1.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây người ta dành sự quan tâm rất nhiều đến
việc tách chiết enzyme bromelain để sử dụng làm tác nhân kích thích tiêu
hóa, chữa vết thương, ổn định dịch lên men.
Việc nghiên cứu thành công một enzyme là ở việc chiết xuất, xác
định đặt tính, yếu tố ảnh hưởng hoạt động của enzyme. Việc tinh chế
enzyme hết sức cần thiết bởi làm cho enzyme tinh sạch ít còn lẫn tạp chất
(các protein không phải enzyme), nâng cao hoạt tính enzyme so với dạng
thô nhiều lần, thuận lợi cho nghiên cứu, bảo quản, nguyên liệu cho một số
ngành công nghệ thực phẩm và trong dược phẩm dùng làm thuốc trong
điều trị và sản xuất.
Bên cạnh đó việc nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme bromelain cũng
đang được nghiên cứu. Phương pháp cố định enzyme là một trong những
hướng nghiên cứu nhằm nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme. Bằng cách
cố định enzyme trong chất mang không tan trong nước enzyme có thể
tách ra khỏi cơ chất dễ dàng sau phản ứng. Thêm vào đó enzyme cố định
được tái sử dụng nhiều lần khắc phục tình trạng khan hiếm enzyme như
hiện nay. Ngày nay, enzyme đã được sản xuất và sử dụng trong nhiều
lĩnh vực như công nghệ thực phẩm, y học, dược phẩm và các ngành công
nghiệp khác.
Đối với nước ta nguồn enzyme từ thực vật có triển vọng lớn vì nguồn
nguyên liệu rất phong phú (dứa, đu đủ, .). Trong quá trình chế biến dứa
đóng hộp chỉ khoảng 30% quả dứa được sử dụng, còn lại 70% phụ phẩm
mà chủ yếu là chồi trên quả dứa, thân dứa (Hội thảo quốc gia năm 2005).
Nếu tận dụng được nguồn phế phẩm thì vừa có thể giảm thiểu chất thải
hữu cơ gây ô nhiễm môi trường vừa có thể sản xuất sản phẩm bromelain
bởi vì hầu như trên tất cả các bộ phận của cây dứa đều có enzyme.
Bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase.
Bromelain thân, chồi có thể phân hủy cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng
hợp, chúng là enzyme có giá trị kinh tế và hầu hết sản phẩm bromelain
thương mại được ly trích từ thân dứa. Trong đề tài này chúng tôi đã tiến
hành tách chiết, tinh sạch enzyme bromelain ở quy mô nhỏ. Khảo sát các
tác nhân tủa, xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt động
của enzyme trên chồi dứa. Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate
bằng phương pháp tủa muối Ammonium sulfate.
2. MỤC ĐÍCH:
- Xác định khối lượng tủa (mg)
- Xác định hàm lượng protein (mg)
- Xác định hoạt tính bromelain (U/ml)
- Xác định hoạt tính riêng (U/mg)

3. SƠ ĐỒ THU NHẬN ENZYME BROMELAIN TỪ DỨA:

Nguyên liệu Xử lý sơ bộ Nghiền , ép
dứa (rửa sạch, cắt hoặc xay
nhỏ) nhuyễn

Tủa protein
Ly tâm Ly tâm / Lọc
(muối)

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1 Chuẩn bị hóa chất
- Dung dịch chuẩn tyrosin 1 mM : cân 181,19 mg tyrosin , sau đó hòa tan trong
HCl 0,2N và định mức đủ 1 lít .
+ Pha 1L dung dịch NAOH: mNAOH =(1000 .40 .0,5)/(10 .1 .97 )=20,62 gr
+ Pha 1L HCL 0,2N: VHCL =(1000 .36,5 .0,2)/(10 .1,18 .1 .36)=17,18 ml
+ Pha thuốc thử Folin 1 / 3N : từ Folin 1N pha loãng 3 lần bằng nước cất .
+ Pha 100 ml dung dịch tris HCL 1M : cân 12,114 g tris base , thêm 100 ml
nước cất , khuấy đến tan hoàn toàn .
4.2 Xử lý nguyên liệu
Mục đích: thu dịch dứa.
Cách tiến hành:
- Chọn trái dứa còn xanh, tươi, rửa sạch.
- Gọt bỏ vỏ và lõi.
- Cân m (g) thịt trái dứa, ép lấy dịch hoặc xay bằng máy xay sinh tổ.
- Lọc hỗn hợp bằng vài màn sau đó loc bằng lớp bông mỏng, thu dịch trong.
- Xác định thể tích dịch dua thu được V ( ml).
4.3. Ly tâm
Mục đích: Loại bỏ mảnh vỡ tế bào, thu dịch enzyme bromelain thổ.
Cách tiến hành:
- Ly tâm dịch dứa với lực ly tâm 2910 g trong 15 phút. Hút dịch nổi vào cốc
sạch.
4.4. Kết tủa protein bằng muối amonium sulfate
Mục đích: thu kết tủa protein trong dịch enzyme thô.
Cách tiến hành:
- Lấy 50 ml dịch enzyme thô vào cốc 250 ml.
- Cho từ từ muối (NH,)2SO4 rắn vào cốc chứa enzyme, khuấy liên tục trên máy
khuấy từ cho đến khi bão hòa. Đề yên trong 60 phút.
- Ly tâm thu tủa protein với lực ly tâm 2910 g trong 15 phút.
- Hòa tủa protein với 10 ml đệm tris-HCI 10 mM pH 8,0.
- Xác định khối lượng tùa ( mg), hàm lượng protein ( mg), hoạt tính bromelain
(U/ml), hoạt tính riêng (U/mg).

Hóa chất Đơn Các ống nghiệm

vị Ống Ống Ống Ống Ống Ống
0 1 2 3 4 5
Tyrosin 1mM ml 0,0 1 2 3 4 5
Dung dịch HCL 0,2N ml 5,0 4 3 2 1 0
Dung dịch NaOH 0,5N ml 10 10 10 10 10 10
Thuốc thử Folin 1/3N ml 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Lắc mạnh 30 giây, để yên trong 10 phút
Đo OD tại  =595nm 0
Chú ý: Ống 0 là ống kiểm chứng, các ống khác là ống thí nghiệm