Purificación proteica por cromatografía

[Guía de respostas]

Cultivo celular en horizontal para aumentar aireación. Cultivos con producción de GFP. Pellet celular con GFP.
Cromatografía. GFP retida en columna HIC

• Fase de cultivo celular.

1. Fixeches dous cultivos, un partindo dunha colonia non fluorescente baixo

luz UV e outro partindo dunha fluorescente. Que se trata de demostrar
facendo isto?
Ámbalas dúas placas contiñan colonias +pGLO. Xa que logo, o
feito de que unhas colonias sexan fluorescentes e outras non
débese a que as primeiras expresaron o xen da GFP e as
segundas non. No novo medio no que se inoculan (caldo LB
con ampicilina e arabinosa) asbacterias de ámbalas dúas
colonias son quen de expresar o xen e producir a GFP.Isto
demostra que as dúas conteñen o xen, pero unhas o expresan
e outras non en función das caracterísiticas do medio no que
se desenvolven.

2. Que papel cumplen no proceso de clonación o iluminador de UV, a estufa

de incubación e a axitación mecánica antes ou durante a incubación?
O iluminador UV pon de manifesto a presenza da GFP.
A estufa incubadora proporciona as condicións térmicas
axeitadas para un óptimo crecemento das bacterias.
A axitación, ben sexa manual ou no incubador, proporciona
unha óptima axitación e aireación dos cultivos bacterianos. O
incremento de osíxeno aumenta a taxa de crecemento das
bacterias. Por esta mesma razón, no caso de non dispor de
estufa de cultivo con axitación, colócanse os tubos deitados
para aumentar a superficie de intercambio gaseoso.

3. Para que se fan medrar as bacterias en caldo nutritivo previamente a facer

a purificación? Non sería máis sinxelo tomar directamente as colonias da
placa de agar?
A razón é conseguir unha concentración elevada da proteína
 que pretendemos purificar. No cultivo en medio líquido
obtemos unha gran cantidade de células, todas elas clónicas
das que formaron a colonia (en última instancia dunha única
UFC) e, polo tanto, productoras de GFP.

• Fase de concentración celular e lise

1. Indica o papel nesta fase do protocolo, da ultracentrífuga, a lisocima e
o conxelador.
A ultracentrífuga illa as bacterias do medio de cultivo
concentrándoas nun precipitado ó que adóitase chamarlle
«pellet».
A lisocima (ou lisozima, do inglés lysozime) realiza unha
dixestión enzimática da parede celular bacteriana,
deixando desprotexida a membrana celular.
O conxelador, a conxelación, causa a ruptura das
membranas celulares. Isto fai que se libere o contido
celular.
2. Porque eliminamos o sobrenadante logo da primeira centrifugación?
Porque contén o medio de cultivo, pero non a proteína que
pretendemos purificar. A GFP está no interior das células.
3. Como pode a conxelación, un dos principais procesos de
conservación, romper ás membranas celulares?
Hay dous mecanismos implicados. Por unha banda, nunha
conxelación sen usar sustancias crioprotectoras,
fórmanse cristais que poden danar as membranas; por
outra, durante a conxelación, o contido citoplasmático
aumenta de volume, o que xenera presións que a
membrana non é quen de soportar porque, a temperaturas
máis baixas, ten reducida tamén a súa fluidez.
4. Cal é o propósito de lisar as bacterias?
A liberación da GFP. A proteína prodúcese no citoplasma
pola expresión dos xenes plasmídicos. Precisamos tela
liberada para poder purificala na columna de
cromatografía.
5. Que cor ten o concentrado celular? Que color debería ter o
sobrenadante? Interpreta estas observacións.
O pellet tería que ter unha cor verde pálida ou branquecino
e o sobrenadante tería que ser verde fluorescente. Isto
implica que a proteína fluorescente foi liberada das
bacterias.
6. Porque eliminamos o concentrado celular nesta fase do
procedemento?
O precipitado, nesta fase, contén restos celulares que non
nos interesan no procedemento (fragmentos de paredes e
membranas celulares, DNA cromosómico, ribosomas).
Cando queda algo de GFP retida no mesmo, é unha
cantidade despreciable.

• Fase de cromatografía
1. Describe brevemente o proceso de cromatografía por interacción
hidrofóbica. Relaciona a expliación co caso concreto de purificación desta
práctica.
A cromatografía de proteínas é unha técnica que permite a
purificación ou separación de proteínas presentes nunha
mestura na que están presentes outras moléculas (tamén
proteínas distintas das desexadas). Nesta práctica se usa una
columna de interacción hidrofóbica porque a superficie da GFP
ten carácter hidrofóbico. Isto se debe, por suposto, as
características das cadeas laterais dos aminoácidos que
ocupan posicións superficiais na conformación global da
proteína. Iso a diferencia doutras proteínas bacterianas e
permite a súa separación.

2. Cubre a seguinte táboa indicando as observacións realizadas logo de

correr os tres tampóns de cromatografía.

Tubo de Predicción Observación

recolleita baixo luz UV
(columna e
tubo)
#1. a GFP é a GFP
Mostra retida na aparece
en matriz da como unha
tampón columna banda
de fluorescente
ligazón na parte
superior da
columna(ver
imaxe
seguinte)
#2. a GFP a GFP
Mostra permanece permanece
con retida na como unha
tampón matriz da banda na
de columna parte
lavado superior da
columna (ver
imaxe
seguinte) Obsérvese a banda fluorescente na parte superio
#3. a GFP é a GFP
Mostra lavada da descurre
con columna pola columna
tampón e aparece no
de tubo #3
elución

1. Tendo en conta os resultados, indica o papel de:

  O tampón de equilibrado
Prepara a columna para a
aplicación da GFP. Eleva a
concentración salina da columna
para que coincida coa que ten o
lisado celular que contén a GFP.
 O tampón de ligazón.
Eleva a concentración salina da
solución coa GFP para inducir un
cambio de configuración na
mesma o que provoca a
exposición das rexións
hidrofóbicas.
 O tampón de lavado
Vehiculiza a través da columna
aquelas proteínas e outras
moléculas que teñen carácter
menos hidrofóbico, facendo que a
columna só reteña a proteína
desexada, a GFP.

 O tampón de elución (TE)

Modifica as caraterísticas salinas
provocando de novo un cambio de
configuración na GFP de xeito que
as rexión hidrofóbicas non queden
expostas e, xa que logo, a proteína
deixe de ser retida pola matriz da
columna.
2.
3. Que tampóns teñen concentración salina maior e cal menor? Que se pode
decir sobre o papel da salinidade?
As solucións empregadas, de maior a menor concentración
salina son: Tampón de ligazón >> Tampón de equilibrado >>
Tampón de lavado >> Tampón de elución
O tampón de ligazón ten a maior concentración salina, precisa
para elevar a concentración do lisado que contén a GFP. Os
restos proteícos hidrofóbicos quedan expostos en estas
condicións. A menor concentración corresponde ó tampón TE
para provocar a elución da GFP xa que, ó baixar a
concentración salina, os restos hidrofóbicos reoriéntanse cara
o interior da molécula quedando expostas as rexións
hidrofílicas.

4. O resultado da práctica foi exitoso? Xustifica a resposta en base os datos

experimentais.
Consideramos que
acadamos un
resultado exitoso na
purificación da GFP,
si aparece
fluorescencia no
tubo #3 e non
parece na columna
de cromatografía.
Se a fluorescencia
permanece na
columna, pode ser
que se producise
algún erro no uso das
dilucións, que a
salinidade foi elevada
en tódalas dilucións
usadas. Tamén
houbo erros nas
dilucións no caso de
que a fluorescencia
apareza nos tubos #1
ou #2 e desapareza
da columna nun
deses pasos. Tubo de elución #3 (esquerda) e control negativo (dereita)
A aparición de pouca baixo luz UV
fluorescencia no
tubo de recollida da
elución (ver imaxe
seguinte) é debida á
unha baixa
concentración celular
no tubo centrifugado
inicialmente.
-oOo-