứ ba, ngành Công
nghệ Sinh học, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Đại học Quỏc gia
Hà Nội.
Sinh viên tiến hành làm 20 bài thực hành của 11 chương khác nhau, tùy thuộc
điều kiện, cơ sở vật chất của phòng thí nghiệm cho phép. Cán bộ phụ trách thực hành
có thê lựa chọn các bài của các phần như: cách tính toán các loại nồng dộ, xứ lý mẫu
till nghiệm, phương pháp so màu, phương pháp quang phổ kê, định lượng gluxit, định
lưựng lipit., định lượng axit am in và protein, định lượng axit nucleic, xác định hoạt độ
định lượng vitamin, định lương một sô' nguyên tô'kim loại ...
Ngoài ra, quyên sách còn được dùng cho thực tập chuyên đề của sinh viên năm
t hủ' tư và phục vụ cho học viên cao học làm luận án thạc sĩ thuộc chuyên ngành Hoá
sinh học, trưòng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Sách đả được sửa chửa và bố sung một sô phương pháp ở các chương định lượng
protein, xác* định hoạt độ một sô" enzim, định lượng một sô" nguyên tô" kim loại... so với
lan xuàt ban đầu.
Tác giả
Chương 1
HOA CHAT VA DƯNG DỊCH
I. KHÁI NIỆM VỂ HOÁ CHẤT
1 . C ác c h ấ t h o ả học
Các chất dùng đê phân tích hoá học, làm tiêu bản.... trong phòng thí nghiệm được
gọi là hoá chất. Các hoá chất có thê là chất rắn, lỏng, khí có mức độ tinh khiết khác
nhau.
- Sạch kỹ th u ật
- Sạch phản tích
* Sạch hoá học
Hoá chất được-'đóng trong các chai lọ thuỷ tinh, nhựa... có nhãn ghi (Hình 1 . 1 ):
- Tên hoá chất
- Công thức hoá học
- Mức độ sạch
- Khôi lượng hoá chất
- Phân tử khôi
- Nơi sán xuất
- Điều kiện bảo quản
Ethyl acetate GPR

CH3COOC2H5 M.W.88.11
g/ml 0.90
99%
By IR spectrum
Maximum Limits o f Impurities
Water 0 . 1%
Non-volatile matter 0.005%
Acidity (CH 3CO O H ) 0.05%
Ethanol 0.5%
Heavy metals (as Pb) 0 .0002%
Hinh 1.1 - Nhãn hoá chất
Tính chất nguy hiểm của hoá chất được cảnh báo bằng các ký hiệu in trên nhàn
hoá chất (Hình 1.2).
Chất ản mòn Chất kích thích C hất dễ nổ
C hất dễ cháy Chất dễ oxi hoá C hất độc hại môi trường
Chất độc Chất có khói độc Chất có phóng xạ
Hình 1.2 - Các kỷ hiệu cảnh báo hoá chất nguy hiểm
Trong các cơ quan nghiên cứu và nhà máy sản xuất hoá chất có những vùng
nguy hiểm được cảnh báo bằng các ký hiệu (Hình 1.3), các biển hiệu cấm (Hình 1.4) và
các biên hiệu điều kiện an toàn (Hình 1.5).
A A A A A Rủi 1*0 sinh học
<- Dễ cháy không mỏ

UAMOKH
A OLA t l
<r- Nguy hiểm thuỷ tinh vồ
4k .4*. A*. <- Độc với tế bào
<- Độc vái gan

DANGER>INFECTION A <—Nguy hiểm nhiễm trùng
<- Nguy hiếm nhiễm trùng

[
BSBEBSpn I <—Mẫu bệnh lý, chú ý dễ hỏng
STERILE STERILE STÊRH
<” Tiệt trùng
A A u«>r.
trj?' <- Cảnh báo nguyên liệu phóng xạ
Vùng có chất độc Nguyên liệu dễ bốc cháy Nguyên liệu dễ nô
Có tia laze Chất ăn mòn Rủi ro sinh học
Hình 1.3 - Ký hiệu cảnh báo các vùng nguy hiểm
Cấm hiit thuốc Câ'm lửa Cấm vào
Cấm đi bộ Cấm dập lửa Nưốc không Cấm dùng găng tay
bằng nước uống được bằng cao su
Hình 1.4 - Các ký hiệu cấm
II
Mũ bảo hiểm Chông ồn Phải rửa tay trước
•> + * %
Mù. kính báo hiêm, chông ôn Mủ che đâu và mặí Phải đi ủng cao su
Chỉ được đi bộ Găng tay bảo hiểm có cổ tay Phải có khẩu trang
Phải có găng tay cao su Phải có kính Phải có mặt nạ chống: độc
Tire nearest first

box 'msituated— >
Person in. .c. .h. a rg e flH
. J.. . -
Dội nưóc khẩn cấp Hộp trợ cứu đầu tiên Rửa mắt TrỢ cứu đầu tién
Hình 1.5 - Các ký hiệu vế điểu kiện an toàn
12
2. C ách s ử d ụ n g h o á c h ấ t
a) Cần g i ữ h o á chất sạch
- Chai lọ hoá chất phải cỏ nắp

Trước khi lấy hoá chất phải lau sạch nắp và cô lọ.
- Không clùng lẳn nắp đậy và dụng cụ lấy hoá chất.
- Không dùng hoá chất đã rơi vãi.
h) Hoá c h ấ t (tá p h a
- Lọ hoá chất phải có nhăn ghi tên hoặc công thức hoá học.
- Ghi n ồ n g độ dung dịch.
- Ghi ngày pha.
* Chai lọ đựng hon chất pha phải có nắp.
- Không đê hoá chất rơi vào nhăn.
- Trước khi mớ nắp lọ phải lau sạch nắp và cô lọ.
- Để nấp và dụng cụ lây hoá chất ở nơi sạch, không đế phan tiếp xúc vối hoá chất
xuống bàn.
c) B à n th í n g h iê m
- Chỉ đê hoá chất dang dùng lúc đó.

- Các ho á chất đê bốc hơi, có mùi... phải lấy nhanh hoặc lấy trong tủ hút, phải
đậy kín,
- Khi làm việc vói kiềm, axit và các chất độc phải theo đúng quy (lịnh.
- Không được ngửi hay nếm thử hoá chất.
- Các hoá chất dễ cháy, dễ nô không được để gần lửa.
II. DUNG DỊCH
Dung dịch là hồn hợp nhiều loại của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ vói
nhau về lý, hoá học - thành phần đơn giản nhất của dung dịch có thê tách ra được ớ
dạng t inh khiết, ngược lại có thể điểu chế dung dịch ấy theo một thành phần bất kỳ
dược gọi là th à n h phần dư trong dung dịch so với thành phần kia là dung môi. Thành
phần còn lại là chất hoà tan.
Ví dụ:
- Dung dịch NaOH 10% trong nước:
NaOH là chất tan, nước là dung môi.
13
- Butanol bão hoà nước:
Nước là chất tan. butanol là dung môi.
111. NỒNG ĐỘ DUNG DỊCH
Trong phép tính nổng độ dung dịch, các chất tan được biểu thị bằng đơn vị khôi
lượng, khôi lượng m oi đương lượng gam (thường được sử dụng), còn sô lượng dung mòi
hoặc dung dịch được biểu thị bằng đơn vị khôi lượng mol hoặc đơn vị thê tích. Trong
nghiên cứu thường dùng 3 nồng độ cơ bản.
- Nồng độ phần trám (%).
- Nồng độ mol/1 (mol - M).
- Nồng độ đương lượng gam (N)
Ngoài ra còn có:
- Nồng độ gam trên lít: sô" gam chất tan có trong một lít
- Nồng độ dung dịch bão hoà: là ở nhiệt độ nhất định, chất hoà ta n không thê hoà
ta n thêm được nữa. Thường biểu thị bằng sô" gam chất tan trong 1 0 0 ml nước.
1. N ồ n g độ p h ầ n trả m (được c h ia là m 3 loại n ồ n g độ)
- Phần trăm khỏi lượng - khối lượng (% w/w) là sô" gam ciia một. chất hoà tan trong
100 gam dung dịch.
- Phần trăm khối lượng - thể tích (% w/v) là sô" gam của một chất koà tan trong
10 0 ml dung dịch.
- P hần trăm thê tích - thê tích (% v/v) là sô" ml của một chất hoà tan trong 100ml
dung dịch.
Ngoài ra còn có loại nồng độ phần trăm chất hoà ta n nhỏ 1000 lần được tính bằng:
+ Miligam phần trăm (mg%) là sô" mg của chất hoà ta n trong lOOg hoặc trong
100ml dung dịch (rag/lOOml).
+ Microgam phần trăm (ng%) là sô" microgam (|ig) của chất hoà ta n trong 100 gam
hoặc lOOml dung dịch (Ịig/100ml).
và hai loại nồng độ thường được sử dụng là:
+ Dung dịch phần nghìn (%o) là sô" gam chất hoà tan trong 1000ml dung dịch.
+ Dung dịch phần triệu (ppm) là sô' gam chất tan trong 1.000.000ml dung dịch
hay miligam trong 1 0 0 0 ml dung dịch hoặc microgam trong lml.
a) N ồ n g độ p h ầ n tr ă m k h ô i lư ơ n g - k h ố i lư ơ n g (% w /w )
• Chất rắn tan trong chất lỏng
14
+ Chất rắn không ngậm nước
Pha dung dịch từ chất rắn không ngậm nước được tính theo công thức sau:
X =— (1.1)
100
Trong đó:
X - sô gam chất tan lấy đê pha
a - số phần trăm dung dịch muôn pha
b - khối lượng dung dịch cần pha
Ví dụ ỉ: Cần bao nhiêu gam NaCl và bao nhiêu ml nưốc để nhận được 300 gam
đung địch NaCl 15% (w/w)?
Giải: Áp dụng công thức trên ta có:
x = l ^ -3 -9° = 45(g)
100
Đáp so: Để n h ận được 300 gam dung dịch NaCl 15% (w/w) cần cân 45 gam NaCl
hoà tan trong 255 gam (ml) nước (300 - 45 = 255).
+ Chất rắn ngậm nước
Muôn pha dung dịch này phải tính cả lượng nưốc ngậm trong phân tử của chất
tan, sau đó tính khôi lượng tổng cộng (khôi lượng chất ta n và khổì lượng nưốc ngậm).
Công thức tính:
X = — (1.2)
w
Trong đó: X- sô" gam chất tan lấy pha
a- khôi lượng mol ngậm nước
b- phần tră m dung dịch cần pha
w- khôi lượng phân tử không ngậm nước.
Ví dụ 2: Pha dung dịch Cu s o 4 10% từ C u S 0 4 .5H 2 0 .
Giẩi: Phải tính khôi lượng mol của C1 1 SO 4 và C uS 0 4 .5H20
C u S 0 4 = 159,6 (-160); C u S 0 4 .5H20 = 249,7 (-250).

Lắp vào công thức:
X = 25010 =
160
Đáp số: Cần phải cân lõ , 6 g CuSO^.õH.Ô và 84,4 gam (ml) nước (100 - 15,6 = 84,4)
ta được dung dịch CuSO 10% (w/w). ị
15
Trong thực tê, khi pha những dung dịch có nồng độ) vài % thì người ta thường
cân chất tan rối cho vào binh định mức hay ông đongr, sau đó thêm nước đên ngàn
muôn pha (vi trong trường họp này thẻ tích mất đi khôrhg đáng kể), cỏng thức tính:
(1.3)
- Chất lỏng tan trong chất lỏng

Chất tan ở đây là chất lỏng và được cân như chất tam và dung môi là nước.
Tính theo công thức:
X= 100 -a (1.4)
Trong đó: a - sô gam chất tan
X - số ml nước cần (lùng.
Ví dụ 3: Pha dung clịch HC1 10% trong nưôc: ta cân dung dịch HC1 rồi láy 100 gam
trừ đi sô gam HC1 là lượng nước thêm vào.
*Chú. ỷ: Các chất lỏng có nồng độ hoà tan tôi đa được tính theo phần trăm. Ví dụ:
H.,SO | hoà tan tôi đa là 96%, HC1 là 37%, H.,PO.ị là 65% v.v... Vì vậy khi cân các chất
lổng này phải tính sô gam chất đó trong dung dịch theo công thức:
100.a
A — —*-------
b
Trong đó: X - khôi lượng chất tan cần có
a - nồng độ dung dịch cần pha
b - nồng độ chất tan hiện có.
Ví dụ 4: Pha dung dịch HC1 10%.
Ta có HC1 đặc là 37%, vậy khối lượng HC1 được tính theo công thức(l.õ):
Như vậy ta phải cân một lượng HC1 là 27,03g, sau đó thêm một lượng nước:
100 - 27,03 = 72,97 (hay 72.97ml nước vì clị|i() = 1 )
Đôi với chất lỏng ta có thê chuyến thành thế tích đe th u ậ n lọi cho pha chê và đước
tinh theo công thức sau:
V P (1.6)
(ỉ
16
Trong đó: V- thế tích cần lấy
p - khôi lượng chất tan
d - tỷ khôi chất tan
Vậy thể tích của 27,03 gam HC1 37% có thê tính như sau:
97 0 °,
V = ^ ^ 2 3 (m l) (d„n;i7% = U 9 )
b) P h ầ n t r ă m kh ô i lương - thê tích (% w/v)
Cân sỏ" gani chất rắ n bang sô nồng độ muôi pha cho vào bình định mức hay ông
đong 100ml và cho dung môi đến vạch 100ml. Nếu chất rắn ngậm nước phải cộng
thêm khôi lượng phân tử nước ngậm.
Vi dụ: c ẩ n bao nhiêu gam NaCl đê nhận được 300ml dung địch NaCl 15% (w/v)?
Giái:
lOOml dung dịch có lõg NaCl
300ml dung dịch có Xg NaCl
_ 3 0 0 Xlõ
X = ------ -— = 45 (g)
100
Đáp sỏ: Cân 45g NaCl rồi dẫn nưốc đến 300ml.
c) P h ầ n t r ă m thê tích- t h ể tích (% v/v)
- Tính theo nồng độ và th ể tích

Áp dụng công thức:
V 1x%1 = v 2y%2 (1.7)
Trong đó: V ì - thê tích dung dịch cần lấy pha
V 2 - thê tích dung dịch cần pha
% J - phần trăm dung dịch lây pha
%; - phần trăm dung dịch pha

Vi dụ 1: c ầ n bao nhiêu ml dưng dịch NaCl 27% (w/v) để nhận được 3000ml dung
dịch NaCl 0,9% (w/v).
Giải: Thay vào công thức ta có:
X m l . 27% = 3000m l. 0,9% Ị
x = 3000x09
27 i
"■ . ...ì
17
Cách p h a: Lây 100ml dung dịch 27% pha với 2900ml H 2 O (3000 —100) hay dẫn
nước đến 3000ml.
Ví dụ 2: Cách pha như thê nào đê nhận được 200ml dung dịch HC1 25% (w/v) từ
HC1 có tỳ khối d = 1,19 và nồng (ỉộ 37%.
Giải: Nồng độ của HC1 đặc là phần trăm khối lượng - khôi lượng bằng cáchchuyển
nồng độ % w/w sang % w/v qua giá trị tỷ khôi của axit.
Nồng độ axit %(w/v) = 37%(w/w). 1.19(d) = 44 thay vào công thức (1.7)
X(ml).44% = 200(ml) . 25%
x = 200x25 = 6
44
Cách pha: lấy 113,6ml HC1 đặc dẫn nưóc đến 200ml.
- Tính theo quy tắc hình binh hành
a ^r___________ (Ị X: nồng độ dung dịch cần pha
a: nồng độ dung dịch cao
(1.8)
c: nồng độ dung dịch thấp
c ^ k di số ml (X-c) của dung dịch a
b: sô" ml (a-X) của đung dịch c
+ Pha dung dịch từ một nồng độ
Ví dụ 3: c ầ n bao nhiêu ml H2 S 0 4 đặc 96% (d = 1,84) để n h ậ n được dung dịch
H 2 S 0 4 30% ?
Giải: Áp dụng công thức (1.8) ta có:
96 ------------ 30g H 2SO., 96%
. 30:
0 < --------------------- 66g H 20
Cách pha: Pha 30g HjjSO,, 96% (30:1,84 = 16,3ml H^so^ 96% ) và 6 6 ml H / )
+ Pha dung dịch từ hai dung dịch có nồng độ khác nhau:
Ví dụ 4: c ầ n có dung dịch 40% từ hai dung dịch 50% và 20%.
Giải: theo quy tắc ta có
50 — 7- 20g 50%
2 0 < -------------- lOg 20%

Cách p h a: Lấy 20g dung dịch 50% và lOg dung dịch 20% được 30g dung dịch 40%.
18
*Chú ý: Nếu chỉ từ một nồng độ dung địch cao xuống nồng độ dung dịch thấp cũng
tính theo quy tắc hình bình hành, nhưng dung dịch thấp là nưóc 0 %.
Ví dụ 5: Pha dung dịch 10% từ dung dịch 50%.
Giải: Theo quy tắc hình bình hành ta có:
50 I0 g 50%
/ \
0 < --------------- 4 0 g H 20
Cách pha: Lấy lOg dung dịch 50% và 40g H20 (=40ml) ta được 50g dung dịch 10%
Trường hớp không cần độ chính xác cao và 2 nồng độ gần nhau thì có thể tính theo
thê tích.
Vi dụ 6: c ầ n bao nhiêu ml dung dịch NaCl 20% và 3% (w/v) đế nhận được 500ml
dung dịch NaCl 9%.
Giải: Thay vào công thức ( 1 .8 ) ta có:
20 <r------------------ - ^ 6 m l 20%
3 ệ ----------------- 11 ml 3%
Từ 6 ml NaCl 20% có thể nh ận được 17ml NaCl 9% (6 + 1 1 )
Từ X ml NaCl 20% có thể nhận được õOOml NaCl 9%
X = = 176(m l)
17
Cách p h a: Lấy 176ml NaCl 20% và 324ml NaCl 3% (500 - 176 )
d) C ách tín h các lo ạ i n ồ n g đô
1 % = 10 %.. = 100 0 mg% = 10 .0 0 0 ppm = 1 .0 0 0 . 0 0 0 \xg%

1%0 = 0 ,1 % = 100 ng% = 1.000 p p m = 1 0 0 . 0 0 0 ịig %
1 mg% = 0,001% =0,01%o = lO p p m = 1.000 ng%

1 ụg% = 0 ,0 0 0 1 % = 0 ,0 0 1 %o = 0 ,0 0 1 mg% = 0 ,0 1 ppm
2. N ồ n g d ộ mol/1 ( n ồ n g đ ộ M )
Mol/1 (hay mol) là khối lượng của các chất tính ra gam bằng khối lượng phân tử
của nó.
Sô" moi chất ta n trong 1 lít dung dịch gọi là nồng độ mol/1 của dung dịch, ký
hiêu là M.
19
Muôn pha dung dịch loại này là cân chính xác khôi lượng chất tan bằng khỏi
lượng mo] của chất đó, cho vào bình định mức và cho nưốc vào đến vạch ngấn lăc đều.
*Chú ý: Cho hoá chất qua phễu đặt trên bình định mức 1 lít, rửa cân th ậ n côc cân
hoá chất và phễu bằng tia nưổc nhỏ. Bình định mức phải được đặt trên bàn phang.
Những chất toa nhiệt hay thu nhiệt phải đê cho vể nhiệt độ bình thường (2 0 °C) rồi
mối thêm nước đến vạch ngấn.
a) P h a c h ấ t rắ n k h ò n g n g ậ m nước
Vi dụ 1: Pha K.,Ci\,0 7 có nồng độ IM.
Giải: Khôi lượng moi của K2 Cr 2 0 7= 294 (g)
Cách pha: Cân 294g K.,Cr.,07 pha trong bình định mức 1 lít.
b) P h a c h á t r ắ n n g â m nước
- Chát tan là chất lồng tinh khiết (100%)

Tiên hành cân và pha như chất rắ n không ngậm nước.
Ví dụ 2: Pha dung dịch Na^SÔ.Ị.õHÔ có nồng độ IM.
Giái: Khỏi lượng mol của Na.,S2 0.,.5H70 = 248 (g)
Cách p h a: Cân 248 gam Na^SÔọ.õHrÔ pha vào bình định mức 1 lít.
- Chất tan là chất có phần trăm thấp (chưa được 100%)
Cần phai chú ý nồng độ phần trăm
Ví dụ 3: Pha HC1 IM từ HC1 37%, d = 1,19
Giái:Khỏi lượng mol HC1 = 36,5 (g)
Tính khôi lượng theo công thức:
v M X100
x “ C l l ' 9)
Trong đó: X - khôi lượng chất tan cần cân

M - khôi lượng mol
c - nồng độ thực của dung dịch
Thay vào công thức (1.9) ta có:
v _ 36,5x100 ftQCC/^
X = ----- — ----- = 9 8 .6 5 (g )
Không thể cân HC1 được mà phải chuyển về thể tích đê’ đong theo công thức (1.3),
ta có:
1,19
Cách pha: Lấy 83ml HC1 37% pha thành 1 lít được dung địch HC1 IM
+ Nếu cần pha nồng độ M lốn hơn hay nhỏ hòn IM. Tính theo công thức sau:
M x io o (110)
c M
Trong đó: X - khôi lượng chà't tan cần pha
M - khôi lượng mol
c - nồng độ thực của dung dịch
C^Ị - nồng độ mol
Ví clụ 4: Pha HC1 2M từ HC1 37%, d = 1,19 ?

Giải: Thay vào công thức (1.10), ta có
X = 36,5 * 100 X 2 = 19 7 ,3(g)

37
V = ! Ì M = i65,8(ml)
1,19
Vi dụ 5: Pha H 2 SO.t 0,2M từ II 2 SO,, 96%,d=l,84 ?
Giai: Thav vào công thức (1.10) ta có:
X = -9 8.x-i .Q0 X0,2 = 20,42 (g H aSO. 96%)

96 ^ 4

20 42
Y = z z l Z z = IX, l(ml)
1,84
Cách pha: Lấy 11,1 ml H 2 S 0 4 96% pha th àn h lMt
Cùng có thể lấy khôi lượng hoặc thế tích chất ta n nhân với số lần lớn hơn hoặc nhỏ
hon.
Ví dụ 6: Pha HC1 0 J M
Giải: IM HC1 - cần 83ml HC1 37%
0,1M HC1 - cần X ml
8 3 x0 ,1 =8;3(ml)
Cách pha: Lấy 8,3ml HC1 37% pha thành 1 lít.
21
Cách pha: Láy 8,3ml HC1 37°ó pha thànii 1 lít.
3. N ồ n g độ đ ư ơ n g lư ợng (N - th ư ờ n g được s ử dụ ng)
Nồng độ đ ư ơ n g lượng là sô đưdng lượng gam của một chất có trong một lít dung
dịch hay sỏ mili đương lượng gam một chất có trong lml (lung dịch.
Đương lượng gam (E) CIU1 một chất là phần mol chất đó ứng với một điện tích hoạt
động. Điện tích hoạt động trong phản ứng trao đổi tính (heo sô electron đă thực hiện
tham gia kết hợp vổi ion khác, trong phản ứng oxi hoá khử thì tính theo sô electron dẫ
cho hoặc nhận.
Ví dụ: H 2 Sí) ị + 2NaOII = Na 2 SOtJ + 2H.,0
Hay 2H + 20H = 2H20
Đương lượng gam H >SO,ị = - khôi lượng mol
H jjSO , = = 4 9 .0 4 (g )
Trong phản ứng

GFeSO,, + K 2 Cr 2 0 7 + 7 H ,S 0 4 = 3Fe 2 (S 0 4);í + Cr^SOj);, + KvSO, + 7 H .fi
6 Fe2+ + Cr.,07" + 14 H+ = GFe:u + 2Cr:H + 7HaO

994 9
Đương lượng gam K.,Cr, , ( ) 7 = ------ =49,04 g
Nồng độ đương lượng thường dược dùng đế biểu thị nồng độ các dung (lịch chuấn
vi rất tiện lợi. Nêu dung dịch cùng một nồng độ đương lượng thì phíin ứng đúng theo
thè tích bằng nhau. Nêu hai dung dịch có nồng độ đương lượng khác nhau thì phản
ứng đúng theo những thế tích tỷ lệ nghịch với nong độ đường lượng cùa í húng. Khi hai
dung dịch phản ửng đúng vói nhau thì
V ì xNj = V2 xN 2 (1.11)
Trong đó:
V 1 là sô ml dung clịcli thứ nhất có nồng độ đương lượng N 1
V.; là số’ ml dung dịch thứ hai có nồng độ đương lượng Nv

Đây là biểu thức cơ ban đế tính toán trong quá trình cliuán độ
IV. PHA DUNG DỊCH TIỀU CHUAN đẻ CHUAN độ
1* Một s ố d u n g đ ịr h tiê u c h u ẩ n
Một sô" dung dịch tiêu chuẩn đê chuẩn độ trong phòng thí nghiệm như HọS0j
0 .1 N; KMnO ị 0,1N. Từ các dung dịch có nồng độ 0 ,lN pha ra các* dung địch 0.05N:
0.02N: 0 ,0 IN. Đẻ pha những dung dịch này trưóc hết pha gần đúng 0,1N (thường lấy
cao hôn một ít) rồi sau đó mối xác định lại nồng độ chính xác và điều chình chúng
bãng pha loãng.
Bảng 1.1- Pha dung dịch tièu chuẩn thường dùng (gần đúng)
Dung dịch tiêu chuẩn Lượng hoá chất đê pha thành

1 lít dung clịch
h 2s o 4 cun 2,8ml H 2 S 0 4 đặc ((1=1,84)

NaOH 0,1N 4,0 g
KMnO.ị 0,1 N 3,16 g
Trilon B 0,05N 9,305g (có thê pha chính xác)

Phan lốn những chất đà pha trên khống thế căn cứ khối lượng đã lấy pha đê tính
ra nồng độ chính xác vì chúng chứa tỉ lệ nưốc ngậm không ôn định hoặc trong thành
phần chúng có lẫn thành phần khác như NaOH có chứa Na«,CO K M n 0 1 có lẫn MnOjj.
Người ta thường dùng những chất có thành phần ồn định, có lượng nước trong
tinh thê ôn định hoặc dễ dàng sấy khô, không bị h út ẩm hay bị oxi hoá trong quá trình
pha chế, những chất này gọi là hoá chất gôc dùng để kiểm tra các dung dịch tiêu
chuẩn đă pha trên. Nồng độ hoá chất gốc được tính từ khôi lượng đỗ lấy pha, sau đó
tính nồng độ đương lượng và áp dụng công thức ( 1 . 1 1 ).
Cach kiểm tra: P ha 100ml hoá chất gốc có nồng độ chính xác 0,1N. Lấy 3 bình nón
cờ 250mỊ cho vào mỗi bình chính xác 20ml dung dịch 0,1N của hoá chất gốc và chất
chỉ thị. Dùng dung dịch tiêu chuẩn đă pha rót vào buret. Chuẩn độ cho đến điểm
tương đương (đồi m àu chất chỉ thị).
Bảng 1.2- C á c chả't gốc dùng đế kiểm tra nống độ các dung dịch tiéu chuẩn
Dung Sô gam đê
Bỉnh nón có 20m l
dịch pha 100ml Màu chuân
Chất gốc dung dịch gốc và chất
tiêu chất gốc độ
chi thị
chuẩn 0,1N
N atri tetrabonat 1,910 2 giọt chỉ thị metyl da Vàng sang
Na^B 4 0 7 . 1 0 H 2 O cam đỏ nhạt
H2 SO f1 TRIS 1,214 Như trên Như trên

tris [hiđroximetyl]
aminoetan C^HpNO^
NaOH Axit oxalic 0,630 3 giọt chỉ thị Xuất hiện

(X4N H 2 C 2 0 4 .2H20 phenolphtalein màu hồng
nhạt
23
KMnO.ị Axit oxalic 0,630 15ml H.,SO,ị đun nóng Xuất hiện
(U N H 2 C 2 0 4 .2H20 nhẹ (80 C) màu hồng
nh ạt
Na 2 SOfl Kali bicromat 0.490 15ml KI 10%, 3ml HC1 Mất màu
0 ,1 N K.;Ci\)Q 7 (sấy ò (lặc ((1=1,19), lõOml xanh
100°C) nuỏc cất, chuẩn độ đên
màu vàng nhạt thì
thêm 2 ml t i n h bột 0,5%
AgNO, Natri clorua khan 0,580 Cho vào bình nón 5ml Xuất hiện
0,05 N NaCl (sấy ỏ 120 °C) NaCl 0,1N thêm lml m àu n â u
K2 C r0 4 10%
Trilon B Magie clorua khan 0,476 5ml đệm a mon Đỏ sang

0.05N MgCL, (sấy ở 200°C) (pH =ll), 10 giọt chỉ x a n h nước
thị cromogen đen 1 % biển
(eriochrom black T)
2. P ha d u n g d ịch tiê u c h u ẩ n từ fiexan al
Ficxanal là lượng cân chính xác của hoá chất chứa trong các ống thuỷ tinh
(ampun).
Trước khi pha cần bóc nhãn và rửa ampun bằng nưỏc: nóng, sau đó rửa ampun
bằng nưổc cât và bỏ vào phễu thuỷ tinh (xem hình vẽ 1 .6 ). Đặt đầu cuổĩ của ampun
lên trên đỉnh chữ thập (đính này thường có sẵn trong mồi hộp ficxanal). sau đó đập
mạnh xu ông đỉnh chữ thập đê cho thủng đầu dưới, dùng đinh thuỷ tinh đục thủng lỗ
bên phía trên của ampun. Khi ampun đã thủng ở hai lồ quy định, dung dịch trong
ampun sẽ chảy vào bình định mức, dùng pipet hoặc bình phun rứa sạch ampun, dẫn
nước đến ngấn bình định mức 1 lít. Dùng nút nhám đậy kín, trộn đểu và cho vào lọ
chứa để dùng dần.
Ampun
Phễu
Lồ trên Vach
Ampun
Lỗ dưới
Bình định mức
Hình 1.6 - Cách pha dung dịch chuấn
24
*Chú ý :
- Các ficxanal kiểm ăn da có thể bảo quản không quá sáu tháng vì giữ lâu dễ bị
vẩn đục do có chất bẩn và tạo thành cacbonat tương ửng.
- Các ficxanal của muôi hay axit có thể bảo quản được lâu dài.
V. CÁCH TÍNH HỆ SỐ ĐlỂU CHỈNH
Trong quá trình pha hoá chất có nhiều yếu tô' làm sai nồng độ như:
* Cân đo không chính xác

- Các chát chưa tinh khiết hay hút nưổc v.v.
- Đê lâu bị thăng hoa hay oxi hoá v.v.
Do đó người ta phải kiểm tra nồng độ thực của dung dịch pha dựa vào các chất ôn
định hay có nồng độ chính xác như các dung địch tiêu chuẩn ficxanal. Tính sự sai sô
cùa dung (lịch để tìm nồng độ thực gọi là hệ sô điêu chỉnh, thường được ký hiệu là T.
Hệ sô' điểu chỉnh theo dung dịch tiêu chuẩn ficxanal.
Ví dụ 1:
- Dung dịch ficxanal của HvSO (1 0,1N (chính xác) và dung dịch NaOH tự pha có
nòng (lộ 0,IN.
Chuan dỏ: Lấy lOml tiêu chuẩn, chuẩn hết 12ml NaOH tự pha. Hệ sô" điểu
chính là:
rr .............. ..... Vh2S<M<>,1) _ 1 0
1 n : io h /h > s o 4 = - 1-------- “ T o =
VNaOH
Như vậy trong trường hợp này nồng độ của NaOH dung dịch tự pha sẽ chí là:
0,1N X0,83 = 0,083N
Vi dụ 2: Nếu dung dịch Ficxanal NaOH là tiêu chuẩn, thì tính ngược lại
V NaOH (0. 1N)

T H.,S<)4 -
V lỉ_,SO,
- Nêu trường hợp chỉ có một thứ tiêu chuẩn hoặc kiểm hoặc axit, chẳng hạn chí có
H.,SO.j 0 .IN thì chúng ta phải dùng NaOH tự pha đê làm dung dịch so sánh.
Ví dụ 3:10ml NaOH tự pha chuẩn hết 9ml H 2 S 0 4 tự pha, như vậy nồng độ của
H.,SO ị tự pha so vối kiểm tự pha là:
rr _ V NhOH _ 1 0 _ 1 11
MIjjSOj /NaOII = 77 — = — = 1,11
vHvS(), 9
25
Sau đó so H.,SO t tự pha voi ll.,vS()| 0, IN tiêu chuấn theo, công thưc sau:
T h j S C V I I . s u , <".lN> ” ^11 >SOj / NaOỈI * "Nỉ iOỊI /II . s o. (AlNi
Trong đó:
T ||.,so /ỈUSO (0 . 1 N): 1lộ số 11,80, tự p h a so vối H.,SOj tiêu chuẩn.
T|ị so /NaOH : 1lệ số’II.,SO 1 tự pha so với NaO II tự pha.
T n í i O I I / H oSO. ( Í I ] N ) : H ộ sỏ N a O H t ự p h a s o v ớ i I I , s o , t i ê u c h u ẩ n .
Thay sô ở 2 ví dụ tròn vào ta có:

Tịị so. /II so, {(UN) =0.83* 1,11 =0,9213
Vậy nồng độ thực của axit tụ pha là:

0,1N X 0,9213 = 0 ,0 9 2 13N
Ngược lại. nếu chỉ có NaOH tiêu chuấn thi ta làm và tính hoàn toàn ngược lại.
VI. BÀI TẬP
B à i tậ p 1: Cần bao nhiêu gam NH.ịNOo đê nhận được 60g dung dịch Nll.ịOH 40% ?
Đáp sỏ: 24g NH 4 NO;i, 36g (ml) nước.
B à i tậ p 2: Cần bao nhiều gam cađimi clorua (CcỉCl.,. 2.5H.,0) và bao nhiêu ml
nước để nhận được CclCl, 5% (w/w) ?
Đáp số: 6,23g C đ C Ị,. 2,51120 , 93.77ml II./).

B à i tậ p : Cần brio nhiêu nil II ,SOj 96% (<1 =1,84) và bao nhiêu ml nưỏc ctểnhận
được dung dịch Hi,SO ị 5% ?
Đá p số: 2,72ml H.jS O j 9G%, 91 ml II./).

B à i tậ p 4: Cần bao nhiêu nil HNO., 70% (cl = 1,42) và bao nhiêu ml nước đô nhận
được dung dịch HNO.J 20% ?
Đáp sò: 14,lml IĨNO 70*?« và f)0ml H.,0.

B à i tậ p 5: Cần bao nhiêu ml CH >COOH 95,5% (đ= 1,05) và bao nhiêu ml nưốc đê
nhận được dung dịch CHọCOOII 15% ?
gap.sol; 1.4,28ml CH.COOIl 95,5% và 80,5ml 11,0.

B à i ta p 6: Cẩn cho nước đến vạch bao nhiêu ml khi pha 40ml dung địch25%
(\v/w) đô nhận được (lung dịch ró nồng- cỉộ 3°ó ?
Dá]) sò: 333ml.
26
lià i tậ p 7: Có bao nhiêu ml dung dịch 20% (w/v) khi pha 50nil HC1 37% (d =1,19)?
Đ á p s ố: 1 1 0 m l .
B à i tậ p 8: Cần bao nhiêu ml H.,S0 4 96% (d = 1,84) bao nhiêu ml nước để nhận
dược dung dịch II.,s o 1 30%?
Đáp sỏ: 16.3ml H.,SOị 96%, 6 6 ml H.,0

B à i tậ p 9: Cần bao nhiêu ml cồn 96% (d = 0,81) và bao nhiêu ml nước để nhận
được dung dịch cồn 1 0 % ?
Đáp số: 8 6 ml H 2 0 , 12,34ml cồn 96%.
B à i tập 10: c ầ n bao nhiêu ml HNOa 70% (d = 1,42) dể n h ận được dung dịch
HNO >0,5M ?
Đáp sỏ: 31,7ml
B à i tập 11: Cần bao nhiêu ml H.,SOị 96%(d = 1,84) đế nhận được dung dịch
H.SO.J 2M ?
Đáp so: l l l m l
B à i tập 12: Hoà tan 20g chất trong 100ml nưốc. Tìm nồng độ phần trăm của
dung dịch.
Đáp số: 16,7%
B à i tậ p 13: Cần pha loãng 150g dung dịch NaOH 40% để có dung dịch 15%. Hỏi
phải thêm bao nhiêu nước ? Được bao nhiêu gam dung dịch 15% mới pha ?
Đáp số: 250ml, 400g
B à i tập 14: Pha 90g dung dịch H 2 S 0 4 42% vào 135ml nước. Hỏi nồng độ phần
tràm của dung clịch pha được ?
Đáp sỏ: 16,8%
B à i tậ p 15: Có thế thu được bao nhiêu dung dịch KOH 22% từ 1 lít dung dịch
KOH 47,8% có tỷ khôi 1,485 . c ầ n them bao nhiêu nước vào dung dịch ?
Đáp số: 1745ml
B à i tậ p 16: Tìm nồng độ dung dịch KOH khi trộn 80g dung dịch 25% vối 60g
dung dịch 42%.
Đáp số: 32,3%

B à i tậ p 17: Cần thêm bao nhiêu nước vào 1 lít dung dịch amoniac có tỷ khôi
0.910 đẻ được dung dịch 5% ?
Đáp sỏ: 3460ml
27
B à i tậ p 18: Cần chuẩn bị 80ml dung dịch kiềm 40% từ dung dịch 50% và 20%.
Hỏi mỗi dung dịch cần bao nhiêu ?
Đáp sỏT: 26,7ml clung dịch 20% và 53,3ml dung dịch 50%
B à i tậ p 19: Cần thêm bao nhiêu nước vào 2 lít dung dịch NaOH 40%, tỷ khôi 1,43
đê có dung dịch kiềm 1 0 % ?
Đáp số: 8,58 lít
B à i tậ p 20: Hoà ta n l,966g NaCl vào trong bình định mức dưng tích 200ml và
dẫn nưốc tỏi vạch. Tìm nồng độ M của clung dịch ?
Đáp số :(U682M
B à i tậ p 21: Tìm nồng độ M của dưng dịch N a 2 CO:ì 15,20%, d = 1,46 ?
(MW = 105,99)
Đ áp SCK 1,663M
B à i tậ p 22: Phải chuẩn bị 1 lít dung dịch KOH 0,2N th ế nào từ dung dịch 27,3%,
d = 1,260?
Đáp so>: 32,6ml KOH 27,3% thêm nưóc vào đến 1 lít.
B à i tậ p 23: Phải chuẩn bị 4 lít dung dịch HNO.J 0,1N thê nào từ dung dịch HNO'J
42,9%, d = 1,265 ?
Đáp số: 46,4ml HNO.Ị 42,9% pha thêm nưốc đến 4 lít.
28
Chương 2
PHƯƠNG PHÁP LẤY MẨU PHÂN TÍCH
I. LẤY MẪU
1. Lây m au h ạ t
Khi lấy mẫu hạt chí cần lấy 1/5 hay 1/10
hạt thu hoạch, nhưng không ít hơn 25g. Hạt
thu hoạch được trải trên giày thành hình
vuông (lấy 1/2 hay 1/3 số’ hạt của một cây),
vạch hai đường chữ thập chia hình vuông
thành 4 phần đểu nhau, vạch thêm các đường
chéo chia thành các phán nhỏ hơn bằng nhau,
lấy một sỏ h ạt ờ các hình tam giác đối nhau
(xem hình 2 . 1 ), nhưng lượng hạt lấy phải tuỳ
thuộc loại hạt, hạt bé phải lấy hơn 25g, hạt lớn
Hình 2 .1 - C á c h chia õ lấy mẫu hạt ph âi lâ'y từ 500-1000g.
Mẩu được nghiên hoặc xay thành bột, rây qua rây có kích thước lỗ 0,15 - 0,50 mm.
Bột giử trong lọ kín, có thê cho thêm chất chông mốc mà không ảnh hưởng đên thành
phần hoá học của chất định phân tích. Đôi với h ạ t có dầu phải giã từng ít một, nên bảo
quán nguyên hạt. Nêu làhạt lớn cóvỏ cứng ngoài thì phai bóc vỏ trước khi nghiền
nhỏ. Nêu muôn tính sò liệuphán tích toàn bộ hạt, phải xác định % vỏ bằng cách cản
khôi lượng 50 hay 100 hạt. tách vỏ và tính % khôi lượng vỏ hoặc tính % khôi lượng
nhân hạt đả tách vỏ và so sánh vói khôi lương hạt nguvên. Lúc bóc vỏ can chú ý không
làm hỏng các phần nhan bên trong như m ắt của các loại hạt đậu v.v... Đố dễ dàng tách
vỏ, có thê nghiền nhẹ trong cối cho nứt vỏ và sau đó bóc hoặc có thể ngâm cho trương
nước rồi mỏi tách vỏ, ví dụ ngâm hạt bông 4 - 6 giờ và dùng dao tách vỏ.
H ạt nguyên hoặc h ạt đă tách vỏ trước khi nghiển có thê sấy ở 70 - 80°c trong 15 -
18 giò hoặc sấy ỏ 80 ■85"c từ 4 - 5 giờ cho đến trạng thái khô không khí. Sau đó, nếu
xác định tro hay dầu lại đem sấy tiếp tục ở 1 0 0 - 1 2 0 °c trong một giờ.
2. Lây m an rau
Tuỳ từng loại rau mà phải chú ý đến đặc điểm của nó lúc lấy mẩu.
29
- Các loai ra u ăn quả như cà chua, ốt, dưa chuột, bầu, bí v.v... cần chú ý đến sô
lượng quả, vị trí quả trê n cây, độ chín của quả V . V . . . . Những cây ra quả nhiều lứa, cần
phân tích ít n h ấ t là 10 cây và từ 3 - 5 quả mỗi cây.
- Các loại củ như khoai lang, khoai tây v.v..., sau khi lấy 10 cây, ph ân các cú
th à n h 3 loại to, vừa, nhỏ và lấy 20 - «30 củ ở cả 3 loại.
- Những loại ra u ăn lá phải chú ý đến giai đoạn sinh trưởng và phân tích ít nhất 2
lứa.
Khối lượng của mỗi mẫu lấy để p h ân tích tùy từng loại. Rau ă n lá là lkg. Cà chua,
bắp cải, dưa chuột, v.v... là 2,5kg. Những loại quả lổn như bầu, bí, dưa bở v.v... là 5kg.
Quả, củ cần bổ dọc và lấy ở quả, củ một phần, lượng mẫu không ít hơn lkg.
Các loại ra u nên lấy vào sáng sóm để kịp p hân tích trong ngày. Nếu lấy vào buôi
chiều (17-18 giờ) p h ải giữ lạnh để hôm sau phân tích. Nếu phân tích nhiều lần trên
một đỗi tượng thì phải thông n h ấ t thời gian lấy.
Quả và quả mọng như táo, lê, mận, cam, chanh v.v... phải lày trung bình của 10
cây mọc ỏ các vùng khác n hau trong vườn rộng, trong sô đó có ít n h ấ t là õ cây mọc ở
các vùng đại diện cho vườn. Chọn các quả ở các tầng khác nh au trên cây, mỗi cây lấy
từ õ - 6 quả, tổng khôi lượng quả ở 10 cây từ 1,5 - 2 kg hoặc lkg đôi vối nho. Quả hỏng
không được dùng để p h ân tích.
M ẫu p h ả i ghi đầy đủ:
- Tên mẫu
- Ngày, th án g thu hoạch
- Sô" quả hay khối lượng (sô' dãy, cây), số lặp lại
3. L â y m ẫ u h ỗ n h ợ p d ại d i ệ n c â y t r ổ n g
Việc lấy m ẫu hỗn hợp đại diện là công việc đầu tiên của quá trình p hân tích cây
trồng, nó quyết định kết quả phân tích sau này. Muôn cho m ẫu đại diện điển hình cho
toàn khối vối mức độ cao có thể thực hiện theo các kiểu sau:
- Lấy n h iều điểm
Trên một diện tích cây trồng phải lấy nhiều m ẫu ở n hiều điểm khác nhau, thường
lấy từ 5-9 điểm rồi trộn đều lại và lấy ra một lượng cần thiết, các điểm này phân bô"
đều trên toàn diện tích lấy mẫu (hình 2 .2 ).
- Loại tr ừ cá biệt không điên hình.
Khi lây mẫu ở các điểm cẩn trá n h những mẫu cá biệt không điển hình như các
mẫu cây bị bệnh, bị sâu hoặc quá tốt. T ránh lấy m ẫu khi vừa mới phun thuốc trừ sâu
hay phun hoá chất kích thích. Nếu toàn diện tích kém đổng nhất, thì phải phân chia
nhỏ ra. Ví dụ toàn diện tích lấy m ảu có chỗ cao, chỗ trùng , cây trổng khác nhau, trong
trường hợp này phải p h ân nhỏ ra nhiều ô, mỗi ô lấy một m ẫu đại diện đế về phân tích.
Mì
1 2 3
• • •
6 5 4
• • •
Hình 2.2 - Các điểm lấy mẫu phân tích
- Trộn mẫu
Các m ẫu lấy p h ân tích phải được trộn đểu, càng đều sô" lượng càng chính xác. Các
mẫu cây thường lấy từ 0,2 -0,5 kg. Cho mầu vào túi nilông và ghi phiếu đầy đủ. Nhãn
được ghi bằng b út chì đen loại mềm đê tr á n h nhoẻ. Mâu mang về cần được xử lý và
phân tích ngay.
II. C H U Ẩ N bị m ẩ u p h â n t íc h
T ấ t cả ra u quả trước khi ph ân tích phải rử a sạch đất, gọt sạch vỏ. Cà chua, dưa
chuột, ớt, khoai tây, cà rốt, táo, lê, nho, mơ, mận ... nghiền toàn bộ quả. Bắp cải trưốc
khi nghiền phải bỏ các lá bẩn, lá xanh ở ngoài. H ành củ loại bỏ lớp vỏ ngoài. Cam,
quýt, bưởi bóc lớp vỏ ngoài và cùi trắn g bên trong. H ạt quả một số trường hợp lấy
phân tích cùng t h ị • quả (ót, cà chua, dưa chuột...), một sô" quả cần bỏ h ạ t (nho, cam,
chanh, lê, mận) kể cả phần bao h ạ t vì phần này giầư hemixenlulozd và pectin.
Các quả đã lấy theo cách như trên đem bô dọc, mỗi quả lấy một lát, nghiền nhỏ
(quả to có th ê d ù n g dao th á i nhỏ trước k hi nghiền), quả n h iều nước có th ể ép nước để
riêng, bã nghiền sau. Có th ể dùng cối xay thịt, cối xay hạt, cối sứ, máy xay sinh tô"... để
nghiền. Mâu được nghiền th à n h dịch th ể đồng thể.
III. CỐ Đ ỊN H MẨU
Sau khi lấy mẫu, chưa ph ân tích ngay cần phải cô" định mẫu để giữ nguyên các
thành ph ần của mẫu.
1. S ấ y k h ô đ ế n t r ạ n g th á i k h ô k h ô n g k h í
Phương pháp này dùng nhiệt độ cao để diệt enzim và vi khuẩn, sau đó dùng nhiệt
để loại phần lốn nưổc đến khi nguyên liệu khô giòn.
Đầu tiên cho nguyên liệu vào tủ sấy> sấy ỏ 110 - 120°c, nhiệt độ trong nguyên
liệu sẽ đạt 100 - 105° trong khoảng 30 phút, enzim và vi k h u ẩ n bị diệt. Sau đó tiếp
tục sấy ỏ 60 - 70°c cho đến khi khô giòn. Thòi gian sấy khác nhau tuỳ từng loại
nguyên liệu, nhưng không kéo dài quá 8 - 10 giờ. Đê sấy khô nhanh chóng cần thái
nhỏ nguyên liệu, tủ sấy phải thông khí (có quạt gió và lồ thỏng khí). Trong quá trình
sây không được đê nhiệt độ cao quá có thể làm cháy, làm hiên đối thành phần hoá học
(đặc biệt với nguyên liệu nhiêu đường sè bị caram en hoá có mùi khét). Trong thời gian
đầu nếu sấy khô chậm, các enzim sẽ hoạt động mạnh làm biến đôi thành phần trong
nguyên liệu. Vì vậy nâng nhiệt độ sấy cao lúc ban đầu rất quan trọng.
Nguyên liệu đã được sấy khô, cho vào bình đậy chặt bằng nút cao su hay n ú t bấc
có parafin gắn phía ngoài nắp, giữ ơ nơi khô và lạnh.
2. C ỏ đ ị n h b ằ n g h ơ i n ư ớ c
Dùng hới nước đê làm ngừng hoạt động enzim. Có thê dùng nồi xông hơi, nồi cách
thuý hoặc xoong binh thường. Đun một ít nước sỏi. lúc đun đậy nắp, sau khi nưốc đã
sỏi, trải nguyên liệu thành lốp mỏng gói trong vải màn hoặc đặt trong chén sứ và đặt
trên vi trong xoong, không để mẫu tiếp xúc với nưốc, đậy nấp tiếp tục đun 1 5 - 2 0 phút
hoặc lâu hon tuỳ theo nguyên liệu. Lây mẫu ra và sấy trong tủ sấy thong khí ở 30 -
50“c hoặc tủ sấy bình thường ỏ 60 - 70°c đến khô.
Phương pháp này có thể dùng để cô định các nguyên liệu như lá, thân, rễ, hạt...
chứa ít axit và hàm lượng (ỉưòng đã được xác định trong nguyên liệu tươi (cà rốt, bắp
cải...)- Còn các quả, quả mọng (cà chua) và các loại rau quả có chứa nhiểu nước, đường,
axit hữu cơ không thế dùng phương pháp này được vì có thê bị mất dịch, đường bị thuỷ
phân cùng như làm biên đối tỷ lệ giữa các dạng hiđratcacbon khi sấy tiêp tục. Vì vậy
các loại mẫu này nên dùng phương pháp cố định bằng cồn.
Nguyên liệu sau khi sấy khô cho vào lọ sạch, đậy nút chật. Phướng pháp này có
thê dùng khi đi khảo sát ngoài thiên nhiên để giữ mẫu về phản tích ở phòng
thí nghiệm.
3. Cố d ịn h b ằ n g cồn
Thường khi phân tích đường, axit a mill, lấy 1 lượng mẫu thái nhỏ cho vào bình có
lắp ông làm lạnh, cho cồn 96° đã đun sôi vào bình làm ngập toàn bộ mẫu, phải tính
toán trước đê nồng độ cồn còn từ 78 - 82°, tiếp tục đun sôi 30 phút trên nồi cách thuỷ.
Sau đó để nguội (vẫn giữ nguyên ỏng làm lạnh), thay ông làm lạnh bằng nút đậy kín.
Cô định mẫu bằng phương pháp này có thế giữ được thành phần hoá học trong mẫu
không bị biến đổi trong thời gian đến 1 năm.
Phương pháp này thường dùng đê cô" định các mẫu lá, quả, rễ, cú. hạt ... Một sô
đối tượng khác như mẫu có chất chát cần sấy khô trong bóng tối và ỏ nhiệt độ không
cao lam, vì ánh sáng mặt trời làm giảm hàm lượng chất chát, nhiệt độ cao làm tăng
quá trình oxi hoá và tạo thành các chất không tan. Ngoài ra, tấ t cả các chất chát đểu
tan trong nước lạnh và bị thuỷ phân dưối tác dụng của các enzim có trong nấm mốc.
Vì vậy các mau phân tích chất chát phải giữ khô, tránh ẩm, mốc như:
• Đật mảu (lá, rễ) vào chỗ tối.
32
sấy khô khống quá 60°c.
Sấy khỏ mẫu đến trạng thái khô giòn.
T ránh mưa, sương, đất ẩm.
Phòng tránh mốc.
Chương 3
PHƯƠNG PHÁP SO MÀU
(C olorim etry)
I . PHƯƠNG PH Á P SO MÀU
Một trong những kỹ th u ật phân tích hữu hiệu nhất trong sinh học là phương pháp
phân tích so màu (colorimetry). Trong phương pháp này, nồng độ của hợp chất màu
được xác định bằng cách đo cường độ màu của dưng clịch chứa hợp chất màu đó.
Phương pháp so màu chỉ là một phần của phương pháp quang phỏ hấp thụ.
Phương pháp quang phô hấp thụ củng chỉ là một phần của phương pháp quang học.
Trong hoá sinh, các phương pháp đo quang phô thường được cìo trong dải bước sóng từ
2 2 0 đến 800nm. Dải quang phố này lại được chia thành vùng tứ ngoại (dưối 380nm),
vùng khá kiên (trên 380nm) và vùng hồng ngoại (trên 800nm). Vùng hồng ngoại có rất
ít ứng dụng trong thí nghiệm hoá sinh. Còn vùng kha kiên (ánh sáng thây) lại dùng
trong phương pháp phân tích so màu.
Đề biết màu được đo như th ế nào, trước hết phải hiểu được m àu ]à gì? Khi dòng
ánh sáng trắng xuyên qua một dưng dịch màu, các bước sóng n h ất định (tuỳ thuộc vào
bản chất của dung dịch) sẽ bị hấp thụ, trong khi những bước sóng khác thì gần như
không bị ánh hương. Màu của dung dịch sẽ là màu của những bưóc sóng không hấp
thụ. Những điểu đó được tống kêt một cách đơn giản trong bíing 3.1.
Báng 3.1 - Tính chất màu dung dịch trong vùng ánh sáng trắng
Ánh sáng trắng Ánh sáng hấp thụ Ánh sáng không hấp Màu của dung
tỏi thụ dịch
Vàng và xanh da trời Đỏ Đỏ
Đỏ, Xanh da trời Đỏ và vàng Da cam
vàng Xanh da trời và đỏ Vàng Vàng
và xanh da trời Đỏ Vàng và xanh da trời Xanh lá cây
Đỏ và vàng Xanh da trời Xanh da tròi
Vàng Xanh da trời và đỏ Tím

Cường độ màu của dung dịch có thê được xác định bẳng cách đo cường độ ánh
sáng hấp thụ bởi hợp chạt màu có trong dung dịch. Vì dùng ánh sáng tran g đo cưòng
độ màu. nên ánh sáng hấp thụ cách càng xa càng tốt những bưóc sóng mà không bị
34
hấp thụ bới dung dịch màu. Ví dụ: đế đo độ hấp thụ ánh sáng của một dung dịch màu
đỏ thì dùng ánh sáng vàng - xanh da trời (chính là ánh sáng xanh lá cây) là thích hợp
nhất. Tốt n h ất là dùng ánh sáng của một bước sóng riêng (ánh sáng (lờn sảc). Anh
sáng đơn sắc này có thê được tạo ra từ giấy lọc, lăng kính hoặc là cách tử nhiều xạ
trong máy so màu và máy quang phô.
II. ĐỊNH LUẬT LAMBERT- BEER
Nêu á n h sáng đơn sắc xuyên qua một dung dịch màu thì cường cỉộ ánh sáng hấp
thụ sẽ phụ thuộc vào:
- Độ dài đường ánh sáng qua dung địch
- Nồng độ của chất tan hấp th ụ ánh sáng.
Môi liên hệ nàv được biểu hiện bằng định luật Lambert- Beer trong phương trình
sau:
lg ụ = Kci (3.1)
Trong đó: I0 - cường độ của tia tới
Ie - cường độ của tia đi ra

K- hệ sô" tắ t hoặc chỉ sô hấp thụ phán tử (cũng có thể được dùng 6
thay K)
c - nông độ dung dịch
1 - chiểu dài của ánh sáng qua dung dịch (thường là lcm)
độ hấp thụ (A- absorbancy). Trong thực hành, giá trị này không phải tính mà thu được
trực tiếp từ mấy đo.
OD
3*
é
CL
Hình 3.1 -Đ ô thị mẫu
35
Từ phương trình (3.1) dễ dàng thấy rằng khi 1 (độ dài) được giữ không đổi thì mật
độ quang sẽ tỷ lệ thuận trực tiêp với nồng độ của chất màu. Vì vây, đường chuẩn (sè là
một đưòng thẳng) có thể được vẽ từ một dãy các (lung clịch chuẩn vối những nồng độ
khác nhau (hình 3.1).
Nồng độ của một dung dịch nghiên cứu sẽ được xác định dựa trẽn đường chuấn
này. Tuy nhiên, không phai lúc nào củng cần phải vẽ một đường chuẩn. Vì có thế tính
được nhò sự liên quan giữa dung dịch nghiên cứu (u) và dung dịch chuẩn (S):
An - Kcl
A u _ cu
A s cs
và As = Kcsl
Bởi vì Aj,, cs là đã biết hoặc có thê đo được nên cu có thê được tính từ phương
trình trên.
Khi tăng chiều dài (1) cũng như tăng nồng độ thì mật độ quang (OD) sẽ tăng tỷ lệ
th u ận vối chúng chứ không phải độ hấp thụ ánh sáng.
Ví dụ: nêu dung dịch có nồng độ C ì hấp thụ 50% ánh sáng thì dung dịch có nồng
độ c 2= 2Cj phải chăng sẽ hấp thụ 100% ánh sáng?
Mật độ quang của dung dịch thứ nhất là:
O D , = lg — = lg = 0 ,3
' I, 100
Mật độ quang của dung dịch thử hai là:
OD^ = lg — = 2 0 D ị = 0 , 6
1*2
Từ đó ta có thê tính:
lg U = lg I0 - OD^ = 2,0 - 0,6 = 1,4
I2 =25
Nghĩa là độ hấp thụ ánh sáng của clung dịch thứ 2 là 75%.
Trong Iihiểu trường hợp độ hấp thụ và nồng độ không tỷ lệ thuận.
Do đó, cần phải xác định giới hạn nồng độ, chỉ áp dụng định luật Lambert-Beer ó’
phần nồng độ táng tuyên tính. Khi quan hệ giữa hai yếu tố này không phải là cỉưòng
thang tuyên tính thì không dùng được công thức (3.1). Trong trường họp này. phải xây
dựng một đường chuẩn và giá trị dung dịch nghiên cửu dược xác định trực tiếp từ
36
(lường chuẩn. Đê so màu, người ta chọn điếu kiện sao cho mật độ quang (OD) nằm
trong khoảng 0 , 1 - 1 : tốt nhất là 0 .2 -0 ,5.
III. M À U D U N G DỊCH VÀ CH Ọ N BƯỚC S Ó N G ÁNH S Á N G (HAY CH Ọ N KÍNH

LỌC M À U )
Màu của dung dịch là do sự hấp thụ không đồng đểu các vùng khả kiên. Khi cho
ánh sáng trắ n g đi qua dung dịch màu. không phải tất cả các tia cua phố đều bị hâp
thụ vối mức độ giông nhau, có phần tia bị hấp thụ mạnh, có phan tia hình như không
bị hấp thụ. Mỗi (lung dịch màu của các hợp chất khác nhau có đường cong hấp thụ
khấc nhau hay có phổ hấp thụ khác nhau. Đê có đường cong hấp thụ, người ta tiên
hành đo m ật độ quang của dung dịch màu đó ở các bưỏc sóng khác nhau. Trên trục
hoành của đồ thị là độ dài của bưỏc sóng ánh sáng từ 400nm (tím) đẻn 700nm (đỏ).
Trên trục tung ctồ thị ghi giá trị mật độ quang (OD). Điếm cực đại của cìường cong là
dạc tính quan trọng của hợp chat màu. Khi nói hệ sô" hấp thụ phân tử của một chất
màu nào đó có nghĩa là trị sô" đó đủ được đo ổ vùng phổ mà ánh sáng bị hấp thụ cực đại
(hình 3.2).
Tím Xanh Lục Vàng Cam Da cam Đỏ

Hinh 3.2 - Đường cong hấp thụ của dung dịch axeton coban sunfoxianua(1)
và của sắt sunfoxianua (2)
Nhửng dung dịch có mầu trong các thí nghiệm sinh học ít khi chứa những màu
đơn giản và cơ bản. Do đó, việc lựa chọn bước sóng đúng đê dùng sẽ không phải là một
vấn clề dễ dàng mà phải được xác định bằng thực nghiệm. Những ký hiệu của màu
như đỏ, xanh, vàng... thiếu chính xác so vổi bước sóng của ánh sáng (X) thường được
dùng. Mối liên quan giữa bưỏc sóng và màu được giới thiệu ỏ hình 3.3.
37
1. T hí n g h iê m 1 - Liên hệ giữa các màu và các bướic sóng.
Đặt một mẩu giấy trắng nhỏ trên đường tia sánjg truyền qua trong một máy
quang phể (theo hướng dẫn) và ghi lại màu của tia sán g tại những bước sóng khác
nhau.
350 430 470 500 650 850
*Chú ý: Đơn vị của bước sóng (X) lànm .

Hãy cho biết
lnm = .........m
lnm = ........Â (đòn vị này không được dùng cho X).
2- T hí n g h iê m 2 - Đồ thị độ hấp thụ của chất màu thực phẩm.
. 1 Quan sát màu sắc của 3 chất màu thực phẩm được đưa ra và dự đoán các
đỉnh hấp thụ sẽ là bao nhiêu dựa trên bảng màu - bưóc sóng ỏ* trên.
Chất màu thực Màu của chất Dự đoán đỉnh trong Dự đoán đỉnh tại vị
phẩm màu thực phẩm phạm vi màu trí bước sóng (nm)
A
B
c '
2. Đồ thị hấp th ụ của 3 chất màu này sẽ được ghi lại bằng máy quang phổ
tự kí.
3. Đỉnh hấp thụ của mỗi chất màu là bao nhiêu ?
38
Sử dụng máy so m àu hoặc máy quang phố để phân tích những dung dịch này theo
phướng pháp so m àu thì đọc ỏ bưóc sóng nào là tốt nhất ?
Chất màu M àu của chất Đỉnh (nm) quan Vùng màu của Bưốc sóng tốt
thực phẩm m àu thực phẩm sát được đỉnh quan sát n h ất cho phân
được tích (nm)
A
B
c
4. Đ ỉnh hấp th ụ của dung dịch xanh lá cây là bao nhiêunm ?

5. Cho một dung dịch xanh lá cây đã pha loăng 50%, độ hấp th ụ dự tính là bao
nhiêu?
. Trộn 5ml ch ất màu xanh lá cây vối 5ml nước không ion hoá (nước cất). Sau
6
đó xác định độ hấp thụ của cả chất màu ban đầu và chất màu đă bị pha loãng bằng
máy quang phố ở đỉnh bước sóng.
7. Có dung dịch xanh lá cây vối nồng độ lổn gấp 5 lần. Hăy dự đoán độ hấp thụ
của dung dịch này là bao nhiêu ?
8 . Đọc độ hấp th ụ bằng máy quang phổ.
9. Độ hấp th ụ của dung dịch này có lơn gấp 5 lần độ hấp thụ của dung dịch ban
đầu không ? Giải thích tại sao ?
3.T h í n g h iệ m 3 - Minh hoạ định lu ật Lam bert - Beer
1. Sắp xếp các ông nghiệm theo bảng sau. Thành phần của các ổng nghiệm
được trộn cẩn thận.
ô n g n gh iệm số 1 2 3 4 5 6
10|ig/m ỉ ch ất m àu xan h lá cây (ml) 0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0
H 20 (ml) 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0
2. T rên máy quang phổ, đặt bưốe sóng tạ i đỉnh hấp thụ của dung dịch màu
xanh lá cây mà đã xác định ở thí nghiệm 2. Dùng ống sô" 1 để điều chinh th iết bị về vị
trí sô' 0. Sau đó ghi lại độ hấp thụ của mỗi dung dịch.
3. Sinh viên được cung cấp một chất m àu không biết nồng độ. Ghi lại độ hấp
thụ của dung dịch nghiên cứu này.
4. Báo cáo th í nghiệm:
- Vẽ đồ thị độ hấp th ụ A* và nồng độ của chất màu (Âg/ml trong mỗi ống nghiệm).
- Đồ thị có tu â n theo định lu ậ t Lambert- Beer không ?
39
- Nồng độ cùa chát màu nghiên cứu là bao nhiêu ? í Đưa vể đoìi vi ng/ml.
4. T hí n g h iệ m 4 —Định lượng hiđratcacbon bằng ị phương pháp so màu
a) Định lương glucozơ hằng phươ ng p háp so rmàu Somogyi - Nelson
- Nguyên tắc
Vì phần lốn các hợp chất sinh học là khóng màu inẻn phương pháp phản tích so
màu thường đòi hỏi phải có một phản ứng đầu dế tạo rra một sán phẩm có màu. Phán
ứng này được tiên hành dưỏi những điêu kiện sao cho !lượng màu tạo thành phải tỉ lộ
thuận vối nồng độ của hợp chất được phân tích.
Ví dụ: phân tích glucozd bằng phương pháp Somoggyi • Nelson. Trong th í nghiệm
này, muôi đồng bị khử trong dung dịch kiêm. Khi thêmi dung dịch arseno-molypđat,
đồng oxit hình thành ỏ giai đoạn đẩu cua quá trinh khư sẽ phan ứng vối arseno-
moiypđat, tạo th àn h một dung dịch màu xanh (két hỢ]p giữa xanh da tròi và xanh lá
cây). Màu của (lung dịch tỷ lệ th u ận vối nồng độ của chường khứ (dường khứ là bất cử
phân tử đường nào có chứa một nhóm anđehit hay xetoỉtt).
Thí nghiệm này cho các loại (tường khác nhau.
- T hí nghiệm
1 . Chuẩn bị 8 ỏng nghiệm cỡ 25ml có chia vạch, sắp' xêp các ông nghiệm theo bảng
sau:
Các ống nghiệm 1 9 3 4 5 6 7 8
Glucozd 100 Jig/ml - 0,25 0,50 0,75» 1.0 • - -

Fructozd 100 Ịig/ml • * - - - 1.0 * *
Xylozơ 100 |.ig/ml - - * - - • 1,0 -
Hồn hợp glucozơ - fruct.ozơ - - - - - - - 1,0
H ,0 1,0 0,75 0,50 0,25 - - - •
. 2 Cho 1 ml thuốc thử Somogvi vào tấ t cả các ông nghiệm và đun nóng trong nồi
cách thuy đang sôi khoảng 2 0 phút..
3. Làm nguội bằng nước lạnh và thêm lm l thuốc th ử arseno - molvpđat rồi trộn
đều. Hoà loăng đến 25mỉ. Trộn đều bằng cách lộn ngược ông nghiệm (dùng parafin bọc
miệng Ông nghiệm lại).
4. Đo cường độ tạo thành bang máy quang phô ỏ 500nm . dùng ống nghiệm sô 1
làm đôi chứng. Ông nghiệm này là ông thuốc thứ trắng và dùng cỉể hiệu chỉnh màu
của thuốc thử.
- Báo cáo th í nghiệm:
1. Vẽ một cìồ thị chuẩn cho glucozơ từ giá trị thu đưọc của các ông nghiệm sô 1 đến
sô 5. Đổ thị này có tuân theo định luật Lambert - Beer không ?
2. So sánh giá trị thu được của ống sô 5, 6 , 7. Chúng có giông nhau không ?
Giai thích.
3. Tinh lượng đường khứ trong dung dịch, chuyến thành đơn vị mg/ml.
b) Đ ịnh lương glucozơ bằng phương p h á p dùn g enzim glucooxidaza
Nguyên tắc
Các kỳ th u ậ t hoá học dùng trong quá trình phân tích gluxit. thiêu tính đặc trưng.
Khi tiên hành thi nghiệm bằng phương pháp dùng enzim glucooxidaza sè cho kêt quả
tốt hơn nhiều. Enzim này oxi hoá glucozơ tạo th àn h axit gluconic và H 2 0 2- Thuốc thử
có peroxidaza. sẽ khử peroxit (H./).,) thànli nước với sự có m ặt của chất cho hiđro
thích hựp. C hất cho hiđro (o-toluiđin) sẽ bị oxi hoá đê tạo ra màu,
-Thi nghiệm:
1 . C huẩn bị những ông nghiệm như sau
..... ......
Các ông nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8
Glucozd 100 [Ấg/ml - 0,25 0,50 0,75 1,0 - _ -

Fructozd 100 (.Ig/ml - - - - - 1,0 - -
Xylozo* 100 ịig/ml - - - - - 1,0 -
Hỗn hợp - - - - - - - 1,0
glucozờ * fructozo’
11,0 1.0 0,75 0,50 0,25 - - - ■
2. Trộn đểu. cho thêm õml thuốc thử glucozơ vào mồi ỏng ỏ những khoảng thời
gian nhất định. Trộn đểu và để ỏ nhiệt độ phòng trong 20 phút.
3. Tiếp tục cho thêm 0,5ml HC1 IM vàó, trộn đểu và đọc ở bước sóng 680nm .
Báo cáo th í nghiệm:
1. Vê đồ thị chuẩn từ giá trị đo được của ống sô 1 đến ông số 5. Kết quả có tuân
theo định luật L am bert - Beer không ? Nếu tín h nồng độ bằng công thức này thì đến
nồng độ g]ucozơ nào mà định lu ậ t L am b ert« Beer văn được dùng.
2. Nồng độ của glucozd trong hỗn hợp là bao nhiêu ?
3. Kẻ bảng ghi nồng độ của glucozơ và fructozơ trong dung dịch. Thể hiện bằng
đơn vị Ịig/ml và mM.
4. Xylozơ được đưa vào p h ần a và b để làm gì và nó đã chứng minh được điêu gì ?
T rá lời một cách định lượng.
c) H oá c h ấ t
- Dung dịch glucozơ 100|Ag/ml
41
- Dung dịch fructozd 100fig/m]
• Dung dịch xylozơ 100|ig/ml
- Dung dịch HC1 1M
- Thuôc thử arseno-molypđat:
Cân 25g amoni molypdat [(NH t):,MoO j] hoà ta n trong 450ml nước cất, cho thêm
31ml H 2 S 0 4 đặc, trộn đểu, cho thêm 3g natri arsen at (Na 2 H A s0ít.7H.,0). Trộn lẫn hai
dung dịch, ủ ở nhiệt độ 37°c từ 24 - 48 giờ hoặc đun nóng đến 55°c và giữ ở nhiệt độ
này 25 phút. C ất dung dịch trong lọ màu. Dung dịch có màu vàng và bển.
- Thuốc thử Somogyi:
+ Thuôc thứ đồng I: Cân 200g Na 2 S 0 4 khan hoặc 356g N a2SO J.10H.,0 hoà vào
600ml nước cất nóng. Cho thêm 25g muôi Seignette (kali - natri - tactrat)
(KNaC<lH 4 0 G.4H 2 0), Cho vào bình định mức 1 lít. Lọc nếu dung dịch vẩn đục. Tốt
nhất bảo quản ở nhiệt độ 37°c. Trong trường hợp xuất hiện tinh thể thì được hoà
ta n lại bằng cách đun nóng nhẹ trên bình cách thuỷ.
+ Thuốc thử đồng II: Dung dịch CuSOị. 5H20 15%, cho thêm 1-2 giọt HvSO.ị đặc
Thuốc thử Somagyi là dung dịch hỗn hợp thuốc thử đồng I và đồng II theo tỷ lệ 25:1.
42
Chương 4
PHƯƠNG PH Á P QUANG P H ổ KỂ
(S p ectrop h otom etry)
Nhiều phép phán tích trong hoá sinh học được thực hiện bằng phương pháp so
màu (trong vùng ánh sáng nhìn thấy) như đã giói thiệu trong th í nghiệm sô 1 . Tuy
nhiên, phép đo quang phố kê lại có phạm vi phân tích lổn hon, các tran g thiêt bị cùng
phức tạp hớn.
Vùng quang phổ dưối 380nm là vùng tử ngoại, đặc biệt là gần UV( 200 - 380nm)
được dùng trong các phân tích hoá sinh. Còn vùng hồng ngoại trên 800nm lại được
dùng đê xác định và phân biệt gốc hữu cơ.
Nhửng nguồn năng lượng sáng (nguồn ánh sáng) như dây tóc vonfram, cung cấp
quang phố liên tục từ 320 - lOOOnm và đó là nguồn sáng chính trong vùng khả kiến.
Ánh sáng phát xạ dưới 320nm được hấp thụ bởi thuỷ tinh (vỏ bóng đèn, cuvet hoặc tê
bào). Đèn vonfram - halogen (thạch anh * iôt) cũng được dùng cho vùng khả kiên và
một phần vùng tử ngoại gần. Đèn vonfram - halogen có thể chịu được nhiệt và làm
giảm khả năng vỏ bóng đèn bị tôi đi. Những đèn vừa giải phóng hiđro hay đơtơri có
quang phố liên tục từ 190 - 440nm được dùng trong vùng tử ngoại và vỏ được làm bằng
silic chất lượng cao. Những đèn này dao động theo điện thế, do đó các thiết bị đểu được
lắp máy ổn thế.
Sự tách riêng quang phổ được thực hiện bởi thiết bị lọc ở trong máy so màu. Có
hai điểu cần chú ý:
+ Bưỏc sóng yêu cầu.
+ Độ rộng của đám phô.
Độ rộng quang phô của th iế t bị lọc thuỷ tinh hoặc w ratten (gelatin - nhựa)
khoang giữa 25 - õOnm. Trong máy quang phổ, ánh sáng trắng được phân tán bồi lãng
kính (bằng thuỷ tinh “ vùng khả kiến, và bằng thạch anh - vùng tử ngoại). Ánh sáng
trắn g cũng có thê được phân tá n bởi máy đơn sắc lưối và đám phổ cần thiết thì được
tách riêng bởi khe hở cơ học. Bưốc sóng nhỏ hơn 0,5nm và 0,1 lim có thê thu được bằng
cách sử dụng lăng kính và các th iết bị lưới.
Cưvet thạch anh dùng t.hay cuvet thuỷ tinh trong vùng tử ngoại, nhưng vì giá
thạch anh đắt hơn nên thạch anh chỉ dùng khi đo bước sóng đưổi 320nm. Vì vậy, chọn
đúng loại cuvet đê dùng rấ t quan trọng, đồng thời càng phải đê ý đến cả việc bao quản
cuvet.
Tê bào quang điện, máy p h át hiện nảng lượng phát quang: tế bào quang điện
selen đơn giản không đủ độ nhạy và được thay thê bởi ông quang điện chân không.
43
Khi tiếp xúc nhiều với sự ánh sáng chiêu mạnh, các ông quang diện sẽ bị mòn. Do đó
chúng được bảo vệ bằng cửa trập khi không sử dụng hoặc chỗ (lê cuvet mổ. Những ông
quang điện chân không này được cải tiên thêm thành máy nhân quang điện.
Điểu chính vể không tự động là một ưu th ê rõ ràng trong điếu kiện dao động điện
thê và sự thay đồi nhiệt độ. Điều chình về không tự động là cần th iêt của thiêt bị quét
các bưốc* sóng. Điều này được thực hiện bằng hệ thông tia kép trong máy đo quang phô
tia kép.
I. HẤP THỤ TỬ NGOẠI CỦA CÁC LOẠI CUVET KHÁC NHAU
Sự hấp thụ bơi vật liệu của cuvet cần được chú ý tại một sô bước sóng. Ba loại
cuvet hiện có (thuỷ tinh, thạch anh và nhựa) được dùng ỏ máy đo quang phô tia kép.
1. Tiến hành thí n gh iệm
1 . Điều chỉnh thiết bị vé không như đă được miêu tả trong hưổng dẫn sử
dụng.
2. Cho nước cất vào cuvet thạch anh đến khoảng 2/3 cuvet. Sau đó đặt vào chỗ
giữ mẫu thí nghiệm, còn chỗ giữ mẫu so sánh thì để trông.
3. Tiến hành quét nhanh qua vùng tử ngoại - khả kiến.
4. Làm tương tự đôi với cuvet thuỷ tinh và nhựa, ghi cả 3 kêt qua lên cùng
một đồ thị để so sánh.
2. Báo cáo k ết quả
1 . Trình bày bán gốc hoặc bản sao kết quả quét của 3 cuvet.
2 . Nhận xét vể kết quả này.
3. Mỗi loại cuvet nàv có thê dùng ỏ các bước sóng nào ?
II. QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI CỦA NAD* VÀ NADH
NAD+ và NADP 4 cỉưổi (lạng oxi hoá có đỉnh hấp thụ ớ 260nm và không hấp thụ tại
340nm. Tuy nhiên, dạng khử NADH và NADPH lại hấp thụ ô* bước sóng 340nm. Sự
khác nhau này là cơ sở cho một vài hệ thông phân tích quan trọng dùng trong hoá
sinh.
1. Tiến h à n h th í n g h iệ m
Dùng máy quang phổ tia kép đế ghi lại quang phổ hấp th ụ của:
1. NAD* (40|ig/ml trong dung dịch đệm natri sunphat. 0,02M, pH 7,4).
2. NADH (40fAg/ml trong dung dịch đệm natri sunphat 0,02M, pH 5,6).
44
2. Báo cáo k ết quả
. 1 Đưa ra bản sao quang phổ và nhận xét (ìộ hấp thụ của hai dọng nucleotit
tại 260nm và 340nm.
2. Độ hấp th ụ của NADH tại 340nm lả bao nhiêu ?
3. Tính nồng độ phân tử của NADH dùng trong thí nghiệm này.
4. Độ hấp th ụ tại 340nm là bao nhiêu khi dùng NADH vối nồng độ mol như
được tính ở trên?
Biết độ hấp th ụ phân tử của NADH = 6,22x10 *và khối lượng moi là 665 (g).
5. So sánh giá trị của phần 2 và 4 vối nhau như thê nào ?
III. ƯỚC TÍNH KHỐI LƯỢNG NADH
Cung cấp bột khô đông lạnh chứa khoảng 25 mg NADH trong ]g bột. Tính khối
lượng bột anh chị sẽ dùng đê hoà tan trong 1 0 0 ml mà phải thu được độ hấp thụ tại
340nm là khoảng 0,3. Biết rằng khả năng hấp thụ phân tử của NADH = 6,22x10“ và
khõi lượng mol là 665 (g).
1. Thí n gh iệm
1. Cân ỉượng bột yêu cầu (đã tính ở trên), không cần chính xác lắm nhưng
phải ghi lại chính xác khôi lượng cân được.
2. Chuyển lượng bột đâ cân vào bình chuẩn 100ml và đồ nước tới vạch chuẩn.
3. Xác định độ hấp thụ ở 340nm bằng cuvet nhựa.
2. Báo cáo k ế t q uả:
1 . Đưa ra độ hấp thụ

2. Chi ra khôi lượng bột tan anh chị đã dùng và tính chính xác nồng độ của
NADH trong bột khỏ đông lạnh. Thê hiện kết quả dưối dạng mg NADH/g bột.
45
C hương 5
ĐINH
•
LƯỢNG
•
GLUXIT
I. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ TH EO PHƯƠNG PH Á P BERTRAND
Phương pháp hoá học dùng để định lượng đường khử đêu dựa trén khả năng khư
các hợp chất khác nhau của chúng. Một trong những phương pháp định lượng đường
khử chính xác và phố biên là phương pháp Bertrand. Phương pháp này cho phép định
lượng đường khử chính xác trong khoảng từ 1 - 40mg.
1. N g u y ên tắ c
Phương pháp dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm, các đường khử (glucozo.
fructozơ„ mantozơ,...) có thê dễ dàng khử đồng (II) oxit thành đồng (I) oxit
(Cu~ > C uỉ+ ), kết tủ a đồng (I) oxit có màu đỏ gạch, qua đó tính được lượng
đường khứ.
Định lượng đường khử thường dùng thuốc thử fehling. Thuốc khử fehling là hỗn
hợp ( 1 : 1 ) của hai dung dịch: dung dịch đồng sunfat gọi là fehling (I) và dung dịch kiểm
của muôi Seignett (muôi kali n a tri tactrat) gọi là fehling (II) hay là fehling B.
Khi trộn hai dung dịch fehling (I) và fehling (II) vối nhau thì xẩy ra phản ứng
giữa chúng theo hai giai đoạn. Đầu tiên tạo th àn h kết tủa đồng hictroxit [Cu(OH).,]
màu xanh da trời.
C u S 0 4 + 2NaOH = Cu(OH ) 2 + Na.,SO,
Sau đó Cu(OH ) 2 tác dụng vối muối Seignett tạo thành muôi phức hoà tan, dung
dịch có màu xanh thâm .
HO-CH COONa /O - C I I - C O O N a
/ I
C u ( O H )2 + + 2 1 I<)
Muôi phức trên là một hợp chất không bển. Các đường có chứa nhóm anđehit hoặc
xeton dễ dàng khử Cu^+ th àn h C u1+, tạo ra kết tủa đồng (I) oxit màu đỏ gạch và đường
bị 0 X1 hoả khi tác dụng với clung dịch fehling.
46
CIIO COOII HO-CII-COONa
I /O -Cll-CO O N a i
(C’IK )IÍ ) 4 + 2Cu ị + 2 II 2 O (CHOH)jj + 2HO-CH-COOK + Cu . p i
ị ()-CH-CX)()K I
(1 1 . 0 11 CII2 OÍI
Để định lượng đồng (I) oxit (Cu 2 0 ) tạo thành, trưốc hêt oxi hoá nó bằng sắt (111)
sunfat hoặc bằng amoni sắt kép sunfat trong môi trường axit sunfuric, đồng (I) (Cu1+ )
bị oxi hoá trở lại đồng (II) (Cu‘i+), còn sắt (III) (Fe'ì+) bị khử thành sắt (II) (Fe2+).
Cu20 + Fe 2 (SO.,);j + H 2 S 0 4 = 2CuSO., + 2FeSO,j + H.,0
Lượng sắt (II) (Fe2+) tạo thành được xác định bằng cách oxi hoá nhờ dung dịch
KMnO.ị trong môi trường axit.
lOFeSO,, + 2K M nơ 4 + 8H 2 S 0 4 = 5Fe 2 (S 0 4 ) 3 + 2MnSOí( + K2 S 0 4+ 8H20
Từ lượng KMnO. tiêu tôn trong chuẩn độ, có thể tính lượng đồng (I) oxit và từ đó
ị
tính hàm lượng đường trong dung dịch bằng cách tra bảng tỷ lệ giữa lượng đồng và
(Uí<ing khử của Bertrand.
Đê cỉơn giản việc tính toán, ngưòi ta lập bảng tỷ lệ trực tiếp giữa lượng dung dịch
KMnO ị (1/30N) và đường khử bằng thực nghiêm. Biết được lượng dung dịch KMnO.,
( 1/30N) dùng chuẩn độ lượng đồng tạo thành, tính được lương đường có trong dung
(lịch thí nghiệm.
2. Hoá ch ất
- Na.^CO , bảo hoà.

- Pb(NO;j) 2 hoặc Pb(CH;ỉCOO ) 2 10%.
- Na^SO.ị hoặc N a 2 HPO,ị bão hoà.
- Dung dịch fehling (I): C uS 0 4 . 5H.,0 4%.
- Dung dịch fehling (II): cân 200 gam muối Seignett và 150 gam NaOH, hoà tan
trong nước và chuyển vào bình ctịnh mức 1 lít rồi thêm nước cất cho đến vạch mức,
lắc đều.
- Dung địch Fe 2 (SO,ị)., trong axit sunfuric: hoà tan 50 gam Fe 2 (SO ^ ) 3 và 20 gam
I Ị,SO,ị đậm đặc (đ = 1,84) trong nưỏc cất và dẫn tối 1 lít.
Hoặc dùng dung dịch amoni - sắ t (III) sunfat (phèn sắt): hoà tan 8 6 gam
(NH.,).,S0.ị.Fe.,(S04);1.24H^0 và 2 0 0 gam (158,7ml) H 2 S 0 4 ( d=l,84) trong nước cất và
dẫn tói 1 lít.
KMnO.j 1/30N: cân 1,06 gam K M n04, hoà ta n trong 1 lít nưốc cất, đun nóng
(KMnO,ị dễ ta n trong nước nóng ). Nồng độ KMnO;ị xác định bằng amoni oxalat
|(NH |.H 2Oj hoặc axit oxalic (CvH/(0 4 .H 2 0 ) ít xihất một ngày sau khi pha.
47
Bàng 5.1 - Bảng tỷ lệ giữa KM n04 (1/30N) và đường khử
KMnOị 1/30N Glucozd Fructozd KMnO, 1/30 N Glucozd Fructozo'

(ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (ml)
0 ,2 0 ,0 0 ,0 18 19,2 20 .1
1 0 ,8 0,85 19 20,3 21,2
2 1,8 1.9 20 21,5 22,4
3 2.8 2.9 21 22,7 23,7
4 3,9 4,1 22 23,8 24.9
5 5.0 5,3 23 25,3 26,2
6 6 .1 6 .5 24 26,2 27,0
7 72 7,7 25 27.4 28,8
8 8,3 8,9 26 28,6 30,2

... - ......
9 9,3 10 ,0 27 29,9 31.7
10 10.4 11,1 28 31,2 33,1
11 11,5 12,2 29 32,5 34,5
12 12,6 13,3 30 33,8 35,5

13 13,7 14,5 31 35,1 37,1
14 14,8 15,6 32 36,3 38,6
15 15,9 16,7 33 37,6 -
16 17.0 17,8 34 38.9 -
17 18.1 18,9 35 40.2
3. T iến h à n h
ci) Chuàn bị d ung dịch thí nghiêm

Tuý đối tượng nghiên cứu (hạt, quả...) mà cách chuẩn bị dung dịch nghiên cứu
dùng đế định lượng đường có khác nhau đôi chút, nhưng nguyên tắc chung như sau:
- Trường hợp nguyên liệu thí nghiệm không chứa quá nhiều tinh bột hoặc inuỉin,
có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nước. Cân và cho vào côi sứ 1 gam nguyên liệu
h ạt hay các màu th í nghiệm thực vật khô như cây, lá hoặc quả khô... đã được nghiên
nhỏ (và sấy khô đến khôi lượng không đổi). Nếu là nguyên liệu tươi (như hoa, quả
tươi) thì cân 5 - 10 gam. Nghiền cẩn th ận vối bột thuỷ tinh hay cát sạch và 30ml nước
cất nóng 70 - 80“c. Chuyền toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức dung tích 1000ml.
48
Đun cách t.huỷ 70 - 80°c trong 35 - 40 phút, kết tủa protein và các tạp chất bằng dung
dịch chì axetat [Pb(C.2 H 2 0 2 ) 2 .3H 2 0 ] hoặc chì n itrat [Pb(NO;ỉ).J 1 0 %. Tránh dùng quá
du chì axetat (dùng 2-5ml chì axetat). Sau đó loại bỏ lượng chì axetat dư bằng dung
dịch Na 2 SO,ị bão hoà, để yên hỗn hợp 10 phút. Tiếp đó thêm nước cất tỏi vạch mức và
đem lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình khô. Nưốc lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm.
- Trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin như khoai lang,
sắn, khoai tây v.v... cần chiêt đường bằng rượu 70 - 80°c, đun hỗn hợp cách thuỷ trong
bình cách thuý có lắp ông làm lạnh không khí. Trong trường hợp này không cần kêt
tủa protein bằng chì axetat vì lượng protein chuyên vào dung dịch không nhiều.
- Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều axit hữu cơ như cà chua, dứa, chanh,
khê... cần chú ý là trong quá trình đun khi chiết, đường saccarozơ có thể bị thuỷ phân
một phan. Do đó cần xác định riêng đường khử và riêng saccarozo*. Trưốc khi đun cách
t huỷ hỗn hợp phải trung hoà axit bằng dung dịch N a2CO i bão hoà tỏi pH 6,4 - 7,0.
b) Tiên h à n h th ỉ n g h iê m
1. Lấy 10ml dung dịch thí nghiệm có chứa khoảng 0,8 - 40mg đường cho vào
binh nón dung tích 1 0 0 0 ml.
2. Thêm 10ml dung dịch fehling (5ml dung dịch fehling I và 5ml dung dịch
fehling II).
3. Đun sôi hỗn hợp 3 phút, tính từ khi xu ất hiện bọt nước đầu tiên. Sau khi
đun sôi, dung dịch vẫn phải có mầu xanh biếc đặc trưng. Nêu dung dịch bị m ất màu
hoàn toàn chứng tỏ lượng dung dịch fehling cho vào không đủ để oxi hoá hoàn toàn
lượng đường có trong dung dịch mầu thí nghiệm. Trong trường hợp đó, phải làm lại thí
nghiệm với lượng dung dịch thí nghiệm ít hơn hoặc vỏi lượng thuốc thử fehling
nhiều hơn.
4. Đê lắng kết tủa, lọc vào bình lọc chốn không Buchner (qua phều lọc xốp G4
chuyên dùng đê định lượng đường).
5. Rửa bình và phễu lọc bằng nước cất nóng 3 - 4 lần. c ầ n chú ý sao cho giữ
phần lớn kêt tủ a đồng (I) oxit trên phễu lọc cũng như ở bình nón luôn được phú bởi
một lớp nước nóng, trán h cho Cu20 khỏi bị oxi hoá bởi oxi không khí.
G. Hoà ta n kêt tủa đồng (I) oxit vào bình Buchner bằng cách cho những lượng
nhò (5ml) dung dịch sắt (III) sunfat trong môi trường H 2 S 0 4 và dùng đũa thuỷ tinh
khuấy th ậ t cẩn th ận để hoà tan hoàn toàn kết tủ a đồng oxit trê n phễu.
7. Tráng cẩn th ận bình và phễu lọc 3 - 4 lần bằng nước cất nóng, cho vào
bình nón.
. Chuẩn độ dung dịch thu được bằng K M n0 4 1/30N cho đến khi xuất hiện
8
m àu hồng n h ạt bển khoảng 20 - 30 giây.
49
9. Tính lượng KMnO.j dùng chuẩn độ, tra bảng có thể suy ra được lượng đường
có trong mẫu thí nghiệm. Song song làm th í nghiệm đối chứng bằng cách thay dung
dịch đường bằng nưốc cất.
4. T in h k ế t q u ả
Hàm lượng đường khử tính theo công thức sau:

ỵ - a x Vị X1 0 0
~ v Xw X1000
Trong đó: X- hàm lượng đường khử tính theo %,
a - sô' mg glucozơ tìm được khi tra bảng ứng với số ml KMnO.j 1/30N
dùng đê chuẩn độ mẫu th í nghiệm trừ đi sô ml KMnOị 1/30N chuẩn độ
ỏ mẫu đỗi chứng,
V - dung tích bình định mức (ml),
V} - lượng dung dịch lấy để xác định đường khử (ml),
w - lương mẩu thí nghiệm (g),
100 - hệ sô" tính chuyển thành %,
1000 - hệ sô" đổi gam thành mg.
II. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ TH EO PHƯƠNG PH Á P VI LƯỢNG CỦA

RODZEVICH
Phưdng pháp dựa trên cơ sd trong môi trường kiềm các đường khử (glucozd,
fructozd, mantozd...) có thế khử dề dàng đồng (II) oxit th àn h đồng (I) oxit (Cu 2 *’—►Cu1
dưái dạng kết tủ a màu đỏ và qua lượng CuSO^ị dư (không tham gia phản ứng) tính
được lượng đường khử. Cơ chê của quá trìn h xảy ra theo các giai đoạn sau:
Khi trộn hai dung dịch fehling (I) và fehling (II) vối nhau thì xảy ra phản ứng
giữa chúng theo hai giai đoạn:
Đầu tiên tạo thành kết tủ a đồng hiđroxit màu xanh da tròi:
C u S 0 4 + 2NaOH = Cu(OH ) 2 + N a 2 S 0 4
Sau đó Cu(OH ) 2 tác dụng với muôi Seignett tạo thành muối hoà tan có dung dịch
màu xanh thâm .
IIO-CII-COONa yO-CII-COONa
C u(O H )2 + — ► Cu I + 2 H2<)
IIO-C1I-COOK ()-CIỈ-C()OK
50
Muôi trên là một hợp chất không bển, vì th ế các đường khử có nhóm anđehit hoặc
xeton dễ dàng khử đồng (II) oxit tạo th àn h kết tủa đồng (I) oxit có màu đỏ, bản thân
đường bị oxi hoá khi tác dụng với đung dịch fehling.
Lượng CuSO.| dư (không tham gia phản ứng) cho tác dụng với KI trong môi
trường H.,SO,ị sẽ giải phóng ra iôt tự do.
CuSO,, + 4KI + H 2 SO.,->. I 2 + Culỵ +2K 2 S 0 4
Chuẩn độ lượng iôt tạo thành bằng natri thiosunfat (Na 2 S 2 0^) chuẩn, qua đó tính
được lượng đường khử có trong dung dịch.
I 2 + 2N a 2 S.2 0 3 = N a 2 S 4 Of, + 2 NaI
2. Hoá ch ất
- Dung dịch fehling (I ): 34.64gCuS0.1. 5H20 trong 500ml H 20
- Dung dịch fehling (II) : 173g Seignett + 50g NaOH trong 500ml H20
- Dung dịch KI 30%
- Dung dịch lỉ.^so,! 25%
- Dung dịch N: S2O ỉ O,1N.
3. T iến h à n h
a) Chuẩn bị d ung dịch thí nghiệm
Cách xử lí m ẫu để có dung dịch đường đem phân tích giống như mục (a) tran g 48.
b) Tiến hàn h thí nghiêm
1. Cho vào bình nón dung tích 50ml: lm l dung dịch đường, 2ml nưốc cất, lm l
dung dịch fehling (I) và lm l dung clịch fehling (II).
2. Đun sôi 2 phút (kể từ lúc xuất hiện bọt sôi đầu tiên). Sau khi đun sôi, dung
dịch vẫn còn màu xanh đặc trưng và ở dưối có một lớp kết tủ a đồng (I) oxit màu đỏ
gạch là được. Nếu dung dịch m ất màu hoàn toàn chứng tỏ lượng dung dịch fehling cho
vào không đủ để oxi hoá hoàn toàn lượng đường có trong dung dịch mẫu thí nghiệm.
Trường hợp đó phải làm lại thí nghiệm vổi dung dịch đường ít hơn hoặc pha loãng
dung dịch đường. Ngược lại, nếu không có lớp kết tủ a đồng (I) oxit thì phải táng lượng
dung dịch cỉường, giảm nước cất (luôn bảo đảm thể tích là 5ml).
51
3. Làm nguội, cho thêm vào hỗn hợp lm l H 2 SO 4 25% v àlm l KI 30%, lắc đểu
và giữ trong 2 0 phút.
4. C huẩn độ I 2 tạo thành bằng Na 2 S 2 Oa 0,1N. Song song làm thí nghiệm đỏi
chửng bằng cách thay dịch đường bằng míỏc cất.
4. T ín h k ế t q u ả
Hàm lượng đường khử được tính theo công thức sau:
X = ( a - b ) x f x 3 ,3 « y x l0 0
w XV1
Trong đó: X - % đường khử,

a - sô' ml N a 2 S 2 0«t 0,1N dùng chuẩn độ mẩu đôi chứng,
b - sô' ml NagSÔ-i 0,1N chuẩn độ mẫu thí nghiệm,
f - hệ sô" hiệu chỉnh nồng độ của N a 2 S 2 0^ 0,1N,

3,3 - hệ sô chuyên thành đường,
V - tống thể tích dịch chiết (ml),
Vj - thể tích lấy thí nghiệm (ml),
w - khối lượng nguyên liệu (g),
100 - hệ số* chuyển thành % .
III. ĐỊNH LƯỢNG GLUCOZƠ TRONG MÁU BANG PHƯƠNG PHÁP NELSON
l.H oá ch ất
- Dung dịch Z1 1 SO 4 0,45% (pha loảng từ dung dịch gôc 45%).
- Dung dịch NaOH 0,1N (0,4%).
• Hoá chất đồng (I): Hoà tan 200g Na 2 SO ,1 hoặc 356g N a 2 S 0 4 .10H20 vào 600ml
nước cất nóng. Cho 25g muôi Seignette vào 100ml nưốc, hoà tan. Cho cả hai dung dịch
vào bình định mức 1 lít. Cho thêm 20g NaHCO<Ị và 25g Na 2 CO^ khan, sau khi hoà tan
dẫn nưỏc đến 1 lít. Lọc nêu dung dịch vẩn đục. Tốt n h ất bảo quản ơ37°c. Trong
trường hợp xuất hiện tinh thê thì hoà tan lại bằng cách đun nóng lại trên nồi cách
thuỷ.
- Hoá chất đồng (II): Dung dịch C uS 0 4 .5H20 15%, cho thêm 1-2 giot H^so.-I đặc.
* Thuốc thử Somagyi là dung dịch hỗn hợp thuốc thứ đồng (I) và đồng (II) với tỷ lệ
25: 1 . Chuẩn bị trưỏc khi cỉủng.
52
- Hoá chất arseno molypđat: Cân 20g amoni molypđat [(NH 4 )2 MoOf1] hoà vào
450ml II./). Trộn hai dung dịch vói nhau, ủ ỏ nhiệt độ 37°c từ 25-48 giò hoặc nung
nóng đến 55°C/ và giữ ỏ nhiệt độ này 25 phút. C ất giữ dung dịch trong bình màu tối.
Dung dịch bển, có m àu vàng.
2. T h a n g c h u ẩ n
Pha dung dịch gốíc glucozd 500mg%: 500mg/100ml nưốc. Thay 0,1 ml máu bởi
0 .1 ml (lung dịch glucozd chuẩn có nồng độ từ 1 0 -2 0 0 mg% từ dung dịch gôc.
3. T iền h à n h
1. Cho vào ông nghiệm 2,9ml dung dịch hỗn hợp ZnSO.ị 0,45% và NaOH 0,1N
(tỷ lệ 5:1).
2. Cho thêm 0,lm l máu (lấy ở ngón tay bằng ông pipet lấy máu, thối hết máu
có trong pipet). Rửa sạch máu trong pipet bằng một ít hỗn hợp trên.
3. Đặt ỏng nghiệm lên nồi cách thuỷ đun sôi 3-5 phút. Làm nguội, lọc lấy dịch
trong (hoặc li tâm). Lấy lm l dịch lọc cho vào ông nghiệm. Cho thêm lm l thuốc thứ
Somagyi và đun sôi trên nổi cách thuỷ 20 phút.
4. Làm nguội, cho thêm lm l thuốc thử arseno molypcìat, lắc m ạnh hoà tan toàn
bộ (tồng oxit, đê yên thấy có bong bóng khí C 0 2 tách ra. Tiếp tục cho thêm 70ml H 2 0 ,
lắc đểu.
õ. Đo trên máy so màu với phin lọc màu đỏ (GOOnm), song song làm thí nghiệm
kiêm tra. thay máu bằng nước cất. Kết quả phán tích được xác định theo dung dịch
ehuấn.
Có thê tính nồng độ glucozơ theo phương trình (3.1) của định luật Lambert- Beer
hoặc theo đồ thị chuẩn.
IV. ĐỊNH LƯỢNG FRƯCTOZƠ TRONG DUNG DỊCH CÓ LAN ĐƯỜNG KHỬ KHÁC
MuòVi biết riêng hàm lượng của glucozơ và fructozd, người ta phải định lượng
fructozơ. Nếu hàm lượng các đường khử khác không đáng kể thì hàm lượng glucozơ
bằng hiệu của hàm lương đường khử và hàm lượng fructozd. Trưổc hết phai xác định
lượng đường khử tống số, sau đó xác định hàm lượng fructozd.
1. N guyên tắ c
Đầu tiên oxi hoá glucozơ và các đường khử khác bằng dung clịch kiểm của iôt.
CH 2 OH(CHOH)4CHO + I 2 + 3NaOH = CH.pHCCHOH^COONa + 2NaI + 2H20

Trong điều kiện này, fructozơ không bị oxi hoá. Sau đó, xác định fructozd bằng
phương pháp B ertrand hoặc phương pháp vi lượng.
2. Hoá chât
- Dưng dịch iôt 0,2N trong KI

- Dung dịch NaOH 0,2N
- Dung cìịch NaOH 5%
- Dung dịch H.,SOt1 5%
- Dung dịch N a 2 S0^5%
- Dung dịch metyl 0,02% (0,02g metyl đỏ (Cj.-Hj5 N.jO9 ) 60ml cồn, 40ml nưốc)
- Các thuốc thử dùng để xác dịnh đường khử.
3. T iến h à n h
. Cho vào bình nón 250ml 20ml dung dịch thí nghiệm (chứa không quá 20mg
1
glucozơ). Trung hoà đến pH 6,5- 7,0.
2. Cho thêm 5ml dung dịch iôt 0.2N và 2,5ml đung dịch NaOII 0,2N (thêm
từng giọt). Giữ 15 phút ở nhiệt độ phòng.
3. Axit hoá dung dịch bằng 2ml HọSOị 5% và loại iôt dư bằng dung dịch
Na.jSO.* 5% (nhỏ từng giọt cho đến khi dung dịch m ất màu vàng rơm). Thêm vài giọt
metyl đố và trung hoà hỗn hợp bằng NaOH 5%.
4. Thê tích dung dịch thu được là V(Jo. Dịch thu được chỉ chứa fructozd. Phân
tích fructozơ theo phương pháp B ertrand hoặc theo phương pháp vi lượng.
4. T ín h k ết q u ả
Nếu fructozd được xác định theo phương pháp vi lượng thì hàm lượng đường được
xác định theo công thức sau:
X = (ĩ-b )» f» 3 ,3 « v « v ,i,, K
20x W xV 1
Trong đó: a * sô ml Na.jS.jO.) 0,1N cỉùng chuẩn độ mẫu đôi chứng,

b - sô" ml Na^s<;0., (XlN chuẩn độ mẫu thí nghiệm,
f - hệ sô" chỉnh nồng độ của Na^SÔit 0,1N,
3,3 - hệ sô" chuyển thành đường,
V - tỏng thể tích dịch chiết từ m gam nguyên liệu (ml),
20 - lượng dung clịch thí nghiệm loại cấc đường khừ khác (trừ fructozd),
Vị - thể tích lấy thí nghiệm (ml),
w - khôi lượng nguyên liệu (g),
100 - hệ sô" chuyển thành %.
54
V. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẢNG PHƯƠNG PHÁP AXIT DINITRO -
SALICYLIC (DNS)
1. N guyên tắc
Phương pháp dựa trên cơ sỏ phản ứng tạo màu giữa đường khử vối thuốc thử axit
dinitrosalicylic (DNS). Cường độ m àu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ th u ận vối nồng độ
đường khử trong một phạm vi nhất định. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucozở
tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
2. Hoá ch ấ t
- Thuốc thử DNS:

Hỗn họp: Nưốc c â t : 1416ml
Axit - 3,5 - dinitrosalicylic ( C 7 H.ịN.>07) : 1 0 ,6 g

NaOH : 19,8g
Sau khi hoà tan, cho them vào dung dịch :
Muối Seignett (KNaC jMjo j;.4H 7 0 ) : 306g
Phenol (Cr Hr>OH) nóng chảy ở 50UC: 7,6ml
N atri m etabisunfit (Na 2 S^0 5 ) : 8,3g

Chuẩn 3ml thuốc thử DNS bằng HC1 0,1N với 5-6ml chỉ thị phenolphtalein. Nêu
cần thêm NaOH.
3. T iên hành
a) D ự ng d ồ th ị c h u ẩ n g lu co zơ
Pha dãy glucozơ chuẩn từ 0,2-5,Omg trong lm l. Cho l-2ml dung dịch glucozơ
chuẩn vào một ông nghiệm, thêm 3ml thuốc thử DNS. Đun sôi đúng 5 phút. Làm lạnh
đến nhiệt độ phòng. Pha loăng mẫu nếu cần sao cho m ật độ quang nằm trong khoảng
G.2-0,8. Đo mật clộ quang ỏ bước sóng 540nm vối đối chứng là nước. Võ đường chuẩn
glucozd vối trục tung là m ật (ìộ quang, trục hoành là nồng độ glucozơ. Đường thẳng
thu được có thể cắt trục hoành ở 0,04mg glucozơ do glucozơ bị oxi hoá.
b) C h u ẩ n bị d u n g d ịch th í n g h iê m
Dung dịch đường cần phân tích cũng được chuẩn bị như mục (a) (trang 48).
Hỗn hợp phản ứng giữa glucozơ vối thuốc thử DNS được tiến hành như trong
phần xây dựng đồ thị chuẩn.
Đốì với những mẫu có lượng đường khử thấp, thêm 0,1 mg glucozơ vào mỗi mẫu.
Cứ 3ml thuốc thừ DNS này sẻ phản ứng hêt với khoảng lOmg glucozơ. Những dung
clịch đường đậm đặc phái đu ọc pha loãng sao cho mẫu đem phân tích chi chứa 4mg
(tường khử hoặc ít hdn.
*Cku v:
- Màu của hỗn hợp chỉ được tạo th àn h trong môi trường kiêm. Vi vậv những mầu
fix it. phải được trung hoà trùỏc khi đem phân tích.
- Phương pháp này không đặc hiệu cho tất cá các đường khử. Nêu glucozơ được
dùng làm đường chuẩn thì xelobiozd cho giá trị thấp hơn 15% còn xylozd lại cho cao
hớn 15%.
- Các mẫu cìả đun có thê đế được một thời gian (20 phi it) trước* khi đo. Cá< mảu
không (tun sẽ bị phàn huỷ dần dần.
VI. ĐỊNH LƯỢNG SACCAROZƠ THEO PHƯƠNG PHÁP THƯÝ PHẨN BANG AXIT
Trong nhiểu loại rau, củ, quả... các vật phẩm thực phẩm có chửa một lượng khá
lún saccarozd cùng với đường khử. SaccarozcJ không có tính khứ nên không thê trực
tiếp xác định được bàng các phương pháp Bertrand. Đế có thế xác (tịnh saccarozci bang
phương pháp nhy phải thuỷ phân saccarozo thành các đường khử (glucozcj và
fruetozd).
1 . Nguyên tắc
Khi thuỷ phân dung dịch sacc:arozo' bằng axit ta (luộc: hỗn hợp của hai đường khử
lả glucozo* và fructozd. Định lượng đường khử tạo thành cho phép tính được lượng
saccarozơ có trong mẫu thí nghiệm.
^ 12^ 2 2 ®1 1 +■ Cị.HịọOị;
(saccarozcf) (glueozri) (fructnzd)
2. Hoá c h ấ t
- Dung dịch HC1 5%

- Dung dịch NaOH 5% hoặc dung dịch Na.,C().> bão hoà.
- Metyl (tỏ 0,02% (0,02g rnotyl đỏ trong 60ml rượu etylic và 40ml nước cất)
Các thuốc thử dùng đe xác định đường khử theo Bertrand.
3. Tiến hành
. Lấy 10ml dung dịch mẫu thí nghiệm (đã loại bổ protein và í/huan bị cho xát-
1
định đường khử như phần (a) (trang 48) cho vào bình nón 250ml.
2. Cho thêm 5ml clung dịch HC1 5%.
3. Đun cách thuỷ hỗn họp có ống làm lạnh bang khỏng kill trong M0-40 phut,
làm nguội nhanh.
4. Trung hoà hổn hợp bằng dung dịch Na.,CO:ibào hoà đèn pH 6 ,5-7,0 vối chi
thi metyl đỏ (3 giọt).
5 . Thêm từng giọt kiểm vào cho đến khi dưng dịch chuyên từ đỏ sang vàng.
6 . Xác định lượng đường bằng phướng pháp Bertrand.
*Clỉũ ý: Khi xác định saccarozơ là các dịch chiết bằng nước có thẻ kêt quả sẽ bị sai
khác, bới vi cổ một số polisacarit cao phân tử khốc cũng chuyến vào dịch chiêt một
phan hay hoàn loàn. Trong quá trình thuỷ phản những chất này cũng tạo thảnh các
nionosacarit. Do đó, có thể chiết đường bằng cồn sao cho nồng độ của cồn trong dung
dịch đạt 75 • 80%.
4. T ính kốt quả
Ham lượn£saccarozơcaủa mầu thí nghiệm tính theo công thức:

X = (a b)*0.95
Tron tỉ dó: X • hàm lượng sacarozd tính bằng %,
a - hàm lượng đường khử t.heo glucozd của dịch đường sau khi thuỷ
phản hang axit (%),
b - ham lượng đường khử của dung dịch đường (trước khi t-huỷ phân)
(%),
0,95 * hệ sô chuyển từ glucozd sang saccarozd
VII. ĐỊNH LƯỢNG TINH BỘT THEO PHƯƠNG PHÁP THUỶ PHÂN BANG AX1T
Hiện nav, có ríu. nliiểu phương pháp xác định tinh bột: các phương pháp hoá học,
phương pháp cực phổ, phương pháp khúc xạ kế, phương pháp hoá sinh...
Các phương pháp hoa học xác định bằng cách đo cường độ m àu của tinh bột vối iôt
hoặc bằng cách định lượng glucozơ tạo thành sau khi thuỷ phân tinh bột bằng axit
hoặc- bang enzim amylaza. Phương pháp này không chính xác vì amylozd và
amylopectin tạo màu vối iôt rấ t khác nhau mà hàm lượng của chúng trong từng loại
tinh bột iại khác nhau.
Phương pháp dựa trên cơ sỏ thuỷ phân tinh bột bằng axit cũng không cho kết quả
th át đáng tin cậy vì khi thuỷ phân tinh bột bằng axit, không những chỉ có tinh bột mà
cả hemixenlulozt) và các polisaccarit phân tử thấp cùng bị phân giải. Do đó khi dùng
phương pháp thuỷ phân bằng axit, trước tiên phải tách tinh bột ra khỏi nguyên liệu
thực vật, sau đó mới thuỷ phân và xác định hàm lượng glucozơ.
Phương pháp thuỷ phân bằng enzim cho kết quả chính xác hơn cả, vi khi dùng chê
phẩm enzim đặc hiệu thì chỉ có tinh bột bị phân giải.
Dưởi đay là phương pháp thuỷ phản bằng axit.
57
1. N guyên tắc
Dưổi tác dụng của axit, tinh bột bị thuỷ phân tạo th àn h đường glucozơ. Xác định
lượng glucozơ tạo th àn h rồi nhân vối hệ sô 0,9 ta được hàm lượng tinh bột.
(C(*>Hl0 O-)n + nH 20 -> nCGH 1 2 0 6
162,1 18,02 180,12
F = - 1 ^ i2- = 0,90
180.12
2. Hoá c h ấ t
- Dung dịch HC1 5%
- Dung dịch NaOH 5%
- Dung dịch Pb(CH 3 COO ) 2 10 % hoặc Pb(NCKị) 2 10%

- Dung dịch N a 2 SO t1 hoặc N aH P 0 4 bão hoà
- Các thuốc thử dùng đê xác định đường khử.
3. Tiến h àn h
. Cân 200-250mg mẫu tinh bột đã nghiền nhỏ (đã biết rõ độ ẩm), cho vào
1
bình cầu dung tích 1 0 0 ml.
2. Cho thêm vào bình 50ml nưốc cất, lắc đều, giữ yên 30-45 phút, lọc, bỏ nưâc
lọc đê loại bỏ đưòng tan.
3. Rửa tinh bột bằng nước cất 2-3 lần. Chọc thủng giấy lọc và chuyển tinh bột
vảo bình cầu chứa 25ml dung dịch HCI 5%. Đậy kín bình bằng n ú t cao su có lắp ông
lảm lạnh hồi lưu.
4. Đun cách thuỷ hỗn hợp 3-5 giờ. Thử sự thuỷ phân hoàn toàn của tinh bột
bằng dung dịch iôt.
5. Làm nguội. T rung hoà hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 5% đến pH=5,6-6,0
(bỏ trực tiếp mẩu giấy quý vào bình) .
. Chuyển hỗn hợp vào bình định mức lOOmL Kết tủa protein bằng (lung dịch
6
chì axetat 10%. Loại bỏ chì axetat bằng dung dịch NagHPOị hoặc Na^so,} bão hoà.
Thêm nưổc cất tói vạch mức, lắc đểu và lọc.
7. Định lượng đương glucozo’ trong dung dịch (lấy 5ml hoặc 10ml) bằng
phướng pháp B ertrand, qua đó tính được hàm lượng tinh bột.
4. Tính k ế t quả
H àm lượng tin h bột tín h theo công thức sau:
58
a XV X100 X0,9
~ V1 Xw
Trong đó: X - hàm lượng tinh bột tính bằng %,

a - sô' mg glucozơ tra bảng tính được (ứng vỏi sô' mlK M n0 4 dùng chuẩn
độ mẩu thí nghiệm trừ đi số* ml KMnOị dùng chuẩn độmẫu đối
chứng),
V, - thể tích dung dịch đường (sau thuỷ phân) lấy để xác định đường
glucozd (ml),
V - dung tích bình định mức,
w - khỏi lượng mẫu thí nghiệm (mg),
100 - hệ sô" tính chuyển thành %,
0,9 - hệ sô" quy chuyển glucozơ th àn h tinh bột.
VIII. ĐỊNH LƯỢNG XENLULOZƠ
Trong các sản phàm thực vật (hạt, rau, quả...) xenlulozd thường gặp cùng vối
nhiều chất khác như: hemixenlulozơ, lignin, pectin...
1. N guyên tắc
Phương pháp định lượng xenlulozơ dựa vào tính chất của nó trong một hợp chất
bền đôi vói tác dụng của axit mạnh và kiềm mạ nil, không bị phân huỷ dưới tác dụng
của axit yếu, còn c~c chất khác thường đi kèm theo vối xenlulozơ như hemiluloza,
iignin... ít bển hơn đối vỏi tác dụng của axit và kiềm nên bị oxi hoá, phân giải và tan
vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu bằng dung dịch kiềm hoặc bằng hỗn hợp axit
nitric vối axit axetic.
2. Hoá ch ất
- Dung dịch axit nitric (HNOfi) đặc ( đ=l,4),
- Dung dịch axit axetic (CH.ịCOOH) đặc,

- Rượu etylic 96%.
3. T iến h à n h
.
1 Cân 0,5-1 gam mẵu đă nghiền nhỏ (sấy khô đến khôi lượng không đổi ở
nhiệt độ 100-105°C), cho vào bình nón dung tích 250ml. Nêu hàm lượng xenlulozơ
trong m ẫu khoảng 10-20% thì cân l,5-2g, hàm lượng khoảng 40-50% thì cân 1-1,5g,
nhỏ hớn 10% cân 2,5-5mg.
59
2. Thêm vào bình 1(5,õml hỗn hợp gồm 15ml axit nitric dạc và ],õml axit
axetic đặc. Láp ông làm lạnh hồi lưu vào bình và đun sôi hỗn họp 30 phút. Đê nguội,
pha loăng hỗn hợp bằng nước nóng. Lọc qua giấy lọc đã biêt trước khôi lượng.
3. Rửa kết tủ a xenlulozd nhiều lần bằng nước cất nóng (mồi lẩn 10*15ml).
4. Rửa bằng rượu etylic (96%) 1-2 lẩn.
5. Rửa bằng ete etylic.
0. Sấy giấy lọc có chứa xenlulozơ ở nhiệt độ 100-105'’c đôn khối lượng không
đổi (khoảng 2-3 giờ). Tuỳ theo nồng độ của thuốc thử đem dùng, cùng vói xenlulozd
thường còn lại một lượng nhỏ hemixenlulozd, chú yếu là các pcntozd và 1‘ignin v.v... Do
đó xenlulozơ xác định được gọi là xenlulozo* ’’thô".
4. T ín h k ố t quỉi
Hàm lượng xenlulozơ tính bàng công thức sau:

v _ a x io o
./V —....
w
Trong đó: X - hàm lượng xenlulozơ tính bằng %,
a - khốỉ lượng xenlulozơ (gam),
w - khôi lượng mẫu thí nghiệm (gam),
100 - hệ sô" chuyển thành %.
IX. ĐỊNH LƯỢNG PECTIN BANG PHƯƠNG PHÁP CANXI PECTAT
1. N g u y ên tắ e
Phương pháp dựa trên cơ sỏ thu nhận muối canxi pectat ờ dạng kết tủa.
2. H oá c h â t
- Dung dịch canxi clorua 2 N: hoà tan 230-250 gam canxi clorua íCaCl.^) trong bình
dung tích 1000ml, thêm nước cat tới vạch ngấn. Dung tích phai có tý khôi l,09g/cm:\
không cần xác định nồng độ chuẩn.
- Dung dịch NaOH 0,1N: hoà tan 4g NaOH trong bình định mức có dung tích
10 0 0 ml, thêm nước cất tới vạch ngấn.
- Dung dịch axit axetic (CH^COOH) IN: pha loãng 60,03ml axit axetic đặc bằng
nước cất cho tối 1 0 0 0 ml.
3. T iến h à n h
1. Cho 0,] 5 gam pectin mẫu nghiên cứu vào bình.
60
2. Cho thêm 100ml NaOH IN.
3. Đe hồn hợp trong 7 ịỉiơ hoặc qua đêm để xà phòng hoá hoàn toàn pectin
ĩhnnh nxit pectic.
4. Thêm 50ml dung dịch axit axetic 0?1N.
5. Sau 5 phút thêm õOml CaCl, 2N . giữ 1 giờ.
. Đun sôi 5 phút và lọc qua giấy lọc không tan dã được sấy khỏ tới khói lượng
6
không đối.
7. Rửa kết tủa canxi pectat bằng nước cất nóng cho tối khi không còn ion clo
nửa (thứ nước rửa với dung dịch bạc n itrat 1 % không có kết tủa trang).
8 . Sau khi rửa xong, đặt giấy lọc có kêt tủa vào chén cân và sấy ỏ 105’c cho
tới khôi lượng không đôi.
4. T ĩn h k ết q u a
Lượng pectin lấy đê xà phòng hoá (B) tính theo công thức sau:
V,
Trong đó: W- khỏi lương của pectin lấy đẻ pha thành dung dịch (gam),
V ị -thể tích dung dịch pectin ban đẩu (ml),
V., - thể tích dung dịch pectin lấy đê xà phòng hoá (ml).
Hàm lượng của canxi pectat hằng hiệu của khỏi lượng giấy lọc có kết tủa và giấy
lọc không có kết tủa.
Hàm lượng pectin (P) tính theo công thức sau:
p Wx 0,92x100
B
Trong đó: w - khôi lượng của kết tủa canxi pectat (g),
B - lượng pectin lấy đem xà phòng hoá (g),
0,92 - hệ sô" tính chuyển đã trừ hàm lượng canxi trong kết tủa (nghía là
pectin chiêm 92% khôi lượng caiixi pectat),
100 - hệ sô'chuyển để biểu thị kết quả theo phần %.
X. Đ ỊNH LƯỢNG DEXTRIN BANG PHƯƠNG PH Á P KẾT TỦA VỚI C ổ N
1. N g u y ê n tắ c
Phương: pháp dựa vào tính chất đextrin kết tủa hoàn toàn trong cồn nồng độ cao,
còn đường glucozơ, mantozơ tan trong cồn.
61
2. Hoá chat
Cồn tuyệt đốì.
3. T iến hành
1 . Cân 5g mẫu cho vào cốc. Cho thêm 50ml nưỏc cất. Khuấy kỹ cho tan.
2. Lọc qua giấy lọc và cho vào bình định mức. Rứa vài lần bằng nưóc cất định
mức đến vạch lắc đểu.
3. Dùng pipet lấy 100ml dung dịch trong bình định mức cho vào cốc. Thêm từ
từ vào côc 30ml cồn tuyệt đôi, lắc đều. Để yên cỏc khoáng 30 phút cho kẻt tủa đextrin
màu trắng lắng xuống.
4. Lọclấy kết tủ a qua hai lớp giấy lọc (đã biêt khôi lượng). Rửa kết tủ a vài
lần bằng cồn tuyệt đôi. Sấy giấy lọc có chứa kết tủa ỏ 105°c đến khi có khôilượng
không đổi.
5. Hàm lượng % đextrin trong mẩu là hiệu sô' giữa giấy lọc có chứa đextrin và
giây lọc không chứa đextrin.
Hàm lương đextrin được xác định theo công thức sau:
^ _ ( a - b ) x V x 100
“ vJT w
Trong đó: X - % đextrin trong mẫu,

a - khỏi lượng của giấy lọc và kết tủa sau khi sấy (gam),
b - khôi lượng giây lọc (gam),
V - thế tích định mức (ml),
V I - thể tích lấy xác định (ml),
w - khôi lượng mẩu phân tích (gam).
62
C hương 6
ĐỊNH LƯỢNG LIPIT
I. ĐỊNH LƯỢNG L IP IT BANG MÁY SOXHLET
1. Nguyên tắc
Tron^ tê bào, lipit ở dạng tự do và liên kết. Lipit tự do tập trung chủ yếu ỏ các cơ
quan dự trữ như hạt, quả (ở thực vật) và mô mỡ (ở động vật). Trong thực tế, sự xác
định lipit dựa vào hàm lượng lipit được rú t ra khỏi nguyên liệu bằng các dung môi hữu
cơ. Có hai phương pháp đê xác định:
- Phương pháp xác định trực tiếp: chiết xuất lipit ra khỏi nguyên liệu và cân trực
tiếp.
- Phương pháp xác định gián tiếp: chiết xuất lipit ra khỏi nguyên liệu và cân lại
nguyên liệu.
Các dung mỏi chiết x uất lipit thường dùng là ete etylic (ete dầu hoả, et.e petrol,
benzen, xang, cloroform, tetraclorua cacbon...)- Trong phòng thí nghiệm thường dùng
ete etylic, vì nó có độ bay hơi cao, nhiệt độ sôi thấp. Tốc độ của quá trình chiết xuất
phụ thuộc vào mức độ nghiền nhỏ nguyên liệu. Ngoài lipit ra còn có một sô hợp chất
khác như: vitam in hoà ta n trong lipit photphatit, steroit, các sắc tô... cũng được chiết
ra. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp hàm lượng các chất này rấ t ít, nên các phương
pháp này vẫn được chấp nhận trong các thí nghiệm thông thường. Vì vậy các lipit xác
định được bằng một trong hai phương pháp trên được gọi là lipit “thô”.
Quá trìn h chiết x uất lipit được thực hiện trên máv Soxhlet, gồm có: bình cầu (a)
(lung tích 100 - 300ml. trụ chiết (b) và ông làm lạnh (sinh hàn - c).
T ất cả các phàn được lắp nôi vói nhau nhờ cố nhám (hình 6.1).
2. Hoá ch ấ t
Ete etylic hoặc ete petrol.
3. T iến h àn h
- C huẩn bị tú i bằng giấy lọc để đựng nguyên liệu hoặc dùng ống hình trụ đựng
m ẫu có sẵn (hình 6.1), túi giấy lọc được cắt hình chữ nhật, chiều dài gấp 2,5 lần chiểu
rộng, gấp th à n h túi trụ (kiểu gói thuốc) có đường kính bé hơn trụ chiết. Túi được sấy
khò đến khôi lượng không đổi và được cân trên cân phân tích (nêu xác định theo
phương pháp gián tiếp).
63
C á c b ép củ a
bộ c h iè t S o x h le í
C á c ống chiẻt
H in h 6.1 - B ộ ch iế t S o x h le t
a - b in h c ầ u ; b - trụ c h iế t; c - ốn g làm lạ n h
64
- Nguyên liệu được nghiên nhỏ, sấy khô đến khôi lượng không đổi (hoặc làm thí
nghiệm kiểm tra nguyên liệu đến khôi lượng không đổi và tính tỷ lệ vối lượng mẩu
nghiên cứu). Cân chính xác 2 - 5g rồi cho mẫu vào túi giấy. Gấp kín mép túi, đặt túi
có mấu phân tích vào trụ chiết.
a) P h ư ơ n g p h á p x á c đ ịn h trự c tiếp
1 . Trước khi chiết, bình cầu (a) được sấy khô đên khôi lượng khỏng đối.
2. Đặt bình cầu trên nồi cách thuỷ và cho ete vào 1/2 thể tích bình.
3. Cho tú i nguyên liệu vào trụ chiết (b).
4. Lắp trụ chiết vào bình cầu (a).
5. Cho dung mỏi vào bình chiết đến ngập túi nguyên liệu. Mức dung môi đến
phần trên ông xifon trụ chiết.
6 . Lắp õng làm lạnh (c), ngâm nguyên liệu trong dung môi vài giờ.
7. Đ ặt máy Soxhlet vào nồi cách thuỷ (đôì vổi ete không quá 50 ’-C) sao cho số’
lần dung môi rút từ trụ chiết xuống bình cầu khoảng 10-15 lần trong 1 giò (4-6 phút/lần).
8. Thử lipit đã chiết hêt chưa bằng cách lấy một vài giọt ete từ đầu cuối trụ
chiêt cho lên đĩa kính đồng hồ sạch. Cho bay hơi hết ete. Nêu không có lipit trên đĩa
kính, xem như lipit đã được chiết hoàn toàn.
9. Khi chiết xong, lấy bình cầu ra, lắp ống sinh hàn vào và cất lấy ete.
. Sấy bình cầu có chứa lipit đến khôi lượng không đổi rồi đem cân. Nêu
10
chiêt bằng ete etylic thì sấy ở nhiệt độ 60-70°c trong 30 phút. Nêu chiết bằng ete
petrol thì sấy d nhiệt độ 80-90°C trong 45-50 phút. Để trá n h cho chất béo khỏi oxi hoá,
tôt nhất là sấy trong chân không ỏ nhiệt độ 70-80°C (trong 4 giờ).
Tính kết quả:
Hàm lượng lipit có trong lOOg mẫu nguyên liệu tính theo công thức sau:
ỵ _ (a -b )x 100
c
Trong đó: X - hàm lượng lipit tính theo %,
a - khối lượng bình và lipit (g),
b - khốỉ lượng bình (g),
c - khổi lương mẫu đã tách lipit (g).
b) P h ư ơ n g p h á p x á c đ ịn h g iá n tiếp
Sau khi kẻt thúc th í nghiệm như trên, lấy tú i mẫu nguyên liệu ra khỏi bình chiết,
cho bay hơi hết dung môi, sấy khỏ đến khôi lượng không đổi.
65
Tính kết quả:
Hàm lượng lipit có trong lOOg mẫu nguyên liệu như sau:
v _ (a - b) X100
Ả —---------------
c
Trong đó: X - hàm lượng chất béo lipit tính bằng%,
a - khôi lượng túi mẫu nguyên liệu trưổc khi chiêt (gam),
b - khôi lượng túi mẫu nguyên liệu sau khi đã chiết (gam),
c - lượng nguyên liệu lấy đê xác định các chỉ sô" của chất béo (lipit).
II. XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ s ố CỦA L IP IT
1. Xác định ch ỉ s ố a xit
a) N g u yên tắ c
Chỉ sô axit của lipit là sô mg KOH cần đế tran g hoà axit béo tự do trong 1 gam
chất béo.
P hản ứng xảy ra như sau:
RCOOH + KOH -> RCOOK + H 20
Dựa vào lượng KOH dùng đê trung hoà các axit béo đê tính chỉ sô axit..
b) Nguyên liệu
Bơ tươi và bơ ôi hoặc dầu thực vật.
c) H óa c h ấ t
- Dung dịch cồn - ete (3:1)
- Dung dịch KOH 0 ,IN trong cồn 96".
- Dung dịch phenolphtalein (C 2 qH 1 4 0 4) 1 % trong cồn 96°.
cỉ) D ụ n g cụ và m áy m óc
Buret 10ml, 2 bình cầu 200ml, ông đong 50m], nồi cách thuỷ.
e) T iên h à n h
1 . Cho vào bình cầu 200ml khoảng 5g chất béo (hoặc dầu lạc).
2. Thêm vào 50ml hỗn hợp cồn - ete (tỷ lệ 3:1) đê hoà tan chất béo, lắc cẩn
thận. Nếu chất béo chua tan hết có thê đun nhẹ hỗn họp trên nồi cách thuý. lắc đều.
Làm nguội.
66
3. Cho hai giọt chỉ thị phenolphtalein và chuẩn độ hổn hợp bằng dung dịch
KOH 0,1N trong cồn (dùng dung dịch KOH trong cồn để tránh xẩy ra sự xà phòng hoá
trong trường hộp hỗn hợp chứa từ 2 0 % trở lên) cho đến khi xuất hiện màu hồng tươi
(trường hộp chất béo có màu thảm thì dùng chỉ thị tym olphtalein 1 % trong cồn. chuẩn
độ cho (tên m àu xanh).
/) Tính kết quả
Chỉ sô axit (Ax) tính theo công thức:

( a - b ) x 5,611
Ax —------------------
c
Trong đó: a • sô ml dung dịch KOH 0,1N chuẩn độ ỏ bình thí nghịêm (bơ ôi),
b - sô ml dung dịch KOH 0,1N chuẩn độ ỏ bình kiểm tra (bơ tươi),
c - sô gam bơ,
5,611 - sô mg KOH có trong lm l KOH 0,1N
hoặc tíiili theo công thức:
A a Xf X5,611
Ax = --------------
c
Trong đó: a - sô" ml KOH dùng để chuẩn độ,
f - hệ sô" điếu chỉnh của KOH 0 , 1 N (dung dịch tự pha),
c - sô gam mẫu.
2• X ác địn h ch ỉ s ố xà phòng hóa
a) N g u yên tắ c
Chỉ sô xà phòng hóa là lượng mg KOH cần đê trung hoà axit béo tự do cũng như
liên kết có trong lg chất béo.
Phán ứng xảy ra như sau:
CHịOCOR I CII 2 O II KịCOOK

Ị I
CHOCOR2 + 3KOH — ►CHOH + I W ) ( ) K
Ổ lbO C O R , CH 2 OH R O )()K
Lượng kiểm dư được xác định bằng HC1. Dựa vào lượng kiểm phản ứng, tính được
chỉ sỏ xà phòng hoá.
b) N g u y én liêu
Bơ, hoặc mỡ, hoặc dầu thực vật.
67
c) H oá c h ấ t
• Dung dịch KOH 0,5N

- Cồn 96%
- Dung dịch HC1 0,5N
- Dung dịch phenolphtalein (C.2 ()H1 .1 0 .1) 1% trong cồn 96“.
d) D ụ n g cu và m áy móc
Hai bìnli cầu 200ml với ông làm lạnh, ông đong 50ml, pipet 10ml, buret 25ml, nồi
cách thuỷ.
e) T iên h à n h
1 . Lấy 1 g chất béo cho vào bình cầu.

2. Thêm vào 10ml KOH 0,5N và 50ml cồn.
3. Lắp ổng làm lạnh không khí (ồng thuỷ tinh dàikhoảng Im, đường kính
3-õmm).
4. Đun sôi cách thuỷ 1 giờ. Sự xà phòng hoá kết thúc khi dung dịch ỏ trong
bình trở nên trong suốt. Làm nguội hồn hợp.
5. Thêm vài giọt phenolphtalein vào bình.
. Chuẩn độ bằng dung dịch HC1 0,5N. Song song làm th í nghiệm kiếm tra
6
bang cách thay chất béo bằng nước cất.
f) Tính kết qua
- Chỉ sỏ xà phòng (Xp) tính theo công thức:
xp =(a - b) X28,055
-
Trong đó: a - sô ml dung dịch HC1 0,5N dùng đê chuẩn độ ở bình kiểm tra,
b - sô ml dung dịch HC1 0,5N dùng đế chuẩn độ ở binh thí nghiệm,
c - sô gam chất béo,
28,055 - sô mg KOH trong lm l KOH 0,õM
hoặc tinh theo công thức:
v _ (a - b) X X28, Oõõ XỈ2
p
r “ c
Trong đó: a - sỏ^ ml HC1 0,õN dùng đề chuẩn độ bình kiểm tra,
b - sô ml HC1 0,5N dùng đê chuẩn độ bình thí nghiệm.
68
f 1 - hệ sô hiệu chỉnh nồng độ HC1,
ĩ2 - hệ số’hiệu chỉnh nồng độ KOH,
c - sô gam chất béo.
3, X ác đ ịn h ch ỉ sô oste
Chỉ số este là sô' mg KOH cần để xà phòng hoá các glixerit (este) có trong lg chất
béo. Chỉ sô este (Es) bằng hiệu sô" của chỉ sô" xà phòng và chỉsô" axit.
Es= Xpx A,
Trong thực tẽ sản xuất, chỉ sô este cho phép tính được lượng glixerin có thể thu
được khi xà phòng hoá chất béo. Hàm lượng glixerin của chất béo tính theo công thức:
G% = 0,0547 X Es
4. Xác định ch ỉ s ố iôt
a) N g u yên tắc
Chỉ sô iôt là sô" gam iôt kết hợp vối lOOg chất béo.
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc iôt kết hợp vỏi axit béo ớ các vị trí nôi đỏi.
Ớ nhiệt độ thưòng, iỏt phản ứng với axit béo có trong thành phần cúa chất béo chậm,
khi đun nóng thì iôt kết hợp vào các nối đôi không đồng đểu, không làm no được hoàn
toàn các nôì đôi. Các halogen khác (clo, brom) phản ứng vổi axit béo rất mạnh, nên
thay iôt bằng các hợp chất của nó vói các halogen khấc.
b) N guyên liêu
Bớ, mỡ hoặc dầu thực vật.
c) H oá c h ấ t
- Dung dịch Hanus (lOg IBr hoà tan trong 500ml axit axetic [CH.jCOOH]
đặc).
- Dung dịch KI 10%.
- Dung dịch N a 2 S 2 0 3 0 ,1 N.
- Dung dịch tinh bột 1 %.
• Clorofom.
d) D u n g cu và m áy m óc
Pipet lOmỊ hai bình cầu dung tích 200 - 300ml có nút nhám, 2 cốc nhỏ (đường
kính 1 - 2 cm).
69
e) T iên h à n h
1. C ân vào lọ nhỏ 0,2g dầu hoặc 4g bơ hoặc mỡ. Chuyên sang bình cầu dung
tích 200 - 300ml có nút nhám . Bình kiểm tra thay chất béo bằng 0,2ml nước cất.
2. Cho thêm 10ml clorofom vào mỗi binh, lắc nhẹ đê hoà tan hết ch ất béo.
3. Cho thêm lõ m l dung dịch H anus, đậy kín bình ngay bằng n ú t nhám . Lắc
cẩn th ậ n bình. Để yên chỗ tốĩ 15 phút (dầu có nhiều axit béo không no thì để lâu hơn).
4. Thêm 15ml dung dịch KI 10%, 50ml nước cất. C huẩn độ iôt giải phóng ra
bằng dung dịch Na.,S.,O.Ị 0 , 1 N cho đên m àu vàng rơm.
5. Thêm lm l dung dịch hồ tinh bột 1 %, 3ml clorofom. C huẩn độ tiếp cho đên
khi dung địch bị m ất m àu hoàn toàn.
6. Cho thêm clorofom vào để giải phóng iôt bị hấp thụ trên ch ất béo (khi
chuẩn độ phải lắc mạnh), đồng thời làm th í nghiệm kiểm tra.
f) Tính kết quả
Chỉ số' iôt được tính theo công thức sau:

J ( b - a ) x f x O ,01269x100
c
Trong đó: a - sô ml dung dịch Na.^S.Ôo 0,1N dùng chuẩn độ bình kiểm tra,
b - số ml dung dịch Na^SgCX* 0 ,lN dùng chuẩn độ bình thí nghiệm ,
c - lượng chất béo (g),
f - hệ sô điểu chỉnh nồng độ N a 2 S 2 0 ^)
100 - hệ sô" quy chuẩn cho lOOg chất béo,
0,01269 - số gam iôt tương ứng vói lm l dung dịch Na.;SyO.< 0 , 1 N.
5. X ác đ ịn h ch ỉ sô p ero x it ch ất béo
a) Nguyên tắc
Chỉ sô peroxit là sô gam iôt được giải phóng ra bởi peroxit có trong lOOg mầu.
Trong không khí, các axit béo có trong chất béo, đặc biệt là các axit béo không no dễ
dàng bị oxi hoá một phần và tạo th àn h peroxit, gầy nên hiện tượng mơ bị ôi. Việc xác
định chỉ sô peroxit dựa vào phản ứng sau:
Rì - CH - CI Ỉ - R 2 Rì - CH - CH - R 2
+ KI + 2CH:1COOH -> \ / + 2CH:tCOOK + H20 + L,
o
Lượng iôt giải phóng ra được chuẩn độ bằng clung dịch N a 2 S 2 0 .?

2 N a 2 S ./), + I, ----------- > 2NaI + N a 2 S 4 Ofì
b) N g u yên liệu
Bơ, mõ hoặc dầu thực vật.
c) H oá c h ấ t
- Axit axetic (CH^COOH) đặc

- Clorofom
■ Dung dịch KI bão hoà (pha dùng ngay)
• Dung dịch Na.>s.,0.t 0 ,0 IN (pha trước khi dùng từ dung dịch Na^SyO^ 0,1N
bằng nước cất đun sôi để nguội không chứa C 0 2.
- Dung dịch hồ tinh bột 1 %.
d) T iến h à n h
1 . Lấy hai bình nón dung tích 250ml. Cho vào bình 1 (bình th í nghiệm) 2g dầu
lạc, bình 2 (kiếm tra) 2 ml nước cất.
2. Cho thêm vào mỗi bình 10ml dung dịch hỗn hợp axit axetic - clorjofom (tỷ lệ
2 : 1 ), lm l dung dịch KI mói pha (hoặc một ít tin h thê KI), đậy nút. Lắc hổn hợp cẩn
th ận và đật vào chỗ tôi 1 0 phút.
3. Cho thêm 25ml nước cất.
4. Cho thêm 0,5ml dung dịch hồ tin h bột 1 % và chuẩn độ iôt tạo th àn h bằng
clung dịch Na^SÔ.j 0,01N cho đến khi m ất màu xanh.
e) Tính kết qua
Chỉ sô' peroxit (p) tính theo công thức sau:

p ( a - b ) x f x 0,01269 X 100
c
Trong đó: a - sô" ml đung dịch N a 2 S 2 0 ^ 0,01N dùng chuẩn độ bình thí nghiệm,
b - sô ml dung dịch N a 2 S 2 0 ' 4 0 ,0 IN dùng chuẩn độ bình kiêm tra,

c - khôi lượng chất béo,
f - hệ sô" hiệu chỉnh nồng độ N a 2 S 2 0 3,
100 - hệ sô quy chuẩn cho lOOg ch ất béo,
0,01269 - sô gam iôt tương ứng vối lm l dung dịch Na.^SyO.^ 0 ,0 IN.
71
C hương 7
Đ ỊN H L U Ơ N G A X IT A M IN và p r o t e in
I. ĐỊNH LƯỢNG AXIT AMIN BANG PHƯƠNG PH Á P CHUAN độ FO RM O L

(PHƯƠNG PH Á P SỒ R EN SEN )
Axit am in hoà tan trong nước có tính chất muôi nội phân tử, các nhóm am in và
cacboxyl trung hoà lan nhau. Nhóm -COO của axit amin bị cản trở bởi các nhóm
amin nên không thê chuẩn độ trực tiếp được. Trong fomanciehit. nhóm am in của axit
amin phản ứng với nhóm anđehit cho metylen. kẻt quả cũa phản ứng là nhóm am in
m ất tính chất cơ bán của nó, ngược lại nhóm cacboxyl trong axit am in tồn tại dạng
metylen không bị cản t.rớ và có thê chuẩn độ.
N H ,+ o N = CH.
i I
R HC R CH H .p
I \ I
coo II COOH
N=CH., N = CH.,
I 2 I
R — CH + NaOH --------♦ R — CH + HO
I I
COOH COONa
Số nhóm cacboxyl tự do bằng sô' nhóm amin liên kết với fom andehit, khi chuẩn độ
nhóm cacboxyl thì xác định được nlìóm amin. Vì vậy cho phép định lượng được axit
am in có trong dung dịch nghiên cứu.
2. N guyên liệu
Dung dịch axit amin khoảng 0,1% hoăc cốc nguyên liệu có axit am in cần địníì
lượng.
3. Hoá c h ấ t
- Dung dịch NaOH 0,IN
72
- Dung dịch HC1 0,1N
- Dung dịch fom andehit trung hoà 30%: Lấy 50ml fomandehit 30% cho thêm
0 . 1 ml phenolphtalein trong etanol 1% và chỉnh bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện
màu vàng nhạt.
- Dung dịch tym olphtalein 0,1% trong etanol 90%.
- Dung dịch KOH 0,01 N trong etanol 90%.
- Cồn tu y ệt đối
- Dung dịch CuCl 2 amoniac 0,0025M

- Dung dịch phenolphtalein 1% trong etanol 60%.
4. D ụng cụ
Bình nón, buret, 2 pipet 10ml.
5. T iến h àn h
1. Cho vảo bình nón 20ml dung dịch chứa axit am in và 0,5ml dung dịch
phenolphtalein 1 %.
2. Để trung hoà dung dịch axit amin, cho từng giọt NaOH 0,1N đến khi xuất
hiện m àu vàng nhạt.
3. Cho thêm 20ml dung dịch fomandehit 30% đã trung hoà và lắc đều bình
nón. Sau 5 phút dung dịch m ất màu.
4. C huẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện m àu vàng n h ạt trở lại (pH =
9,0). Thí nghiệm kiểm tra cũng được tiến hành tương tự vối các hoá chất trên nhưng
thay dung dịch chứa axit am in bằng nước cất cùng th ể tích.
6. T ín h kết quả
lm l dung dịch NaOH 0,1N tương đương l,4m g nitơ. Sô” mg nitơ amin của dung
dịch nghiên cứu được tính theo công thức:
mgN = (A - B) X 1,4
Trong đó: A - Số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm,
B - Sô ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra.
Phương pháp chuẩn độ formol các axit am in trực tiếp và thuận lợi. Nó được sử
dụng để định lượng axit am in trong dung dịch nghiên cứu. Đồng thời cũng cần nhố
rằng phương pháp này không cho kết quả hoàn toàn chính xác giá trị nitơ amin, vì
nếu trong dung dịch có prolin, nó sẽ liên kết không bền vối fom andehit nên làm giảm
kết quả định lượng. Ngược lại nếu dung dịch nghiên cứu có từozin, nó lại làm tăng kết
quả định lượng vì nó có nhóm phenol. Phương pháp định lượng bằng chuẩn độ formol
73
không thể sử dụng vái mẫu có muôi amoni, vì formalin sẽ cho hexamin, đồng thời giải
phóng ra axit.
4N H 4CỈ + 6 HCHO ------- > N4 (CH 2 )r. + 6H20 + 4HC1

Nhóm cacboxyl của các axit amin lưỡng tính, các peptit lốn và protein có th ể được
xác định bằng kỹ th u ậ t chuẩn độ trong dung dịch nước - etanol không có formalin. Môi
trường nưốc - etanol gây cản trỏ sự phân ly nhóm amin, kết quả là nó trơ trong môi
trường nưóc, axit am i .11 trỏ thành axit, nhóm cacboxyl của axit amin có th ể được chuẩn
độ lại bằng kiềm. VỚI đặc tính cơ bản này. có thể định lượng axit am in bằng phương
pháp micro:
Lấy 2ml dung dịch chứa axit amin, cho thêm 2 giọt dung dịch tym olphtalein 0,1%
trong etanol 90% và chuẩn độ bâng KOH 0,0IN trong etanol 90% đến khi x u ất hiện
màu xanh. Sau đó cho thêm 10 thỏ tích cồn tuyệt đối vào 1 thể tích (lung dịch cần định
lượng axit amin. M àu dung dịch biên mất, chuẩn độ lại dung dịch cho đến m àu xanh.
Mầu để so sánh vối m àu chuẩn độ có thê sử dụng dung dịch amoniac CuCl2 0,0025M .
Phương phốp này đăc biệt dùng cho nghiên cứu quá trình động học enzim, biểu
diễn dưối ảnh hưởng tác động lên các enzim proteolitic protein và peptit.
II. ĐỊNH LƯỢNG AXIT AMIN BANG NINHIĐRIN
1. N guyên tốc
Dưới tác dụng của ninhiđrin, axit amin bị oxi hoá chuyên thành axit am in rồi đến
amoniac và cacbonic. Axit amin bị giảm bớt 1 nguyên tử cacbon, nó trở th à n h dọng
anđehit. Như vậy axiit amin có khôi lượng phân tử nhỏ hơn và amoniac tạo th àn h sẽ
oxi hoá ninhiđrin tạo nên phức hợp có màu xanh tím. cường độ màu tương ứng với giá
trị nitơ am in của axitt am in. Phản ứng của axit amin vói ninhiđrin là cơ sở để định
lượng các hợp chát theo phương pháp khí kê bằng cách tính số lượng CO <2 hoặc NHU,
bay ra, còn phương pháp so màu lại đo cường độ màu, nó phụ thuộc nồng độ phức hợp
của ninhiđrin vói NH :V
Phản ứng m àu niiihiđrin cũng xảy ra với axit amin mạch bên của pept.it vi
protein cũng như với muôi amoni, glucozamin và amoniac. Để định lượng chính xác
axit amin, dung dịch nghiên cứu phải không có hợp chất trên.
0 o
II
H c OM
I CS V H
R -C -C O O H + c —> R - CH + CO., + + H ,0
I / \ II / \
n h 2 c OH NH c OH
II
0 o
axit amin ninhiđrin ninhicừin khử
74
R - CH + H , 0 —> R - c f + NH J
11 H
NH n
o o
II II
c OH
\ /
/ \
c OH
II II
o o
o
II
c c
* ./
c —N = c + 3H 20 + NH 4
/ \
c c
II II
o o
Phức chất mầu
2. N guyên liệu
Dung dịch chứa axit am in có 3 - 5 |0.g nitơ trong lm l.
3. Hoá ch ất
- Dung dịch ninhiđrin: hoà ta n 2g ninhiđrin trong 50ml dung dịch etanol 50%.
- Dung dịch đệr* x itrat 0,4M; pH = 5
- Dung dịch etanol 50%
4. Máy móc và d ụ n g cụ
Bình định mức 10ml, 1 pipet lm l, 2 pipet 5ml, ông nghiệm 10ml, nồi ủ, máy so
màu.
5. T iế n h à n h
. Lấy 0,5ml clung dịch axit amin, cho thêm l,5m l dung dịch đệm x itrat 0,4M;
1
pH = 5 và 2ml dung dịch ninhiđrin.
2. Lắc đều Ống nghiệm và đặt vào nồi ủ nhiệt đun sôi 30 phút.
3. Cho thêm etanol 50% vào đến 10ml. Đo giá trị hấp thụ ở 570nm. Chĩnh
máy về không vối ông kiểm tra có đủ các hoá chất nhưng thay dung dịch axit amin
bằng nưỏc cất cùng thể tích. Giá trị hấp th ụ nh ận được tương ứng vói độ hấp thụ của
dung dịch chuẩn leuxin đã biết nồng độ (cường độ màu trong phản ứng ninhiđrin
tương ứng với cường độ màu của dung dịch chuẩn leuxin).
75
4. Đường chuẩn leuxin: lấy lm l của các dung dịch chuẩn leuxin có từ 1 - 5|ig
cho vào các ống nghiệm. Làm phản ứng vối các hoá chất trên và đo hấp thụ.
Phương pháp ninhiđrin rất. nhạy và chính xác, nó được sử dụng nhiều để định
lượng axit am in tách ra bằng phương pháp sắc ký giấy hoặc sắc ký cột. Nó cũng được
dùng để định lượng axit amin của các peptit và protein thuỷ phân bằng hoá học hoặc
enzim.
*Chú ý: Định lượng chính xác axit amm bằng phương pháp dùng ninhiđrin phụ
thuộc vào sự loại bỏ chất chứa NH 3 và các hoá chất sứ dụng cũng phải không có NH‘V
III. ĐỊNH LƯỢNG AXIT AMIN NHỜ TẠO THÀNH PHỨC CHAT VỚI ĐỎNG
(P hư ơ ng p h á p P o p e và S tevens)
1. Nguyên tắc
Để định lượng axit amin của dung dịch nghiên cứu cán cho thêm vào môi trường
bazơ yếu dung dịch đồng photphat dư trong dung dịch đệm borat. Muối đồng của axit
am in hoà tan tố t trong dung dịch. Đồng photphat dư được loại bỏ bằng cách lọc, sau đó
cho thêm CH 3 COOH và KI. Xác định lượng đồng bằng cách chuẩn đô vối dung dịch
Na 2 S 2 0 3 , iỏt được tách ra, phản ứng xảy ra như sau:
2Cu2+ + 41 ->2C uI + I 2
Xon I trong môi trường axit khử ion đồng của phức chất liên kết vối axit amin và
bị oxi hoá thành I2. Từ kêt quả của phương trình trên ta thấy 1 ion iôt khử 1 ion đồng
tạo nên sự liên kết của phức chất với 2 gôc axit amin. 1 ion iôt "nối" nhóm amin của
axit amin. lm l dung dịch Na2 S.j0.ị 0,0lN tương ứng vói 0,28mg nitơ amin.
2. N guyên liệu
Dung dịch chứa axit amin hoặc dung dịch protein thuỷ phân đã trung hoà chứa
0,5 T l,0mg nitơ am in trong lml.
3. Hoá chất
- Dung dịch đồng photphat mối pha. Một thể tích dung dịch A vổi 2 th ể tích dung
dịch B, cho thêm 2 thể tích dung dịch c .
Dung dịch A: hoà tan 35,4g CuC 1.2 2H20 hoặc 27,3g CuCly vào nước và dẫn
đến lOOOml.
Dung dịch B: Hoà tan 64,õg Na 2 HPO,t.12HvO cùng 7,2g NaOH vào 500ml
nước và dẫn đến 1 0 0 0 ml.
Dung dịch C: Dung dịch đệm borat: 57,21g borat (Na.,B4 P 7 .10H.,0) hoà tan
trong 1500ml nước, cho thêm 100ml HC1 IN và dẫn nưổc đến 2000ml.
76
- Dung dịch tymolphtalein: 0,25g tymolphtalein hoà ta n trong 100ml dung dịch
etanol 50%.
- Dung dịch N a 2 S 2 0 3 0,0IN (được pha loãng từ dung dịch gốc 0,1N đã được chỉnh
bởi KIO 3 ).
- Dung dịch NaOH 0,lN .
- Dung dịch tinh bột 1 % hoà tan trong NaCl bão hoà.
- CH;<COOH đặc.
- Tinh thể KI.
3. D ụng cụ và m áy m óc
Bình định mức 25ml, 2 pipet lm l, 1 pipet 5ml, 1 pipet 10ml, cốc thuỷ tinh.
4. Tiến h à n h
. Lấy 2ml dung dỊch chứa axit am in hoặc dung dịch protein thuỷ phân đã
1
trung hoà cho vào bình định mức 25ml, cho thêm 2 giọt tym olphtalein và từng giọt
NaOH IN đến khi xuất hiện màu xanh n hạt (pH khoảng 10).
2. Cho nưốc vào bình đến 25ml và lắc kỹ. Kết tủ a (đồng photphat dư) được li
tâm hoặc lọc qua giấy lọc.
3. Lây 5-10ml dịch li tâm (hoặc dịch lọc) cho vào cốc, cho thêm 0,5ml
CH.ịCOOH đặc và 0,2 - 0 ,5 'g KI, trộn đểu.
4. Chuẩn đô I 2 giải phóng bằng N a 2 S 2 0 3 0,01 N. G ần kết thúc chuẩn độ cho

thêm 2-4 giọt tinh bột 1% và tiếp tục chuẩn độ đến khi xuất hiện màu xanh.
Tướng tự, làm thí nghiệm kiểm tra vối cùng các hoá chất, nhưng thay dung
dịch chứa axit am in bằng nưốc cất cùng thể tích.
5. T ính k ế t q u ả
mgN = (A - B)x 0,28

Trong đó: A - Sô" ml N a 2 S 2 0 3 dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm,
B - Số ml N a 2 S 2 Os dùng để chuẩn độ bình kiểm tra,
0,28 - lm l N a 2 s 2 0 3 0,01N tương ứng 0,25mg nitơ.

*Chú ý: Khi sử dụng phương pháp này phải loại bỏ cẩn th ận đồng photphat dư
trong dung dịch nghiên cứu, vì nó sẽ làm tăng kết quả chuẩn độ. Ưu điểm của phương
pháp này là có thể định lượng nitơ am in của axit am in khi có 1 lượng nhỏ amoniac và
ngay cả 1 lượng lổn ure. Vì vậy có thể sử dụng phương pháp này để định lượng axit
am in trong nước tiểu.
77
IV. ĐỊNH LƯỢNG NITƠ BANG PHƯƠNG PH Á P KJELDAHL
1. N guyên tắ c
T ất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng sô Nitơ
có trong th àn h phần axit amin của protein là nitơ protein. Nitơ không có trong thành
phần protein như của các muối vô cơ, axit nitric, các axit amin tự do. các peptit, ure và
các dẫn xuất của ure, các ancaloỉt, các bazơ purin và pyrimiđin... là nitơ phi protein
v.v...
Nitd tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein
Trưổc tiên m ẫu được vô cơ hoá bằng H 2 S 0 4 đặc ỏ nhiệt độ cao và có chất XÚ2 tác.
Các phản ứng của quá trình vô cơ hoá xảy ra như sau:
2H 2 S 0 4 -» 2H20 + 2SOat + 0 2
Oxi tạo th àn h trong phản ứng lại oxi hoá các nguyên tô khác. Các phân tử chứa
nitơ dưổi tác dụng của H 2 S 0 4 tạo thành NHg. Ví dụ các protein bị thuỷ phân thành
axit amin, cacbon và hiđro của axit amin tạo thành CO«2 và H.ô, còn nitơ được giải
phóng dưổi dạng NH-}( kết hợp với H 2 S 0 4 dư tạo thành (NH 4 ) 2 S 0 4 tan trong dung dịch
2NH 3 + H 2 S 0 4 -> (NH 4 ) 2 S 0 4

Các nguyên to" p, K, Ca, Mg... chuyển thành dạng oxit: K2 0 , CaO, MgO...
Đuổi amoniac ra khỏi dung dịch bằng NaOH:
(NH 4 )2 S 0 4 + 2NaOH = N a 2 S 0 4 + H 20 + 2NHa
NH 3 bay ra cùng với nước sang bình hứng, bình hứng chứa H 3 BO3
2NH ịOH + 4H;ìBOa = (NH4)2B40 7 + 7H,;0
hoặc H 2 S 0 4, phản ứng xảy ra như sau:
2 NH 4 OH + H 2 S0 4 -> (NH 4 )2 S 0 4 + 2 H 2 0
2. Tiến h à n h
a) Vô cơ h o á n g u yên liệu
1. Cân lg mẫu tươi hoặc 0,1 - 0,3g mẫu khô đã được nghiền nho (dùng met ông
giấy cân cuộn tròn). Cho cẩn thận vào đáy bình Kjeldahl dung tích 50ml.
2. Cho thêm 5 - 10ml H 2 S 0 4 đặc (d=l,84). Nếu mẫu là bột khô, trước khi cho thêm
axit cần cho vài giọt nưóc cất không có nitơ đê thấm ưỏt bột. Nếu mẫu lỏng nhi) rntóc
mắm, xì dầu,... dùng pipet lấy 2 ■ õml, còn nưốc quả hộp lấy 1 0 - 20ml. Khi ch( mẫu
vào bình, không được để mẩu dính bám cổ bình.
78
3. Đậy bằng nút lổng thuỷ tinh quả hồng hoặc nút thuỷ tinh lọ nhỏ giọt. Lắc
nhẹ bình rồi đặt lên bếp cách cát đun nhẹ khoảng 30 - 40 phút, sau đó nhấc bình ra,
đê nguội.
4. Cho vài giọt xur tác axit percloric (hoặc HC10., hoặc H:,c> 2 30%, chỉ cho ở giai
đoạn cuối dung dịch đã có màu vàng sẫm) hoặc hỗn hợp K^SO.J và C u S 0 4 vối tỉ lệ 3:1,
cho một lần ngay từ đầu (lượng hỗn hợp chất xúc tác bằng lượng m ẩu tưdi dùng để vô
cơ hoá), tiếp tục đốt trên bếp khoảng 30 phút nữa. Dung dịch sẽ chuyên từ màu đen
sang màu cánh dán. Nhắc bình ra khỏi bếp, để nguội.
5. Cho them chất xúc tác lần thứ hai (vài giọt axit percloric), tiêp tục đôt cho đên
khi dung dịch trong bình không màu. Đê nguội.
6 . Chuyến dung dịch sang bình định mức 50 hoặc 100ml, tráng bình Kjeldahl vài
lần bằng nưổc cất không có nitơ và dẫn đên thê tích định mức bằng nưốc cất không có
nitơ.
b ) S ử d ụ n g H 'ị B O .ị ở b ìn h h ử n g
• Hoá chất:
- H 2 SO,| đặc
- Dung dịch H 2 S 0 4 0,1N

- Dung dịch NaOH đặc
- Dung clỊch NaOH 40%
- Dung dịch HClO't hoặc H 2 0 2 30% hoặc K 2 S 0 4, CuSO.ị (100:10:1), có thể
dùng selen kim loại 0,05g) hoặc hỗn hợp K 2 S 0 4 : C uS0 4 (3:1).
- Dung dịch H.jBO.j 3%.
- Thuốc thử hỗn hợp: metyl đỏ 0 , 1 % trong rượu etylic và metylen xanh 0,1%
trong etylic, tỉ lệ 2 : 1 .
- Chi thị Tashiro:
Hỗn hợp metyl đỏ và metylen xanh có giối hạn biến đối màu ở pH 5,2-5,6 . Môi
trường axit có màu tím đỏ, môi trường kiểm có màu xanh lục. Hoà 0,05g metvlen xanh
vào õml nưỏc, cho vào đấy 100ml etanol và hoà thêm 0,15g metyl đỏ. Hoà ta n và cho
vào lọ màu đậy kín.
• Tiến hành:
. Rửa bộ chưng cất Kjeldahl kỹ bằng nưốc cất không có nitơ. Lấy 10 • 20ml
1
(tuỳ theo hàm lượng nitơ có trong mẫu) đã vô cơ hoá cho vào bình phản ứng (c) qua
phều (e).
2. Cho một vài giọt thuốc thử hỗn hợp vào bình phản ứng nếu dùng xúc tác
bằng axit HCIO.^ hoặc H9 O 2 .
79
3. Cho vào bình hứng 20ml clung dịch H^BO-Ị 3%, thêm vài giọt chỉ thị
Tashiro.
4. Đun sôi nước trong bình đốt (a) đồng thời cho nước từ vòi qua ông làm lạnh (d).
5. Cho qua phễu (e) vào bình phản ứng (c) 30ml NaOH 40%.
. Mở khoá cho kiềm chảy vào bình đến khi dung dịch trong bình phản ứng
6
đối m àu thì đóng khoá lại.
7. Đun bình đốt, NH.J được bay lên cùng vối nước qua ống làm lạnh sang bình
hứng và tác dụng với H^BO.Ị tạo thành muôi amon tetraborat [(NH/))2 B4 0 7]. Quá
trìn h cất được tiến hành 30 - 40 phút. Kiểm tra NHg đã hết chưa bằng cách hạ thấp
bình hứng và thử bằng mẩu giấy đo pH vào đầu ống làm lạnh. Khi NH.( đã được cất
hoàn toàn, hạ bình hứng xuống, dùng tia nước cất nhỏ tráng sạch axit dính đầu ông
làm lạnh.
. Định lượng amon tetraborat[(NH 4 )2 B4 0 7] tạo thành bằng dung dịch H 2 S 0 4
8
0, IN cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt, phản ứng xảy ra như sau:
(NH4)2B,í0 7 + H2S 0 4 + 5H20 -» (NH4)2S 0 4 + 4 H 3 BO3
• Tính kết quả:
Hàm lượng nitơ tổng số có trong mẫu:
Nmg% = — “. M 2 1 100
w
Trong đó: V- số ml H 2 S 0 4 0 ,1 N chuẩn độ,
1,42 - số’mg nitơ ứng vói lm l H.,S0 4 0,lN ,

100 - hê số chuyển thành %,
w - khôi lượng mẫu tính bằng mg.
c) Sử d ụ n g H2S 0 4 ở bình hứng
• Hoá chất
- H 2 S 0 4 đặc
- Dung dịch H.,S0,J (hoặc HC1) 0,1N (chính xác)

- Dung dịch NaOH 30% - 40%
- Dung dịch NaOH 0, IN.
- Thuốc thử hỗn hợp: metyl đỏ 0.1% trong rượu etylic và metyl xanh 0,1%
trong rượu etylic, tỉ lệ 2 : 1 .
- C hất xúc tác ( như trên)
80
Bép đốt Kjeldahl lớn
Bộ cất Kjeldahl lớn
Hình 7.1 - Bộ chưng cất Kjeldahl định lượng nitơ

a - bình đốt e - phễu
b - bình rửa f - bình hứng
c - bình phản ứng g - đèn đốt
d - ông làm lạnh
81
-Thuôc thử Nessler: phát hiện sự có m ặt nitd trong dung dịch. Cách pha chê:
+ Cách 1 : 15g Hgl.,; lOg KI hoà vào lõm l nước cất, thêm 80ml dung dịch
NaOH 50%, dan thể tích đến 500ml bằng nước cất (không có nitơ và
cacbonic).
+ Cách 2: - 35g KI hoà tan trong 100ml nưỏc cất nóng
- 17g HgCl2 hoà tan trong 300ml nước cất

- NaOH hoặc KOH 20%
Đồ dung dịch HgClr, vào dung dịch KI đến khi kết tủa đỏ của H gỈ 2 tạo
thành không thấy tan nữa thì dừng lại. Sau đó dùng (lung dịch kiềm 20%
dẩn đến 1 lít. Lại thêm õml dung dịch HgCL, đến khi có kết tủa đỏ xuất
hiện. Đẽ dung dịch lang đến khi hoàn toàn trong. Bảo quản trong lọ màu,
đậy bang n út cao su.
• Tiên hành:
Quá trìn h định lượng được tiến hành như trên nhưng ở bình hứng cho một
lượng H.;S0 4 0 ,IN (sao cho ngập đầu ỏng làm lạnh) và vài giọt thuốc thử hỗn hợp.
Theo dõi bình hứng, nêu thấy dung dịch biên đôi từ màu vàng sang màu lá mạ thi cho
thêm 5m] HrjSO I 0,1N nữa vào bình hứng, cần làm nhanh đê tránh mất nitơ.
Đun sôi khoảng 30 phút, quan sát cột nước ỏ đầu ông làm lạnh không chuyển
từ mầu hồng sang xanh là được. Mucin chắc chắn, lây nước đầu ông làm lạnh thử vổi
thuốc thử Nessler, lấy bình hứng ra và chuẩn cỉộ axit dư bằng kiềm 0 J N.
• Tính kết quả:
Hàm lượng nitơ có trong mẫu được tính theo công thức:
(Vì - v2) X 1,42 X f V 1 0 0
Nmg%
w
Trong đó: V ị - sô ml H.^SOị 0,1N cho vào bình hứng,
v «2 - sô ml NaOH dùng đê chuẩn độ axit (lư trong bình hứng,
f ■ hệ sô điểu chỉnh nồng độ H.,SO ị ờ bình hứng. f = 1 khi nồng độ

H.>SO,ị chính xác 0,1N,
w - khôi lượng mấu dùng đê vô cơ hoá mẫu ửng với thể tích cỉung
dịch mẫu lấv đê định lượng ni tớ tương ứng voi ì ml HySO ị,
I,42 - sô mg nitơ.
* Chú ỷ:
- Quá trình vô cớ hoá mẫu trong bình Kjeldahl giai phóng khi so., nen phíii tiên
hành trong tủ hôt.
S2
- Thời gian dốt màu kéo dài 3 - 4 giò phụ thuộc vào lượng mau. nguồn nhiệt và
chất xúc tác. Nếu dùng C uS0 4 vối lượng lớn (1 - 2g) thì thời gian vôcơhoá mẫu
khoảng 2 - 3.5 giờ. Khi dùng H 2 0., (4 - 5ml) m ất 40 - 50 phút. Dùng selen (0,1 g/lg
mẫu thực vật) thòi gian khoảng 30 - 40 phút. Dùng hỗn hợp xúc tác K.,SOẺị: C uS 04: Se
(100:10:1) vói ti lệ 4 g/lg mảu. thời gian khoảng 50 - 60 phút.
d) B á o cá o th í n g h iê m
1 . Viết phản ứng xảy ra ỏ bình phản ứng và bình hứng.

2. Xác định hàm lượng nitơ tống sô"ỏ một mầu thí nghiệm.
V. ĐỊNH LƯỢNG PR O T E IN BANG PHƯƠNG PH Á P LOWRY
1. N guyên tắ c
Có thê tính hàm lượng protein của mẩu nghiên cứu dựa vào dường chuẩn của
protein và dựa vào phản ứng màu của protein vối thuốc thử Folin. Cường độ màu của
dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ protein.
2. Hoá ch â t
- Dung dịch protein chuẩn có 10 - 100 ịxg protein trong lml.
- Protein được hoà tan trong dung dịch NaCl 0,9% vối lượng protein trong lm l có
10, 20, 30, 40, 80, 100 |.ig protein. Dung dịch chuẩn thường dùng tinh thể album in
huyết thanh bò (BSA - bovine serum albumin).
- Dung dịch A: Dung dịch Na 2 CO< 2% trong NaOH 0,1N
- Dung địch BI va B2:
+ B l - Dung dịch CuSO.j 1 %
+ B2 - Dung dịch muôi Seignett 2% (Kali natri tactarat).
- Dung địch C: Hỗn hợp 0,5ml dung dịch B l, 0,5ml dung dịch B2 và 50ml dung
dịch A (dung dịch c chuan bị trưốc khi dùng 30 phút).
- Dung dịch D: Dung dịch Folin có nồng độ IN.
Cách pha dung dịch Folin: Cho vào bình cầu đáy tròn n út nhám 700ml
nước cất, lOOg natriw onfram at (NaW 0^.2H 2 0 ) và 25g natri molypđat
(NaMoO j.211^0). Thêm 50ml axit photphoric (H.^PO^) 85% và 100ml HC1 đậm
đặc. Đun sôi hỗn hợp trong bình cầu đáy tròn dung tích 2 lít cóống làm lạnh
hồi lưu trong 10 giờ. Sau đó cho thêm 150g liti sunfat (Li.(, S 0 (1 .H 2 0), 50ml
nước cất và 5 giọt brom. Tiêp tục đun sôi 15 phút không có ỏng làm lạnh hồi
lưu đế đuổi lượng brom thừa. Dung dịch phải có màu vàng. Nếu dung dịch có
màu xanh thì phái xử lv với brom lần thứ 2 sau khi làm nguội dung dịch.
83
thêm nưốc cât đến 1 lít (bình định mức). Xác định nồng độ thuỗc thử Folin
bằng cách chuẩn độ vối dung dịch NaOH IN có chỉ thị phenolphtalein. Dung
dịch gốc có nồng độ IN (để chuẩn độ chính xác thường pha loãng dung dịch
gốc 1 0 lần và chuẩn vối dung dịch NaOH IN).
Bảo quản dung địch Folin trong lọ thuỷ tinh màu. cất giữ ỏ nơi lạnh. Sau 2 - 3
tháng dung dịch chuyển m àu xanh lại thêm vài giọt brom và đun sôi 15 phút, dung
dịch lại có màu vàng trở lại. Trưốc khi dùng phải pha loãng thuốc thủ bằng nước cất
đến nồng độ 0,5N.
3. D ụng cụ
Bình định mức 25ml, pipet 5ml và 0,5ml, ống nghiệm.
4. T iến h à n h
Lấy lm l dung dịch protein nghiên cứu cho vào ống nghiệm, cho thêm õml dung
dịch c. Lắc đều, để ở nhiệt độ phòng 10 phút. Tiếp tục cho thêm 0,5ml dung dịch D,
lắc, để 30 phút và đo trên máy so màu ở bưổc sóng 750nm. Đồng thòi làm ống kiểm
tra vối hoá chất như ông nghiệm chuẩn nhưng thay dung dịch protein bằng nước.
Nồng độ protein nghiên cứu được tính theo lượng protein ơ đồ thị chuẩn.
5. B áo c á o th í n g h iệ m
1 - Lập đồ thị chuẩn protein.

2- Định lượng một mẫu protein dựa vào đồ thị chuẩn protein.
VI. ĐỊNH LƯỢNG PR O T E IN T ổN G s ố , ALBUM IN VÀ GLOBULIN TRONG

HUYẾT THANH MÁU BANG PHƯƠNG PH Á P B IU RE
1 . N guyên tắc
Protein của huyết thanh phản ứng vối thuốc thử biure cho màu xanh. Cường độ
màu tương ứng với nồng độ protein của dung dịch chuẩn. Khi sử dụng dung dịch
Na.pSOị 27% sẽ kết tủ a globulin. Vì vậy nồng độ globulin là hiệu sô giữa hàm lượng
protein tông sỏ và albumin.
Thuốc thử biure phản ứng với liên kết peptit (- C O -N H -) trong chuỗi polipeptit.
Phương pháp này cho kết quả khi định lượng protein.
2 . Hoá chất
- Dung dịch NaCl 0,9%

- Dung dịch N a^so^ 27% được điều chỉnh pH đến 6.2 - 6,4 bằng dung dịch NaOH
hoặc H 2 S 0 4. Thuốc thử cất giữ trong bóng tôi.
84
- Dung dịch biure: Can l,5g CuS0.ị.õH20 và 6 g muối Seignet. cho vào bình định
mức 1 lít, cho thêm 300ml dung dịch NaOH 30%, 2g KI và dẫn nước đến vạch ngấn.
Dung dịch giữ trong lọ sầm màu, đậy bằng n ú t cao su.
3. D ụ n g cụ
1 pipet lm Ị 2 pipet 2ml, 3 pipet 10ml, 12 ông nghiệm, phều lọc, bình định mức
50ml. máy so màu, tủ ấm.
Cho vào ông nghiệm 0,5ml huyết thanh và 0,9ml dung dịch N a 2 S 0 4 27%, lắc đều,
đặt 30 phút trong tủ ấm 37nc. Lắc đều lây 2ml clung dịch cho vào ổng nghiệm ghi chữ
T (protein tổng số). Phan còn lại lọc qua phễu lọc (trong tủ ấm), lấy 2nìl dịch lọc cho
vào ông nghiệm ghi chữ A (albumin). Òng nghiệm thử 3 ghi chữ K (ông kiếm tra) cho
2ml dung dịch N a.,so 27%. Tất cả 3 ông nghiệm đểu cho thêm 8 ml dung dịch biure,
..ị
lắc đểu. sau 30 phút xác định độ hấp thụ ỏ 530nm so với ống kiêm tra. Hàm lượng
protein trong huyết thanh nghiên cứu được xác định so với đường chuẩn hoặc tính qua
hệ sô".
5. Dựng dường chuẩn
5ml huyết thanh được định lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl dẩn đến
50ml trong bình định mức bằng dung dịch NaCl 0,9%. Cho vào các ông nghiệm lần
lượt dung dịch huyết thanh đã pha loãng: 0,4; 0 ,G; 0 ,8 ; 1,0 và l,5ml. Dẫn thể tích
trong các ống nghiệm đến 2ml bằng dung dịch NaCl 0,9%. Cho thêm vào mỗi ông 8 ml
dung dịch biure và xác định độ hấp thụ sau 30 phút phản ứng so với ống kiểm tra.
Đường chuẩn phụ thuộc vào độ hấp thụ từ hàm lượng phần trăm protein nhận được
trong ỏng th í nghiệm chứa l, 0 ml dung dịch huyết thanh pha loăng (0 , 1 ml không pha
loãng) tương ứng với nống độ protein biểu thị bằng % của phương pháp xác định bằng
Kjeldahl. Phương pháp biure không tính được theo định luật Lambert-Beer (đên nồng
độ protein 1 0 %) mà có thể thay bằng cách tính hệ sô tương quan, hệ sô này nằm trong
giá trị % protein được chia ra bởi phương pháp xác định bằng Kjeldahl qua giá trị hấp
thụ (A) cho dung dịch chuẩn của thí nghiệm này.
Ví dụ: Nồng độ protein trong huyết thanh được xáo định bằng phương pháp
Kjeldahl là 7%, giá trị A cho ông thí nghiệm lm l dung dịch huyết thanh pha loãng (7%
protein) = 0,223. Vậy A cho ống thí nghiệm có 0,6ml huyết thanh pha loãng (4,2%
protein) = 0,134.
Hệ số = —— - 31,39 hoặc = 31,40

0,223 ' 0,134
Vậy % protein = A,,„hl(:ứll Xhệ số
85
VII. ĐỊNH LƯỢNG PR O T E IN BĂNG COOMASIE BRILLIA N T BLUE G-250
1 . N g u y ên tắ c
Phương pháp này dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi Coomassie B rilliant Blue
G-250 liên kết với protein trong dung dịch axit, dạng proton hoá của thuốc nhuộm
Coomassie Blue có màu da cam đỏ. Thuốíc nhuộm liên kêt chặt chẽ vổi các protein,
tương tác với cả nhóm kỵ nưốc và các nhóm mang điện tích dương trên phân tứ
protein. Trong môi trường của các gốc mang điện tích dương, sự proton hoá không xảy
ra và có m àu xanh xuất hiện.
Dạng không proton hoá của Coomasie Blue G-250 (C4 7 H/|8 N ^0 7 S 2 Na, khôi lượng
phân tử 854).
2. P h ư ơ n g p h á p H a rris và B a sh fo rd
a) H oá chất
. Hoà ta n lOOmg (õOmg) Serva Blue G trong 50ml (25ml) etanol 100%. Pha
1
loăng dung dịch đến 500ml với nước cất (Serva Blue G dề tan trong etanol, những
thuôc nhuộm khác có thể phải lọc trước khi dùng).
Nồng độ thuốc nhuộm trong dung dịch gốc mỏi pha được điều chỉnh với etanol
1 0 % (v/v) để có OD r>r>0 - 1,18 trong hồn họp (a) + (b) ỏ sau, điều này đảm bao sự thống
n h ất giữa các lần pha thuốc nhuộm.
2. Axit photphoric 17% (axit photphoric 85% được pha loãng 1 : 5). Axit
percloric 0,3M có th ể thay thê axit photphoric 17% nhưng trán h dùng ỏ phướng pháp
này vì những đặc tính oxi hoá của nó.
Dung dịch ( 1 ) và (2) được pha trộn theo tỷ lệ 1:1 tạo thành thuốc thử màu
dùng trong ngày (dung dịch thuốc nhuộm có sẵn của hàng hoá chất Biorad và Pierce
Chemicals). Dung dịch (1) và (2) bền vững trong vài tháng ở nhiệt độ phòng.
86
b ) Tiếtỉ hiìrih
Phương pháp này chỉ có thè dùng cho protein tan trong nước.
C huẩn bị 0,2ml mẫu (2-20f.ig protein) trong nưốc (hoặc đệm). Thêm 2,3ml thuôc
thử m àu (dung dịch thuôc nhuộm axit). Trộn đểu và đọc ngay ở OD.-9 5 . Màu bển vững
trong khoảng 30 phút, sau đó kết tủa của phức hộp protein với thuốc nhuộm có thế
xảy ra. ÕỊ-Ig protein có OD 5 9 5 * 0 , 1 .
Các cuvet hoặc các ông nghiệm phàn ứng thưòng có màu xám clo phức chất thuôc
nhuộm - protein dính vào thành, vì vậy cần phải rửa màu thuôc nhuộm sau khi thí
nghiệm bằng HC1 đặc hoặc metanol (CHjOH).
Phương pháp phân tích này nhạy hơn 2-3 lần so vỏi phường pháp Lowry,
n hanh và đon giản hơn nhiêu, đồng thời làm giảm ảnh hưởng của đệm, muôi, các
ch ất khử... Tuy nhiên những chất kiểm m ạnh có thế gây sai lệch do làm tăng mật
độ quang.
c) P h ư ơ n g p h á p c ả i tiên
Đôi với protein không tan, vối sự có m ật các chất tẩy rửa anion (sodium dodecyl
sunphat - SDSjC^H-Ô ịNa), phương pháp này không thực hiện được. Tuy nhiên, mảu
có thề được hoà tan trong Triton X - 100 (0,2%), chất này không gây ảnh hương.
Đôi với các dung dịch protein rấ t loăng, thể tích mẫu trong thí nghiệm phân tích
này có thê tăng lên đến 50% hoặc nhiều hơn nữa so với dung dịch thuốc nhuộm gốc.
Trong trường hợp này, clung dịch thuốc nhuộm gốc phải tăng nồng độ sao cho nồng độ
cuối cùng trong phân tích là 0,01% thuốc nhuộm, 0,8M (5% v/v) etanol' 1 ,6 M (9% v/v
uxit photphoric).
* Chú ý: M ẫu không được pha đệm đậm đặc hoặc phải hạn chê quá trình proton
hoá. Màu xanh sẻ xuất hiện khi không có protein.
d ) Đ ịn h lư ơ n g p r o te in q u a đ ư ờ n g c h u ẩ n
■Quy trinh vi p h â n tích (l-20f.tg protein):

C huẩn bị một sô" dung dịch protein chuẩn có nồng độ từ l-20(ig/ml. Tiến hành vè
đường chuẩn như sau: cho Q,8 ml dung dịch protein chuẩn có nồng độ khác nhau được
pha loảng tưởng ứng vào các ông nghiệm khô và sạch, ổng nghiệm đối chứng thay
bang 0,8ml dung dịch đệm. Cho thêm 0,2ml thuốc nhuộm vào các ổng nghiệm. Trộn
đều (tránh tạo bọt) hoặc lộn ngược vài lần. Sau khoảng 5 phút đến 1 giờ, đọc ODr)(|f) so
vối ỏng đôi chửng. Vẽ đường chuẩn vổi OD 5 9 5 của các nồng độ protein chuẩn khác
nhau. Tính hàm lượng protein của mẫu qua đường chuẩn. Hiệu chinh OD ^ 5 với
mẫu trắng.
87
0,<;
0,5
* 0 .‘l .
Ể
{—
>
5 0.3.
0,2 Ị
0 ,1
2 ỉ 6 8 ĩo“ 12 14 1618*20
Protein
Hình 7.2 - Đưòng chuẩn protein (1-20iig)
(S ử dụng protein chuân của hàng Bio-Racỉ)
- Quy trình phân tích chuân (20-14fìịigprotein):
C huẩn bị một số dung dịch protein chuẩn có nồng độ từ 20 - 140fig. Đường chuan
cho mỗi lần nghiên cửu được tiến hành như sau:
Cho 0,1ml dung dịch protein đả được pha loãng tương ứng vào các ông nghiệm
sạch, khô. Cho 0,1 ml dung dịch cìệm vào ông nghiêm đôi chứng. Cho thêm 5ml thuốc
nhuộm pha loăng. Trộn đểu (tránh tạo bọt) hoặc lộn ngược ông nghiệm vài lần. Sau 5
phút hoặc 1 giò đo ở ODggr, so với đôi chứng. Vè đường chuẩn ỏ OD 5 9 5 của các nồng clộ
khác nhau của chất chuẩn. Đọc thông sô" protein nghiên cứu từ đường chuẩn. Hiệu
chỉnh ODf)9fì vối m ảu trắng.
3. Phương pháp Sedm ak và G ronberg - quy trình chuẩn

1,0
0.8 Ị
I
0.(5*
0,4 -
0.2
20 10 00 80 100 120 140

Protein ( I-Ip)
Hình 7.3 - Đường chuẩn protein (20-140ng)

(Sử dụng protein chuăn của hảng Bio-Rad)
88
- Dung dịch thuốc thử (1) Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBBG - 250) 0,06%,
cân 60mg CBBG - 250 pha trong 100ml axit percloric 3% (w/v; 0,3M) hay axit clohiđric
2,2% (w/v; 0,6N). Lọc qua giấy lọc W hatm an N°l. Dung dịch được bảo quản lâu dài ở
nhiệt (tộ phòng.
- Dung dịch m ẫu (2): protein đệm được pha loãng trong nưốc không có nitơ.
Thí nghiệm mẫu: lấy 0,5ml dung dịch thuốc thử (1), thêm 0,5ml dung dịch mẫu
(2). Trộn đều và đọc sau 2 phút ỏ bước sóng 620nm.
Thí nghiệm đôi chứng: dùng dung dịch NaCl 0,15M thay cho dung dịch mẫu.
4. Phương pháp Bradford
Thuốc nhuộm: dung dịch Coomassie B rilliant Blue G-250 (CBB G-250) 0,01%:
lOOmg CBB G-250, 50ml etanol 95% (4,7%; w/v), 100ml H^PO,j 85% (8,5%), dẫn nưốc
đến 1 lít.
• Quy trinh p hâ n tích:
1. Dung dịch protein chuẩn: 10 - 100|i.g protein/ml dung dịch NaCl 0,15M.
2. Ông th í nghiệm: 0,1 nil dung dịch protein, thêm 5ml dung dịch thuốc nhuộm
protein, trộn đểu.
3. Ống đổi chứng: 0,1ml dung dịch NaCl 0,15M, thêm 5ml dung dịch thuốc
nhuộm protein, trộn đều.
4. Đọc quang phổ ở bưốc sóng 595nm sau 2 phút đến 1 giò (cuvet 3cm).
- Quy trinh ưi ph â n tích:
1 . Dung dịch protein chuẩn: 1,0 - 10,0|ag/ml dung dịch NaCl 0,15M.
2 . Ông thí nghiệm: 0 ,1 ml dung dịch protein, thêm lm l dung dịch thuốc nhuộm
protein trộn đều.
3. Ống đối chứng: 0,1 ml dung dịch NaCl 0,15M, thêm Im l dung dịch thuốc
nhuộm protein, trộn đều.
4. Đọc quang phổ ở bưốc sóng 595nm sau 2 phút đến 1 giờ (cuvet lcm)
Rửa ch ất màu: ống nghiệm và cuvet được loại bỏ chất màu bằng axeton, sau
đó rửa hoặc ngâm trong dung dịch HC1 0,1M.
VIII. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BANG PHƯƠNG PHÁP QUANG P H ổ
1. N guyên tắ c
- P hát hiện và đo protein: phương pháp đơn giản n h ất để đo nồng độ protein trong
dung dịch là độ hấp th ụ tia cực tím của nó. Nêu protein tinh sạch thì nồng độ tuyệt đối
cúa nó được tính theo giá trị đo được. Nếu protein không tinh sạch (ví dụ, dịch chiết từ
89
sắc ký) thì nồng độ của protein tông sô' được tính tương đối từ độ hấp thụ. Phương
pháp này không dùng được cho các dung dịch có nồng độ protein thấp (dưói 0 .0 Õ -
0 ,lmg/ml) hoặc khi có m ặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng một vùng cực tím (ví dụ.
đệm, axit nucleic và một sô chất béo), hoặc khi protein ỏ trong dịch huyền phù chứ
không phải trong dung dịch (ví dụ trong màng hoặc các phức hợp có khôi lưdng phân
tử lốn). So vói phương pháp so màu thì phương pháp này đơn giản hớn. nhạy hơn, mẫu
dùng lại thường ổn định hoá phần lốn protein.
- S ự hấp thụ tia cực tím: Các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước sóng
280nm do các axit am in tryptophan, tyrozin và một phần là phenylalanin. Đồng thòi
chúng cũng hấp th ụ d bưốc sóng thấp hơn (2l5-230nm) bởi chuỗi polipeptit. Độ hấp
thụ ở 280nm thay đổi tuỳ loại protein nhưng hệ sô tắ t đo được (nghĩa là độ hấp thụ
của dung dịch protein 1% vối đường sóng truyền qua lcm) cho mỗi protein (bảng 7.1)
cho phép tính nồng độ của protein tin h sạch. Độ hấp th ụ ờ bước sóng thấp hơn có quan
hệ trực tiếp với khối lượng của polipeptit và thường được coi là nhạy hơn ở 280nm. Tuy
nhiên, rấ t nhiều loại đệm và phân tử khác cũng hấp thụ ở những bước sóng thấp hơn
(đệm photphat và tris có thể dùng được, nhưng chất bảo (Ịuản natri azit (NaN;í) hấp
thụ rấ t mạnh). Độ hấp thụ ở 215 hoặc 230nm phù hợp cho việc peptit không có
tryptophan hoặc tyrozin.
Bảng 7.1 • Hệ số tắt của các loại protein liên quan hoá miền dịch.
Các giá trị trung bình dối với E2 8 0 1 /c {nghĩa là s ự hấp thụ của 10mg/ml dung dịch Ở280nm)
của các loại protein khác nhau
IgG 13,6 Chuỗi Y 13,7 Concanavalin A 120
IgM 11,8 Chuỗi ỊX 13,9 Lectin Lens 12,5

calinaris
IgA 13,2 Chuỗi a 12,3 BSA 6,7
IgD 17,0 Chuỗi nhẹ 12,3
IgE 15,3 Chuỗi J
2. N guyên liệu và th iế t bị
- Dung dịch protein để đo.

- Đệm hoà tan protein.
- Máy quang phố u v có cuvet thạch anh đường sáng truyền qua lcm.
3. T iến h à n h
1. Li tâm mẫu (nếu thấy cần thiết) để loại bỏ các phân tử hoặc phức hợp khác
có trong thể huyền phù.
2. Đ ặt bước sóng 280nm ở máy quang phổ và điều chỉnh độ hấp thụ về không
vối cuvet chứa đệm.
3. Đọc độ hấp thụ của mẩu hoặc trong cùng một cuvet hoặc cuvet khác cùng
cặp. Nếu giá trị thu được > 2,0 thì pha loãng mẫu (1/5 hoặc 1/10) hoặc đường sáng
truyền ngắn hơn (2mm) cho đến khi số đọc nằm trong khoảng 0,1 - 1,5.
4. Lặp lại bước 2 và 3 ỏ 360nm.
õ. Tính tỷ sô độ hấp thụ 260: 280nm. Tỷ sô này nên nhỏ hơn 0,6. Nêu tỷ sô cao
hôn cho hiết protein khòng sạch, có lẩn các chất khác đặc biệt với axit nucleic.
XT* 5 _ độ hấp thụ ỏ 280nm _ ..
Nồng độ m ẫu = — —— — x 10m g/l
hệ sô tắt ở 280nm
Vói một hỗn hợp các protein hoặc vối b ất cứ một loại protein nào mà không biết hệ
sô" tắ t thì tính như sau:
Nồng độ protein = 1,55 Xđộ hấp thụ ở 280nm - 0,77 Xđộ hấp thụ ở 260nm
91
Chương 8
ĐỊNH
• LUƠNG
é
AXIT n u c l e i c
Phương pháp hoá học định lượng axit nucleic dựa vào sự định lượng thành phần
cấu tạo của axit nucleic như axit photphoric, riboza, deoxyriboza và các bazơ nitd.
Nhiều tác giả đã đưa ra phương pháp dựa vào sự phân tích hợp chất photpho của
axit nucleic. Phương pháp thông dụng để phân tích hợp chất photpho của các mô và tê
bào động vật là của Schimidt và T hannhauser (1945), Schimicìt (1945). c ả hai phương
pháp này hiện nay vẫn thông dụng. Còn đế định lượng axit nucleic trong nguyên liệu
thực vật dựa vào phương pháp Ogur và Rosen (1970).
Các phương pháp này dựa vào khả năng tách chiết các hợp chất axit hoà tan và
không hoà tan. Các hợp chất hoà tan chứa axit photphoric được tính theo các phần tử
nhỏ mà nó liên kết, ví dụ: nucleotit, este của hexoza và triozophotphat, axetyl
photphat... Các hợp chất không hoà tan chứa axit photphoric như photpholipit, axit
nucleic, photphoprot.em...
I. PHƯƠNG P H Á P SCHIM IDT VÀ THANNHAUSER
1. N guyên tắ c
Tiến hành tách ARN khỏi ADN và phần lớn protein của mô sau khi thuỷ phân
mẫu ti'ong NaOH IN. Trong điều kiện này ARN phân giải thành các nucleotit, ADN
còn lại không bị thuỷ phân, c ả hai loại axit nucleic (ARN và ADN) được xác định bằng
hàm lượng photpho.
2. Hoả chất
- Dung dịch CCI3 COOH 5-10%

- Dung dịch NaOH IN hoặc KOH IN
- Etanol 80%
- Hỗn hợp etanol - cloroform (3:1)
- Hỗn hợp etanol - ete (1:1)
- Dung dịch HC1 6 N
92
Quá trìn h xác định ADN theo các bưốc được giối thiệu ở bảng 9.1. Theo phương
pháp Schimidt và Tharm hauser, ARN tách khỏi ADN và phần lớn protein mô được
thuy phản bằng NaOH IN ở 37°c trong một đêm. Trong điểu kiện này ARN thuỷ
phân th àn h các nucleotit, ngược lại ADN tồn tại ở dạng không hoà tan. Axit hoá dung
dịch thuỷ phân kiềm (III) bằng HC1 6 N và CClgCOOH cho phép tách kêt tủa ADN và
protein (VI). ARN tồn tại ở dạng các nucleotit hoà ta n (IV). Xác định các loại axit
nucleic theo hàm lượng photpho ỏ phần IV và VI theo phương pháp xác định photpho
của Horecker và cộng sự (1940) có sửa đổi từ phương pháp Fiski và Subbarow (1925).
Nếu giá trị của photpho vô cơ rấ t nhỏ, giá trị nguồn photpho từ photphoprotein ở
phần IV có thể được dùng để tính cho hàm lượng ARN. Để xác định giá trị chính xác
của ARN có th ể xác định đồng thời photpho vô cơ được tách ra ớ phần IV. Hàm lượng
photpho của ARN được tính từ hiệu giá trị photpho ở phẩn IV và V. Điều quan trọng
là ở các mô giàu photpho, axit không hoà ta n có nguồn gốc không phải axit nucleic, ví
dụ mô gan, mô não (cả chất trắng cũng như chất xám). Một phần hợp chất photpho vô
cở được tách khỏi khi sử dụng phương pháp Delory (1938).
Phương pháp Schmidt và T hannhauser đã được cải tiến đế có độ chính xác cao
hơn, ví dụ khi phân tích ADN có cho thêm 1 % dung dịch album in để làm kết tủ a dễ
dàng. Phương pháp quang phô kê xác định axit nucleic cũng thường được sử dụng
phướng pháp T hannhauser và Tsanev (1960). Phương pháp Schmidt và Thannhauser
có thể xác định được số lượng nucleotit khi được tách bằng sắc ký điện di. Phương
pháp xác định axit nucleic theo Schmidt và T hannhauser giói thiệu ỏ bảng 9.1.
Bàng 9.1 - Các bưóc tiến hành để xác đinh ADN bằng
phương pháp Schmidt và Thannhauser
Các hơp ch at photpho có

Cốc giai
Xử lý tro n g thành phẩn của cốc
doạn
giai đoạn
Mô tươi Để phân tích sử dụng các mô tươi
nghiền kỹ hoặc ưốp lạnh ở - 1 0 °c
I Chiết nhanh 3 lần với CClaCOOH 5- Các hợp chất axit hoà tan
1 0 % lạnh
II Chiết mô còn lại ở phần I bằng etanol Photpholipit

80%, hỗn hợp etanol - cloroform nóng
(3:1) hoặc hỗn hợp etanol - ete (1:1)
III Thủy phân mô còn lại ở phần II bằng Các nucleotit được tạo thành từ
NaOH IN hoặc KOH 1N ỏ 37°c qua ARN, AND cùng photpho
đêm (lm l NaOH / lOOmg mô tươi) (không phải là từ
photphoprotein)
93
C ác hợp c h ấ t p h o tp h o có
C á c g ia i tr o n g th à n h p liầ n c ủ a các
x ử lý
đoạn giai d o ạ n
IV Lấy dịch li tám sau khi cho thêm HC1 Nucleotit của ARN và photpho
6 N vào p h ần II (để tru n g hoà NaOH vô cơ có nguồn gôc không phải
hoặc KOH) và tiếp tục cho thêm của nucleot.it. (chủ yếu là từ
CCI3 COOH đến nồng độ cuối cùng là photphoprotein)
5-10%. Kết tủa ADN được tách bằng li
tâm ở 0°c. Rửa tiếp hai lần bằng
CCI3 COOH 5%
V Tách các hợp chất photpho vô cơ từ Photpho không phải của

p h ầ n IV và xác định chúng bằng nucleotit, chú yêu photpho
phương pháp Delory được giải phóng khi thuỷ p h ân
bằng kiểm từ các
photphoprotein
VI K ết quả n h ận được từ p h ầ n III cho ADN và protein

thêm một ít HC] 6 N để tru n g hoà và
cho thêm CCI3COOH đến nồng độ 5-
10%
VII C hế phẩm nhận được khi xử lý p h ần AND

VI vối CCI3 COOH 5% ở 90°c trong 15
phút
II. PHƯƠNG PHÁP SCHNEIDER
1. N guyên tắc
Phương pháp Schneider tách chiết ARN và ADN đồng thời bằng dung dịch
CCI3 COOH hoặc HC10 4 nóng (90“C) loại bỏ một lượng đáng kế protein và chuyển vào
với th à n h p h ầ n ax it không hoà tan. Vì vậy, dịch chiết của cả hai loại nucleic th ủ y
phân th à n h các nucleotìt hoặc các bazơ tự do, nhò đó có thê xác định đồng thời chúng
bằng phương pháp chuyên biệt đôi vổi riboza và deoxyriboza.
2. Hoá ch ấ t
N hư ở p h ầ n hoá c h ất của phường pháp Schm idt và T hannhauser.
3. Tiến hành
Q uá tiùnh xác định đươc mô tả ơ bảng 9.2.
94
Bàng 9.2 - Các giai đoạn tách chiết các hợp chất photpho theo phương pháp Schneider
Các giai Các hợp c h ấ t p h o tp h o có

T iến h à n h
đoạn tro n g các giai đo ạn
Mô tươi Như ỏ bảng 9.1

I Như ỏ bảng 9.1 Hợp chất axit hoà tan
II Như ỏ bảng 9.1 Photpholipit

III Phần mô còn lại sau chiết rút của phần I ARN, ADN, photphoprotein
và II
IV Chê phẩm nhận được ỏ giai đoạn III xử ARN, ADN và một phần
lý với CCI3 COOH 5% hoặc HC104 6 % ỏ photphoprotein
90°c trong 15 phút. Kết tủa còn lại rửa
hai lan bằng axit
Xác định ARN và ADN theo phương pháp Schneider th u ận lợi hơn phương pháp
Schmidt và T harm hauser đối vói nhiều mô động vật khác nhau (ruột, lá lách, tuyến
ức, bạch cầu và hồng cầu lưới). Ngược lại, trong trường hợp phân tích mỏ năo và thận
lại nhận được kết quả khác nhau, vì có thể xác định cả lượng photphoprotein cũng như
những phức chất protein từ inosin photphat. Trong những trường hdp như thế, để có
kết quả chính xác hơn cần sử dụng cả hai phương pháp và xác định bố sung sự hấp
thụ tia tử ngoại.
III. PHƯƠNG PH Á P OGUR VÀ ROSEN
1. Nguyên tắc
Các phương pháp trên không thực hiện được cho nguyên liệu thực vật vì có những
hợp chất được tách ra như pentosan, poliuronit đă cản trở việc xác định axit nucleic.
Trong bảng 9.3 giỏi thiệu cách tách chiết rú t theo phương pháp Ogur và Rosen.
Phương pháp này cho phép xác định ARN và ADN (sô" lượng lfig) trong đầu rễ cây và
trong phấn hoa. Sự tách chiết các mô bằng etanol và hổn hợp etanol - ete (phần I và II)
đả tách các chất hoà ta n khỏi sự liên kết của chúng và cho màu đỏ thẫm với
điphenylamin. Một phần axit không hoà tan (IV) được tách chiết bằng HCIO 4 0 ,lN ỏ
4°c, ARN được tách khỏi hỗn hợp và được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ trong
quang phố kế. Tiếp theo sử dụng dung dịch HCIO 4 nóng tách ADN và photpho của
protein trong phần mô còn lại và định lượng giá trị ADN ở bưóc sóng 270nm hoặc xác
định giá trị của deoxyriboza hoặc photpho.
Dùng phương pháp này sẽ cho kết quả khôn^ tốt khi phân tích các loại mô khác
nhau, ví dụ khi chiết rú t ARN của nấm men sẽ đồng thời làm m ất một phần ADN.
Cần chú V rằng việc nghiên cứu nguyên liệu vi khuẩn bằng phương pháp này phụ
95
thuộc vào sự kéo dài thời gian tách chiết ARN (ngay cả đên 30 giờ). Phương pháp Ogur
và Rosen củng được sử dụng đê xác định axit nucleic của một sô mô động vật.
2. Hoá ch ấ t
- Etanol 70%
- Dung dịch HClO j 0,1%
- Dung dịch HClO.ị 0,2N và IN

- Hổn hợp etanol : ete (3:1)
3. Tiến h à n h
Quá trình xác định theo bảng 9.3.
Bảng 9.3 - Các hợp chất photpho ở các giai đoạn theo phương pháp Ogur và Rosen
Các hợp chất photpho có

Các giai
Tiến hành trong thành phần của các
đoạn
giai doạn
Mô tươi Mô tươi có thê giữ trong etanol 70-90% ở
0 °c trước khi được chiết rút
I Chiết rú t bằng etanol 70%, phần mô còn Các chất hoà tan trong etanol
lại được rửa bàng etanol 70% có HCIO J
0,1N tiến hành ỏ 4"c
II Chiết rút hai lẩn phần mô còn lại bằng Các chất hoà tan trong hỗn hợp
hỗn hợp etanoỊ 96% và ete (3:1) etanol - ete
in Nhanh chỏng chiết rút (lạnh) hai lần Các chất, axit hoà tan
phần mô còn lại (ID bằng dung dịch
HC10/t 0,1N
IV Phần mô còn lại sau khi chiết nít ỏ phần ADN, ARN, photphoprotein
m
V Chiết rút phần rv bằng dung dịch ARN
HC104 0,1N ỏ 4°c trong 18 giờ. Kết tủa
sau khi chiết rút, rửa hai lần bằng
HC10 ị 0,1N. Tập trung các phần địch li
tâm
VI Chiết rút hai lan phần còn lại (V) bằng ADN, photpho của
dung dịch HClO j 0,5N ờ 70"c 20 phút photphoprotein
96
IV. PHƯƠNG PHÁP QUANG P H ổ
1. N gu yên tắc
Phương pháp của Tsanev và Markov sử dụng HCIO.J để phân chia ARN và ADN
bởi sự thủy phân bằng kiểm ồ phần III. Tách chiết ADN và xác định dịch chiết ở bưốc
sóng tử ngoại.
2. Hoá c h ấ t
Như ở phần hoá chất của phương pháp Schmidt và T hannhauser.
3. T iến h à n h
Quá trìn h xác định axit nucleic theo phương pháp T saner và Markov được giỏi
thiệu ỏ bảng 9.4.
Bảng 9.4 - Sự phàn chia các hợp chất photpho theo phưang pháp Tsanev và Markov
Các hợp chất photpho có

Các giai
Tiến hành trong thành phần của các
đoạn
giai đoan
Mô tươi Như ở bảng 9.1
I Như ỏ bảng 9.1 Photpholipit
II Như ỏ bảng 9.1 Các hởp chất axit hoà tan
III Như ở bảng 9 . 1 ARN ở dạng nucleotit, ADN và
photpho từ photphoprotein
IV Phần dịch li tâm nhận được sau khi thủy ARN
phân bằng bazơ (III) được trung hoà bằng
HC10,j, tiếp tục cho thêm HC104 đến
nồng độ cuối cùng là 3% ở nhiệt độ 0°c
V Kết tủa nhận được từ phần in khi đã axit. ADN và protein
hoá bằng HC10,ị
VI Hai lần chiết rú t bằng dung dịch HC104 ADN
IN ở 80”c qua 30 phút
Dịch chiêt ARN và ADN đo ỏ hai bước sóng, 268 và 284nm cho ADN, 260 và
286nm cho ARN.
Sỏ lượng ARN và ADN được biểu thị giá trị photpho và tính theo công thức:
ARN = Kakn X (A« .o, z ± ĩ s ủ 1 v mg%p

w X1
97
AruvT =
ADN ~KT,” vNn X ------
(^26# ------- ) * V go/oP
“ A2ha-------m
w X1
Trong đó: V - t he tích mau chiêt n it (ml),
1 - độ dày của lóp dịch đo,
w - khôi lượng mẫu (g).
ÂKN = 0,00651,
K adn = 0,00800,
Hệ sô K tính theo công thức:
Tr _ M Xr
K = ---------------
£(P) X(r - 1)
Trong đó: M - khôi lượng mol photpho.

C(P) - hệ sô" moi hấp thụ của axit nucleic ỏ 260nm liên quan đến khôi
lượng mol photpho. đôi vối ARN = 10130, đỏi với ADN = 8782,
r - sự liên quan giữa hấp thụ và độ sạch của axit nucleic ỏ 260nm đên
sự hấp thụ ỏ Xit (nghĩa là ở 286nm cỉôi với ARN và 284nm đỏi vối ADN),
r = ^ 0 =2, 2 đối VỚI ARN,

A-J8 U
r= ầm . = 1,79 đối với ADN.

A 284
V. ĐỊNH LƯỢNG H ộ p CHAT PHOTPHO TRONG MÒ RUỘT THEO PHƯƠNG

PHÁP SCHMIDT VẢ THANNHAUSER CÓ SỬA Đ ổ i
1. N guyên tă c
Sự sửa đổi dựa vào việc sử dụng phương pháp Niemierki (1953) đê loại lipit và
dung dịch HClO j để tách hợp chất axit hoà tan ADN.
2. N g u y ên liệu
Ruột tươi của bò hoặc bê.
3. Hoá chât
■ Hỗn hỢp axeton : cloroform (5:1).

• Hỗn hợp etanol : ete (3:1 và 1 : 1 ).
- Dung dịch etanol 96% và ete.
- Dung dịch HC10 4 3%, 50% và 0,2N.
- Dung dịch KOH IN.
4. D ụng cụ và m áy móc
Phều lọc đường kính 5 - 10cm, coic 200ml, ông li tâm 25ml, 5 ông nghiệm 10ml, nồi
cách thuỷ, tủ ấm, máy so màu, máy nghiên đồng thể.
5. T ien h à n h
Thí nghiệm được tiến hành sau sơ đồ sau:

Mô tươi
3 lần chiết rú t bằng hỗn hợp axeton-cloroform (5:1) ờ 0°c
3 lần chiết rú t bằng hỗn hợp etanol-ete (3:1) ỏ 37°c
Dịch li tâm Kết tủa

(lipit)
3 lần chiết rú t bằng HC10 4 0,2N

(các hợp ch ất axit hoà tan) (hợp chất axit không hoà tạn)
c Thuỷ phân bằng KOH IN, 37°c, 18 giờ
Dịch thuỷ phân

(nucleotit của ARN, ADN
và p của photphoprotein)
D Dùng HC10 4 50% để trung hoà,

tiếp tục dẫn đến nồng đô 3%

(ribonucleotit (ADN + protein)
p vô cơ từ photphoprotein)
99
1. Loại lipit của mô ruột (A): lấy 300g mô ruột nghiền cẩn thận với hỗn hợp
axeton - cloroform (5:1) trong máy nghiền đồng thể. Li tâm. Tiến hành chiết, rú t 3 lẩn
với hỗn hợp axeton - clorofom (5:1) ở 0°c. Tiếp tục chiết rú t 3 lẩn bằng hồn hợp
etanol-ete (3:1) ở 37°c. Sau mỗi lần chiết rút, li tâm 5 phút ồ 3000 vòng/phút. Dịch
chiết chứa hợp chất lipit, tập trung các phần chiết lại, dẫn đến thể tích xác định bằng
hỗn hợp axeton - cloroform.
2. Chiết rú t các hợp chất axit hoà ta n (B): mô đã loại lipit, tiêp tục chiêt rú t
trong ông nghiệm 3 lần vối 4 - 5ml dung dịch HClO (1 0,2N lạnh ở nhiệt độ 0 - 4nc
trong 10 phút. Sau mỗi lần chiết li tâm lạnh 10 phút ở 4000 vòng/phút. Dịch li tâm
cho vào Ống đong và dẫn đến 15ml bằng HC10 4 0,2N. Kết tủ a là hợp chất axit không
hoà tan, rửa hai lần bằng etanol 96% lạnh, mỗi lần 4-5ml, ba lần hổn hợp etanol - ete
(1:1) và một lần bằng ete. Mỗi lần rửa phải li tâm . Kết tủa được làm khô trong không
khí.
3. Thuỷ phân hợp chất axit không hoà tan (C): cho thêm õml KOH IN vào kết
tủa của hợp chất axit không hoà tan, ủ ỏ 37°c (chính xác) trong 18 giờ.
4. Phân chia ARN và ADN (D): sản phẩm thuỷ phân làm lạnh đến 0nc và
trung hoà bằng HC10 4 50% (cần đặt trong chậu nưốc đá), thử bằng giấy (ỉo pH. Tiếp
tục cho thêm HCIO 4 50% đến nồng độ HCIO 4 có trong dung dịch là 3%. Khuấy cẩn
th ận và đế 30 p h ú t trong chậu nước đá, li tâm lạnh 10 phút ỏ 2800 vòng/phút. Kết tủa
là ADN, rửa kết tủ a 3 lán bằng HC10,ị 3% (3-4ml), sau mỗi lần rửa lại li tâm lạnh.
Dịch li tâm được tập trung và dẫn đên 20ml bằng HClO j 3%. Kết tủ a đượcrửa hai lần
bằng etanol lạnh 96% (4-5ml) và một lần bằng etanol 96% ở nhiệt độ phòng, 3 lần
bằng hỗn hợp etanol - ete ( 1 : 1 ) và 1 lần bằng ete (mỗi lan rửa đều phải li tâm).
5. Xác định hàm lượng photpho bằng phương pháp Horecker:
+ Trong toàn bộ mẫu
+ Trong phần lipit
+ Trong dung dịch A (photpho của toàn bộ axit hoà tan)
+ Trong dung dịch D (photpho của ARN và photphoprotein)
+ Trong kết tủ a D (photpho của ADN) giá trị photpho tính bằng mg% mô tươi
qua thang chuẩn của hợp chất photpho.
* Chú ý: Nếu giá trị photphoprotein trong mô ruột nhỏ, phẩn photpho của dung
dịch D xem như photpho của ARN.
100
VI. ĐỊNH LƯỢNG PHOTPHO THEO PHƯƠNG PHÁP HORECKER VÀ CÁC
CỘNG S ự
1. N guyên tắc
Photpho vô cơ được giải phóng khi thuv phân nguyên liệu bằng H2SO ị , photpho sẽ
tác dụng với am oni m olypđat có m àu xanh. Tính hàm lượng photpho theo th an g chuẩn
p , 0 5.
2. Hoá ch ấ t
- H 2S 0 4 đặc
- Dung dịch HClOị 72%
- Dung dịch am oni m olypđat Ị(NH 4) 2M o 0 4] 5%
* Dung dịch ejkonogen hoặc amidol [2.4 - điam inophenol đihiđroclorit

HOC(;Ho(NH 2) 2.2HC1)] [dung dịch ejkonogen 0,2% hoặc am idol cho thêm 12g n atri
pyrosunphit (Na^S.Ô-)].
Máy li tâm , ống nghiệm chịu n h iệt có n ú t nhám 10 ml, 3 pipet lm l, 1 pipet 5ml,
nồi cách thuỷ, m áy so màu.
4. Tiến hành
Thí nghiệm đư c tiến hành với hàm lượng photpho từ 3-10|.ig. Vô cớ hoá mẫu
trong các ống li tâm vói 0,5ml H.^so^ đặc đến khi th ấy có khói trắ n g bay ra thì cho
them 1*2 giọt HCIO 4 72%. Sau khi vô cờ hoá xong cho vào khoảng 8 ml nước cất lắc cẩn
th ậ n và cho thêm 0,5m l am oni m olypđat, 0,5m l dung dịnh ejkonogen hoặc amidol, dẫn
nước đên 10ml. Tương tự làm thí nghiệm kiểm tra. Đê các ông nghiệm vào nồi cách
thuỷ (lun sôi 15 ph ú t, sau đó làm lạnh. Đo độ h ấp th ụ bằng m áy so m àu ở bưốc sóng
720nm. Giá trị photpho đưởc tín h theo đồ th ị c h u ẩn có hàm lượng từ 10-15fig
photpho.
VII. ĐỊNH LƯỢNG PHOTPHO VÔ c ơ CÓ N G U ồN G ố c TỬ PHOTPHOLIPIT

THEO PHƯƠNG PHÁP DELORY
1. N gu yên tắc
Dùng phương pháp xác định photpho vô cơ với sự có m ặt của ch ất ức ch ế để làm

giảm sự tạo th à n h phức chất photpho - m olvpđat và dựa vào sự tách các photpho vô cơ
ở dạng Ca.jPO ị, sự kết tủ a của magie cacbonat (MgCO.^).
101
2. H oá c h ấ t
- Dung dịch C aC l 2 2,5%.
• Dung dịch MgCOy 0,5%.

- Dung dịch am oniac 2%.
- Dung dịch HClOị 60%.
- Dung dịch am oni molypcỉat [(Nỉl.ị)7Mo0.ị] 5%.

- Dung dịch ejkonogen (xem phần hoá ch ất trên).
- Dung dịch phenolphtalein trong etanol 45%.
Ông li tâm lõ m Ị pipet 1 , 2, 5 và 10ml. máy li tâm , máy so màu.
4. Tiến hành
1. Lấy lõm l dung dịch chứa photpho vô cơ (từ photphoprotein) cho vào ông li tâm.
2. Cho thêm từng giọt dung dịch am oniac đặc vối sự có m ật của
phenolphtalein đê tru n g hoà dung dịch. Sau khi tru n g hoà dung dịch cho thêm 0,2ml
hoá ch ất đó.
3. Cho tiếp vào ông nghiệm lm l CaCL, 2,5% và lm l MgCO.^ 0,5%. Lắc cắn
th ận và đế yên 30 phút.
4. Li tâm . C ẩn th ậ n gạn bỏ lớp dịch phía trên. T hành ông li tâm được thấm
khô bằng giấy thấm .
5. Rửa kết tủa vối 5ml am oniac 5%. Li tâm và làm khô như trên.
6 . Kêt. tủ a hoà ta n vào 1,1 ml HClO.ị 60%, cho thêm khoảng 10ml nước cất,
I ml (N H ^M oO ,! 5%, 0,5m l dung dịch ejkonogen và dẫn nưỏc đến 15ml.
7. S au 10 phút, xác định sự hấp th ụ dung dịch ờ máy so m àu vối bước sóng
720nm. Giá trị của photpho được tinh theo giá trị sự hấp th ụ của (lung clịch chuẩn.
VIII. ĐỊNH LƯỢNG ARN BANG ORXINOL

1. N guyên tắc
Khi p h ản ửng giữa orxinol vối riboza có trong ARN cho phức chất m àu xanh, dựa
vào cường độ m àu có thể tín h được hàm lượng ARN.
2. Hoá ch ất
- Thuốc th ử orxinol: lg orxin (orxin; orxiiiol; C 7H 80 2.HoO) sạch hoà ta n trong

100ml dung dịch HC1 đặc có 0,õg PeCl Làm sạch orxin thương mại bằng cách hoà
102
ta n vào benzen nóng. Lọc qua th a n hoạt tín h và loại orxinol kêt tủ a sinh ra sau khi
cho thêm hexan.
• Dưng dịch KOH IN
- Dung dịch HClO j 60%

- D ung clịch c h u ẩn ARN nấm m en có 10f.ig/ml photpho ARN (ARN-P)
- D ung clich bazd yếu của m agie ribonucleonat có nồng độ xác định. C huẩn bị dung
dịch có nồng độ khoảng lm g/m l.
3. D ụng cụ và m áy móc
Ông nghiệm , hai bình định mức 25ml, ông li tâm bằng thuỷ tinh 10ml, 2 pipet
5ml, pipet 2ml, chậu ù nhiệt, máy so m àu, m áy li tâm .
4. T iến hành
1 . Cho vào ống li tâm 2ml dung dịch m agie ribonucleat với dung dịch KOH IN
(ty lệ 1:10). Đạt ông nghiệm vào chậu nước, đun sôi 15 phút, khuấy đểu. Làm nguội.
2. T ru n g hoà bằng HClO ị 60%, tiếp tục cho thêm HClOj 60% cho đên nồng
độ dung dịch 3%. Đ ặt ỏng nghiệm vào chậu nước đá. Sau 15 p h ú t đem li tâm . Kêt tủ a
có KCIO J và có th ể có ADN.
3. Dịch li tâm cho vào bình định mức 25ml. Rửa kết tủ a hai lần bằng lm l
nước dể tác h chiết hoàn toàn kết tủ a ribonucleoiit, tấ t cả dịch chiết cho vào bình định
mức. D ân nước đến vạch ngấn và lắc cẩn thận.
4. Cho vào ông nghiệm khô 2m l dịch thuỷ phân, cho thêm lm l nưỏc và 3ml
thuốc th ử orxinol. Lắc đếu các ông nghiệm và để trong chậu nước nóng 20 phút.
Đồng thời c h u ẩn bị ỏng kiếm tra với các hoá chất, còn các ống thí nghiệm vói
dung dịch ARN chuẩn. Trong các ống th í nghiệm có ARN xuất hiện màu xanh da tròi
bền vững của phức ch ất furfural vối orxin.
5. Sau khi đê nguội, các ông th í nghiệm được đo ở bước sóng 669nm (giá trị
cực đại của phức c h ấ t tạo th àn h ) đôi chứng vối ông kiểm tra. Giá trị của ARN trong
các ông nghiên cứu được tính theo độ hấp th ụ của các m ẫu chuẩn. Mẩu ch u ẩn được
pha theo đơn vị ịig, mg magie ribonucleat trong lm l.
* Chủ ỷ: Phức ch ất m àu orxin p h ả n ứng với các riboza tự do của các nucleotit và
của các nucleozit purin. Riboza liên k ết của các bazơ pyrim iđin không có p h ả n ứng. Vì
vậy, để xác định sô" lượng ARN không dựa vào riboza tự do mà phải xác định bằng giá
tr ị photpho ARN (ARN-F). Ngoài riboza, orxin cũng p h ả n ứng vối 2 • đeoxừiboza
n h ù n g cho m àu xanh yếu hơn 10 lần so vối riboza. Để xác định số’ lượng ARN trong sự
có m ặt của ADN phải loại trừ giá trị của ADN.
103
IX. ĐỊNH LƯỢNG ADN BANG PHƯƠNG PHÁP ĐIPHENYLAMIN
1. Ngư vẻn tắc
ADN p h ả n ứng vói điphenvlam in cho phức chất m àu xanh da trời. Dựa vào cường
độ hấp th ụ ADN của th an g chuẩn, tính được hàm lượng ADN nghiên cứu.
2. Hoá ch ất
- D ung dịch CCI3COOH 10%
- D ung dịch HC10 4 0,6N
- Thuốc th ử điphenylam in: lg điphenylam in (C 12H 1|N ) hoà ta n vào 100ml

C H 3COOH đặc, cho thêm 2,75m l H ọS 0 4 đặc. Độ tin h k hiết của đipkenylam in phụ
thuộc vào sản phẩm thương m ại kêt tin h bởi hexan.
- D ung dịch ADN chuẩn có nồng độ 20|-ig ADN-P/ml.
3. D ụ n g cụ và m áy m óc
Ồng nghiệm , bình định mức 25ml, ống li tâm 50ml, 2 pipet 5ml, pipet lm l và pipet
lOml, ch ậu cách thuỷ, đá, máy nghiền đồng thể, m áy li tâm và m áy so màu.
1 . Lấy 3g tu y ên ức (khi lấy phải giữ trong đá) nghiền vối 5 thể tích dung dịch
CCl^COOH 10% lạn h trong máy n ghiền đồng thể.
2. Cho dịch nghiền đồng thể vào ông li tâm cõ 50m Ị đặt vào chậu nước đá,
k h u ấy 10 phút. Li tâm , loại bỏ dịch.
3. K ết tủ a được rử a vời 10 thể tích dung dịch CCl^COOH 10% lạnh. Lại li tâm
tiếp. D ung dịch CCl^COOH 10% chiết các p h â n tử nhỏ axit không hoà tan (nucleotit,
axit. am iii, este photphat, p h o tp h at vỏ cơ) từ mô. Trong p h ầ n k ết tủa chứa protein
p olỉsaccarit và axit nucleic.
4. Cho vào kêt tủ a 10ml dung dịch HClOị 0,6N và lắc đều 15 p h ú t trong nồi
cách th u ỷ ở 90°c. Dung dịch HCIO 4 nóng làm cho axit nucleic (ARN và ADN) tách
khỏi protein, các hợp ch ất axit hoà ta n được th u ỷ p h â n và chuyển vào dung dịch. Sau
khi li tâm , trong kêt tủ a có chứa protein, rửa k ế t tu a hai lần vổi 5 thể tích dung dịch
HC10,ị 0,6N. Còn dịch li tâm chuyển vào bình định mức 25ml, dẫn nùốc đến vạch
n g ấn v à trộ n đều.
5. Cho vào ổng nghiệm lm l dung dịch ax it nucleic, lm l nước cất và 4ml thuốc
thử điphenylam in. Trộn đểu và đ ặ t vào nồi cách thuỷ, đun sỏi trong 10 phút. Đồng
thời làm th í nghiệm kiểm tra vối thuốc thử và dung dịch ADN chuẩn đã biết giá trị
104
photpho của ADN (ADN-P). Trong các ông nghiệm có ÀDN x u ấ t hiện m àu xanh da
trời bển viìng.
6. Độ hấp th ụ được xáo định là hiệu giá trị 013 của các ống th í nghiệm có dung
dịch ch u ẩn và ông th í nghiệm kiểm tra đo ỏ bước hóng 600nm (hấp th ụ cực đại đối vối
hợp c h ất m àu tạo thành). Hàm lượng của ADN trong các ống th í nghiệm nghiên cứu
tính theo độ hấp th ụ của các ống thí nghiệm dung dịch chuẩn. Hàm lượng của ADN
tính theo mg trong Ig mô tươi.
105
C hương 9
XÁC ĐỊNH
• HOẠT
» ĐỘ* CỦA MỘT
• s ố ENZIM
I. ĐỊNH NGHĨA ĐƠN VỊ HOẠT ĐỘ CỦA ENZIM
H oạt động của enzim được tính theo đơn vị quốc tê u (Unit) hoặc m il (mili Unit).
Một u là h o ạ t động của enzim xúc tác cho sự chuyên hoá một micro mol (1 nmol) cơ
ch ất sau 1 p h ú t ở các điều kiện thích hợp nhất.
Đôi với chế phẩm enzim, ngoài việc xác định mức độ hoạt động cẩn phải đ á n h giá
độ sạch của nó. Đ ại lượng đặc trừng cho độ sạch của chê phẩm enzim là hoạt độ riêng.
H oạt độ riêng được biểu thị bằng sô' đơn vị enzim /lm g protein (U/mg), cũng có th ê là 1
gam ch ế phẩm hoặc lm l dung dịch enzim, thông thường hàm lượng protein được xác
định bằng phương pháp Lowry. Một sô" trường hợp đặc biệt (ví dụ một sô" hidrolaza) thì
định nghĩa này không th ể áp dụng được. Trong một sô" trường hợp cần phải xác định
các điều kiện p h ản ứng (ví dụ bản chất nồng độ cơ chất), khi cần th iết có thê đưa ra
định nghĩa của nhữ ng đơn vị khác hoặc điểu kiện th í nghiệm tương ứng. N hiệt độ đo
cũng hình th à n h một hoạt độ riêng của enzim, ví dụ 400Ư/mg (25UC). Nếu b iết được
khôi lượng p h â n tử của enzim có the tính được hoạt độ p h ân tứ cd chất (hoặc sô
đương lượng các nhóm tương ứng) bị chuyển hoá dưới tác dụng của một p h â n tử
enzim sau 1 phút.
II. CHÚ Ý KHI XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZIM
- Độ bền của enzim thường cao hơn coenzim. Các vi sinh v ậ t san xuất proteinaza
thường không bển nên có thể cho thêm ch ất bảo quản để làm bền . Đê bển enzim,
người ta thường cho thêm cơ chất hoặc chất tương tự cơ chất (ví dụ: đế làm bền
glixerol kinaza, thêm etylen glycol 1% (v/v), đây là cách duy n h ấ t có thế ổn định giống
hơn 1 năm). Tuy n h iên cần phải kiểm tra các chất bao quản này có ức chê enzim
không đê có biện pháp xử lý khi xác định enzim.
- Cần trá n h các yêu tô gây biến tín h protein như n h iệt độ cao, pH quá axit hoặc
quá kiềm, muối kim loại nặng...
- C ần có các điếu kiện tiêu chuẩn và thích hợp n h ấ t của enzim xúc tác như nồng
độ cơ chất, pH môi trường, nhiệt độ... (thường tiến h àn h trong điểu kiện (lư cò chất,
khi ngừng phản ứng, lượng cơ chất bị chuyển hoá từ 20 - 30%).
106
III. XÁC Đ ỊN H H O Ạ T ĐỘ CỦA A SC O R B A T OXIDAZA
A scorbat oxidaza thuộc lốp enzim oxi hoá khử (oxidoreductaza), nó oxi hoá axit
ascorbic (vitam in C) th à n h axit đehiđroascorbic
X) J)
c ----- C ------
C-OII c=<>
II í) + -L 0 2 o
2
-> c = ()
H -C ------ H-C-------
1IO-C-II HO-C-H
CH2OH CH2OH
ax it L-ascorbic axit L-đehiđroascorbic
Enzim n ày có nhiều ti'ong ra u quả tươi. H oạt độ enzim này cũng có thể xác định
bầng cách dùng iot để đo sô' lượng axit.
2. Hoá ch ấ t
- Dung dịch K l();í 0,01 N
- Dung clịch KI 10 %
• D ung clịch Na-^SgO.Ị 0 ,0 0 IN

- Dung dịch tinh bột 1%
- Đệm p h o tp h at pH 7; 0,15M
- Dung dịc.h ax it ascorbic lg/1.
1. C ân 20g nguyên liệu thực v ật tươi (dưa chuột) cho vào cối sứ nghiền vỏi 10 -
lõ m l dung dịch đệm p h o tp h at pH 7; 0,15M.
2. C huyển vào bình định mức 50ml, định mức bằng đệm photphat. Lắc, để
yên một giờ.
3. Lọc hoặc li tâm . Dịch lọc dùng để nghiên cứu h o ạt độ enzim.
4. Cho vào 2 bình định mức dung tích 50ml, mỗi bình 10ml dịch enzim.
5. Bình kiểm tra đun sôi 2 phút, sau đó làm lạnh.
6 . Đ ặt cả h ai bình vào nồi ổn n h iệt ở 37 °c trong 5 phút.
7. Cho thêm vào. mỗi bình 10ml dung dịch axit ascorbic đã ủ trưốc ở 37°c. ủ
hỗn hợp p h ả n ứng 30 phút.
107
8 . Đun sôi cả hai bình và làm lạnh. Cho nước cát vào 2 bình đến vạch.
9. Lay 10ml dịch cho vào bình nón lOŨml, thêm 5m l dung dịch KI 10%, lOml
HC1 5%, 10 giọt dung dịch tinh bột 1% và lOml dung dịchK IO :v
10 . Sau 5 phút, chuẩn độ cá hai bình bằng dưng dịch Na^s.^cv, đến khi m ất
m àu xanh.
4. Tính k ết quả
Kêt quả được tín h theo côn^r thức.

v (a - b) X f X 0.088
À —-------------- -— —
w
Trong đó: X - hoạt độ của ascorbat oxidaza biêu thị bằng m iligam axit ascorbic bị
oxi hoá dưới sụ tác động cùa enzim chiết từ m ột gam mầu thực v ật sau
thời gian cho tác động,
a - sô" ml dung dịch N a 2SọOo 0,001 N dùng đê c h u ẩ n độ bình th í nghiệm ,
b - sô" ml dung dịch N a 2S 20 3 0,001 N dùng để ch u ẩn độ bình kiểm tra,
f - hệ sô chình lv dung clịch N a 2S 20 .t tương ứng với lm l (lung dịch

N a 2S 20 3 0,001N 4
w- khốĩ lượng nguyên liệu lấy đế phan tích.
IV. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA a- AMYLAZA THEO RƯKHLIADEVA GERIACHEVA
Am ylaza có khá nảng thuỷ phân tinh bột tạo th àn h các dextrin có khôi lượng rnol
khác nhau. Khi cho tác dụng với iot, chúng sẽ tạo màu. Đo cường độ màu tạo th àn h ,
tính được h o ạt độ của am ylaza. Đớn vị hoạt độ am ylaza là lượng enzim xúc tác th ủ y
p h ân được lg tin h bột th à n h dextrin có phân tử lượng khác n h a u ỏ n h iệt độ 3 0 °c
trong 1 giờ.
pH cho am vlaza của m alt là 4,8-4,9; cho am ylaza nấm mốc là 4,7; cho am ylaza
của vi k h u ẩ n là 6 ,0 .
Am ylaza xúc tác cho các phán ững thủy phân tinh bột, glycogen, các polisacarit
tương tự. Amvlaza được chia làm 3 loại:
- a - am ylaza (1,4 - a - D- Glucan - glucanohiđrolase; EC 3.2.1.1) có trong nước
bọt, h ạ t hoà thảo nảv m ầm , trong tuỵ tạng, nấm mốc, vi k h u ẩ n . Nó phân giải liên k ết
1,4 - glvcozit ỏ giữa chuỗi polisaccarit (nên gọi là “enđo am ylaza”) tạo th à n h dextrin
ph ân tử thấp. Dưối tác dụng của enzim này. dung dịch tinh bột n h an h chóng bị m ất
khả năng tạo m àu vối dung dịch iot và bị giảm độ nhốt m ạnh, a - am ylaza bển với
nhiệt, nhưng kém bển vối axit.
* p - am ylaza (EC 3.2.1.2) có nhiều ở hạt, củ thực vật. Nó xúc tác cho p h ả n ứng
thủy p h â n liên k ết 1,4 - glycozit từ đầu không khử tạo th àn h chủ yếu m an taza và
dextrin p h â n tử lốn. M ất h o ạ t tín h ở n h iệt độ trê n 70°c, nhưng bền với axit hơn
ư - amylaza.
- G lucoam ylaza có nhiêu ở vi sinh vật, gan động vật. Nó xúc tác cho phản ứng
th ủ y p h â n liên kẻt 1,4 - và 1,6 - glycozit b ắ t đầu từ đầu không khử của ctyuỗi
polisaccarỉt. s ả n p h ẩm chủ yếu là glucozd và dextrin. Nó bị m ất hoạt tính ở n hiệt độ
trên 70°c. N hiêu glucoam ylaza hoạt động m ạnh ở pH 3,5 - 5,5.
2. Hoá ch ấ t
- Dung dịch HC1 0,1N cho vào bình định mức 100ml, 8,2m l HC1 đặc, thêm nước
cất. đến vạch lắc đểu.
- D ung dịch iot gốic.
Hoà ta n 0,5g iot và 5g KI trong 1 lượng nhỏ nước, lắc

nhẹ. Chuyển dung dịch vào bình định mức 200ml, dùng
nưỏc cất dẫn th ể tích đến vạch. C ất giữ dung dịch trong
lọ m àu, dùng trong vòng m ột tháng.
- Dung dịch lot p h ả n tích.
P h a loãng 2ml dung dịch iot gôc bằng dung dịch HC1
0,1N trong bình định mức 100ml. Trước khi dùng dung
dịch iot p h ân tích cần kiểm tra m ật độ quang ỏ bước sóng
453m m là 0,16 (I 0,01). Nếu sai lệch m ật độ quang
cần phải hiệu chỉnh bằng cách thêm vài giọt dung dịch
iot gốc.
- D ung dịch ch ế phẩm enzim gốc.
C ân 0 ,lg chê phẩm cần nghiên cứu cho vào côc thuỷ
tin h dung tích 25ml, hoà vối m ột lượng nưỏc nhỏ rồi
chuyến vào bình định mức lOOml, thêm nưổc cất đến
vạch, trộ n đều, lọc. Có th ê bảo quản dung dịch enzim 1
ngàv ở 2 - 4°c.
- D ung dịch chê phẩm enzim nghiên cứu.
P h a loăng dung dịch enzim gốc sao cho trong 3m l dung

dịch enzim p h â n tích có chứa m ột lượng enzim đủ để
th u ỷ p h ân tin h bột từ 20% đến 70%. Muốn vậy cần lấy
lượng dung dịch gốc khác n h a u tuỳ thuộc vào hoạt độ của
ch ế phẩm mà pha loăng bằng nước tối 50ml (có hoạt độ
từ 20-700 đơn vị/g) hoặc tới 200ml (hoạt độ 700 đơn vị/g
trở lên).
109
H oạt độ am ylaza Lượng dung Lượng c h ế phẩm Tổng lượng
( H d A ) củ a c h ế dịch gôe lây đí* có trong 5ml d u n g d ung dịch được
phẩm , (dv/g - độ pha loãng dịch phân tích pha loãng
dự kiến) (ml) (g) (ml)
Từ 20-80 50 5,0 50
80-150 20 2,0 50
150-300 10 1,0 50
300-700 15 0,5 50
700-1200 10 0,25 200
1200-2500 5,0 0,125 200

2500-5000 2,0 0,05 200
Trén 5000 1.0 0,025 200
- Dung dịch đệm a x etat pH = 7,4 dùng (ỉế xác định am ylaza của nấm môc,
Ị)H = 4,9 dùng để xác định am ylaza cua m alt (xem p h ầ n đệm tra n g 159).
- Dung địch tin h bột 1%.
Hoà lg tinh bột (theo khôi lượng khô tu y ệ t đối) trong bình định
mức 100 m] vói 50ml nước cất, lắc đều khi tinh bột tan hoàn toàn,
làm nguội bình và thêm 10ml dung địch đệm a x e ta t (pH ứng với
p hản ứng) rồi them nước cất đến vạch, lac đểu. C huẩn bị dung dịch
tinh bột dùng trong ngày.
1 . Cho vào 2 bình nón 50ml, mỗi bình 10 ml dung dịch tinh bột 1% và đặt vào
m áy ủ n h iệt ỏ 30°c, giữ 10 phút.
2. Thêm vào bình 2 (bình thí nghiệm ) 5ml dịch chiêt enzim . K huấy đêu và
giữ 10 phút.
3. Lấy từ mỗi bình 0,5m l hỗn hợp cho vào 2 bình khác có chứa 50ml dung dịch
iot. Lắc đểu. Bình đôi chứng có m àu xanh, bình th í nghiệm có m àu tím .
4. Đo độ hấp th ụ ở bước sóng 656nm. M ật độ quang của bình đôi chứng (OD|)
là lượng tin h bột ban đầu. M ật độ quang của bình thí nghiệm (OD.>) là lượng tinh bột
còn lại sau khi a-am y laza thúy phân. Sự khác nhau giữa m ật độ quang của bình đỏi
chứng và bình th í nghiệm là lượng tinh bột bị enzim thúy phân.
- Lượng tinh bột bị thủy phán (c) tính theo công thức:
I 10
00, - 00,
OD,
Trong đó: O D 1 - m ậ t độ quang của dung dịch đối chứng ,
ODi, - m ậ t độ quang của dung dịch nghiên cứu,
0,1 - lượng tin h bột phán tích (g).
Nêu lượng tin h bột bị th ủ y p h â n nhổ hơn 0,02g hay lốn hơn 0,07g thì lặp lại thí
nghiệm bằng cách th a y đổi lượng enzim cho tác dụng (nhiều hay ít) dùng đê p h ân tích.
5. Cách tín h h o ạ t độ am ylaza từ các c h ế phẩm en zim khác nhau
- H oạt độ am ylaza (tính theo đon vị/gam) của chê phẩm enzim vi k h u ấ n môc
(HdAv) tín h theo công thức:
HdAv = Ẽ j g 6 ^ ± W Ọ Ị g ? ì „ 1000
w
- H oạt độ am ylaza (tínli theo đơn vị/gam) của chê phẩm enzim từ nấm môc
(HclAn) tín h theo công thức:
HdAn = 7.26*» ° -0 .0 3 7 6 6 „ 1000
w
- H oạt độ am ylaza (tín h theo đơn vị/gam) của m alt (HdAm) tính theo công thức:
TJ 1 Ạ _ 6,889 X c - 0,029388 1
HdAm = —--------------------------X 1000
w
Trong đó: w - lượng chê phẩm enzim (chế phẩm , dịch nuôi cấy vi khuẩn, malt)
đem th í nghiệm (mg),
c * lượng tinh bột bị th ủ y p h ân (g),
1000 - hệ sô" chuyển mg th à n h gam,
5,885; 0,001671; 7,264; 0,03766; 6,889; 0,029388 là các hệ số của

phương trìn h tín h hoạt độ th u được bằng phương pháp xử lý toán học
số’ liệu thực nghiệm về sự phụ thuộc của lượng tin h bột bị th ủ y phân
và lượng enzim lấy để nghiên cứu. Trong các hệ sô này có đưa vào thừa
sô tín h chuyên ra 1 giờ tác dụng của enzim.
- H oạt độ am ylaza (HđA) tín h theo hoạt độ ch ất khô tu y ệ t đôi của các loại chê
phẩm (HdAcp) được xác định.
TTJA HdAcp X 100
HdA = —— —£—------
100 - w
T rong đó:
w- độ ẩm của chê p h ẩm (%).
111
V. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA CATALAZA
C atalaza xúc tác biên đôi H .;0 2 th à n h nước và oxi phân tứ . Ngoài ra, c a ta la z a còn
xúc tác cho các p h an ứng oxi hoá khử các loại rượu peroxit nhưng yêu hớn.
2 ìl,0 2 O a l a la z a >2 H 20 + 0 7
1. N guyên tắc
Hoạt độ của catalaza dựa vào lượng peroxit (H mO.^ị) bị th u ỷ phân dưới tác dụng của
enzim bằng cách ch u ẩn độ với dung dịch KMnO ị.
2. Hoá ch ấ t
- C aC 03
- Dung dịch H .,S 0 4 10%.
- D ung dịch KMnO,, 0,1N.
- h 2o , 1%.
C ân õg nguyên liệu tươi (khoai tây, khoai lang) nghiển nhỏ trong côi sứ với bột
thuỷ tinh và 0,3g CaCOH, sau đó cho thêm 20ml nước cất, nghiên lại cẩn th ậ n tạo
th à n h dịch đồng thể, cho vào bình định mức õOml và dẫn nước đến vạch mức. Lắc đều
hỗn hợp, sau 30 p h ú t đem lọc hoặc li tâm .
Lấy 2 bình nón 1.00ml, cho vào mỗi bình 20ml dịch lọc. Đ un sôi bình kiểm tra 2 - 3
p h ú t (làm m ất h o ạt động của enzim), làm nguội bình. Thêm vào mỗi bình 2 0 ml nước
cất và 3ml dung dịch H.20 2 1%, để ở n h iệt độ phòng (25°C) 30 phút, cho thêm 4ml
dung dịch H 2S 0 4 10% và c h u ẩn độ bằng dung dịch KMnOf 0,1N đến khi xuất hiện
m àu hồng n h ạ t không bị m ất m àu trong 1 phút. H oạt độ của enzim được: tín h theo
công thức sau:
v (a - b) X f X 1,7
A —---------------------
w
Trong đó: X -hoạt độ catalaza tính theo mg H 2O v của lg nguyên liệu bị p h ân giải.
a - sô' ml dung dịch K M n0 4 0,1N dùng để chuẩn độ ỏ bình kiểm tra,
b - sô ml dung dịch KMnO^ 0,1N dùng để chuẩn (ỉộ ủ bình th í nghiệm ,
f - hệ số chỉnh lý dung dịch K M n0 4 0 , 1N,
1,7 - số mg H 20., tương ứng với lm l KMnO.ị 0 , 1N,

w - khôi lượng nguyên liệu m ẫu (g).
112
VL XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CHOLINESTERAZA CỦA HUYẾT THANH (ChE) -
PHƯƠNG PHÁP SỬA ĐỔI CỦA HESTRIN
1. N guyên tắc
Enzim ChE p h â n giải cớ chất axetylcholylclorit (C 7H 1(;N(X,.HC1) hoặc benzoyl-

cholylclorit(Cì 2H lhNO„). P hần không bị phân giải phản ứng lại vói hiđroxylam in
trong môi trường kiểm tạo th àn h axit axetylhiđrosam ic hoặc ax it benzovlhidrosam ic,
trong môi trường a x it (pH = 1,0 Ỷ 1,4) nó phản ứng với ion Fe;u tạo th à n h phức ch ất C.Ó
m àu đỏ đôi với axetylcholin hoặc m àu tím đổi vói benzoylcholin.
C H ọ C 0 -0 -C H 2~CH 2~N*(CH *).| + H 20 -> C H X O O H + HO~CH 2-C H 2- N +(CH;^
(C H ^^-C H ^-C H ^rO -C Q -C H ;^ NH2OH -> (CH;^N*~CH.r e n p H + CHX O-NH OH
2. Hoá ch ất
- Dung dịch đệm p hotphat 0,1M; pH = 7,5

- Cơ chất: Dung dịch axetylcholinclorit hoặc benzoylcholinclorit 0,16M (2,904g
axetylcholinclorit hoặc 3,89g benzoylcholinclorit hoà ta n trong nước và dẫn đến
100ml). D ung dịch bển sau khi điều chỉnh pH đến 4 bằng HC1.
- D ung dịch hiđroxylam inclorit (NH 2OH.HCl) hoặc hiđroxylam in su n fat

l(NH 20 H ) 2.H 2S 0 4] 2 M.
- Dung dịch NaOH 14% (3,5M).
- D ung dịch HC1 pha loăng: 1 thê tích HC1 + 2 th ể tích nước.
- Dung dịch FeCỊj 0,37M trong dung dịch HC1 0 . 1N (FeCl.*.6H.,0 10 %).
- Dung dịch CCI3COOH 10 %.
ò n g nghiệm , phễu, 1 pipet 0 ,lm l, 2 pipet Iml, 3 pipet 2ml, 4 pipet 10ml, nồi ủ,
m áy so m àu.
Cơ ch ất được hoà tan vào đệm p h o tp h at theo tỷ lệ 1 : 10, còn huyết th a n h vói tỷ lệ
1:25. Cho vào ông (1): l,5m l huyết th a n h pha loãng vói l,5m l dung dịch cơ chất, ủ 60
p h ú t ơ 37°c. Cho thêm 3ml CCljCOOH 10 %. Sau 10 p h ú t đem lọc hoặc li tâm . Song
song làm th í nghiệm kiểm tra (2): 1,5ml huyết th an h pha loãng, l,5 m l đệm và 3ml
113
CCl'jCOOH 10%, sau 10 phut lọc hoặc li tâm . Cho vào cả 2 ông nghiệm nghiên cứu và
kiêm tra 2ml dung dịch lọc; cho vào ông th í nghiệm hoá chất (3): 0,5ml dung dịch cơ
chất; 0,5m l đệm và lm l CCl^COOH 10%; cho vào ông kiểm tra hoá chất (4): Im l đệm
và lm l CCI3COOH 10%. Cho vào tấ t cả 4 ông nghiệm 2ml dung dịch kiểm
hiđroxylam in (dung dịch NaOH 3,5M và hiđroxylam in 2M có cùng thể tích). S au 2
p h ú t cho thêm lm l HC1, lắc đều, cho thêm lm l dung dịch FeC Ịv Xác định độ h ấp th ụ
của ống th í nghiệm ( 1) đối với ông kiểm tra (2), dung dịch chuẩn (cơ chất) (3) đôi vối
ống kiểm tra hoá chất (4) ở bưốc sóng 530nm.
5. T ính k ết quả
K ết quả hoạt tính được tính theo sô" lượng fimol cơ chất phân giải qua lm l huyết
th a n h trong 1 giờ ủ. Sô" đơn vị được tính theo công thức:
^ m ẫ u chuẩn ^ m ẫ u thí nghiệm

--------------------------------- —-— X 8Q X------
1 ^ m ẫ u chuẩn ^ m ẫ u thí nghiệm
= -------------------------------- —-— X400
mẫu chuẩn 0 ,0 2 mẫu chuẩn
Trong đó: 8 - sô" ịxmoì cơ chất trong 0,5ml

0,02 - sô" ml huyết th an h không pha loăng trong 2 ml dịch lọc
Chỉ tiêu sinh lý: 160 - 250 I

*Chú ỷ: K hi dùng benzoylcholin làm cơ chất xác định hoạt .độ ChE có thể sử dụng
đệm pH = 7,5. Vì vậy trong th í dụ này, pH từ 6,8 -ỉ- 8,0 không ả n h hưởng đến h o ạ t độ.
V II. XÁC Đ ỊN H HOẠT Đ Ộ CỦA GLUCOAMYLAZA
G lucoam ylaza có khả năng thủy phân các liên kết a(l-4), ct(l- 6 ) và «(1-3) glycozit
cao n h ất. Vì vậy sản phẩm cuối cùng khi thủy p h ân tinh bột và glicogen là glucozd
1. N guyên tắc
Để xác định h o ạt độ của glucoamylaza có các phương pháp:

- Xác định đường khử trong dịch thuỷ phân. Xác định đường khử theo phương
pháp th u ỷ p h â n (theo F iehert - Bleyer).
- Dựa vào sự oxi hoá đặc hiệu của glucoxidaza đôi với glucozơ.
2. Hoá ch ất
- Dung dịch tin h bột tin h k hiết 2%.

- Đệm a x e ta t pH = 5,5.
- Dung dịch KMnO,ị 0,1N.
- Dung dịch đồng sunfat: cân 69,28g C u S 0 4.5H20 hoà vào bình định mức, dẫn
nưốc đến 1000 ml.
114
- D ung dịch n a tri a x e ta t 50%.
■ D ung dịch phèn sắt: cân 100g Fev(S 0 4)>.(NHiỊ)l,S0.1.24H 20 hòa vào 100ml
H 2S 0 4 đặc, dẫn nước đễn 1000 ml.
3* T iế n h à n h
1. Lay lOg môi trường nuôi cấy bể m ặt nấm môc Aspegỉllus usam iỉ hoặc
Rhizopus delemary nghiền nhỏ trong cốc sứ vối bỏng thuỷ tin h và 200ml dung dịch
đệm a x e ta t pH = 5,5. Lọc lấy dich trong để xác định hoạt độ enzim.
2. Cho vào 2 bình nón dung tích 250ml, mỗi bình 10ml dung dịch tinh bột 2%,
5ml dung dịch enzim (nêu hoạt tính enzim cao thì cần pha loãng 5 lần), đê hỗn hợp ở
4Õ°C tro n g 30 phút.
3. B ình kiểm tra cần làm m ất hoạt động của enzim trước bằng cách đun sôi
dung dịch enzim trước khi cho tác dụng vối cơ chất (tinh bột).
4. S au đó cho vào mỗi binh 10ml dung dịch CuSO,j và 20ml dung dịch na tri
a x e ta t 50%.
5. Đ un bình nón trên nồi cách thuỷ 20 phút. Lọc và rử a k ết tủ a CuO bằng
nước cất ấm trê n phễu th u ỷ tin h xôp sô 2 hoặc G4.
6 . Hoà ta n kết tủ a CuO bằng dung dịch phèn sắ t trong H 2S 0 4.
7. C h u ẩn độ bằng K M n 0 4 đến khi x u ấ t hiện m àu hồng bền.
H oạt độ của enzim glucoamylaza được tính theo sô" lượng m iligam glucozơ được
tạo th à n h do enzim thuỷ p h â n tin h bột, theo công thức sau:
X - — - b) X 60
t Xp
T rong đó: X - hàm lượng glucozd đươc tạo th àn h (mg),

a - sô' m iligam glucozd ở bình thí nghiệm,
b - sô m iligam glucozơ ỏ bình kiểm tra,
60 - thời gian tính theo giờ (60 phut),
t «thời g ian cho glucoamylaza tác động (trong 30 phút),
p - hệ sô pha loăng, hay sô" lượng enzim lấy để p h â n tích (tính theo gam
nguyên liệu hay miligam chế phẩm).
Một đơn vị hoạt động của glucozd là lượng enzim có khả năng thuỷ p h ân lg tinh
bột th à n h glucozơ trong những điểu kiện xác định thích hợp và nghiêm n g ặt nhất.
H oạt động riêng của glucoam ylaza được biếu thị bằng sỏ đơn vị của lm l dịch enzim,
lm g chê p h ẩm hoặc protein của chê phẩm .
115
B ả n g c h u y ể n đ ố i lượng đ ố n g kh i xá c đ ịn h đư ờ ng k h ử (m g )
Đồng Đường Đồng Đường Đồng Đường Đồng Đường
1.1 0,50 8,6 4,05 12,8 6.15 16,2 7,85
1,5 0,68 9.0 4,25 13.0 6,25 16,4 7,95
2,0 0,90 9.5 4.50 13,2 6,35 16,6 8,05

2,5 1,13 10,0 4,75 13,4 6,45 16,8 8,15
3,0 1,36 10,2 4,85 13,6 6,55 17,0 8,25
3,5 1,59 10,4 4,95 13,8 6.65 17,2 8,35
4,0 1,81 10,6 5,05 14,0 6,75 17,4 8,45
4,4 2,00 10.8 5,15 14,2 6,85 17,6 8,55
5,0 2,27 11,0 5,25 14,4 6,95 17,8 8,65
5,5 2,50 11.2 5,35 14,6 7,05 18,0 8,75
6,0 2,75 11,4 5,45 14,8 7,15 18,2 8,85
6.6 3,05 11,6 d ,5 o 15,0 7,25 18,4 8,95
7.0 3,25 11,8 5,65 15,2 7,35 18,6 9,05
7,2 3,35 12,0 5,75 15,4 7,45 18,8 9,15
7,4 3,45 12,2 5,85 15,6 7.55 19,0 9,25
7,8 3,65 12,4 5,95 15,8 7,65 19,2 9,35
8,2 3,85 12,6 6,05 16,0 7,75 19,4 9.45
V I I I . XÁC Đ ỊN H H O Ạ T Đ Ộ LIPAZA
Enzim lipaza xúc tác cho quá trìn h thuỷ phân các liên kết este giữa glixerin và
các axit béo.
CH 0O CO R 1 CH,O H R,COOH
I I
CHOCOR. + 3 H ,0 --------- > CHOH + R.,COOH
I I
CH 2OCORo CH2OH RXOOH
Lipaza có ỏ nhiều thực vật, đặc biệt ]à các loại cây có dầu. Mặc dù được phân loại
th àn h một nhóm nhưng các lipaza có tính chất rấ t khác n h a u như lipaza h ạ t th ầu dầu
(Ricừnus communis) không hoà ta n trong nước, có pH hoạt động thích hợp là 4 ,74-5 ,0 ;
lipaza tụy tạn g lại hoà ta n trong nưốc, pH thích hợp ớ vùng kiểm; các lipaza vi sinh
v ậ t có pH thích hợp là 8 ,0 .
L ipaza của các h ạ t ngũ cốc tham gia vào các quá trìn h thuỷ phân lipit nên làm hư
hóng các loại ngủ cốc bảo quản, đặc biệt ở các h ạ t chứa nhiều dau.
1. N guyên tắc
Dưới tác dụng của lipaza, lipit bị th ủ y p h ân và giải phóng ax it béo. H àm lượng
axit được c h u ẩn độ bằng kiểm. H oạt độ của enzim là lượng kiềm cần đê tru n g hoà axit
mói được h ìn h th à n h . Cơ ch ất tốt n h ấ t đối vổi lipaza chính là lipit của cùng m ột đốì
tượng chứa enzim.
2. N g u y ê n liệ u
D ầu lạc: trộ n 2 00 g (250ml) dầu lạc sạch vối 50ml NaOH 2% trong phều chiết, loại
dung dịch kiềm . Chiêt nhiều lần đến khi dầu không có phản ứng vối chỉ thị
phenolphtalein. Đẻ yên và cho qua cột CaCl.2-
3. Hoá ch ấ t
- Đệm a x e ta t pH = 4,7.
. Cồn 96%.
- Toluen.
- Dưng dịch N aOH 0,1N.
- Thuôc chỉ thị m àu tym olphtalein hoặc phenolphtalein 1%.
1 . C ân 5g h ạ t hoặc ng€i cốc nghiền nhỏ th à n h dạng đồng thể. Chuyển vào bình
nón lOOml, cho thêm 10ml nước cất, lắc đều.
2. Cho thêm lm l dầu lạc làm cơ ch ất và 5ml dung dịch đệm a x etat pH 4,7 (1
th ể tích CH 3COOH IN và một thể tích CH.^COONaIN) với vài giọt toluen. T rộn đểu
hỗn hợp và cho vào tủ ấm 30°c trong 20 -ĩ* 24 giờ.
3. B ình kiểm tra phải đun sôi dịch enzim 3 -ỉ*5 p h ú t để làm m ất hoạt động của
enzim trước khi cho tiếp xúc vối cơ chất.
4. S au khi ngừng p h ả n ứng, cho vào ìììỡi bình 25ml cồn 96 % và 15 * 25m l ete.
Lắc đểu, để lắng.
5. C h u ẩn độ bằng đung dịch NaOH 0,1N vói 0,5m l chỉ thị m àu tym olphtalein
1%. Đôi với dịch chiết nguyên liệu thực v ậ t không có m àu th ì dùng chỉ thị
phenolphtalein.
5. Tính k ế t quả
H oạt độ của lipaza được biểu th ị bằng sô" m ililit NaOH 0,1N trong lOg h ạ t theo
công thức:
117
(a - b) X f X 10
X —------ —
—~—-----
w
Trong đó: X - hoạt độ lipaza,

a - sô" mililit NaOH 0 ,lN dùng đê chuẩn độ binh th í nghiệm,
b -sô" m ililit NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra,
f - hệ sô chỉnh lý NaOH 0,1N,
w - khối lượng hạt.
IX, XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PAPAIN
1. P hương pháp chuẩn độ
a) Các du n g dịch
- D ung dịch cazein: pha dung dịch H am m ersten cazein 6 % bằng cách trộn 60g
cazem vói m ột ít nưốc trong cỏi nghiến, cho từ từ 60ml NaOH IN và dẫn nước đến 1
lít. Đ un nóng dung dịch 30 phút trong chậu nước sôi, làm nguội và lọc qua vải len nếu
th ấ y cần thiết.
- D ung dịch x itrat: pha dưng dịch trin a tri x itra t (C6H 50 7Na.i) 0,2M bằng cách
tru n g hoà axit xitric (CgHỹOy) vối NaOH.
- D ung dịch chuẩn độ: chuẩn độ với KOH rượu 0,1N.

- C h ất chỉ thị: dung dịch tym olphtalein cồn 1%.
b) Chuẩn bị mẫu
- B ất hoạt enzim: nếu m ẫu chiết enzim là rắn, nghiền trong cối vôi một ít nước
đun sôi, làm nguội dung dịch. Hoà ta n trong nước sôi để nguội vối tý lệ lả 10 mg m ẫu
b a n đầu vối lm l H 20 . Sau 5 -r 10 phứ t li tâm , giữ lại dịch trong ơ trên.
- H oạt hoá enzim: làm tương tự như phần bát hoạt enzim nhưng dùng một nửa
lượng nưổc. Cho nước sôi để nguội. Li tâm , sau đó 11 dung dịch enzim trong một giò ỏ
4 0 °c để hoàn th à n h sự hoạt hoá.
c) Tiến h ành thí nghiêm
1. Cho 10ml dung dịch cazein và những h ạ t thuỷ tin h có dường kính 4mm vào
bình cầu cỡ lOOml. Làm nóng bình và dịch bên trong đến 40°c.
2. Cho vào binh dung dịch enzim đà chuẩn bị, nhưng không được quá 4ml.
N ếu n h ư lượng này không đú thì chuẩn bị enzim đậm đặc hơn.
3. Cho thêm ngay 10ml dung dịch đệm (pH khoảng 5 ± 0,1). Lắc bình th ật
m ạnh tro n g vài giây và giữ 20 phút ở 40°c trong chậu ủ n h iệt (hoặc tủ ấm) tính từ lúc
cho đệm trong bình nước.
118
4. Cho thêm lm l chất chỉ thị.
5. C huẩn độ vối KOH rượu cho đến khi xuất hiện m àu xanh đậm.
6 . Lắc bình cho đến khi m àu biên m ất hoặc cazein kêt tủ a ta n hoàn toàn (tôt
nh ất cho mỗi lan cho là 0,5ml KOH ).
7. C huyên dung dịch vào bình cầu õOOml và rử a bình h a i lần bằng cồn vối
tòng th ê tích là 25ml. Cho đủ dung địch KOH để có lại m àu xanh.
8 . Cho thêm 175ml cồn sôi vào bình. Cho thêm dung dịch KOH cho đến khi có
m ầu hồng nhưng vản giữ m àu xanh đặc trư ng trong dung dịch.
9. Làm m ẫu kiểm tra như miêu tả ỏ trê n nhưng ch u ẩn độ ngay sau khi cho
đệm chứ không cần ủ n h ư m ẫu thí nghiệm .
Sự khác n h a u giữa chuẩn độ của m ẫu enzim không đun sôi (nghiên cứu) và m ẫu
enzim đun sôi (đốì chứng) là sô" đo hoạt tín h thuỷ phân protein của enzim.
d) Tính đơn vị proteinaza
Với lượng enzim nhỏ thì mức chuẩn độ là m ột phương trìn h đường th ẳn g với lượng
protein dùng. T ừ đó ta đo được mức độ thuỷ phân. Để có kết quả là đương th ẳn g chính
xác ta làm vài c h u ẩn độ vối các lượng enzim khác nhau. Nêu n h ư lượng papain đùng
quá lớn, mối liên hệ đường th ẳn g sẽ không còn nữa, còn nếu lượng p apain dùng là quá
ít thì kết quả sẽ không chính xác. Lượng enzim tạo ra sự khác b iệt khi chuẩn độ từ 0,6
-*• 1,2ml KOH 0,1 N là tốt nhất.
Đơn vị của p ap ain là lượng enzim, dưói các điểu kiện th í nghiệm tạo ra sự khác
biệt ohuẩn độ là lm l KOH 0 , 1N, m à sự khác biệt này được xác định từ đồ th ị hay tín h
toán hằng phướng pháp đại sô. Kết quả của m ẫu ban đầu được biểu hiện lả đơn vị/mg
hoặc là mg p ap ain cần th iế t để tạo ra (có) một đơn vị.
2• Phương pháp đo quang phố
a) Hoá chất
- D ung dịch n a tri p h o tp h at 0,05M: hoà ta n 7 ,lg N a 2H P 0 4 k h a n trong H 20 và dẫn

đến 1 lít. Cho thêm 1 giọt toluen như là c h ất bảo quản.
- Dung dịch axit xitric (CGH 80 7) 0,05 M: hoà ta n 10,5g ax it xitric trong H 20 để tạo
th à n h 1 lít, cho 1 giọt toluen đê bao quan.
- Cơ c h ất cazein: hoà ta n 5g cazein loại H am m ersten tro n g 250ml Na^HPO^ị

CỊ05M đên pH = 6,0 ± 0,1. K huấy n h an h dung dịch và cho liên tục a x it xitric clê n g ă n
ngừa cazein k ết tủ a, hoà loãng trong 10ml H 20 . Dìing ngay trong ngày.
- D ung dịch cìệm p h o tp h at - cystein đ in atri etylenđinitrilotetraxetic: hoà ta n 3,55g

N a 2H P 0 4 với 400m l H .,0 trong bình định mức 500ml. Cho vào 7,0g Na,2H 2 EDTA và
119
3,05g cystein HC1.H 20 , chỉnh đên pH = 6.0 ± 0,1 VỚI HC1 hoặc NaOH IN và pha loảng
đến õOOml với H 20 , dùng ngay trong ngày.
- Dung dịch axit tricloroaxetic (TCA) (CCl^COOH) - 30%: hoà tan 60g ax it
tricloroaxetic trong HoO và pha loảng đến 200ml vói H 20 .
(*Chủ ý : a n to à n khi dùng axit tricloroaxetic)

- Dung dịch p ap ain chuẩn: Cân chính xác lOOmg p ap ain ƯSP, cho vào bình định
mức 100ml và cho dung dịch đệm vào, hoà tan. Hoà loãng với dung dịch đệm. Sau đó
lấy 4ml dung dịch này pha vối đệm đến 100ml. D ùng trong vòng 30 phút.
b) Chuản bị m ẫ u
C ân chính xác lượng mẫu chứa hoạt tín h tương ứng với lOOmg papain chuẩn và
làm chính xác n h ư p h ầ n chuẩn bị dung dịch p apain chuẩn ơ trên.
c) Tiến h à n h th í nghiệm
1 . Cho vào 12 b ìn h thuỷ tinh cỡ 100ml (có n ú t đậy), mỗi bình 25ml cơ chất cazein.
Đ ánh dấu bình n h â n đôi (thí nghiệm được làm hai lần trừ m ẫu trắng): s v S 2 và S ‘ị cho
dung dịch p apain c h u ẩn và cho dung dịch m ẫu. Đ ánh dâu 4 bình còn lại (m ẫu kiểm
tra) S 1B, S2B, S8B và U 2H.
2. Cho 5; 2,5 và Oml dung dịch đệm lần lượt vào các bình Sj, S2> và các bình
kiểm tra S jB, S 2J3, &-ẶỊÌ- Cho 2,5ml dung dịch đệm vào U 2 và u 21*. Đ ặt tấ t cả các bình
vào chậu nước 40°c trong 10 phút.
3. Cho 5ml dung địch papain chuẩn vào mỗi bình kép s v ghi lại thòi gian là 0
p h ú t ngay tạ i thời điểm nhấc pipet ra lắc bình để trộn. Đậy nắp lại và đặt lại bình vào
chậu nưốc 40°c. Cho 7,5ml dung dịch papain chuẩn vào hai bình và làm như trên.
Cùng như th ê với h a i bình s.ị nhưng cho vào 10ml dung dịch papain chuẩn và cho vào
h ai bình Ư 2 7,5m l dung dịch papain đã chuẩn.
4. S au đúng 60 phút, thêm 15ml TCA 30% cho tấ t cả 12 bình và lắc m ạnh. Với 4
bình kiểm tra , cho lần lượt 5ml (Sjfl), 7,5ml (S 2J*) và 10 ml (S.jjj) đung dịch p ap ain
ch u ẩn vào và 7,5m l (U 2h) dung dịch mẫu. Đ ặt tấ t cả các bình vào chậu nước 40°c từ
30 -r 40 p h ú t và đê protein kết tủa hoàn toàn. Lọc qua giấy lọc (dịch lọc phải r ấ t
trong).
5. Đọc độ hấp th ụ (A) của dịch lọc ở 280nm với m ẫu kiếm tra của nó. Vẽ đồ th ị sô
đọc Sj, S 2 và S 3 vói nồng độ enzim à các nồng độ tương ứng theo đơn vị mg/ml của tổng
th ể tích p h ả n ứng là 50ml.
6 . Từ đồ th ị này tin h hiệu lực của m ẫu theo đơn vị USP của hoạt đò papain/m g.
Hiệu lực củ a m ẫu = c X (100/w) X (100/4) X (50/7,5) X u
120
Trong đó:
c = m g/m l th u được từ đồ thị chuẩn
w = mg mẫu
u = hoạt độ của papain ch u ẩn (đơn vị/mg).
d) Định nghĩa đơn vị hoạt tính enzim

Một đdn vị hoạt, tín h enzim là hoạt tín h mà giải phóng tương đương với 1 f.ig
tyrosin từ cơ c h ất cazein dưổi các điều kiện p h ả n ứng và ở nồng độ enzim mà giải
phóng 40 Ịig tyrosin/m l dung dịch th í nghiệm nồng độ p ap ain U S P chứa > 6000 đơn vị
papain/m g.
X. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PEPSIN BANG PHƯƠNG PHÁP ANSON
1. N gu yên tắc
Pepsin (persin A; EC3.4.23.1 từ m àng nhày dạ dày lợn) p h ân giải được

hemoglobin trong mòi trường axit. s ả n phẩm được hoà ta n trong axit tricloaxetic. Xác
định h àm lượng tirozin và trip to p h an hoà ta n nhờ thuốc th ử Folin - Ciocalteu.
2. Hoá chất
- D ung dịch hemoglobin 2% trong dung địch HC1 0,06N.
- D ung dịch ax it tricloaxetic (CCl.ịCOOH) 5%.

- D ung dịch NnOH 0,5N (2%).
- D ung dịch HC1 0,2N.
- D ung địch tyrozin lmM : cân 181,19 mg tyrozin hoà ta n và dán đến 1 lít bằng
dung dịch HC1 0.2N.
- Thuốc th ử Folin - Ciocalteu khi đừng pha loãng 3 lần bằng nưỏc cất.
Cách pha thuốc thử: Cho vào bình cầu đáy trò n dung tích 2000m l (có n ú t nhám )
7Q0ml nước, hoà ta n lOOmg n a tri w olfram at (N a 2W 0 2 (). 2H ?0 ), 25g natrim olip đ at
(N a 2MoO.|.2H 20 ) và thêm 50ml axit octophotphoric 85%, 100ml HC1 đặc - lắp ông làm
lạn h hồi lưu và đun hỗn hợp trong 10 giờ. Sau khi làm nguội dung dịch cho thêm
150mg LÌ 2S 0 ,j.H 20 , 50m l nước và cho cẩn th ậ n 5 giọt brôm . Tiếp tục đun bình thêm
15 p h ú t không có ông làm lạnli đế đuổi brôm th ừ a. S au khi làm nguội bình, th êm nước
đến 1 lít và lọc (thuốc th ử phải có m àu vàng, n ếu có m àu xanh thì phải xử lý brom lần
th ứ hai). Tiếp tục pha loãng để n h ậ n được dung dịch a x it IN (bằng cách chuẩn độ nhờ
dung dịch NaOH IN có chỉ thị phenolphtalein). Thuốc th ử được giữ trong lọ m àu tối
và để nơi lạnh. S au 2 -3 th án g (lung dịch chuyển sang m àu xanh thì lại thêm vài giọt
brom và đun SÔI 15 p h ú t, dung dịch có m àu vàng trở lại. Trước khi dùng, thuốc thử
được pha loãng 3 lần b ằn g nước cất.
121
3. D ụng cụ và ináy inóc
2 ông li tâm , các ông nghiệm, 2 pipot l m Ị pipet 0 ,ỉm l, 2 pipet 10ml, 3 pipet 5ml,
nồi ôn nhiệt, máy so m àu.
Cho vào hai ống li tâm hoặc hai ông nghiệm (A và B) 5ml cd ch ất hemoglobin, đặt
vào nồi ổn n h iệt ở 25°c. Sau khi đã cân bằng n h iệt độ giữa ông nghiệm và nồi ổn
nhiệt, cho vào ỏng A 0,1 nil dịch chiêt enzim và 0,9m l nước hoặc Im l dung dịch pepsin,
tiếp tục đ ặt vào nồi ổn n hiệt 10 p hút (chính xác) và làm ngừng p h ả n ứng bằng cách
cho thêm lOml CCljCOOH 5%. Cho vào ống li tâm B (ống kiểm tra) đồng thòi dung
dịch CH 3COOH và enzim . Sau 30 phút lọc hoặc li tâm . Lấy õml mỗi dung dịch lọc (thí
nghiệm nghiên cứu và kiểm tra) cho thêm lOml NaOH 0,5N và 30ml thuốc th ử Folin -
Ciocalteu đă pha loăng, trộ n đểu, đo độ hấp thụ trên m áy so màu ống thí nghiệm (ông
A) và ông kiểm tra (ông B) ở bưốc sóng 720nm (nêu máy so m àu chỉ có bước sóng
660nm cùng được).
5. D ựng đường ch u ẩn tyrozin
Cho vào các ống nghiệm 0.2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1,0m] dung dịch tyrozin (từ 0,2 đến
ljim ol tyrozin), dẫn đến th ê tích 5ml bằng dung dịch HC1 0,2N, cho thêm 10ml dung
dịch NaOH 0,5N và 3m l thuốc thử Folin - Ciocalteu đã pha loãng, trộn đều. Đo độ hấp
th ụ ỏ' bước sóng 720nm (ở ống kiêm tra được th ay dung dịch tyrozin bằng HC1 0,2N).
Vẽ đồ th ị chuẩn. Kết quả th í nghiệm được tín h theo đồ thị chuẩn.
6. Tính kết quả
T rên cơ sở giá trị h ấ p th ụ của m ẫu nghiên cứu đôi chiếu với sô" lượng Ịimol tyrozin
đường ch u ẩn và tín h theo đơn vị Anson. Một đơn vị Anson là sô lượng enzim ơ điểu
kiện th í nghiệm tiêu c h u ẩn (6 ml dịch ủ, 100 mg hemoglobin, nhiệt độ 35,5°C) thuỷ
phân hemoglobin với sô lượng sản phẩm thuỷ phân hoà ta n trong axit tricloaxetic xẩy
ra trong 1 phút, tương ííng lỊ-tmol tyrozin ỏ nhiệt độ 25nc . hoạt độ pepsm nhỏ hơn 1,82
ở 35,5°c. Vì th ê giá trị cùng độ m àu ở 25°c tính theo hằng sô' này (1,82) là của 5ml
dung dịch từ 16ml dung dịch thí nghiệm . Tông sô thê tích là 60ml, vì vậy phải n h â n
với (16:5), hay là 3,2. Thời gian ủ 10 phút, nên khi tính 1 phút phải chia cho 10 .
A umol tyrozin X 3,2 X 1,82
Anson = ---------------------------------
10 X a
Trong đó: a • sô ml dung dịch nghiên cứu lấy đê xác định,
1,82 - hằng số’giá trị cường độ m àu ỏ 25°c,

3,2 - tỉ lệ thế tích m ẫu th í nẹhiệm .
10 - thòi gian ủ (phút).
122
XL XÁC Đ ỊN H HOẠT ĐỘ PE R O X ID A ZA
Enzim peroxidaza r ấ t phổ biến trong cơ thế’ động v ậ t và thực vật; đóng vai trò
quan trọng trong quá trìn h oxi hoá. Peroxidaza xúc tác cho p h ản ứng oxi hoá nhiều
polyphenol và am in thơm tạo th à n h các sản phẩm khác nh au .
1. Xác địn h hoạt độ p eroxidaza bằng phương pháp ch u ẩn độ
a) Nguyên tắc
Dựa vào sự 0X1 hoá pyrogalol tạo th à n h purpurogalin khi có H 20 2. Purpurogalin

có dạng k ết tủ a m àu nâu, không ta n trong nước nhưng dễ ta n trong ete và H 2S0,J đặc.
OH 0 ---H
+3HP, + 5H 2o + c o ,
pyrogalol purpurogalin
Tuỳ thuộc vào cơ ch ất mà pH tối thích của peroxidaza có th ể th ay đổi m ột ít. Đa sô"
trường hợp th í nghiệm được tiến h àn h trong môi trường kiềm yếu hoặc tru n g tín h và ỏ
n h iệt độ 20°c. Độ nhạy với n h iệt độ của peroxidaza rấ t cao, nó có th ể m ất h o ạt tín h
ngay sau k h i đ u n sôi r ấ t nhanh. Độ nhạy của nó vối sự dư H 20 2 cũng rấ t lổn, do đó
phải tiến h à n h xác định hoạt độ của peroxidaza trong th ể tích lân và pha loãng.
b) Nguyên Ỉiêìỉ
Dịch ch iết peroxidaza : lấy 2g nguyên liệu nghiển cẩn th ậ n trong cối sứ vối 20ml
dung dịch đệm p h o tp h at pH = 8 ,0 ; có th ể thêm 4 - 5 giọt toluen hoặc clorofom (có bột
th u ỷ tinh). C huyển hỗn hớp vào bình định mức 100ml, định mức đến vạch bằng dung
dịch đệm nghiền. Li tâm lạn h hoặc lọc lấy dịch trong.
c) Hoá chất
- Đệm p h o tp h a t pH = 8,0.
- T oluen hoặc clorofom.
- D ung dịch pyrogalol (CflHflO^ 1 %.
- D ung dịch H 20 2 1%.
- H 2S 0 4 đặc.
- D ung dịch H.^SOị 80%.
- D ung dịch KMnO t 0,1N.
123
d) Tiến h à n h
1. Cho vào bình nón cỡ 250ml; 10ml dung dịch pyrogaỉol 1% mới pha, lm l
H ^0 2 1%, ủ ở n h iệ t đệ 20 -r 25“c. Cho thêm vào hỗn hợp 40ml dịch chiết enzirn (cũng ỏ
nhiệt độ 20 *r 25°C). giữ phản ứng trong khoầng thời gian nhất định (12 4- 20 giờ) tuỳ
thuộc vào hoạt độ của enzim.
L àm th í nghiệm kiểm tra song song : cho vào bình nón 250ml 40ml dung dịch
enzim, đun 10 p h ú t, làm nguội và cho thêm lOml pyrogalol 1%, lml H 20 2 1% như
m ẩu th í nghiệm .
2. Trong th ò i g ian phản ứng, purpurogalin kết tủ a m àu nâu. Thêm vào bình 1
- 2ml H 2SO 4 đặc. Lọc kết tủa bằng phễu thuỷ tin h xôp (G-Z). Rửa kết tủa bằng nước
cất cho đến khi nưổc rử a không còn khử KMn(),ị. Sau đó hoà ta n kết tủa trực tiếp trên
phễu vói 10 - 20ml H.,SO,j 80%. Rửa phễu lọc bằng nùóc cất (gấp 7 - 20 lần lượng axit
sứ dụng, nếu pha loảng ít sè khó chuẩn độ, nêu loãng quá kết tủa purpugalin trỏ lại).
3. Đ un nóng dung địch đến 00 - 60°c và chuẩn độ bằng dung dịch K M n 0 4
0,1N đến khi x u ấ t hiện m àu hổng bển trong 30 giây (m àu (lung dịch sẽ chuyên từ đỏ,
n âu sẩm, xanh n h ạ t và cuối cùng là m àu hồng khi có dư 1 giọt KMnO^l.
e) Tính kết qua
H oạt độ của peroxidaza được hiển thị bằng sô" ml K M n0 4 0,1N tương ứng vối lg
m ẫu sau 15 p h ú t tác dụng và được tín h theo công thức sau :
X = — -
w
Trong đó: a - số ml dung dịch KMn 0 4 0,1N dùng để chuẩn độ mẩu thí nghiệm,
b - sô ml dung dịch K M n0 4 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra,

w - khcVi lượng mau tưdnEC ứng với 40ml dịch chiết enzim.
2. Xác din h hoạt đô peroxidaza bằng phiíơầig pháp so màu
a) Nguyên tắc
Xác định hàm lưựng purpurogalin x u ất hiện trong quá trình oxi hoá pyrogallol
dưới tác dụng của peroxidaza khi có H 20 2. Đo lượng purpurogalin bằng cách (ìo độ hấp
th ụ ở 430nm.
b) Hoá chất
- Dung địch p u rp u ro g alin 0,2M.
• Dung dịch 0,1M.
- Dung dịch H.^SO ị 5%.
124
- Đệm veronal 0 ,lM ; pH = 6,0.
- D ung dịch p u rpurogalin 0,4m g/m l trong H ọS 0 4 1%.
c) Thang chuẩn
T hang c h u ẩn có hàm lượng purpưrogalin từ 0,05 - 0,4 mg/ml.
d) Tiến hành
1 . Lấy lg h ạ t n ảy mầm , nghiển n át, thêm đệm veronal từ từ đên thể tích cuỏi
cùng là 10ml. Li tâm lạ n h 20000 vòng trong 20 p h ú t’ lấy dịch trong để xác định hoạt
độ enzim.
2. Cho vào ông nghiệm : 0 ,lm l dung dịch pyrogallol 0,2M; l,0 m l đệm veronal;
l, 2 ml nước; 0,5m l dung dịch H 20 2; 0 ,2 ml dịch chiết enzim.
3. Ú hỗn hợp p h ả n ứng ở 30°c trong 10 phút. Cho thêm lm l dung dịch H 2S 0 4
5% đế ngừng p h ả n ứng.
e) Cách tính
H oạt độ enzim được tín h theo giá trị OD giữa ông th í nghiệm và ống kiểm tra, đối
chiếu với lượng p u rp u ro g alin từ đồ th ị chuẩn.
Một đớn vị h o ạt độ là lượng enzim trong 10 p h ú t xúc tác đê tạo th àn h lfimol
purpurogalin.
XIL XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PHOTPHATAZA KlỂM v à PHOTPHATAZA AXIT

T H E O PH Ư Ơ N G P H Á P K IN G - A R M ST R O N G
P h o tp h ataza th u ỷ p h â n đ in atri phenyl photphat, số lượng phenol được tín h ra xác

định h o ạt độ của enzim . Phenol được xác định bằng phương pháp so m àu vối thuốc
thứ Folin - Ciocalteu. K ết quả được tín h bằng đơn vị King - A rm strong theo mg phenol
được giải phóng từ đ in a tri phenyl p h o tp h at bởi enzim có trong 100 ml huyết th a n h ỏ
37uc tro n g 15 phút, pH = 10 cho p h otphataza kiềm và trong 60 phút, pH = 4,9 cho
p h o tp h ataza axit.
2. Hoá ch ấ t
1. Dung dịch đệm cacbonat, pH = 10: hoà ta n 6,36g N a 2COHvà 3,36g N aH C 0 3

trong nước và dẫn nước đến 1000 ml.
2. D ung dịch đệm x itrat, pH = 4,9: 21g ax it xitric hoà ta n trong nưốc, cho
thêm 188ml NaOH IN và dẫn nừớc đến 500ml. Mỗi lần th í nghiệm phải chỉnh pH =
4,9 bằng HC1 IN hoặc NaOH IN cho thêm vài giọt clorofom. Giữ ở trong lạnh.
125
3. Dung dịch đinatri phenyl photphat 0 ,218 % (cơ chất). Dung (lịch đun sôi,
làm nguội, cho thêm vài giọt clorofom. Dung dịch không bển.
4. Dung dịch Folin - Ciocalteu (chương 7.V.2). Để phản ứng. lấy lm l dung dịch
Folin - Ciocalteu pha loãng với 2 ml nước.
5. Dung dịch N a 2CO^ 15%.

6 . Dung dịch chuẩn phenol chứa lm g phenol trong lm l (clung dịch phenol
0,1% trong HC1 0 , 1N). Giữ trong lạnh.
3. D ụng cụ và máy IT1ÓC
Ống nghiệm , 2 ông li tâm lOmỉ, 1 pipet 0,2ml> 5 pipet 2ml, 2 pipet 5ml, nồi ủ, máy
li tâm , máy so m àu.
Cho vào ông li tâm 2ml đệm cacbonat, pH = 10 (cho photphataza kiểm) hoặc đệm
x itrat, pH = 4,9 (cho photphataza axit) và 2 ml cơ chất. Sau vài phút ủ nóng trong nồi
ủ ở n h iệt độ 37°c qua 15 phút đối vối xác định photphataza kiểm, fi0 p h ú t đổì với
p h o tp h ataza axit. Tiếp tục cho thêm l , 8 ml dung dịch Folin - Ciocalteu pha loãng, lắc
kỹ và li tâm . Lấy 4m l dịch li tâm để so màu.
Ông kiểm tra được tiến hành bằng cách lấy 2 ml đệm và 2 ml cơ chất, cho thêm
0,2m l h u y ết th a n h và lập tức cho thêm l ?8 ml dung dịch Folin - Ciocalteu. Lắc, li tâm
và lấy 4ml dịch li tâm . Cho vào cả 2 ống nghiệm 2ml N a 2CO:, 15% và cho vào nồi ủ ỏ
37°c trong 10 phút. Đo độ hấp th ụ ỏ bưóc sóng 680nm so với nước.
Dựng đường chuẩn: dung dịch chuẩn phenol có nồng độ từ 0,002 - 0,1 mg trong
lm l, cho 2 ml từ n g dung dịch pha ỉoàng (ổng kiểm tra thay dung dịch chuẩn bằng 2 ml
nước). Cho thêm 12ml dung dịch Polin - Ciocalteu: 0,8ml rutóc là 2ml N a 2C(Xj 15%.
Lắc đều, đ ặt vào nồi ủ ơ 37°c trong 10 phút và sau đó đo độ hấp th ụ so vối ống kiểm
tr a - dựng đường chuẩn.
H iệu sô" hấp th ụ của ống kiểm tra và ống thí nghiệm đối chiếu vổi mg phenol của
đ ư òng c h u ẩ n v à n h â n k ế t q u ả đó với 750 ( X — = 750); để tạo m à u c ủ a 4 m l dịch ủ
0,2 4
chứa 0,2m l h u y ết th an h . Kết quả được tính theo đởn vị King - Arm strong (K-A).
T ính theo đơn vị quốc tê (I): Ịimol phenol/phút/lOOOml.
ĐỔI vối p h otphataza kiếm
1 đơn vị K - A = X — X 10 = 7,09 I
94,11 15
126
Đỏi với photphataza axit
. . . . 1000 1 _ -
1 đơn vị K - A = — X— X 10 - 1,77 1
94,11 60
Chỉ tiêu sinh lý đôi vối photphataza kiểm: 3 - 1 3 đơn vị K - A (25 • 291)
dôi VỚI photphataza axit: 3 đơn vị K - A (5,51)
XIII. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PROTEINAZA THEO PHƯƠNG PH Á P ANSON CẢI TIÊN
1. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa vào sự thuỷ phân cơ chất protein (cazein hoặc hemoglobin)
bơi enzim. Sau đódiệt enzim và kết tủa protein chưa bị th u ỷ phân bằng ax it
tricloaxetic. Định lượng sản phẩm được tạo th àn h trong phản ứng bằng phản ứng màu
vói thuốc th ử Folin, kết quả phân tích dựa vào đồ thị chuẩn tyrozin.
Đơn vị hoạt độ proteinaza là lượng enzim trong một phút ỏ 3 0 °c chuyển hoá được
một lượng cazein tương đương với một micromol tyrozin bằng 0,181mg.
Các proteinaza có nguồn gốc khác nhau được xác định ở những pH khác n h au tuỳ
thuộc vào tín h chất của proteinaza.
- P roteinaza axit pH = 2,5 ± 0,2
- P rotem aza axit pH = 5,6 ± 0,2
- P roteinaza trung tính pH = 7,2 ± 0,2
- P ro tein aza ki n pH = 9,5 ± 0,2
а) p H d u n g d ịch đ ệm tá ch c h ấ t p r o te in a z a
- P roteinaza axit (pH đệm 2,5): cân lg nguyên liệu nghiền với dung dịch đệm
pH = 2,5; 0,1M. Đô dịch nghiền vào bình định mức 100ml và cho dung dịch đệm đến
vạch ngấn.
- P roteinaza axit (pH đệm 5,5) củng tiến hành như trên nhưng th ay đệm pH = 2,5
b ằn g đệm pH = 5,5.
- Proteinaza trung tính (pH đệm 7,2)tiến hành như trên. Dừng đệm pH = 7,2; 0,1M.
- P ro tein aza kiềm (pH đệm 9,5) tiến hành như trên, dùng đệm pH = 9,5; 0,1M.
Dùng đệm Britton và Robinson 0,1M.
б) D ung dịch cazein 2%
- Đối vỏi proteinaza axit (pH = 2,5): cân 2 gam cazein hoà ta n trong 90m l dung
dịch đệm đa năng B ritton pH = 5,5, sau đó điếu chỉnh pH dung dịch xuống 2,5 bằng
cách cho thêm 3 - 3,5tnl HC1 IN.
127
Khi axit hoá dung dịch cazein bằng HC1 xu ông dưới pH 5,1 thì dung dịch bị vẩn
đục, nếu đến pH = 3,1 V 3,2 thì kết tủ a hoà tan dần. Ở pH = 2.5 kêt tủa hoà tan hêt.
Vì vậy phải thêm n h a n h HC1 cho tới pH = 3 và khuấy liên tục. Sau đó cho thêm từ n g
giọt HC1 đê dung dịch có pH = 2,5. Chuyển dung dịch vào bình định mức 100ml và chin
đến vạch bằng đệm B ritton pH = 2,5.
- Đối vổi proteinaza axit (pH = 5,5) củng tiến h à n h như trên, nhưng chỉ dùng vài
giọt dung dịch HC1 IN để điểu chỉnh pH về 5,5. D ùng đệm B ritton định mức đến
lOOml đệm pH = 5,5
- Đối vói proteinaza trung tinh (pH - 7,2): hoà ta n 2g cazein vào 90m l dung dịch
đệm B ritton pH = 7,2. Nếu pH dưng dịch th ấp hơn 7,2 thì dùng vài giọt N aO H IN đế
điểu chỉnh. Đ ịnh mức đên 100ml bằng đệm B ritton pH = 7,2.
- Đôi vối proteinza kiềm (pH = 9,5): hoà ta n 2g cazein vào 90ml dưng dịch đệm
B ritton pH = 9,5 thêm vài giọt NaOH IN để điều chỉnh pH = 9,5 định mức đến 100ml
bằng đệm pH = 9,5
c) Điêu kiên thuỷ phản
Nổnẹ độ protein thuỷ phân là 1% (nồng độ cơ ch ất trong dung dịch) tro n g vòng 10
p h ú t ở nhiệt độ 30°c . Trước khi tiến hàiilì p h ả n ứng th u ỷ phân, (lung dịch cơ ch ất và
dung dịch enzim đều phải đưa đên 30!>c. Làm ngừng p h ản ứng bằng cách cho một
lượng dung dịch axit tricloaxetic 0,3M bằng th ể tích hỗn hợp p h ản ứng, trộ n đều, giữ ớ
30°c trong 20 phút, lọc lấy dịch. Lượng enzim cần cho p h ả n ứng phái tính to án để dư
nhiều lượng co' chất, m ật độ quang của dung dịch đem so m àu nằm trong phạm VI
0,07 - 0,45 đốì với proteinaza ax it và 0,2 - 0,6 đôì vói proteinaza tru n g tín h và kiểm.
d) Dung dich enzim proteinaza
Lấy dung dịch enzim proteinaza từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật hoặc dịch tách
chiết từ nguyên liệu khác.
Cho vào 2 ông nghiệm , mỗi ốnự 20ml cơ chất, đặt vào chậu ổn nhiệt ỏ 30°c. Sau
10 p h ú t cho vào mỗi ổng 20 ml dung dịch enzim (cũng ỏ 30°C), lắc trộn đểu và để 10
p h ú t ở 30uc . Sau đó cho vào mỗi ông nghiệm 4 ml dung dịch axit tricloaxetic 0,3M, lắc
trộn n h an h đê protein dư và các họp chất cáo p h ân từ khác kết tủa, giữ các ông
nghiệm ở 30°c thêm 20 phút nửa rồi lọc lấy dịch. Lấy Im l dịch lọc và õml dung dịch
N a:;C(X Q,5M cho vào ông nghiệm , trộ n đểu và thêm lm l thuốc thứ Folin. Sau 20 p h ú t
phân ứng, dung dịch có m àu xanh da tròi, m ang đo trê n m áy so màu.
Song song làm th í nghiệm kiếm tra bằng cách cho thêm các dung dịch hoá chất
theo th ứ tự ngược lại: cho vào ông nghiệm 20ml dung dịch enzim, 4ml dung dịch axit
tricloaxetic 0,3M. Tiên hành phán ứng trong 10 p h ú t ỏ 30nc . Tiếp tục cho thêm 20ml
cỉung dịch cơ c h ất và giữ 20 phút ỏ nhiệt độ 30'C , lọc lày dịch. Lấy ] ml (lung dịch lọc,
thêm õml N a 2CO.) 0,õM, khuấy trộn đều và clio thêm lm l thuốc thử Folin. Dung dịch
nghiên cứu và kiểm tra đo trên máy so màu ỏ bưỏc sóng 670nm.
c) D ự n g đ ư ờ n g chuãtỉ tyrosin
P h a dung dịch gốc tyrosin co nồng độ 10 M (1 fimol/ml): can 181,12mg tyrosin,

hoà ta n trong dung dịch H f'l 0 ,2 N rồi (lịnh mức đên 10ml bằng HC1 0,2N (nêu có cân
chính xác chỉ cần cán ]S.] 18mg tvrosin hoà vào 100ml HC1 0,2N). Từ dung dịch gôc
pha th à n h dãy nồng độ dung dịch như sau:
Tyrosin (ml) 0,1 0.2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,5
HC1 0,2N (ml) 0,9 4,8 4.6 4.4 4.2 4,0 3,5
Nổng độ
ty ro sin 0.02 0,04 0.08 0,12 0,16 0,20 0,30
(1 ỊamoVml)
„ .
Mỗi dung dịch trên lấy Im l cho vào 7 ông nghiệm , cho thêm mỗi ông õml N a 2CO<j
0.5M và lm l thuốc th ứ Folin, lac đểu.
M au đôi chứng thay lm l dung dịch tyrosin bang lm l nước cất. Giữ hỗn hợp phản
ứng tro n g 20 ph ú t, sau đó đo trên máy so màu ở bưốc sóng 670nm (chính xác là
720nm). Lấy số liệu tru n g bình của hai ống nghiệm dựng đường ch u ẩn tyrosin vối trụ c
hoành là nồng độ tyrosin (c) tính theo ị.imol/gam, trục tu n g là m ật độ quang (OD)
H oạt độ proteinaza (Help) tín h bang đơn vị/gam (ctv/g) hay đơn vị/ml (đv/ml) theo
công thức:
OD X 4 X 1000
Hdp = —----------------
a X 10 X w
Trong đó: OD - m ặt độ quang đo được của mẩu,
4 - tỷ lệ thê tích của hỗn hợp phẩn ứng với dung dịch enzim. Sau khi
thêm axit triclolaxe tic (TCA):
( 2 ml cơ chất (tyrosin) + 2 ml (enzim) + 4ml TCA
2 ml (enzim)
a - đương lượng tyrosin xác địiih theo đường c h u ẩn (m ật độ quang mà

1 fimol tyrosin có trong lm l dung dịch chuẩn, khi p h ản ứng cho thuốc
th ứ Folin.),
10 - thời gian thuỷ phân cơ chất (phút),
w - lượng chê phẩm enzim (lấy để thuỷ p h â n cơ c h ất tyrosin tín h bằng

mg có trong lm l dung dịch enzim),
1000 - hệ sô* chuyển sang gam chê phẩm .
129
XIV. XÁC Đ ỊN H HOẠT ĐỘ UREAZA T H E O PH Ư Ơ N G P H Á P C H TJAN độ
1. N guyên tắc
U reaza xúc tác cho p h ản ứng th u ỷ p h ân ure tạo th à n h am oniac và COg
H 2N - c - NH 2 + H ô = 2NH;( t +C0 2 t
II
0
D ùng HC1 chuẩn độ để xác định lượng am oniac
2. Hoá ch ấ t
- D ung dịch chi a x e ta t [Pb (CH.,COO).J 5%.
- D ung dịch u rê 2%.
• D ung dịch HC1 0,1N.
- Thuốc th ử hỗn hợp.
- D ung clịch ureaza: 100 gam h ạ t đậu tương xay nhỏ th àn h bột, cho vào bình, cho
th êm 200m l ete và lắc 10 - 15 phút. Lọc dung dịch qua phễu lọc B urchner. Bột đậu
được rử a 5 - 6 lần bằng ete. S au khi loại mỏ, bột được rả i đểu trên giấy lọc phơi ở nhiệt
độ phòng đến khô. Bột được giữ trong lọ khô, sau thời gian dài vẫn có th ể dùng để
tách ureaza.
C ân 20 - 30 gam đậu tương đã loại mõ, thêm 5 lầ n th ê tích nưốc cất. lắc đêu,
cho vài giọt toluen, để lõ - 20 giò ỏ 5°c. Li tâm 3000 vòng/phút n h ận được dung
dịch enzim.
L ấy 2 bình nón dung tích 100ml, cho vào mỗi bình 10ml dung dịch ureaza. Bình 1
(b ìn h t h í n g h iệ m ) để n g u y ê n , b ìn h 2 (b ìn h k iểm tr a ) đ u n sôi 2-3 p h ú t, s a u đó là m lạ n h
đến n h iệt độ phòng. Cho vào mỗi bình lOml urê 2%, lắc đều, để vào tủ ấm 30°c trong
30 phút, tiếp tục thêm vào mỗi binh 5ml dung dịch chì a x e ta t 5%, ch u ẩn độ cả 2 bình
b ằn g dung dịch HC1 0,1N.
H o ạt độ u reaza là sô mg nitcỉ được giải phóng từ urê dưới tác động của ureaza cỏ
trong dịch enzim đă xúc tác trong 1 ph ú t. H oạt độ enzim được tính trong 1 gam mau
theo còng thức sau:
(a “ b) X 1,4 X Vị
30 X v 2 7 w
130
Trong đó: X - hoạt độ ureaza,
a - sô ml HC1 0,1N dùng để chuẩn độ bình th í nghiệm ,
b - số ni 1 HOI 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiếm tra,

30 - thòi gian phản ứng (phút),
1,4 - h ệ số c h u y ể n th à n h lượng n itở ,
V] - th ế tích m ầu chiết r ú t lấy th í nghiệm (ml),
- tông thê tích m ẫu chiêt r ú t (ml),

w - khôi lượng m ẫu chiêt rú t enzim (g).
131
C hư ơng 10
ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN
1. ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN c THEO PHƯƠNG PHÁP CHUAN độ
1. Phương pháp sử d ụ n g 2,6 - diclophenol - in od op h en ol - DPIP
a) Nguyên tắc
V itam in c (axit ascorbic) hoà ta n tl'ong nước, dễ bị p h â n huỷ dưới tác (lụng của
các chất oxi hoá và bền trong môi trường axit. Vì vậv người ta thường chiêt axit
ascorbic của m ẫu phân tích bang các dung dịch axit như axit axetic 5%, axit
m etaphotphoric 2 %.
Phương pháp dựa trê n nguyên tắc axit ascorbic có khả năng oxi hoa khử th u ậ n
nghịch ch ất chỉ thị 2 ,6 -điclophenol inđophenol (DPIP). Dựa vào lượng chất chỉ thị tiêu
tôn tín h ra lượng axit ascorbic có trong m ẫu phân tích. P hản ứng xảy ra như sau:
C hất chỉ thị này có khả n ăn g chuyên m àu khi pH của môi t.rưdng thay đối từ kiềm
sang axit, c h ất chỉ th ị chuyển từ xanh sang hồng (DPIP có m àu xanh trong môi trường
kiểm và môi trường axit yêu, có m àu tím trong khoảng pH từ 4 đôn 5 và có màu hồng
ỏ pH < 4).
b) Hoá chất
- Dung dịch HC1 1% hoặc CH.jCOOH 5%.
- Dung dịch ax it m etaphotphoric (HPO ị) 2% hay axit axetic(CH;.,COOH) 1%.
- Dung dịch am oni oxa]at(C 2HHN.,0.1.H 20 ) bão hoà.

. Tinh th ể KI.
- Dung dịch H 2S 0 4 2%.
- Axit ascorbic (vitam in C) tin h khiết (bảo quản kín trong lọ màu tôi).
- Dung dịch hồ tin h bột 1 %.
132
- Dung dịch thuốc chỉ thị DPIP 0,001 N: cân 0,15 gam D PIP cho vào binh định mức
dung tích 500ml, thêm 3ỗ0ml nước cất, cho tiếp dung dịch đệm p h o tp h at pH = 6,9-r7,0
đến vạch mức. Vỉ trong nước thuốc thử bị phá huỷ n h an h nên được pha với dung dịch
đệm. Thuốc thư DPIP được báo quản trong hình có m àu ở nơi tối (không quá 7 ngày).
- D ung dịch đệm photphat pH = 6,9-r7,0: trộn 2 th ể tích KH.^POị (9,075 gam
KHọPO,j tro n g 1 lít nước cat) và 3 th ể tích Na.jHPOị (ll,8 6 7 g N a^ H P O ^ H ọ O trong 1
lít nước cất) với n h au trước khi đem dùng.
c) Tiên hành
1. C ân 10 - õOg rau tươi hoặc õ - lOg sản phẩm đóng hộp, tu ỳ theo hàm lượng
vitam in c có trong từng lọ nguyên liệu. Cho m ẫu vào côi sứ.
2. Cho thêm 4,5m l HC1 1% (hoặc CH 3COOH 5%) vào côi (ngập kín m-ẫu). Khi
lấy m ầu trá n h dùng dụng cụ bằng sắ t hoặc bằng đồng. Nghiền m ẫu không quá 10
phút.
3. Cho dịch nghiền vào bình định mức 100ml. Cho thêm 25ml a x it m eta-
photphoric 2% (hoặc chì a x etat 5%) đê loại bỏ protein. Lắc đểu, tiếp tục cho thêm HC1
1% (hoặc ax it oxalic 1 %) để trán g cối và th êm đến vạch mức .
Khi th í nghiệm với các mẫu động vật thì dùng ax it tricloaxeticíCCl^COOH)
20%, sao cho nồng độ của nó đạt 5% trong dung dịch (25ml). Trong trương hợp không
cỏ axit m etaphotphoric (HPOh) hoặc oxalic (C2H 20 4) có thê dùng HC1 1% hoặc
CH^COOH 5%. Lắc và đê yên 10 phút, lọc.
4. D ù n g p ip e t lấ y õm l dịch c h iế t lọc cho vào b ìn h n ó n õOml, th ê m 5 m l d u n g

(lịch am oni oxalat bão hoà, 10ml nước cất và ch u ẩn độ bằng dung clich D PIP cho đến
khi x u ấ t hiện m àu hồng bền (không m ất m àu trong 10 phút). Trong trường hợp dùng
ax it oxalic th ì không cần cho thêm amoni oxalat nữa.
Song song làm th í nghiệm kiếm tra với các hoá ch ất sử dụng.
*Chú ý: Khi xác định vitam in c trong m ẫu th í nghiệm phải p h â n tích ít n h ấ t 2
m ẫu, mỗi m ẫu 3 bình th í nghiệm. Kết quả ch u ẩn độ 2 lần không sai khác quá 0,03ml
D PIP 0,001N.
Thời gian chuẩn độ không quá 2 p h ú t và lượng thuốc th ử D PIP dùng để chuẩn độ
khoảng từ 1 - 2 ml (không quá 2 ml hoặc ít hơn lm l).
d) Tính kết quả
H àm lượng vitam in c (mg%) tính theo công thức.

ỵ _ (a - b) X f X V X 100
5 Xw
T rong đó: a - sô ml dung dịch DPIP 0,001N dùng c h u ẩn độ bình th í nghiệm ,
b - sô" ml dung dịch D PIP 0,001N dùng chuẩn độ ở bình kiểm tra ,
133
f - hệ sô' dung dịch chuẩn,
V - th ể tích dịch chiết v itam in c (ml),
w - khối lượng m ẫu th í nghiệm (g).
Xác định hệ sô" f: hoà ta n 1 - l,5m g ax it ascorbic vào 50m l H 2S 0 4 2%. Lấy 5ml
dung dịch đó và chuẩn độ bằng dung dịch D PIP 0.001N cho đên m àu hồng bền. Lấy
vào bình định mức khác 5ml dung dịch axit ascorbic trên , th êm m ột ít tư ih th ế KI (3 -
5mg) và 5 giọt hồ tin h bột 1%. C huẩn độ bằng dung dịch KlOg 0,001 N cho đến khi
x u ất hiện m àu xanh. Hệ sô" f được tín h theo công thức:
£ _ 0,088 X a
" b
Trong đó: 0,088- sô" mg axit ascorbic ứng vối Im l dung địch K IO '4 0,001N (giống
với lm l dung dịch D PIP 0,001N).
a - sô" ml dung dịch K IO 3 0 ,00 1 N dùng để c h u ẩ n độ õm l dung dịch ax it

ascorbic.
b - sô" ml dung dịch D PIP 0,001N dùng để c h u ẩ n độ 5m l dung dịch

ax it ascorbic.
2. Phương pháp sử dụng io t
a) Nguyên tắc
V itam in c có th ể khử dung dịch iot. Dựa vào lương iot bị k h ử bởi v ita m in c có
trong mẫu, suy ra hàm lượng v itam in c .
b) Hoá chất
- Dung dịch HC1 5%.

- Dung dịch iot 0 ,0 IN.
- Dung dịch tin h bột 1%.
c) Tiến hàn h
Cân 5g lá th ìa là tươi, nghiển nhỏ trong cối sứ vối 5m l HC1 5%, n g h iền kỹ, cho
vào ổng đong (hoặc bình định mức), dẫn đến vạch 50ml bằng nước cất. K huấy đều, lấy
20ml dịch nghiền cho vào bình nón dung tích lOOml, c h u ẩn độ b ằ n g dung dịch có
tin h bột làm chỉ thị m àu cho đến m àu xanh.
d) Tính kết quả
Hàm lượng vitam in c được tín h theo công thức sau:

Y0/ V x V j x 0 ,0 0 0 8 8 X 100
-X. /0 = ----------------------------------
v 2 Xw
134
Trong đó: V - sô ml dung dịch iot 0,01N dùng chuẩn độ,
V ị - th ể tích (lịch m au thí nghiệm (50ml),
v 2 - th ế tích (lịch m ẫu lay để xác định (2 0 ml),

w - khôi lượng mấu (g),
0,00088 - số gam vitam in c tướng ứng với lm l clung dịch iot 0,01 N.
II. Đ ỊN H L Ư Ợ N G VITAM IN B 2 BANG PH Ư Ơ N G P H Á P HUỶNH QUANG
Sự p h á t q u an g có thê được hiểu là năng lượng được tách ra khi các nguyên tử bị
kích thích bởi các chùm sáng có bước sóng tới hạn, tương tự như hiện tượng lân quang.
Tuy nhiên, sự khác nhau giữa hai hiện tượng này là p h á t huỳnh quang giải phóng
ngay lập tức n ăn g lượng ánh sáng hấp th ụ từ một nguyên tử hay phân tử, còn lân
quang giải phóng từ năng lượng hấp thụ. c ả hai đểu là sự p h á t quang.
Rất nhiều hợp chất giàu electron, ví dụ hợp chất có chứa hai hoặc nhiều nôi đôi
liên hợp và do có 7r-electron nên phát huỳnh quang.
Các electron của một phàn tử tồn tạ i trong điểu kiện năng lượng th ấp n h ấ t (mức
n ă n g lượng th ấ p n h ấ t của trạn g th ái cơ bản) vì các electron này không ổn định trong
bất. cứ một bậc n ản g lượng nào khác. T rạng th á i cơ bản này là trạ n g th ái năng lượng
bình thường của m ột phân tử. Nếu như p h ân tử này bị chiêu bởi bức xạ tử ngoại và nó
h ấ p th ụ m ột sô" photon thì phân tử này sẽ bị kích thích đến một trạ n g th ái năng lượng
cao hơn. H iện tượng này cùng giống như hiện tượng xảy ra khi m ột electron hoặc các
electron th u n ă n g lượng và nhảy từ trạn g th á i cơ bản đến mức năng lượng cao n h ấ t
cùa trạ n g th á i kích thích cỉầu tiên. Theo lý th u y êt lượng tử thì mức năng lượng của
m ột p h ân tử có th ê tồn tạ i chì trong một sô" trạn g th ái xác định, cho nén, chỉ có ánh
sán g với nhữ ng tầ n sô" tương ứng với năng lượng cần th iế t để nâng phân tử từ trạn g
th á i cơ b ản lên trạ n g th ái kich thích bị háp thụ. iiỡì VI một trong r ấ t nhiêu trạ n g th ái
kích thích có th ể được hình chành, nên các hợp chất có th ể hấp th ụ ánh sáng vổi các
tầ n sô khác n h a u (trong một dải tầ n sô rộng).
Q uá trìn h h ấ p th ụ xảy ra rấ t nhanh, khoảng 10 hì giây. Electron sẽ duy trì ở

trạ n g th á i kích thích từ 10 8 đến 10 * giây. Sau đó nó sẽ b ắt đầu nhảy vê trạ n g th á i cơ
b án . Q uá trìn h này có thể xảy ra qua sự va chạm phân tử mà năng lượng toả ra đưỏi
dạng n h iệt hoặc electron rơi xuống mức dao động th ấp n h ấ t của trạn g th ái cơ ban,
đồng thòi giải phóng một photon năng lượng và p h á t huỳnh quang- Do một lượng năng
lượng đã bị m ất trước khi electron nhảy xuống trạ n g th á i năng lượng thấp hơn, nên
n ă n g lượng giải phóng dưói dạng photon phải có ít năng lượng hơn photon kích thích.
Do đó tầ n số của á n h sáng p h át xạ sẽ luôn nhỏ hơn tầ n sô" kích thích (định lu ậ t Stoke).
Các họp c h ấ t phát quang tự nhiên được gọi là sự p h á t huỳnh quang tự phát.
N hiều hợp c h ất không phát huỳnh quang có th ể được chuyển hoá hoá học th à n h các
c h ấ t p h á t h uỳnh quang được gọi là có huỳnh quang hoá học (ví dụ thiam in th àn h
135
thiochrom). Nếu các electron của một hợp c h ất được tự do hơn (ví clụ bằng cách thay
th ế o . N hoặc s vào cấu trúc), khả năng p h á t huỳnh quang sê tăn g lên. Tuy nhiên,
một sô nhóm có thề có xu hướng định xứ các điện tư và do đô làm giảm độ huỳnh
quang. Từ ĩlining điều trê n có thê thấy rằng bước sóng hấp th ụ và bước sóng p h á t xạ
của mỗi hợp c h ấ t sẽ khác nhau. Có nhiều hợp ch ất h ap th ụ năng lượng với hước sóng
như n h a u , m ột sô c h ất p h á t quang tại cùng một bước sóng. Sự kêt hớp của hai bước
sóng khá đặc trư n g cho một hợp chat, do đó phép đo huỳnh quang có thê (tược dùng
trong p h ân tích định tính. Nếu cỏ sự nghi ngờ về sự có m ặt của một họp chất p h át
quang, tiếp tục đo bước sóng làn quang, sự xê dịch bước sóng huỳnh quang bởi pH.
hiệu su ấ t lượng tử. thời gian phát quang và dữ liệu phân cực hoá sè hoàn chỉnh sự
nghiên cứu này.
T ính đặc th ù của phép (ỉo huynh quang là đon giản hoá và làm tă n g độ tin cậy của
quá trìn h p h â n tích vì hợp ch ất thường được đo trực tiếp mà không phải tách chiêt
trước. K hông giông n h ư quang phô hấp th ụ mà ở đó các hợp c h ất khác n h au có khả
năng h ấp th ụ cùng m ột bước sóng kích thích, xay ra trong phép đo huỳnh quang, nếu
điều này xẩy ra th ì sử dụng bước sóng kích thích khác. Với việc th a y đổi bước sóng
kích thích cực đại hoặc thay đỏi p i I, cỏ thể làm giảm thậm chí đến mức tôi thiếu tính
chất đó.
Phép cỉo huỳnh quang củng có thể được dùng trong p h án tích định lượng vì cường
độ huỳnh q u ang tỷ lệ th u ậ n vối nồng độ của hợp ch ất phát quang. Tuy nhiên môi liên
quan trực tiếp này chỉ đúng với dung dịch r ấ t loãng vi án h sáng p h á t ra từ những
chất p h á t quang đều phải đi qua dung dịch trước khi đến m áy đo quang vì thê một
lượng ả n h sáng sẽ bị hấp th ụ bới các phân tử khác trong (lung dịch. Nồng độ càng cao
thì lượng á n h sáng p h á t xạ bị hấp thụ càng lớn, cho ctên một điểm n h ấ t định khi mà
sự tản g tiên tới bảo hoà và cường độ huỳnh quang cũng sẽ b ắt đầu giảm dần (vì lý do
này mà đường c h u ẩn như vậy thường được dùng trong các th í nghiệm đo huỳnh
quang). Do đó một giá trị của cường độ huỳnh quang có th ể sẽ tương ứng với h ai giá trị
nồng độ của chất p h á t quang.
C h ấ t ta n có ả n h hương lớn (tôn tính ch ất p h á t huỳnh quang của m ột hợp chất.
N hững c h ấ t ta n khác nhau có thế làm tăn g hoặc giam cường độ p h á t quang. Củng
như vậy, hằng sô điện môi thê hiện mức độ p h á t quang tự do của các điện tử 7t và do
đó the hiện sự th ay đổi bước sóng cực đại huỳnh quang. Dung dịch đệm có xu hướng
gảy ả n h hương dập tắ t bước sóng của một sỏ c h ất và ả n h hưỏng này tă n g khi nồng (ỉộ
dung dịch đệm tản g lên.
Cường độ p h á t huỳnh quang của một hợp chất dễ ion hoá sẽ th ay đôi theo trạn g
th ái lon hoá m à quá trìn h ion hoá nàv lại phụ thuộc vào độ pH. N hiểu hớp c h ất sinh
học có k h ả n ăng p h á t huỳnh quang tự nhiên hoặc phát huỳnh quang hoá học dễ bị ion
hoá, cường độ p h á t huỳnh quang t ua những chất, này phụ thuộc vào độ pH. Một số hợp
chất bị ion hoá bởi ánh sáng và do đó phát huỳnh quang.
Cường độ h u ỳ n h quang có xu hướng giảm khi nhiệt độ tăng. N hiệt độ càng cao thì
tốc độ chuyến động cúa p h án tử trong dung dịch càng tăng. Do đó, n ăn g lượng hấp th ụ
chuyển th à n h nhiệt chứ không phái là huỳnh quang.
136
Vối m ột sô chất không hốn trong dung dịch, tốc độ phân húy quang phụ thuộc vào
rường độ án h sáng. Phẩn lốn các chất phát huỳnh quang phân huỷ th à n h các ch at
không p h á t quang. Tuy nhiên, một sô phân huỷ í hành chất có độ huỳnh quang thậm
chí còn cao hon so vối chat ban đau.
Phẩn lớn những máy đo huỳnh quang có một khe đóng mỏ được ờ giữa ngviôn sáng
và mẩu th í nghiệm , khe này được mỏ ngay trưổc khi đo đê giảm tối thiểu sự p h ân huỷ
quang.
Sự dập tắ t xây ra khi sự phát huỳnh quang của một chàt bị giảm bỏi một ch ât
khác. Có hai loại dập tắt: dập tắ t do ảnh hương m àng lọc và dáp tắ t th ậ t. Anh hưởng
m àng lọc xảy ra khi màng lọc hấp th ụ ánh sáng kích thích hoặc á n h sáng p h át xạ. Còn
sự dập tắ t th ậ t thì xẩy ra khi yêu t ố gây tắ t làm giảm năng lượng của p h á t quang, làm
cho năng lượng h ấp thụ biến thành dạng n ăn g lượng khác chứ không phải th àn h dạng
năng lượng h u ỳ n h quang. Sự dập tắ t xẩy ra trong trường hợp c h ấ t p h á t quang chuyên
hoá th àn h c h ất không phát quang. Có thê phản tích các yêu tô dập t ắ t thông qua sự
biên m ất m ột hợp c h ất phát quang trong dung dịch, ví dụ: sự biên m ất cúa phức ch ất
borat - benzoin trong phổ p h át quang bởi oxi.
Đóng góp q u an trọng nhất của phướng pháp đo quang phô huỳnh quang là tín h
đặc th ù và (ỉộ nhạy. Tính đặc thù được miêu tả ở trên, còn độ nhạy thì thường gấp vài
nghin lần so phương pháp quang phô hấp thụ.
Trong phương pháp đo phố huỳnh quang, bưổc sóng của á n h sáng p h á t xạ dài hơn
hước sóng của ánh sống kích thích. Vì vậy, một máy đơn sắc được dùng để ngăn phẩn
1Ớ11 á n h s á n g k íc h th íc h đ ễn m áy ghi phố m à chỉ cho p h ép á n h s á n g h u ỳ n h q u a n g đi
qua. cho n ên phép đo huỳnh quang được tiên h à n h trong điểu kiện cường độ á n h sáng
thấp? Trong các kỹ th u ậ t hấp thụ, độ nhạy cảm của mức hấp th ụ th ấ p n h ấ t phụ thuộc
vào tính chính xác, do đỏ có thê so sánh hai cường độ ánh sáng tương tự nhau.
Có hai ưu điêrn trong việc sử dụng phương pháp đo huỳnh quang so với kỹ th u ậ t
hấp thụ là:
- Chỉ cần đo một lần chứ không phải hai lần như trong kỹ th u ậ t hấp thụ.
- Kết quả đưa ra từ máy đo huỳnh quang tỷ lệ th u ận trực tiếp với nồng ctộ chứ
không p h ai là ty lệ nghịch vói logarit của nồng độ.
Dựa vào ưu điểm trên mà người ta dùng phương pháp huỳnh quang đê xác định
hàm lượng v itam in B2.
1 .N g u y ê n t ắ c
Trong ngủ cốc, riboflavin (latoflavin, vitam in G, vitam in B.,) là ch ất cỏ m àu vàng -

xanh lá cây được hoà tan trong nưốc được chỉ đinh bằng phương pháp phân tích huỳnh
quan*/. Riboflavin có nhiều trong tế bào động vật và thực vật. Nó bển trong muôi
khoáng và p h ần lớn các tác nhân oxi hoá, nhưng lại không bên trong dung dịch kiềm .
137
Nó r ấ t nhạy cảm với tia khá kiến và tia tử ngoại nên các th ao tác được thực hiện trong
án h sáng dịu hoặc trong các dụng cụ thí nghiệm thuý tinh có độ quang hoá thấp.
AE
E° Radiation
ofenergy \Ej
(activation)
AE, Radiation
■AE« ofenergy AEj
(fluorescence)
Sơ đố mức năng lượng Sự hoạt hoá và

của sự phát huỳnh quang sự phát huỳnh quang SPE
Sơ đổ trạng thái (phản tử - năng lường) cho các quá trinh chuyển tiếp
liên quan đến Anthracen
s 0 Trạng t.hái cơ bản Tị Trạng thái bộ ba đầu tiên (>2 Q Sự ngừng c ù a T | lxii phan
S ị - Trạng thái kích thích VK Sự phục hổi dao động tử ()., tan tron" <lung địrh
đcln đầu tiên I( ĩ Sự chuyển hoá trong KV và CSV Các mửr tlao đỏng ilưói
s 2 Trạng thái kúíh thích ISC Nối giữa hệ thống khát* nhíiu rùa các. trạng thái kith
đơn thứ hai thích và rtl bản
Các mùi tên thẳng (-») rhỉ rát' quá trình phát xạ, phát hoặc thu photon
Các mũi lên hình sóng ( vAJV^ ) chì các quá trình không phát xạ.
138
Trong các tê bào sông, riboflavin thường kết hợp vổi axit photphoric hoặc cả với
axit photphoric và axit adenylic (FMN hoặc FAD), c ả hai đểu có th ê kết hợp một sô
protein đặc th ù đê hình thành các enzim oxi hoá. Trong một sô sản phàm (sữa),
riboflavin tồn tại dưới dạng tự do có thể thấm tách cũng như ờ dạng coenzim.
Trong p h ần lốn các quy trình tách riboflavin, cần thiêt phải xử lý các sản phàm tự
nhiên với ax it hoặc enzim (tể thu được giá trị tôi đa. Bước xứ lý này giải phóng
riboflavin khỏi phức chất protein và giúp cho việc tách chiêt dễ dàng hơn.
Riboflavin được tách chiết từ ngũ cốc và phân tích bằng máy quang phổ huỳnh
quang quét tự ghi (scanning spectrophoto fluorimeter). Dùng máy quang phô huỳnh
quang quét có điều khiên để điểu chỉnh sự phát huýnh quang của riboflavin khi có
m ặt những c h ấ t gây cản trỏ, những chất này theo lý thuyết có ản h hưởng đến cả chất
ch u ẩn và m au thí nghiệm. Do đó cưòng độ của sự phát huỳnh quang tỷ lệ vỏi nồng độ
của riboflavin trong dung dịch loăng và nồng độ này được đo dựa vào sự chênh lệch
giữa độ huvnh quang trước và sau sự khử na tri tiosulfit (Na^SgOị).
a) Quy trình thí nghiệm tách chiết
1. C ân 6 ,0 g ngũ cốíc (dự tính là chứa õ đến 10 |ig riboflavin), nghiến bằng côi sứ.
2. ĐỔ vào bình nón 100ml và thêm 50ml dung dịch HC1 0,1M. Lắc bình để tẩm
ướt hết ngũ cốc. S au đó đậy nắp bình bằng giấy nhôm (tổi n h ấ t là giấy bạc) để trá n h
riboflavin bị p h â n huỷ bơi ánh sáng. Đ ặt trong nồi cách thuỷ đang đun sôi khoảng 1
giò, cứ 5 p h ú t lại lắc một lần. Kiêm tra mức nước mồi lần lắc bình, không để nước cạn.
3. Làm nguội bình đến nhiệt độ phòng và cho vào cốc 100ml. Dùng may đo pH
chinh đến 6,0 (bằng dung dịch NaOH 0,5 M).
*Chú ý: Cho NaOH vào từ từ để trán h những chỗ có pH cao sẽ dẫn đến m ất
riboflavin.
4. Ngay lộp tức thỏm HC1 IM để giảm pH đến 4,5. Li tâm bằng ống li tâm
th uỷ tin h 100 ml ở 2000 v/phút (rpm) trong 10 phút.
5. Pha loãng dịch lọc đến 250ml vổi nưốc cất trong bình định mức.
b) Quá trình axit hoá và oxi hoá của dịch chiết
1 . Lấy 2 ông nghiệm, cho vào mỗi ống lOml dịch chiết và lm l nước. Trộn đều
bằng máy trộn.
2. Lấy 2 ống nghiệm khác, cho vào mỗi ống lOmỉ dịch chiết và lm l dung địch
ch u ẩn riboflavin (0,5jig/ml) và trộn đểu.
3. Cho lm l axit axetic đặc vào cả 4 ổng nghiệm và để 2 phút.
4. Cho thêm 0,5ml dung dịch K M n0 4 3% vào mỗi ống, trộn đểu và để 2phút.
139
5 . Cho 0,5m l 3% vào mỗi ống và trộ n đểu. M àu đỏ sẽ biên m ất trong
vòng 10 giây.
c) Do đô h uỳnh quang của dịch chiết

1. Đê đo độ huỳnh quang của riboflavin, bước sóng phát xạ và bước sóng kích
thích phải được xác định bằng máy clo quang phố quét (scanning spectrophotom eter).
2. Xác định cực đại của bước sóng p h át xạ và bưóc sóng kích thích cua dung
(lịch c h u ẩn riboflavin (nóng ctộ lug/m l riboflavin). Giá trị cực đại cho kích thích nên có
giá trị là 450nm . Giá trị cực đại cho p h át xạ là 530nm.
F = 2,303.f p0.£.b.c (10.1)

Trong đó: ộ- h iệu su ấ t lượng tử %
p 0 - cường độ tôi,
£ - độ hấp th ụ phán tử,
b- độ dài đường dẫn,
c - nồng độ.
Phương trìn h này chỉ đúng với những dung dịch có nồng độ thấp. Ở phương trin h
(10.1), cưòng độ huýnh quang tỷ lệ th u ậ n với cường độ tối p0 và nồng độ c. Độ huynh
quang sẽ tăn g k h i pu tàng (hoặc công su ấ t của nguồn tăng). Độ huỳnh quang cùng
tă n g k h i nồng độ của ch ất p h á t quang tăng.
Đẻ th à n h lập mối liên quan theo định lu ật Lam bert-Beer, có một đường chu ẩn độ
cho rib o fla v in c h ứ a 0 ,5 - 1,0 • 2,0 vả 4,0 ng/m l.
*Chú ý: trong k h i đo huỳnh quang, phải cìê cân th ận trán h không cho dung dịch
tiếp xúc với tia tử ngoại qúa láu nếu khòng sẽ làm riboflavin bị p h ân huỷ r ấ t n h an h .
3. Đo độ huỳnh quang của dịch chiết khòng chứa riboflavin (kêt quả A). Dũng
3ml dung dịch trong cuvett.
4. Cho vào cuvett (là chứa 3ml dịch chiết này khoảng 5 mg N a 2S 20 1(pha
trong nưỏc), trộn đều và do ngay lập tức (kết quả C).
5. Đo độ huỳnh quang của dịch chiết có chứa riboflavin thêm vào (kết quả B).
3. T inh k ết quả
Tính lượng riboflavin có trong ngủ cốc bằng công thức sau:
A - c nống đô riboflavin hê sỏ pha loàng , , .
---- - ------------------— — X - —— Ì— ------ — (u g /m l)
B - A 10ml khôi lượng mầu
4.B áo cáo th í nghiệm
1 . Vẽ m ột đường chuẩn đê th à n h lập mối liên hệ theo định lu ật L am b ert -
B e e r cho rib o fla v in , d ù n g CỈUI1 Ị' dịch rib o fla v in c h u ẩ n 0,5; 1,0; 2 ,0 và 4 (.Ig/ml.
140
2. So sánh kết quà thu được vối giá trị ghi trê n vỏ hộp (đã được xác định bởi
n h à sản xuất).
3. Vẽ cấu lạo hoá học* của riboflavin và chí ra bán chất của nhữ ng p h ầ n p h á t
h u ỳ n h quang.
4. Sự tăng lượng từ của một chất ản h hưởng đến cường độ huỳnh quang n h ư
th ế nào?
Máy quang phổ kê
Máy quang phổ tử ngoại
141
III. Đ ỊN H L Ư Ợ N G VITAM IN Bj BANG PH Ư Ơ N G P H Á P HUỶNH QUANG
1. N gu yên tắ c
Khi oxi hoá vitam in B| (thiam in) bằng kali feroxianua trong môi trường kiểm sẽ
tạo th à n h hợp c h ất thiochom. chất này có màu huỳnh quang xanh dưới án h sáng tử
ngoại. Cứ m ột p h â n tử thiam in sẽ tạo th àn h một phân tử thiocrom.
Để xác định hàm lượng thiam in, người ta dùng dung dịch chuẩn thiam in tinh
k h iết so sá n h với dung dịch nghiên cứu. Trưốc khi tiến hành các phản ứng, thiam in
p h ải được giải phóng ra khỏi mẫu bằng chê phẩm enzim photphataza. papayolin hoặc
ta k a d ia ta z a .
2. Hoá c h ấ t
- Dung dịch Hr^so.ị 0,1N.
- D ung dịch C H aCOOH 30%.

- D ung dịch NaO H 15%.
- D ung dịch kaliferoxianua [K^Fe(CN)(J 1% chuẩn bị để dùng trong ngày và giữ

tro n g lọ m ầu.
- Rượu butylic (C,tH 9OH) hoặc isoamylic [(C H .^C H ÍC H .Ô H Ị: các rượu này
không được p h á t huỳnh quang. Nếu p h á t huỳnh quang phải khử bang th a n hoạt tín h
(15 gam th a n cho lm l rượu): rượu trộn vối than lắc 30 phút trên may lac, lọc, làm
k h a n b ằn g C aC l 2 và cất ỏ nhiệt độ thích hợp.
- Chê p h ẩm photp h ataza của khuẩn ti Penicillium: K huẩn ti Pcnicillium dược sấy
khô ỏ n h iệ t độ 40°c. Lấy lOmg k h u ẩn ti nghiền vối lm l dung dịch n a tri a x e ta t
(N aC 2H 30 2) 30%, chuyến vào bình định mức, them n a tri a x etat đến pH = 5.
- D ung dịch vitam in B ị chuẩn
+ D ung dịch gốc (a): 10mg thiam in tinh th ể hoà tan vào 10ml HC1 0,01 N. Chuyển
dung dịch vào b ìn h định mức dung tích 100ml. Thêm nưổc cất đến vạch, lắc kỹ. Đựng
trong chai m àu n â u , để ở chồ m át có thể giữ được một tháng. Cứ lm l dung dịch này
chứa 100 Y - th iam in . Lấy lm l dung dịch này cho vào bình định mức dung tích 100ml,
th êm nưổc c ấ t đên vạch mức, lắc kỹ, lm l dung clịch này chứa 1 7 thiam in.
+ Dăy dung dịch thiam in chuẩn (b): từ dung dịch trên cho vào các ông nghiệm lần
lư ợ t 0,5; 1,0; 1,5; 2 m l (chứa 0,5; 1,0; 1,5; 2 Y th ia m in ), th ê m vào các ống n g h iệ m lầ n
lượt 4,5; 4,0; 3,5; 3,0m l nưốc cất và lm l dung dịch K^Fe(CN)(; 1% (mỏi pha). Cuối cùng
cho vào mỗi ông 3ml dung dịch NaOH 15%. Lắc nhanh, mỗi ông lại cho thêm 10ml
rượu butylic, lắc. Đê yên 10 phút, dung dịch sẽ tách thành hai lóp. Li tâm , tách bỏ lốp
dưới, cho vào lg N a^so.ị khan. Dung dịch rượu khan chứa thiocrom được cho vào dãy
ông nghiệm khác. Ta được dãy màu tiêu chuẩn bển trong 2 - 3 ngày.
142
1 . C ân 5 * 10g mẫu, nghiền kỹ trong côi sứ với 10 - lõm l H./SO 4 0,1 N. Chuyển
vào bình định mức cỡ lOOml, thêm H.,SO| đến 75ml.
2. Đ ặt binh vào nồi cách thuỷ sôi trong 45 phút, lắc đều, đê nguội và thêm chế
phâm p h o tp h ataza của khuân ti Penicillium vào (cứ lg m ẫu cần 0,03g k h u ẩ n ti khô)
bằng cách: cân k h u ẩn ti, đem nghiền trong cối vói 2 - 3ml n a tri a x e ta t 30% rồi chuyên
vào bình định mức, thêm n atri a x etat đến pH = 5.
3. Đ ặt bình vào máy ôn nhiệt ố 40”c trong 12 giờ. Sau đó lây bình ra, thêm
nước cất đến vạch mức, lắc kỷ, lọc.
4. H ú t lấy 5ml nước lọc cho vào phễu chiết, thêm 10ml rượu butylic, lắc m ạnh
1 - 2 phút, chiết tách bỏ lốp rượu. Thêm vào lm l dung dịch K^FeiCN)^ 1% và 3m l
NaOH 15%, lắc n h an h và thêm lOml rượu butylic. Lắc, tách bỏ lớp nưốc. Lọc lớp rượu
qua giấy lọc chứa Na^SOj khan. Chuyên dung dịch vào ông nghiệm.
5. Đo cường độ huỳnh quang của mẩu thí nghiệm so với dãy dung dịch
th ia m in c h u ẩn trê n máy quang phố dưới ánh sáng tử ngoại cúa đèn thạch anh, thuỷ
n g ân TIK-4, k ính lọc m àu đen (kích thước là 432nm, sự p h át xạ là 545nm).
Hàm lượng v itam in Bj (mg%) dược tín h theo công thức sau:
^ a XV X 100
V] X w X1000
Trong đó:a - lượng vitam in có trong ông nghiệm chuàn có m àu h u ỳ n h q u an g trù n g

vói ông chứa mẫu thí nghiệm (y)>
V - dung tích binh định mức (ml),
V I - th ể tích dung dịch thí nghiệm lấy để oxi hoá (ml),

w - khôi lượng m ẫu (g),
1000 - chuyển từ Yra mg.
143
Chương 11
ĐỊNH
• LƯỢNG
• MỘT
• s ố NGUYÊN T ố
I. ĐỊN H LƯ Ợ N G P H O T P H O
1. Đ ịnh lương p h otp h o bằng phương pháp so màu
a) Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên cơ sở khử Mo (VI) của hợp ch ất clị đa axit.
photphomolypđic (H 3P O 4. 12 M 0O 3) vối sự tạo th àn h “m olypđen xanh” có m àu xanh
hay m àu xanh th ẫ m (tuý thuộc vào hàm lượng photpho) cúa phức c h ất axit
photphomolypđic. T h àn h phan chính của phức hiện n ay chưa xác định. Deniek chơ
rằng nó là hợp c h ất molypđen hoá trị 4 và hoá trị 6 vối axit photphoric
(Mo0 2Mo0 3 ).H 3P 0 4.4 H.,0 . Một sô tác giả khác cho rằn g c!ó là dung dịch keo của
molypđen hoá trị 5 và 6 . Bởi vì molypđen của dị đa ax it được khử dễ hơn molypđen
của m olypđat. Dung dịch cần phải axit vì dị đa axit chỉ tạo th à n h trong môi trường
axit. Trong môi trường kiềm, dị đa axit hoàn toàn bị phá huỷ tạo nên muôi của axit
photphoric (HrjP04) và axit molypđic (H 2M o04). Trong các dung dịch axit m ạnh, dị đa
axit cũng không bền vững. Vì vậy lượng axit của dung dịch ]à (tiểu kiện quy định cho
việc tạo th àn h m olypđen xanh.
Một điểu kiện quan trọng khác cần chú ý đê tạo th à n h phức m àu là nồng độ
molypđen trong dung dịch Khi dư onion m olvpđat có th ể tạo th àn h 2 m àu xanh:
photphom olypđen và molypđen dẫn đến sự sai sô" của phép xác định vì định lượng
photpho dựa trê n cơ sở tính hàm lượng molypđen có th ê tiến h à n h bằng thiếc (II)
clorua, ax it ascorbic, hidrazin sunfat... N hững c h ất khử khác n h au cho nhữ n g sản
phẩm khử dị đa axit photphomolypctic khác n h a u và cho phương pháp có độ n h ạy khác
nhau. T h ành phần của phức màu nhận được phụ thuộc vào ctộ axit của môi trường,
nồng độ am oni m oỉypđat, tính chất của chất khử cho nên điều kiện th í nghiệm phải
th ậ t nghiêm ngặt.
b) H o á chất
• Dưng dịch am oni molypđat Ị(NH4)2MoO ị] 2,5% trong H .,S 0 4 10N:
+ Cho vào bình 500nì] nước cất và 280ml H.,SO,ị đặc (1)
+ Hoà ta n 25g (NH j).,MoO ị trong 200m l nước cất đun đến 6 CTC, n ếu dung
dịch có k ế t tủ a th ì lọc qua giấy lọc không tro (2 ).
144
Rót dung dịch (1) vào (2), đế nguội, chỉnh đến 1 lít bằng nước cất.
- D ung địch c h u ẩn :
+ Hoà ta n 0,1917g KH 2P 0 4 trong 1 lít nưổc cất. Dung dịch n ày chứa 0 ,lm g
P 20 5/m l (dung clịch gốc).
+ Lấy dung dịch gốc pha loãng 10 lần. Trong dung dịch sẽ chứa 0,01 mg
P 2Or/m l (dung dịch chuẩn).
P h a các th an g mau tiêu chuẩn từ dung dịch pha loảng.
* T ha ng chuân ỉ*2®ỉ) từ 0 đến 0 ,05m g/5 0m l dung dịch
Số 1 2 3 4 5 6 7
Dung dịch c h u ẩn (ml) 0 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0
P 2Or, (mg/ml) 0 0,005 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
* T h a n g chuẩn PọO$ từ 0,05 đến 0,25m g/50m l dung dịch
Số 1 2 3 4 5 6
D ung dịch chuẩn (ml) 0 5 10 15 20 25
P,Or, (mg/ml) 0 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25
* T h a n g ch u ẩ n 1*2^5 tl* 0,25 đến 0,60 m g /5 0 m l dung dịch
SỐ 1 9*9* 3 4 5 6 7 8
Dung dịch c h u ẩn (ml) 0 25 30 40 45 50 55 60
P 20 5 (mg/ml) 0 0,25 0,30 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60
c) Tiến h à n h
- Vô cơ hoá m ẫu: có thê tiến hành vô cơ hoá mẩu theo 2 cách: tro hoá và thuỷ
ph ân bằng axit.
• Tro hoá
1. C ân 1g bột thực vật (hoặc 5g mô động vật tươi) cho vào chén sứ.
2. Đôt: m ẩu trong lò nung ở nhiệt độ 500 - 600"c từ 1 - 2 giò, m ẫu biên th àn h

tro m àu trắ n g (không còn th an đen). Lấy chén ra khỏi lò, để nguội.
3. Hoà ta n tro vổi 20ml HC1 10%.
4. Đ ịnh mức trong bình đến 100 ml bằng nước cất. Lắc đều, để lắng qua đêm,
lọc lấy dịch trong.
145
• T huỷ p h à n băng axit
+ Phương pháp Grinsbưrg:
1 . C ân 0 ,lg bột thực vật cho vào bình đốt Keildahl cô 100ml hoặc bình nón
chịu nhiệt.
2. Cho tiếp vào bình 8 ml HvS 0 4 đặc, cho thêm 0,5 - 0,8m l HC10 4 50%. Đê yên
1 giờ, đậy bình đốt bằng phễu nhỏ.
3. Đ un trê n bếp điện cho đến trắn g mẫu hoàn toàn, đun thêm 5 - 10 phút nữa.
Đe nguội.
4. C huyển m ẫu sang bình định mức 100 ml và thêm nưổc cất đên 100ml. Đê
lắng qua đêm. Lọc lấy dịch trong.
+ Phương pháp có sửa đổi:
1 . C ân 0 ,lg bột thực vật cho vào bình đốt Kejldahl cò 100ml hoặc bình nón
chịu nhiệt.
2. Cho thêm vào bình 5ml H 2S 0 4 đặc. Đậy bình bằng phều con, đê yên 30 phút.
3. Đ un bình trên bếp điện cho đến khi có khói trắng bay ra m ạnh. Để nguội bình.
4. Cho thêm 3 - 4 giọt HC10 4 70% và tiếp tục đun cho trắ n g mẫu. Nếu chưa
trắ n g th ì cho thêm 2 giọt HC10 4 nữa và đun đến trắn g m ẫu. Để nguội.
5. C huyển sang bình định mức 100ml, dẫn dung dịch đến vạch ngấn bằng
nưốc cất. Đê lắng qua đêm. Lọc lấy dịch trong.
- Phản ứng
1 . Lấy 10ml dung dịch lọc (hoặc 5ml dịch lọc tuỳ thuộc vào lượng P 20 5 có
trong m ẫu) cho vào cốc 50ml. Pha loãng bằng nước cất và đun sôi.
2. H ạ th ấ p n h iệ t độ, cho vào dung dịch nóng một lượng kim loại. Đậy cốc bằng
m ặt k ín h đồng hồ. Lắc đểu dung dịch và giữ đến khi dung dịch không m àu.
Làm nguội dung dịch đến nhiệt độ phòng.
3. Rửa m ặt kính đồng hồ bằng nưốe. Nếu có kết tủ a nhôm không tan thì phải
lọc qua phễu lọc với giây lọc không tro.
4. Cho dịch lọc vào bình định mức 100ml, trán g cốc và giấy lọc.
5. T rung hoà lượng axit dư trong bình bằng dung dịch NH4OH 10 %. Lắc nhẹ,
dung dịch hơi đục do hiđroxit xuất hiện.
6 . Thêm vài giọt H 2S 0 4 10%, hiđroxit hoà tan. T ốt n h ấ t là thêm vào bình vài
giọt chỉ th ị a- hay P-đinitrophenol và tru n g hoà bằng am oniac đến m àu
vàng. S au đó làm m ất m àu vàng bằng các giọt H.>S04 10% (trung hoà theo
chỉ th ị thường dùng khi xác định photpho trong các loại m ẫu chiết rú t
khác nhau).
7 . Thêm vào binh 10 - 15ml nước cất, 4ml dung dịch am oni m olypđat 2,5%
trong ax it sunfuric. Lắc đểu.
8 . Cho thêm 6 giọt SnCl 2 mỏi pha. Thêm nước đến vạch mức, đậy bình và lắc
3 - 4 lần (có thể cho vào mỗi bình 0,3m l SnCl2). M àu xanh x u ấ t hiện n h an h
và đ ạt cường độ cực đại sau 5 - 10 phút.
9. Đo OD trước 10 phút tính từ lúc bắt đầu hiện m àu. Đo ở bướcsóng
X = 720nm. Nồng độ P.2Of) tốt n h ấ t trong khoảng 0,01 - 0,2ng/100ml.
2. Đ ịnh lương photpho tông số trong thực vật theo phương pháp G uiot
a) Hoá chất
- D ung dịch N H 4OH 10%.
- Hỗn hợp suníbmolypđic: 64 gam am oni molypđat [(N H ^ M o O J hoà ta n trong

700mlnưỏc nóng, lọc cặn nếu có, đê nguội, rót từ từ và khuấy đểu vối 280ml H.,SOị
đặc, dẫn nước đến 1 lít.
- Hỗn hợp thiếc - ascorbic: 4,16g SnCl2, vài giọt HC1 đặc, sau đó cho thêm 20, 8 g
a x it ascorbic (CGH 80 (*)t dẫn nưổc cất đến 1 lít. N út kỹ (có thể dùng đến 1 tháng).
-Chỉ th ị m àu: p - đinitrophenol hoặc phenolphtalein hoặc giấy tẩm Congo đỏ.
b) Tiên h à n h
1 . Vô cơ hoá mẫu: xem phần vô cò hoá m àu ở phần trên.
2. Lấy 5 - 10 ml dịch vô cơ hoá (trường hợp tro hoá, lấy dịch ít hdn 5 lần) cho
vào bình định mức 50ml.
3. T rung hoà dung dịch bằìig NH4OH 10% theo sự đổi m àu của chỉ thị
(P-đinitrophenol, phenolphtalein hoặc giấy tẩm congo đỏ...). Thêm nưốc cất vào hơn
nửa bình.
4. Cho thêm 5ml hỗn hợp sunfomolypdic. Sau đó cho nước đến vạch ngấn, lắc
đểu. Cho tiếp 2ml hỗn hợp thiếc ascorbic, đảo đểu.
5. So m àu ỏ bước sóng 720nm .
3. X ác đ ịn h photpho vô cơ theo phương pháp Gubeco
a) Hoá chất
- D ung dịch N H 4OH Ị0%,
- D ung dịch H 2S 0 4 10%,
- D ung dịch H 2SO,t 2N»
147
- Dung dịch (NH4).,MoO t 2%,
• Dung dịch ax it ascorbic 0,8%.
b) Tiến h à n h
1 . Vô cơ hoá mẫu: xem phần vô cơ hoá mẫu ồ phần trên.
2. Lấy 5 - 10ml dung dịch vô cơ hoá cho vào bình 50ml. Trung hoà bằng
NHÔH 10% đến x u ấ t hiện m àu vàng theo P-đinitrophenol. Lại khử màu vàng bằng
vài giọt H 2S 0 4 10 %.
3. Cho tiếp 10ml H.,SOt 2N, lắc đểu. Them l,25m l dung dịch amoni molypđat
2% (pha trong nước cất), lắc đểu. Thêm 3ml dung dịch axit ascorbic 0,8% (mối pha),
lắc đều. Đ un cách thuỷ 15 phút đê xúc tiên sự xuất hiện màu. Lấy bình ra, đê nguội.
4. So m àu ồ bước sóng 720nm. M àu có thê bển 2 ngày.
c) Thang m ẫu chuẩn
Cho vào các bình định mức 50ml từ 0,02 - 0,20mg P 7O 5 và tiến hành vối các hoá
c h ất như dung dịch phân tích.
4. Đ ịnh ỉương photpho vô cơ trong huyết thanh bằng phương pháp F iske
và S u b b a r o w
a) Nguyên tắc
Sự anion m olypđen trong phương pháp này là clung dịch eikonogen. Cưòng độ
m àu phụ thuộc vào dung dịch axit, đặc biệt rấ t quan trọng là nếu mẫu nghiên cứu đã
vỏ cơ hoá bằng axit suníuric, trước khi phản ứng hiện màu phải được trung hoà bang
dung dịch am oniac có chỉ thị mạụ p-nitrophenol; Độ nhạy của phương pháp trong
khoảng vài \ig. Hệ sô' mihmol hấp th ụ là 3,5.
b) Các dun g dịch
- Dung dịch CH 3COOH 10 %.
- Dung ciịch am oni molypđat 2,5% trong H.;SO ị 5N.
- Dung dịch eikonogen 0,25%: 0,õg eikonogen hoà tan trong 19õml dung dịch
N a H S 0 3 15% và õm l dung dịch N a 2SO.Ị khan 20 %, có thể cho vài giọt axit sunfuric.
Dung dịch sau khi lọc cho vào lọ tôi màu, cât trong tủ lạnh. Dung dịch bền khoang 4 tuần.
- Dung dịch p-nitrophenol nước 0,1%.
• Dung dịch amoniac: khoảng 10%.
- Dung dịch gôc photpho chuẩn: 4.39g KHoPOị hoà tan trong nước và dẫn đến
100ml trong bình định mức. Hoá chất KHọPO ị phai tĩược sấy ỏ l0 0 nc . Dunp dịoh (lật
148
trong chậu nước đá cho vài giọt clorofom để chông vi khuấn mọc. lm l dưng dịch có
lm g photpho.
- Dung dịch photpho pha loãng: pha loăng dung dịch gốc 100 lẩn trong bình định
múc. lm l dung dịch có 0 ,01 mg photpho.
c) Tiên h ành
Cho vào ông nghiệm lm l huyết th an h (hoặc m ẫu vỏ cơ hoá đá tru n g hoà) và 5m l

CCI3COOH, lắc đều, sau 10 p h ú t lọc hoặc li tâm . Lấy 3ml dịch lọc (tương đương 0,5ml
huyêt th an h ) cho vào bình cầu cõ' 10ml hoặc cho vào ông nghiệm 10ml có chia độ, cho 4
giọt p-nitrophenol và tru n g hoà bằng dung dịch amoniac đến khi có m àu vàng.
Tương tự làm thí nghiệm kiểm t-ra (0,5ml nưổc + 2,5ml CCI3COOH + 1 giọt p-
nitrophenol + am oniac đê tru n g hoà) và ông dung dịch chuẩn (2 ml dung dịch c h u ẩn +
2,5ml CCI3COOH + 1 giọt p-nitrophenol + amoniac).
Mỗi Ống nghiệm cho thêm lm l dung dịch amoni m olypđat 2,5%; 0,4m l eikonogen,
trộn và dẫn nưốc đến lOml. Lắc đều, đặt vào nồi U ỏ 37°c trong 7 p h ú t hoặc ở n h iệt độ
phòng trong 10 p h ú t ở chỗ tôi, đo quang phố ở 660nm đôi vối ông kiểm tra.
d) Cách tính
100
0,5
5. Định lượng photpho bằng phương pháp Lowry và Lopex
a) Nguyên tắc
Dựa trê n cơ sở tạo th à n h photpho m olypđat xanh khi có chất k h ử là axit ascorbic
tro n g môi trư ờng pH = 4.
b) H o á c h ấ t
- Dung dịch am oni molvpđat 25%: C ân 25g (NH/1)2MoO(|. 2 H 20 hoà ta n với 1 lít
nước trong bình đinh mức 1 lít. Thêm từ từ 175ml H.^SO ị đặc. Để nguội dưng dịch,
th êm nước đến 1 lít.
- Dung dịch eikonogen: như trong phần định lượng photpho theo phướng pháp
Fiske và Subbarow.
- Dung dịch axit ascorbic: axit ascorbic (CflHÔfj) 1% pha tro n g dung dịch đồng
su n fa t 0,5mM (chỉ pha trưốc khi dùng).
- Dung dịch HC1 2N.
- Dung dịch NaOH 20%.
149
- Dung dịch c h u ẩn phot pho: cân chính xác 0,2213 lg K H .P O j đã sấy khô ơ 105°c,
hoà ta n trong bình định mức 1 lít và dẫn nước đên vạch. H àm lượng photpho trong
clung dịch c h u ẩn là 50mg/ml.
c) T iế n h à n h
T hứ tự tiên h ành, tỉ lệ hoá chất, cách tính toán theo phương pháp Fiske và
Subbarow , chỉ thay eikonogen bằng axit ascorbic.
II. ĐỊNH LƯỢNG KALI T ổN G s ố CỦA T H ựC VẬT BANG NATRI COBANT1NITRIT
1 - N g u y ê n tắ c
Phương pháp dựa vào p h ả n ứng kết tủ a k ali bằng n a tri cobantinitrit.
2KC1 +N a:>[Co (N 0 2)rJ = N aK 2[Co(N 02)rJ + 2NaCl

Rửa sạch kết tủ a, oxi hoá bằng dune: dịch kali p erm a n g an a t và ch u ẩn độ lượng
k ali p e rm a n g an a t th ừ a bằng dung dịch axit oxalic.
2. Hoá ch ất
- C ân lg n a tri cobantinitric pha vối lOml nước cất, khuấy đểu, sục không khí 30
p h ú t, để lắng qua đêm. Lọc lây nước, cho vào nước lọc 208m l cồn, sau vài giò sẽ xuất
hiện kết tủ a n a tri cobantinitric, lọc lấy kết tủ a, rử a vài lầ n bằng cồn, sau đó rử a lần
cuối bằng m ột lần ete và để khô trong không khí, cho vào lọ m ầu n âu kín. P h a trước
khi dùng.
- Có th ế th ay n a tri cobantinitric bằng cách cân lõOg NaNO'j hoà vào 150ml nưổt:
nóng, để nguội 40°c, cho thêm 50g Co(NOrj)2 và thêm từ từ 50ml CH 3COOH 50%.
* Dung dịch ax it oxalic 0,02N: 25g axit oxalic hoà ta n và dẫn nưốc đến lOOOml.
- D ung dịch K M nO ị 0.02N: ọ,63g KMnO.ị hoà ta n và đẫn nước đến 1000ml.
1. Vô cơ hoá m âu: xem phần vô cơ hoá m ẫu.

2. Lấy 20ml dung dịch vỏ cờ hoả cho vào chén, tru n g hoà bằng N aO H 5% đên
biến đối m àu đỏ metyl.
3. Cô khô cách thuỷ còn 1 - 2ml. Cho vào lm l thuốc th ử n a tri co b an tin itrit
ngay lúc còn nóng, khi đó sẽ xuất hiện kết tủ a vàng kali n a tri cobantinitrit.
4. Lấy chén ra khỏi nồi cách thuỷ. Cho vào 5ml CH;,COOH 10%. K huấy đểu
b ằn g đũa th u ỷ tin h , lọc qua phễu lọc thuỷ tin h xốp. R ửa kết tủ a 3 - 4 lần bằng dung
dịch Na«,SO! 2,5% đến khi nước lọc trong.
õ. C huyển k ế t tủ a vào cốc 500 - 700ml với õOml KMnO.ị 0,02 N nóng. Tiếp tục
dùng nưổc cất rửa kết tủ a vào cốc (dùng độ 2Q0ml nước cát tấ t cả). K huấy đểu cho tan,
th êm 5 - 10ml H .,S 0 4 (1:7) và (lun nóng nhẹ.
150
6. C huẩn độ dung dịch nóng bằng axit oxalic 0,02N đến m ất m àu (thường
chuẩn độ quá m ột ít rồi chuẩn độ lại bằng KMnO} 0,02N).
lm l K M nơ 4 0.02N đã chuẩn độ tiêu th ụ trong phản ứng oxi hoá kẻt tủ a tương
ửng vói 0,171m g K.,0.
III. Đ ỊN H LƯ ỢNG CANXI VÀ M AGIE T ổ N G s ố CỬA T H ự C VẬT BANG

T R I LON B
1. N gu yên tắc
Đê xác định hàm lượng canxi và magie trong mô phải xác định hàm lượng tổng sô"
các ion canxi và magie, sau đó xác định hàm lượng canxi. Hiệu sô" giữa chúng là hàm
lương m agie.
2. Hoá ch ấ t
- M etyl tym ol xanh: 0,5g m etyl tymol xam* và 5g KC1 hoà vào 100ml nước cất.
- Đệm am oni pH = 10: 25g NH^Cl và 200ml NH,ịOH 20% pha th àn h 1 lít bằng
nước cất.
- D ung dịch NaOH 10%.
- M urexit bột: vì m urexit khó n h ậ n được điếm chuyển nên có th ể dùng các chỉ th ị
khác tố t hơn.
- D ưng dịch trilon B 0,05N: 9,306g trilon B pha vào bình định mức 1 lít và dẫn
nước đến vạch. Phả^ 'đêm tra lại nồng độ.
- C rom ogen đen 1%.
- Các chỉ thị cho canxi: dung dịch sau khi tru n g hoà bằng NaOH và thêm 5m l
NaOH 10% có th ê dùng các chỉ th ị sau:
+ Fluorexom: cho vào dung dịch vài giọt fluorexom 0,5%. D ung dịch có m àu
hồng, p h á t huỳnh quang m àu lục. C huẩn độ bằng trilon B 0,05N đến tắ t
h u ỳ n h quang m àu lục.
+ P a tto n Reede: cho vào 4-5 giọt p atto n Reede (0,5g pha trong 95m l nước và
õml NaO H 10%). Dung dịch có màu đỏ n âu và chuẩn độ bằng trilon B 0,05N
đến k h i chuyên th à n h m àu xanh.
3. T iê n h à n h
a) Xác đ ịn h tổng ỉượng canxi và magie
1 . Vô cơ hoá mẫu: xem p h ầ n vô cơ hoá m ẩu
2. L ấy 20ml dung dịch m ẫu đã vô cơ hoá cho vào bình nón cỡ250ml.T rung
hoà bằng N aO H 10 % đến đỏi m àu bằng giấy congo đỏ.
151
3. Them 10ml dung địch đệm amoni pH=10; 10 piọt chi thị metyl tv mol xanh 0,5%.
4. C huẩn độ bang triion B 0,05N đến đổi m àu d u n g (lịch từ xanh biển sang
tìm sẫm (ví dụ h ết a ml trilon B). Nếu dùng cromogen đen làm chi thị thì chuyên từ đỏ
thảm sang xanh biến.
b) Xác định canxi
Lấy 20ml dung dịch mẫu đã vô cơ hoá (như trẽn) cho vào bình nón cỡ 250ml, trư ng
hoà bằng NaO H 10 % đến đổi màu giấy congo đỏ. Thêm vào đấy 5ml NaOH 10% và cho
bột m urexit (bằng h ạ t cải). Chuân độ bằng trilon B 0,05N đến khi dung dịch chuyên từ
m àu đỏ sang m àu tím hoa cà (ví dụ chuẩn độ được b ml trilon B 0,05N). c ầ n chú ý
theo dỏi sự biên đổi m ầu vì hơi khó thấy.
a) Phần trăm cartxi
•Thành phần p h án trăm canxi trong mẳu được tín h theo công thức:
^ 0,05 X b X28 X 100 v
%CaO = -------------—---------- = 0,7 X b
200
Trong đó: b - số m ililit trilon B 0,05N dùng để ch u ẩn độ canxi.
200 - sô" miligam m ẫu tương ứng vối thể tích dung dịch đã lấy chuẩn độ.
28 - đương lượng của canxi o x it.
b) Phần trăm magie

T h àn h phần phồn trăm magie trong m ẫu được tính theo công thức
% M gO , 0 ^ ( 0 ^ 2 0 4 6 ^ 1 0 0 _
200
Trong đó: a - sô ml trilon B 0.05N dùng đê chuẩn (ỉộ canxi + magie
20,16 - đương lượng của MgO.
IV. Đ ỊN H LƯ Ợ N G CANXI TR O N G MÔ c ơ T H E O PH Ư Ơ N G PH Á P R E TIN X K I
Đê xác định canxi trong mô cơ trưổc hết p h ải vô cơ hoá mẫu. Một sô" trường hợp
đặc biệt như canxi trong huyết thanh máu có th ê tiến h àn h xác định trực tiếp mà
không cần vô cớ hoá.
1. N guyên tốc
Xác định hàm lượng canxi theo phương pháp R etinxki clựa trên cd sơ kết tủ a canxi
ỏ cỉạng muôi canxi của axit oxalic bằng muôi am oni của ax it oxalic. Sau đó canxi
oxalat tác dụng với axit sulfuric để giải phóng axit oxalic.
152
C aC /)., + HvjSO^ = H 2CoOt + C aSO (J
Dùng clung (lịch kali pprmanganat. (lê chuẩn độ lượng axit oxalic được giải phóng.
5H.,C.,0 s 4- 2 KMn ( ) 1 + 3H.,S0.J = ÌOCO., + 2M nSO, + K 2S 0 4 + 8H 20
2. H oá c h ấ t
- Dung dịch muối am on cùa axit oxalic (NH 4ị).;C.,0.ị bão hoà.
- Dung dịch H.,SO| 5%.

- HC1 đặc.
- Metyl đổ.
- Dung dịch kali p erm an g an at 0.01 N.
- NH jOH đặc.
3* T iê n h à n h
1 . Cán lg m ẫu tưới nghiền nhỏ. Cho vào hình định mức 10ml với 6 ml HC1 đặc.
2. Đun sôi trẻ n nồi cách thuỷ 8 • 9 giờ. Nhấc bình ra và để nguội. Thêm nưỏc
cất đến vạch mức, lắc đều và lọc vào binh khác. Dịch lọc có th ể cho màu vàng n h ạ t
hoặc m àu rễ cây nhưng phải trong.
3. Lấy 2 ông li tâm thể tích lõm l, cho vào mỗi ống 4ml dịch lọc, 3ml dung dịch
muốỉ am oni của ax it oxalic bão hoà và 1 • 2 giọt metyl đỏ. T rung hoà hỗn hợp bằng
dung dịch am oniac. Đế yên các ông li tâm trong khoang 10 - 12 giờ để muôi canxi của
axit oxalic kêt tủ a và lắng hoàn toàn.
4. Li tâm và gạn bổ lốp nước, rửa kết tủ a bằng 4ml nước, li tâm . Bỏ lốp nước.
5. Cho thêm 2ml H.^SOị 5% và đun nóng trên nồi cách th u ỷ trong 5 phút,
trong quá trìn h đó axit oxalic được giải phóng. Làm nguội dung dịch.
6 . C h uẩn độ bằng K M n 0 4 0,1N cho đến khi x u ấ t hiện m àu hồng n h ạt, lm l

KMnO.ị tương ứng vói 0,2mg canxi.
Hàm lượng canxi được tín h như sau:

n 2+/__ O/N _ V , 0 , 2 x 100
Ca (mg%) = ------- -----------
0,4
Trong đó:
V - thê tích KMnO ị 0 ,0 IN dùng để chuẩn độ
0,2 - m iligam canxi tương ứng vỏi lm l KMnOị
153
0.4 • khôi kiõntr mẫu lây phân tích ( le mẫu pha trontĩ 10ml và lây 4mi
dê phán ứng).
V. DỊNH LƯ ỢNG SA T
1. Dựng dường chu ail sắt
Dung dịch chuan chứa 100f.tg Fe/m!. L;ív 5 bình dinh mức 2õml, cho lần lượt vào
các binh 0.5; 0,05; 0,75; 1.0; 1 2r,ml dung dịch chuẩn Fo, 10ml nước cất và các hoá rhất
như ơ trên. ( 1nc bình c h u ẩn sẽ có 1, 2 , 3, 4. 5 f.igFe/ml.
2. Hoá ch ất
- Dung dịch HC1 2N.
• Dung địch H .,S0 4 2N.
- Dung dịch axit. sunfosaiisilic 20 %.
- Dung dịch N H jO H 10 %.
- Dung dịch 3%.
* Dung dịch chuẩn Fe: cần 0,7023 gam muỏi Mohr ((NU .ị).,Fe(SO hoà
tan trong 50ml nước cất, axit lioá bằng HySO.Ị 2N. s ắ t sẻ bị oxi hon bơi Phan
(lư sè bị phán huỷ khi clun sôi trên nồi cách thuỷ, làm lạnh filing (lịch và chuyển
vào binh định mức lOOml, thom nước đến vạch chuan. Như vậy hàm lượng dung dịch
chuẩn là 100|Lig/ml.
1 Lây õm l đung dịch mau cho vào bình định mức 25ml. Axii hoa bằng dung
dịch HC1 2N.
2. Cho thêm vào (lõ 0.1 ml (iung dịch axit sunfosalisilic: 2 0 % và nhỏ từng giọt
(lung dịch am oniac 10% cỉên khi xuất hiện m àu vàng (kiềm yêu). Lac kỹ và clể yên 16 -
20 giờ. nêu đáy bình có kết tủa thi lây pipet hut lay dung địch trong.
3. So m àu với bước sónp T25nm hoặc kinh lọc m àu xanh. Hàm lượng sat được
tính theo dường dồ thị chuán.
154
C hư ơng 12
PHỤ LỤC
1. CÁC DƯ NG D ỊC H DỆM
1. D ung d ịch đệm borat theo Palitsch
a) D u n g d ị c h n x it boric : I2,404g H;íB O , hoà tan và dẫn nước đên lOOOml
b) D u n g d ị c h b o ra t : 1 9 J0 8 g Na..,B40 7.10H,,0 hoà tan và (lan nư ổ c đến lOOOml.
Dung dịch đệm borat cỏ pH khác nhau phụ thuộc vào số mililit dung dịch (a) và
dung dịch (b) theo bảng (lưới đây:
a b pH a b pH
9.80 0.20 6,60 6.50 3.50 8,20
9.70 0.30 0,77 6,00 4.00 8,31
9,40 0,60 7.09 5,50 4,50 8,41

9,00 1,00 7,36 5,00 5.00 8,51
8,75 1,25 7.50 4,50 5,50 8,60
8,50 1,50 7.60 4,00 6,00 8,69
8,00 2,00 7,78 3,00 7,00 8,84
7,70 2,30 7,88 2,00 8,00 8,98
7,50 2,50 7,94 1.00 9,00 9,11
7,00 3,00 8,08 0,00 10,0 9,24
2. D u n g d ịc h d ỏ m x i t r a t (pH = 3,0 -T- 6,2)
a) D u n g d ị c h a x it x i t r l c 0,1M : 21,01 g C()Hh0 7.H.,0 hoà ta n và dẫn nước đến

1000 ml.
b. D u n g d i c h t r i n a t r i xitrcit OylM : 29,41g Cr H '0 7Na.j.2H.,0 hoà ta n và dẫn

nước đến 10 0 0 ml.
Dung dịch đệm x itra t có giá trị pH khác n h au phụ thuộc vào sô mililit dung dịch
(a) và sô" m ililit dung dịch (b) theo bảng sau:
155
a b pH a b pH
46,5 3.5 3,0 23,0 27,0 4,8
- ....... - -
43,8 6,2 3.2 20,5 29,5 5,0
40.0 10,0 3.4 18,0 32,0 5,2
37,0 13,0 3,6 16,0 34,0 5,4
35,0 15,0 3,8 13,7 36,3 5,6
33,0 17.0 4.0 11,8 38.2 5,8
31,0 19,0 4,2 9,5 40,5 6,0
28,0 22,0 4,4 7,2 42,8 6,2
25,5 24.5 4,6 - - -
3. D ung dịch đệm p h otp h al (pH = 5,7 *f 8,0)
a) Dung dich rnononatri ocíhophotphat 0y2M : 27,8g NaH.^POị hoà ta n và

dẫn nưỏc đến 1000 ml.
b) 0y2ml d u n g clich đinatri hiđrophotphat : 53,0õg NagHPO^. 7 H«,0 hoặc

71,7g N a.,H P 0 4.12H 20 hoà ta n và dẫn nước đến lOOOml.
Dung dịch đệm p h o tp h at có pH khác nhau phụ thuộc vào sô mililit dung dịch (a)
và số m ililit dung dịch (b) dẫn nước đến 20 0 ml.
a b pH a b pH
93,5 6,5 5,6 45,0 55,0 6,9
92,0 8,0 5.8 39,0 61,0 7,0
90,0 10,0 5,9 33,0 67,0 7.1
87,7 12,3 6,0 28,0 72.0 7,2
85,0 15,0 6,1 23.0 77.0 7,3
81,5 18.5 6,2 19,0 81.0 7,4
77,5 22,5 6,3 16,0 84,0 7,5
73,5 26,5 6,4 13,0 87.0 7,6
r-» I-T
68.5 31.5 6,5 10,5 89,5 7,7
62.5 37.5 6,6 8,5 91,õ 7,8
56,5 43,5 6,7 7,0 93 7,9
51,0 49.0 6,8 5,3 94,7 8.0
156
4. D ư n g d ị c h đ ệ m N a 2HtP04 - KH2P 0 4 t h e o S o r e n s e n (pH = 5,0 4- 8,0)
a) D u n g d ị c h đ i n a t r i h iồ r o p h o t p h a t 1/15 M : 23,9g N a 2H P 0 .ị.l 2 H 20 hoà ta n

và d ẫn nước đên 1000 ml.
b) D u n g d ị c h k a l i d i h ũ đ r o p h o t p h a t 1/15 M : 9,07g KHọPO ị hoà ta n và dẫn
nước đến 1000 ml.
Dung dịch đệm có pH khác n h a u phụ thuộc vào sô' m ililit dung dịch (a) và số
m ililit clung dịch (b).
a b pH a b pH
10 990 5,0 372 628 6,6
18 982 5,2 492 508 6,8
30 970 5,4 612 388 7,0
49 951 5,6 726 274 7,2
79 921 5,8 818 182 7,4
121 879 6,0 885 115 7,6
184 816 6,2 936 64 7,8
264 736 6,4 969 31 8,0
5. D ư n g d ịc h đ ệ m g ly x in - HC1 (pH ss 2,2 -r 3,6)
a) D u n g d ị c h g l y x i n Q>2M : 15,01g glyxin(C 2H 5N 0 2 ) được hoà ta n và dẫn nưỏc

đến 1000 ml.
b) D u n g d ị c h H C l 0,2M : 16,8ml đặc (37%) pha th àn h 1000ml. D ung địch đệm
glyxin có pH khác n h a u k h i lấy 50ml dung dịch (a) và X ml dung dịch (b) dẫn nưổc đến
200 ml.
X pH X pH
5,0 3,6 16,8 2,8
6,4 3,4 24,2 2,6
8,2 3,2 32,4 2,4
11,4 3,0 44,0 2,2
6 . D u n g d ịc h đ ệ m g ly x in - N aO H (pH ss 8,6 4- 10,6)
a) D u n g d ị c h g l y x i n 0 , 2 M : lõ , 01 g glyxin (C 2H 5NO 2) được hoà ta n và d ẫn nưổc

đến lOOOml.
b) D u n g d ị c h N a O H 0 ,2 M : 8 g NaOH hoà ta n và dẫn nước den 1000ml
Dung dịch đệm glyxin-NaOH có pH khác n h a u khi lây 50ml (lung (lịch (a) và X ml
dung dịch (b) dẫn nưốc đến 2 0 0 ml.
X pH X pH
4,0 8,6 22,4 9,6
6,0 8,8 72,2 9,8
8,8 9,0 32,0 10,0
12,0 9,2 38,6 10.4
16,8 9,4 45,5 10.6
7. D ung d ịch đệm co llid in (pH S5 6,45 -r 8,35)
a) D u n g d ị c h c o lỉid in 0,2M : 24,24g CH*{Cr>H.jNC.,Hr, (d = 0,917) được hoà ta n

và dẫn nước đến lOOOml.
b) D u n g d ị c h H C l O y lN : 8,4ml HC1 đặc (37%) pha th àn h 1000ml.
Dung dịch đệm collidin có pH khác nhau khi lấy 25ml dung dịch (a) và Xml dung
địch (b) dẫn nưốc đến 1 000 ml.
X pH X pH X pH
45,0 6,45 30,0 7,22 15,0 7 ,77
42,5 6,62 27,5 7,30 12,5 7,38
40,0 6,80 25,0 7,40 10,0 8,00
37,5 6,92 22.5 7,50 7,5 8.18

35,0 7,03 20,0 7,57 5,0 8.35
32,5 7,19 17,5 7,67 - -
Giá trị pH này ỏ n h iệt độ 23°C; ỏ n h iệt độ 37°c, giá trị này nhỏ hơn 0,08.
8 . D u n g d ịc h đ ệ m a x e t a t (pH = 3,6 -T 5,6)
a) D u n g d i c h a x it a x e tic 0y2M : ll,5 5 m l CH ịCOOH đặc dan nưốc (ìên lOOOml.
b) Dung d ịc h n a tri a x e ta t 0,2M : 16,4g CH .,COONa hoặc 27,2g

CH ?COONa.3HvO được hoà ta n và dan nước đến lOOOml.
Giá trị pH của dung dịch đệm phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) và Y ml dung dịch
(b) dẫn nước đến 100 ml.
X Y pH X Y pH
46,3 3,7 3.6 25,5 24,5 4,6
44,0 6,0 3.8 20,0 30,0 4,8
41,0 9.0 4,0 14,8 35,2 5,0
36,8 13.2 4,2 10,5 39,5 5,2
30,5 19,5 4,4 8,8 41,2 5,4
- - - 4,8 45,2 5.6
9. D u n g d ịc h đ ệ m v e ro n a n - HC1 (pH = 6,8 -r 9,2)
a) D u n g d ị c h ncitri v e ro n a n 0,2M : 41,2g n a tri veronan (barbital sodium;

C( ĩ ỉ n NyO^Na) cĩược hoà ta n và dẫn nước đến 1000ml.
b) D u n g d ị c h H C l 0,2M: 16,4ml HC1 đặc (37%) dẫn nước đến 1000ml.
Giá tr ị pH của dung dịch đệm veronan - HC1 phụ thuộc vào 50ml dung địch (a) và
X ml dung dịch (b) d ẫ n nưốc đến 200ml.
X pH X pH
1,5 9,2 22,5 7,8
2,5 9,0 27,5 7,6
4,0 8,8 32,5 7,4
6,0 8,6 39,0 7,2
9,0 8,4 43,0 7,0
12,7 8,2 45,5 6,8
17,5 8,0 - -
10. D u n g d ịch đệm n atri veronan - n atri a x eta t ( pH = 2,62 -r 9,64)
a) D u n g d ị c h g ố c : 9,714g C H ọC 00N a.3H 20 và 14,714g n a tri đietvl b a rb itu ra t

(b arb ital sodium - CfiH, j^ O ^ N a ) hoà ta n trong 500m l nước.
b) D u n g d ị c h H C l 0 ,1 N : 8,2ml HC1 đặc (37%), dẫn nước đến 1000ml.
Đê n h ậ n được dung dịch đệm có pH khác nhau, lấy 5ml dung dịch(a), cho thêm
Xml dung dịch (b) và dẫn nước đến 25ml.
159
X pH X pH X pH
0,00 9,64 5,0 7,42 11,0 4,33
0,25 9,16 5,5 7,25 12,0 4,13
0,50 8,90 6,0 6,99 13,0 3,88
0,75 8,68 6,5 6,75 14,0 3,62
1,00 8,55 7,0 6,12 15,0 3,20
2,00 8,18 8,0 5,32 16,0 2,62
3.00 7,90 9.0 4,93 - -
4,00 7,66 10,0 4,66 - -
11. D ung dịch đệm cacb on at ( pH = 9,2 4- 10,7)
a) D u n g d ị c h n a i r i c a c b o n a t 0,2M : 21,2g Na.^CO.Ị được hoà ta n và dẫn nước

đến 100 ml.
b) D u n g d ị c h n a t r i h i đ r o c a c b o n a t 0 , 2 M : 16,8g NaHCO., được hoà ta n và dần

nước đến 1000 ml.
Dung dịch đệm cacbonat có pH khác n h au phụ thuộc vào sô m ililit dung dịch (a)
và sô m ililit dung dịch (b) dẫn nước đến 2 0 0 ml.
a b pH a b pH
4,0 46,0 9,2 27,5 22,5 10,0
7,5 42,5 9,3 30,0 20,0 10,1
9,5 40,5 9,4 33,0 17,0 10,2
13,0 37,0 9,5 35,5 14,5 10.3

16,0 34,0 9,6 38,5 11,5 10,4
19,5 30,5 9,7 40,5 9,5 10,5

22,0 28,0 9,8 42,5 7,5 10.6
25,0 25,0 9,9 45,0 5,0 10,7
12. D ung dịch dệm đa n ăn g B rittonvà R obinson (pH = 1,8 4- 12)
a) D u n g d ị c h g ố c : axit axetic (CHflCOOH) 0,04m (2,32m l pha th à n h 1000ml),

axit photphoric (H ^P 04) 0,04M, axit boric 0,04M.
b) D u n g d ị c h N a O H 0 j 2 M : 8 g NaOH hoà ta n và dẫn nưỏc đến 1000ml.
Dung dịch đệm đa n ăn g có pH khác n h a u phụ thuộc vào 100ml dung dịch gốic (a)
khi thêm X ml dung dịch (b) và dẫn nưỏc đến 200ml.
160
X pH X pH X pH X pH X pH
0.0 1,81 20,0 3.29 40,0 5,72 60,0 7,96 80,0 10,38
2.5 1,89 22,5 3,78 42.5 6.09 62,5 8,36 82,5 10,88
5,0 1,98 25,0 4,10 54,0 6,37 65,0 8,69 85,0 11,20
7.5 2.09 27,5 4,35 47,5 6,59 67,5 8,95 87,5 11,40
10,0 2.21 30,0 4,56 50,0 6,80 70,0 9,15 90,0 11,58
12,5 2,36 32,5 4.78 52,5 7.00 72,5 9,37 92,5 11,70
15,0 2,56 35,0 5,02 55.0 7,24 75,0 9,62 95,0 11,82
17,5 2.87 37,5 5,33 57,5 7.54 77,5 9,91 97,5 11,92
- • - - - - - - 100,0 11,98
13. D u n g d ịc h đ ệ m Me Ilv a in e ( pH = 2,2 f 8,0)
a) D u n g d ịc h a x il x i t r i c OylM : 21,008g axit xitric (C(;H 80 7) được hoà ta n và

dẫn nước đến 1000 nil.
b) D u n g d ị c h đ i n a t r i h i đ r o p h o t p h a t : 35,62g N a 2H P 0 4 . 2 H 20 hoặc 71,7g
Na.^HPO.j.riH.jO được hoà tan và dần nưổc đển 1000ml.
Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) và đẫn
đến 20m l bởi dung dịch (b).
X pH X pH X pH X pH
19,60 22 12,90 3,8 8,85 5,4 3,53 7,0
18,76 2,4 12,29 4,0 8,40 5,6 2,61 7,2
17,82 2,6 11,72 4.2 7,91 5.8 1,83 7,4
16.83 2,8 11,18 4.4 7,37 6,0 1,27 7,6
10,89 3,0 10,65 4,6 6,78 6,2 0,85 7,8
15,06 3,2 10,14 4,8 6,15 6,4 0,55 8,0
14,30 3,4 9,70 5.0 5,45 6,6 - •
13,56 3,6 9,28 5,2 4,55 6,8 - -
14. D u n g d ịc h đ ệ m Thc>orella và S te in h a g e n (pH = 2,0 -r 12,0)
a) D u n g d i c h g ố c : 100ml CH.JfCOOH IN (5,7ml dung dịch ax it axetic đặc d ẫn

nưổc đến 1000ml), 100ml axit photphoric (H^PO.ị) IN, 3,54g axit boric và 343ml
NaOH IN được hoà ta n và dẫn nước đến 1000ml.
161
b) D u n g d ị c h H C l 0,1 N : 8,4ml HC1 đặc (37%) pha th à n h 1000ml.
Dung dịch đệm có pH khác n h a u phụ thuộc vào 100ml dung dịch gôc (a) khi cho
thêm X ml dung dịch (b) và dẫn nước đến 500ml.
X pH X pH X pH X pH X pH
366,0 2,0 247,3 4,2 183.7 6,4 130,5 8.6 77,0 10.8
339,3 2,2 241,8 4,4 176,8 6,6 124,5 8,8 72.6 11,0
319.3 2,4 236,3 4,6 169,6 6,8 118,8 9.0 66,0 11,2
304,0 2,6 231,1 4.8 163,3 7.0 111,9 9,2 56,2 11.4
292,3 2,8 225,9 5,0 157,3 7.2 105.6 9,4 42,0 11,6
282,5 3,0 220,3 5,2 151.8 7.4 99.7 9,6 23,5 11,8
274,8 3,2 214,7 5,4 147,2 7,6 94,1 9,8 2,0 12,0
268,5 3,4 210.0 5,6 143,4 7,8 89,6 10,0 - -
263,3 3,6 203,1 5,8 140,1 8,0 84,9 10,2 - -
257,3 3,8 197,1 6,0 137,3 8,2 81,8 10,4 - -
252,5 4,0 190,5 6,2 134,5 8,4 79,8 10,6 - -
15. D ung dịch đ ệm a x it axetic - am oniac (pH = 3,0 -r 11,0)
a) D u n g d ị c h a x i t a x e t ic OylN : 0,57ml axit axetic đặc pha th àn h 1000ml với

nước cất.
b) D u n g d ị c h a m o n i a c 0 ,1 N :
Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) dẫn đến 100ml
bằng dung dịch (b).
X pH X pH X pH X pH
99,24 3,0 54.60 5,4 47,80 7,8 16,00 10,2
93,40 3,4 50,90 5,8 46,40 8,2 9,80 10,6
88,20 3,8 50,40 6,2 44,70 8,6 2,48 11,0
80,20 4,2 50,30 6,6 41,00 9.0 - -

66,90 4,6 50,00 7,0 34,00 9.4 - -
58,60 5,0 48,40 7,4 28,00 9,8 - -
1 62
II. DƯ NG DỊCH pH CHUAN
1. D un g dịch đikali tartrat (CịHịO^K.^) bão hoà ở 2 5 ° c pH = 3,56; ở 30 c

pH = 3,55.
2. D ung dịch kali p h talat (C8H :- 0.,K ) 0.05M : 10,21 l g hoà ta n trong nưốc và dẫn
đến 1000m l, ỏ 20 - 3 0 °c . pH = 4,0.
3. D ung dịch K H .,P 0 4 và N a 2H P O ị 0.025M: 3,402g K H .Ô ,, và 4,451g

N a.;H P 0,j.2H .,0 hoà ta n trong nước và d ẫn đến 1000m l, ỏ 20- 3 0 " c, pH = 6,86 - 6,88.
4. D ung dịch borat 0.01M : 3 ,8 1 4g N a 2B 40 7.1 0 H 20 hoà ta n trong nưốc và dẫn

đến 1 0 0 0 ml, ở 20- 2 5 ° c , pH = 9.2.
III. NỒNG Đ Ộ AXIT V À A M O N IA C T H Ư Ờ N G G Ặ P
T ê n d u n g d ịc h T ỷ k h ố i (d ) ở 2 0 ° c % k h ố i lư ợ n g N ồng độ N
A xit sunfuric đặc 1,834 9 5 ,0 0 36 ,0 0
A xìt sunfuric pha loãng 1.178 2 5 ,0 0 6,00
A xit sunfuric pha loãng 1.032 5,00 1,20
A xit clohiđric đặc 1,181 3 7 ,0 12,00
Axit. clohictric pha loãng 1,098 20,ọo 6,00
A xit clohiđric pha loãng 1,017 10,00 3 ,0 0
A xit photphoric đặc 1,700 5 ,0 0 14,70
A xit percloric 1,540 6 0 ,0 0 9 ,0 0
A xit flohidric đặc 1,146 4 6 ,6 0 2 6 ,3 0
A xit axetic đặc 1,050 100,00 17,50
A xit axetic pha loãng 1,013 10,00 1,70
A xit axetic pha loãng 1,005 5 ,0 0 0 ,9 0
A m oniac đặc 0 ,9 0 7 2 5 ,0 0 13,40
A m oniac p h a loãng 0 ,9 7 5 10,00 6 ,0 0
A m oniac p h a loãng 0 ,9 7 7 5 ,0 0 3 ,00
163
IV. P H A D U N G D ỊC H P H A N T R Ả M A X IT V À A M O N IA C
(m ililit dung dịch đặc để pha th à n h 1 lít)
T ên h oá T ỷ k h ố i (d ) N ồng C ác n ồ n g đ ộ % m u ố n pha
chất ở 15°c độ % 25% 207r 10% 5% 2% 1%
CH.ịCOOH 1,05 9 5 .5 0 217,8 196,7 97,1 48,2 19,2 9 ,0 0
H ,S O , 1.84 9 5 ,6 0 167,7 129,9 60,6 29,3 11,5 5,60
HC1 1,19 37,23 634,8 4 9 6 ,8 23 6 ,4 115.2 4 5 ,5 2 2 ,6 0
HNO Ị 1,40 6 5 ,6 0 313,6 2 4 3 .6 115,0 5 6 ,0 2 2 ,0 10,80
NH.ịOH 0,91 2 5 .0 0 100,0 8 1 4 ,0 4 2 2 ,0 2 1 5 ,4 87.2 4 3,7
P h a d u n g d ịc h c ó n ồ n g đ ộ đ ư ơ n g lư ợ n g k h á c :
Đ ương
Đơn
Hoá c h ấ t lượng IN 0,5N 0,2N 0 ,1N 0,05 N 0,02N 0,01 N
vị
(N)
H 2S O d (d = l,8 4 ) 49,04 28 ,0 14,0 5,60 2 ,80 1,40 0 ,5 6 0 ,2 8 ml
HC1 (đ = l,1 9 ) 36 ,4 6 82 ,0 4 1 ,0 16,40 8 ,20 4 ,1 0 1,64 0,82 ml
H 2C 20 4.2 H 20 6 3 ,0 4 - - - 6 ,3 0 3 ,1 5 1,26 0,6 3 g
KMnO.! 31,61 - * - 3,16 1,58 0 ,6 3 0,3 2 g

\
N aO H 40 ,0 0 4 0 ,0 20,0 8,00 4 ,0 0 2,0 0 0 ,8 0 0 ,4 0 g
KOH 56,11 56,1 28,0 11,20 5,60 2,8 0 1,12 0 ,5 6 g
A gN O :1 169,89 • - - 17,00 8,51 3 ,4 0 1,70 g
N a 2S jj0 3.5 H 20 24 8 ,2 1 - - - 2 4 ,8 0 12,40 5 ,0 0 2 ,5 0 g
M uôi M ohr * 3 9 2 ,1 6 • - 7 8,40 3 9 ,2 0 19.60 7 ,8 4 3,92 g
K2Cr20 7 4 9 ,0 4 - • 9,81 4 ,90 2 ,4 5 0 ,9 8 0 ,4 9 g
T rilon B ** 186,12 - - - 18,6] 9 ,3 0 6 3 ,7 2 2 1,861 g
* M uôi M ohr : s ắ t (II) - am on i su n fa t * F e S 0 4.(N H 4) S 0 4.6 H .,0
* * T rilo n B : a x it e ty le n điam in tetra axetic đinatri
N a 2H 2(C H vC 0 0 ) 4.N2(CH ./>).>.2H .,0 (Com plexom III hay c h e la to n 3) • 3 7 2 ,2 4 2 .
Có tà i liệu đương lượng T rilon B = khôi lượng mol (M). Ở đây đương lượng tín h
b ằn g M /2.
164
V. KHỔI LƯỢNG MOL PHẢN TỦ VẢ TỶ KHỎI CỦA MỘT s ố AXIT
K h ô i lư ợ n g Để nhận được
N ồng Tỷ khối
T ê n a x it m ol phân d u n g d ịc h
đ ộ (%) (d )
t ử (M ) l m o l (m l/1 )
Axit nitric (H N O . ị) 70 1 5 ,7 64 1 ,4 2
Axit photphoric (H .PO ị) 85 1 4 ,8 68 1 ,7 0
1 A xit percloric (HClO.ị) 60 9 ,2 109 1 ,5 4
A xit percloric (HCIO.ị) 70 1 1 ,6 86 1 ,6 7
A xit a x e tic (CH;,COOH) 9 9 ,5 1 7 ,4 58 1 ,0 5
Axit su n fu ric (H .,S 0 4) 96 1 8 ,0 56 1 ,8 4
A xit clohiđric (HC1) 37 1 2 ,0 84 1 ,1 9
V I. K IẾ M T R A N Ồ N G Đ Ộ CÁC D U N G D ỊC H C H U A N đ ộ đ ả p h a bang
D Ư N G D ỊC H C H Ấ T G ố c CÓ N ổ N G Đ Ộ C H ÍN H XÁC
D u n g d ịc h C hat góc Sô gam đ ể 20m l c h ấ t g ô c và th ê m M àu

chuẩn dộ p h a 100m l các ch ất phụ ch u ẩn độ
dã p h a 0 ,1 N
h 2s o , N a tr i tetraborat 1,910 2 giọt chỉ thị m etyl da v à n g sa n g

0 ,1N Na.2B <10 7.1 0 H 20 cam đỏ n h ạ t
NaO H A xit oxalic 0 ,6 3 0 3 giọt chỉ th ị x u ấ t hiện

0 .1N H 2C 20 4.2 H ,,0 p h en o lp h ta lein h ồn g n h ạ t
KMnO., A xit oxalic 0 ,6 3 0 15m l H 2S 0 4 1:4 đun x u ấ t h iện

0 .1N H 2C 20 4.2 H 20 nóng n h ẹ (80°C) hồn g n h ạ t
N a ,s ,0 , K ali bicrom at 0 .4 9 0 lõ m l KI 10%, 3m l HC1 m ấ t màu

CUN K 2C r20 7 (Sấy đặc, 150m l nưốc cất, xanh
khỏ ỏ 100°C) ch u ắ n độ đến v àn g n h ạt
thi thêm 2 ml tin h bột 0,5%
AgNO.ị N a tr i clorna 0 ,5 8 0 chỉ cho vào bình nón õm l x u ấ t hiện

0 ,0 2 N k h a n - N a Cl( s ấ y N aC l 0 ,l N và 20m l nước, m àu nâu
khô ở 120°C) th êm lm l K2CrO,j 10%
Tri lon B M a g ie su n fat 1,2325 õm l đệm am on i ( p H = ll) , từ đỏ sa n g

M gSO .ị.7 H 20 10 giọt chỉ th ị crom ogen x a n h b ền
0 ,0 5 N
đen (erichrom đen T) 0,5%
165
v u . CHỈ THỊ MÀU AXIT - BAZƠ
T en th ư ờ n g g ọ i ( .lớ i h ạ n M àu D u n g m ôi N ồng
|)H d ô i h o à ta n d ô °ỉt
A x it B azơ
m àu
M etvl tím Ọbưốc ch u yến 1) 0 ,1 -0 ,5 v àn g x a n h lục nước 0 ,]
Met.yl tím (bước ch u yên 2) 1,0-1,5 xa n h lục x a n h biên nước 0.1
C reson đỏ 0,2 -1 .8 đỏ vàn g nước 0,0 5
T ym ol xanh da trời 1.2-2.8 (tỏ vàng eta n o l 20% 0,1
TYopeolin 00 1,2 • 3,2 đỏ vàn g nước 0,1
Đ im ety l vàng 2,9-4.0 đỏ vàn g e ta n o l 96% 0,1
B rom ophenol x a n h da trời 3,0-1.6 vàng đỏ thấm nưốc 0.01
M etyl da cam 3,1-4.4 đỏ v à n g da nưốc 0,1

cam
Brom ocresol xan h 3,8-5,4 vàng x a n h tham Ptanol 20% 0,1
Congo đỏ 3,0-5 ,0 tím đỏ cam eta n o l 80% 0,1
ịM etyl đỏ 4.2-6.3 đỏ vàng eta n o l 60% 0,1 và

0,2
B rom ophenol đỏ th ẳm 5,2-6 ,8 vàng tím nước 0,1
L acm u s (litm u s, quỳ xanh) 5,0-8.0 đỏ xanh thẩm nưỏc 0,1
B rom tvm
- ơl xan h da trời 6,0-7,6 v àn g xanh tham eta n o l 20% 0 ,0 5
....
P h en ol (lo 6,8-8.2 v àn g di eta n o l 20% T r |
Đỏ tru n g tin h 6,8-8,0 dỏ v à n g da eta n o l 70% 0.1

cam
C resol ctỏ 7,2-8,8 vàng đỏ nước 0,1
ịT ym ol xan h da troi 8,0-9.2 v àn g x a n h da eta n o l 20% 0.1 ị

tròi
. . .......
P h on olp h latein 8 ,2-1 0 ,0 không (tỏ a n h đào eta n o l 70% 0.1

m àu
T y m o lp h la tein 8.8-10,5 không eta n o l 90% 0,1

m àu
A lizarin v à n g R 10.0-12.0 vàng eta n o l 80% 0.1
Tio(H*olin 11,1-12.7 van g nước 0.1 !
166
V III. CÁC H P H A V À s r DỤN<; M Ộ T s ố T H U Ỏ C T H Ử C H Í T H Ị M À U T H Ố N G
THƯỜNG
Thuốc thu chỉ th ị màu la hóa chất hiểu hiện màu trong các p h ả n ứng hoa học xây
ra. Thuốc chỉ th ị không ánh hiícìng (tốn quá trinh, tốc độ và th à n h phần của phan
ứng. Sau đây là m ột s ố cha! chi thị m àu thông dụng.
1. T h u ô c t h ử h ỗ n h ợ p d ù n g t r o n g đ in h lư ợ n g n i i ơ
Màu sắc của th uốc thứ này phụ thuộc vào pH của môi trường ph ản ứng và tý ]ệ
phán trăm của nó tron g hồn hợp. c ỏ h a i loại thường (lủng:
a) T h u ố c t h ử 1
• lg m etyl xan h hoà trong 100m l cồn 90%
- lg m etyl đỏ hoà trong 100m l cồn 90%
Trộn hai th ứ th eo tỷ lộ 1:2.
Trong m ỏi trường axit. thuốc thử có m àu hồng hơi tím , trong m ỏi trường tru n g
tín h và kiểm có m àu xan h lá mạ.
b) T h ỉ i ó c t h ử 2
• 33m g brom ocresol xanh lá cây (hoặc brom otym ol xa n h đ a trd i).
• 66m g n ie ty le n đỏ
HoÀ ta n vào 2 0 0 m l cồn 60%. Trong môi trường axit cỏ m àu h ồn g nhạt. T rong mỏi
trường kiểm có m àu x a n h lá ma nhạt.
2. Dci t r u n g t ín h
lg đỏ tru n g tín h pha trong 100m l cồn 60%. Trong môi trường pH nhỏ hơn 6,5 có
m àu đỗ, pH t ừ 6 ,8 -8 ,0 có m àu vàng nh ạt.
3. P h e n o l p h t a l e i n
Nồng độ từ 0,1 - 1% tan trong cồn 60%. N êu pH trong m ôi trường nhỏ hờn 8,
kh ông có m au. pH = 8,2 “ 10, có m àu hông tươi.
4. T y m o lp h t a le in
N ồng độ từ 0 ,0 5 - 0,1% ta n trong cồn 60% trơ lên. T rong m ôi trư ờng pH nhỏ hơn
9, không có m àu, pH từ 9 ,4 - 10,() có m àu xa n h tím.
5. H ổ t in h b ộ t
Chỉ th ị hổ tin h bột kiểm tra sự có m ặt của iot. lo t ở dạn g tự do không có màu.
K hông có iot tự do, có m àu nâu hoặc xanh tím .
167
Cách pha: cân m ộ t lượng tinh bột ta n (nồng độ % theo ý muôn) hoà vào một ít
nước cất, tiếp tục đố th êm một lượng nước cát đang sôi (vừa dỏ vừa khuấy) theo thê
tích có n ồn g độ p h ần trăm tín h trước, đun sôi tiêp 2 - 3 ph ú t, Lọc và cho bão hoà NaCl.
6. T h u ố c th ử N e s s le r
P h át h iện sự có m ặ t của nitơ theo hai cách:
a ) Cách thử 1
lõ g Hgl.; và lOg KI hoà vào 15ml nưóc cất, th êm 8 0 m l du n g dịch N aO H 50%, tiếp
tục th êm nước cát (k h ôn g có nitơ và c o .;) đến th ể tích 500m l. Sau 24 giở lọc lấv nưốc
trong và bảo quàn tron g lọ màu.
T huốc thử nàv có m àu v à n g nhạt, khi tác dụng với nitơ có m àu v à n g tươi.
b) C á c h t h ứ 2
- D ung dịch KI: 3 5 g KI hoà tan trong 100m l nưốc c ấ t nóng.
- D ung dịch HgClg: 17g HgCỊ> hoà tan trong 3 0 0 m l nước cất.
- D ung dịch N aO H h ay KOH 20%.
Đổ dung dịch H gC l2 vào dung dịch KI đến khi có kêt. tua cỉỏ của H g l2 tạo thành,
không th ấy ta n nữ a th ì (lừng lại. Thèm dung dịch kiểm 20% đến 1 lít, th êm tiếp 5m l
dung dịch HgCl.,, k ế t tủ a đỏ xuất hiện. Đê dung dịch lắ n g h oàn toàn trong suốt (có
m àu hơi v àn g n h ạt), lấy nước trong, bảo quản trong lọ m ầu náu đậy ban g n ú t cao su.
Khi tác dụng với nitơ, dung dịch có màu v àn g tươi.
N êu (lung dịch n g h iê n cứu có nồng độ nitơ lớn hơn 8 - 10m g/l sẽ có kết tủa.
N ếu du n g dịch có Ca*^ lổn hrtn 100m g/l hay M g2* lớn hơn 0 ,5 - lm g/1 cũ n g sẽ có
két tủ a. Đ ê trán h h iệ n tượng nàv, phải pha loăng dung dịcK n g h iê n cứu (tể có nốn^ độ
nitơ nhỏ hơn lOmg/1.
IX. C Á C D U N G D ỊC H R Ử A D Ụ N G c ụ B A N T R O N G P H Ò N G T H Í N G H IỆ M
TT T h à n h p h ẩ n d u n g d ic h rử a L oại c h ấ t bẩn
1 D ung dịch N aO H hoậc KOH 10% M áu, protein

9 D ung dịch N aO H cồn nóng (120g N aO H hoà ta n trong Mỡ
120m l nước cấ t và dẫn đến 1000ml bằng cồn)
3 A xeton Mỡ
4 Cồn - HC1 ( 3m l HC1 đặc + 100ml cồn) T huốc nhuộm
5 D ung dịch tr io su iifa t (khoảng 3%) D ấu iot, brom
168
TT T h à n h p h ẩ n d u n g d ịc h rử a L oại c h ấ t bẩn
6 D ung dịch axit oxalic (khoảng 2%) MnO., (có ở pin)
/ D ung dịch natri xitral íro n g NaOH 10% T ấ t cả
8 D ung dịch N a ,P O | nóng õ° 0, 10% hoặc 20% T ất cả
9 H ỗn hớp crom (50g K .,Cr.,07hoà trong 100m l nưổc nóng, cho T ấ t cả

vào cốc sứ trộn vâi 1 lít H.^SO ị đặc)
C hú ý: C h u ẩn bị hỗn hợp crom phải có kinh bảo v ệ và găng
tay cao su.
X. N G U Y Ê N T Ử K H Ố I C Ủ A M Ộ T s ố N G U Y Ê N T ố
T ên Ký h iệ u K h ôi lư ợ n g T ên K ý h iệ u K h ố i lư ợ n g
A ntim on Sb 121,76 Kẽm Zn 6 5 ,3 8

A sen As 74,91 Flo F 19,00
Nitd N 14.008 Photpho p 30 ,9 7 1
Bari Ba 137,136 Nhôm AI 2 6 ,9 8
B itm u t Bi 209,00 H eli He 4 ,0 0 3
Bo B 10.82 lo t I 126,91
Brom Br 79,916 C ađim i Cd 112,41
Clo Cl 35,457 C oban Co 5 8 ,9 4
('rom Cr 52,01 Silic Si 2 8 ,0 9
Thiếc Sn 118.70 L iti Li 6 ,9 4
M agie Mg 24.32 Bạc Ag 107,88
Ma n gan Mn 54,43 Stronti Sr 8 7 ,6 3
Đ ồng Cu 63,54 Oxi 0 16,0 0
M olypđen Mo 95,95 Ư ran u 2 3 8 ,0 7
N ik en Ni 58,69 V anađ i V 5 0 ,9 5
Chì Pb 207,21 C anxi Ca 4 0 ,0 8
K ali K 39,10 Cacbon c 12,01
T huv n g â n Hg 200,61 Hiđro H 1.008
S e le n Se 78.96 Volfram w 183,92
Lưu h u ỳn h s 31.006 V àng Au 197,20
N atri Na 22,997 Sắt Fe 5 5 ,8 5
169
XI. NổNG ĐỘ DUNG DỊCH AMONISUNFAT BÃO HOÀ Ở NHIỆT ĐỘ KHÁC NHAU
N h iệ t độ 0° 10° 20° o25"° 30°
S ố lượng gam (N H 4).2SO ị 707 730 756 767 777

pha th à n h 1 lít
X II. C Á C H T ÍN H L ự c LI TÂM
T rong quá trình li tâm người ta thường tín h sô vòng/phút, đó là sô "vòng quay” (d)
th eo thời gian , n goài ra còn có đại lượng khác là lực li tâm tương đôi được biểu th ị
bằng bội sỏ" trọng lực (g) được tính theo công thức:
g= ll,2.10'cr.x2
T rong đó: r - b á n kính của ‘Vòng quay”, n gh ĩa là khoảng cách (tính bằng cm) từ
trục lực li tâm đến điếm xác định lực li tâm tương đốì (ví dụ đáy của ông
li tâm ).
X - sô" vòng quay trên phút.
X III. CÁC KÝ H IỆ U Q U Y Đ ỊN H KÍCH T H Ư Ớ C VÀ CÁC P H A N t h ậ p p h â n
Q uy định T iếp đầu ngữ Bội số
Exa- E 1 0 18 1 .0 0 0 .0 0 0 .0 0 0 .0 0 0 .0 0 0 .0 0 0
P eta- p 1 0 ,r’ ....... 1 .0 0 0 .0 0 0 .0 0 0 .0 0 0 .0 0 0
T eta- T 1 0 12 1.0 0 0 .0 0 0 .0 0 0 .0 0 0
G iga- G 10° ............... 1.000.000.000
M ega- M 10ữ ....................... 1.000.000
Kilo- k 103 .................................. 1.000
Hecto- h 102 ..................................... 100
Deca- điều kiện io ’ ........................................ 10
Deci- đ 10'1 ........................................... 0,1
C enti- c 10‘2 ...........................................0,01
M ili- m 10'a ...........................................0.001
Micro- n 10'e ........................................... 0.000.001
Nano- n 10'9 ........................................... 0.000.000.001
Pico- p 10 12 ......................................... 0,000.000.000.001
170
XIV. CÁC CHỬ CÁI HY LẠI*
A a alpha I 1 iota p p rho
B p beta K K kappa y s sigm a
r y gam ma A X lam bda T X tnu
A ô C delta M M
- mu r u upsilon
E £ epsilon N X) nu CD Ộ (p phi
z zeta JZ.
c xi
s
XV. C Á C T ÍN H C H Ấ T CỦA M ỘT s ố Đ ồ N G VỊ P H Ó N G X Ạ Ứ N G DỤNG

T R O N G Y S IN H H Ọ C
H at Thời K iể u N ăng N ăng H o ạ t tín h

nhân g ia n phân lư ợng p lư ợ n g r iê n g c ủ a
Sử dụng
b á n rã rã cự c đại y h ạ t tả i t ự d o
(t 1/2) (MeV) (MeV) (mCị /ing-atom)
;ỉH 12,26 p* 0.0186 2 .9 .10'1 clấnh dấu phóng x ạ cho các

nă m chất hữu cơ và hoá sinh
"c 5730 p- 0,156 64 đánh dấu phóng x ạ cho các

năm chất hữu cơ và hoá sinh;
thời g ia n tồn tạ i của
cacbon p h ón g xạ
O
CO
C
14,3 p* 1,71 9.1.10*’ đánh dấu phóng xạ cho

ngày nucleotit, A D N , ARN
OK
s 8 7 ,5 p* 0.1ÍỈ7 1,5.10° đánh dấu ph óng xạ cho các
n gày protein
4f’Cn 165 p- 0,255 8,2. K)5 ngh iên cứ u trao đối canxi
n gày (xương)
snFe 45 P-Y 1,56 1.29 2,9.10'! ngh iên cứ u trao đối sắ t

n gày (máu)
°°Co 5,2 6 P-Y 0,318 1,331 6 ,8 .104 n gh iên cứu hấp th ụ

n ăm v itam in B 12, chữa bệnh
bằng p h ón g xạ (u cấy)
125J 60 EC,y 0,035 sự ion h oá phóng xạ chất
22 .1 0 °
n gày thớm vỏi sự ph ân tích v ết
phóng xạ; giúp ch a n đoán
bệnh
I.
171
X V I. s ụ P H Ụ T H U Ộ C C Ủ A TỶ K H ổ ! V À C H Ỉ s ố K H Ú C XẠ V À O N ổ N C ì Đ Ộ
D U N G D ỊC H
°ĩf k h ô i lư ự n g G ly x e ra l S a c c a i* o z ơ N a tr i d ia t r i z o a t X e s i c lo r it
h o à ta n
Tỷ Chỉ số Tỷ C hỉ số Tỷ C hỉ số Tỷ C hỉ số
tr o n g nư ớc
khối k h ú c xạ khôi k h ú c xạ khối k h ú c xạ khối k h ú c xạ
2 1,003 1.335 1 ,006 1,336 1,010 1.336 1,014 1,334
4 1,007 1,338 1 ,0 1 4 1,339 1,023 1 339 1,029 1.336
6 1,012 1,340 1,022 1,342 1,036 1,343 1,046 1,338
8 1,017 1,342 1 ,030 1 34 5 1,049 1.346 1.062 1 339
10 1,022 1,345 1,038 1,348 1.063 1,350 1 080 1,341
12 1,026 1,347 1,046 1.351 1.078 1,353 1,098 1,343

14 1,031 1,350 1 055 1,354 1,092 1,357 1,116 1,345
16 1,036 1 352 1,064 1.357 1,108 1,360 1,136 1,347
18 1,041 1,355 1,072 1,361 1,129 1,364 1,155 1,349
20 1 046 1,357 1,081 1,364 1,140 1,368 1,176 1,351
22 1,051 1,360 1,090 1,367 1,156 1,372 1,197 1,353

24 1,056 1,362 1,099 1,371 1.133 1,377 1.218 1,355
26 1,061 1,365 1,108 1 ,374 1,191 1,381 1.241 1.357
28 1,066 1,368 1.117 1,378 1,209 1,385 1,264 1,359
30 1,072 1,370 1127 1,381 1.227 1.390 1,288 1,362
32 1,077 1,373 1,137 1,385 1.247 1,395 1,314 1,384

34 1.082 1,376 1 146 1,388 1,207 1 .400 1,339 1.367
36 1,087 1,378 1 156 1.392 1,288 1,405 1,366 1,369
38 1,093 1,381 1,166 1,396 1,310 1,411 1,394 1,372
40 1,098 1,384 1,176 1.400 1,329 1 416 1,423 1,374
42 1,104 1,387 1.187 1,404 1,452 1,377

44 1,109 1,390 1.197 1,408 1,484 1,380
46 1,115 1,393 1,208 1,412 1 516 1,383
48 1,120 1,396 1.219 1 4 16 1,550 1,386
50 1 125 1,398 1,230 1 420 1,585 1,389
52 1,131 1,401 1.241 1.424 1.621 1,392

54 1,136 1,404 1,252 1 42 9 1,660 1,396
56 1,142 1,407 1,263 1 433 1.700 1,400
58 1,148 1,410 1,275 1,437 1 742 1,404
60 1,153 1,413 1,286 1 442 1,787 1,408
G lyxerol C , H , 0 :ì MW 9 2 ,0 9
Saccarozơ MW 3 4 2 ,3
N atri d iatrizoat C ,,H ~ I;iN 20 ,N a MW 6 3 5 ,4
X esi clorit CsCl MW 168.4
172
T à i li ệ u t h a m k h ả o
1. Đ ặn g Thị Thu. N guyễn Thị Xuân Sâm , Tô Kim Anh:
T hí ngh iệm hoá sinh công nghiệp.
Trường D ại học Bách khoa Hà nội.
2. Lê V ăn T iềm , T rần Còng Tấu, 1983.
P h án tích đất và cây trổng.
N h à xu ất bản nòng nghiệp, Hà nội.
3. R odney F.Boyer, 1993.
M odern E xperim en tal Biochem istry.
Second Edition
T he B en jam in / C um m ings P u b lish in g Com pany, Inc, C alifornia.
4. T .A M acrides, 1995.
Laboratory E xercies in A dvanced Applied B iochem istry Su bject Code M L070

A pplied B iochem istry.
S e m e ster 1
D epartm ant. of M edical Laboratory Scince Royal M elboune In stitu teo f

T echnology.
5. K rish M oorthy, 1995.
Practical E xercises in Biochem istry
Senior L ectu res Biochem istry
R oyal M elboune Instit ute of Technology.
6. L eokadii K lyszejko Stefanow icz, 1972.
C w iczenia z R iochem ii
P a n stw o w e w ydaw nictw o N aukow e, W arszaw a.
173
C h ịu tr á c h n h iệ m x u ấ t bần :
G iám đốc NGUYỄN VAN THỎA

T ổng biên tập NGUYÊN THIỆN GIÁP
N g ư ờ i n h ậ n xét: PGS. TSKH NGUYỀN VÀN KÌNH

PGS. TS Đ ỏ NGỌC LIÊN
TS. BÙI PHUONG thuận
B i ề n t ậ p và sửa b ấ n in : ĐINH QUỔC THANG
T r ì n h bà y b ì a : ĐÍNH QƯÕC THANG
T H Ự C H À N H H O Á S IN H H Ọ C
M ã số: 0 1 .1 4 .Đ H .2 0 0 1 - 33.2001
In 1500 cuốh, tạ i N h à in Đ ại học Quôc gia Hà Nội
Sô”x u ấ t b ả n 173/33/C X B . Sô trích ngang 359 KH/XB
In xong và nộp lưu ch iểu quý IV/2001

Thuc-Hanh-Hoa-Sinh-Hoc - (Nxb-Dai-Hoc-Quoc-Gia-2001) - Nguyen-Van-Mui,-172-Trang - (Cuuduongthancong - Com)

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

You might also like

Thuc-Hanh-Hoa-Sinh-Hoc - (Nxb-Dai-Hoc-Quoc-Gia-2001) - Nguyen-Van-Mui,-172-Trang - (Cuuduongthancong - Com)

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Thuc-Hanh-Hoa-Sinh-Hoc - (Nxb-Dai-Hoc-Quoc-Gia-2001) - Nguyen-Van-Mui,-172-Trang - (Cuuduongthancong - Com)

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Đ A I H O C Q U Ố C G I A HA NÔI

NGU YẾN V À N MÙI

NGUYỄN VẢN MỪI

HOÁ SINH HỌC

NHÀ XUẤT B Ả N ĐẠI HỌC QUOC GIA HÀ NỘI - 2001

HOA CHAT VA DƯNG DỊCH

I. KHÁI NIỆM VỂ HOÁ CHẤT

Ethyl acetate GPR

Hinh 1.1 - Nhãn hoá chất

Chất ản mòn Chất kích thích C hất dễ nổ

Chất độc Chất có khói độc Chất có phóng xạ

A A A A A Rủi 1*0 sinh học

<- Dễ cháy không mỏ

<- Độc vái gan

<- Nguy hiếm nhiễm trùng

Có tia laze Chất ăn mòn Rủi ro sinh học

Hình 1.3 - Ký hiệu cảnh báo các vùng nguy hiểm

Cấm hiit thuốc Câ'm lửa Cấm vào

Hình 1.4 - Các ký hiệu cấm

Tire nearest first

Hình 1.5 - Các ký hiệu vế điểu kiện an toàn

a) Cần g i ữ h o á chất sạch

- Chai lọ hoá chất phải cỏ nắp

- Chỉ đê hoá chất dang dùng lúc đó.

II. DUNG DỊCH

111. NỒNG ĐỘ DUNG DỊCH

1. N ồ n g độ p h ầ n trả m (được c h ia là m 3 loại n ồ n g độ)

• Chất rắn tan trong chất lỏng

C u S 0 4 = 159,6 (-160); C u S 0 4 .5H20 = 249,7 (-250).

- Chất lỏng tan trong chất lỏng

b) P h ầ n t r ă m kh ô i lương - thê tích (% w/v)

c) P h ầ n t r ă m thê tích- t h ể tích (% v/v)

- Tính theo nồng độ và th ể tích

V 1x%1 = v 2y%2 (1.7)

Trong đó: V ì - thê tích dung dịch cần lấy pha

V 2 - thê tích dung dịch cần pha

% J - phần trăm dung dịch lây pha

%; - phần trăm dung dịch pha

0 < --------------------- 66g H 20

2 0 < -------------- lOg 20%

Cách p h a: Lấy 176ml NaCl 20% và 324ml NaCl 3% (500 - 176 )

d) C ách tín h các lo ạ i n ồ n g đô

1 % = 10 %.. = 100 0 mg% = 10 .0 0 0 ppm = 1 .0 0 0 . 0 0 0 \xg%

1 mg% = 0,001% =0,01%o = lO p p m = 1.000 ng%

Vi dụ 1: Pha K.,Ci\,0 7 có nồng độ IM.

Giải: Khôi lượng moi của K2 Cr 2 0 7= 294 (g)

- Chát tan là chất lồng tinh khiết (100%)

Ví dụ 2: Pha dung dịch Na^S^O.Ị.õH^O có nồng độ IM.

Giái: Khỏi lượng mol của Na.,S2 0.,.5H70 = 248 (g)

Trong đó: X - khôi lượng chất tan cần cân

C^Ị - nồng độ mol

Ví clụ 4: Pha HC1 2M từ HC1 37%, d = 1,19 ?

X = 36,5 * 100 X 2 = 19 7 ,3(g)

Thay vào công thức (1.3) ta có:

Vi dụ 5: Pha H 2 SO.t 0,2M từ II 2 SO,, 96%,d=l,84 ?

Giai: Thav vào công thức (1.10) ta có:

X = -9 8.x-i .Q0 X0,2 = 20,42 (g H aSO. 96%)

Thay vào công thức (1.3) ta có: