ĐẶT VẤT ĐỀ

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các
chế phẩm Enzyme Papain được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu
hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế…
Trong công nghiệp thực phẩm, papain được sử dụng để làm mềm thịt, cá trước khi
đóng hộp, làm tăng giá trị cảm quan của thực phẩm. Papain có khả năng làm mềm thịt
tốt hơn protease từ vi sinh vật. Trong sản xuất bia, papain được sử dụng để ngăn chặn
hiện tượng vẩn đục của bia trong giai đoạn ổn định sản phẩm. Ngoài ra, có thể sử
dụng papain vào trong quá trình sản xuất nước mắm để rút ngắn thời gian lên men.
Papain còn có thể ứng dụng làm đông tụ sữa và giảm độc tố

Enzyme được biết đến như một chất xúc tác sinh học nổi trội bởi khả
năng thúc đẩy vận tốc phản ứng của chúng. Là một trong ba loại enzyme
protease thu nhận từ nguồn gốc thực vật-papain được nhiều người biết đến bởi
khả năng thủy phân cơ chất protein mạnh mẽ

Đu đủ là loại cây ăn quả có nhiều giá trị dinh dưỡng và tác dụng trị liệu.
Đối với nước ta, đu đủ không phải là nguồn nguyên liệu khan hiếm nhưng lại
chưa được tận dụng tốt để thu hiệu quả kinh tế cao, phần lớn là sử dụng dạng
tươi sống.

TỔNG QUAN
Nhựa đu đủ xanh là một hỗn hợp gồm nhiều protease như: papain,
chymopapain A (gốc amino acid cuối là glutamic acid), chymopapain B (gốc amino
acid cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thiolprotease, trong đó papain là
protease có hàm lượng cao nhất, khoảng 95% tổng hàm lượng protease có trong nhựa
và có ý nghĩa quan trọng nhất.
Papain thuộc nhóm Cystein-protease vì trung tâm hoạt động của nó có
chứa nhóm -SH của Cystein, nhóm này nằm gần vòng imidazol của Histidine
và nhóm -COOH của axit Aspactic. Sự tổ hợp của các nhóm chức có mặt trong
trung tâm hoạt động tạo điều kiện cho hoạt động xúc tác của phân tử enzyme.
Papain đóng vai trò vừa là một endo-protease vừa là một exo-protease nên
chúng thủy phân protein thành các polypeptid và các axit amin. Tính đặc hiệu
cơ chất của papain rộng, nó có thể thủy phân hầu hết các liên kết peptid, trừ
liên kết với proline và với axit glutamic có nhóm -COOH tự do.
Papain là một enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khô,
papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 100oC, còn ở dạng dung dịch, papain bị
mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5oC. Papain tinh sạch có độ bền nhiệt thấp hơn
khi còn ở trong nhựa mủ, có lẽ trong mủ nhựa còn có các protein khác có tác
dụng bảo vệ nó.
Papain có khả năng hoạt động ở một vùng pH tương đối rộng từ 4,5 đến
8,5, nhưng lại dễ bị biến tính trong môi trường axit có pH < 4,5 và trong môi
trường kiềm mạnh có pH >12.
PHƯƠNG PHÁP
Phương pháp trích ly papain từ nhựa đu đủ
Tiến hành lấy nhựa theo trình tự:
• Nhựa đu đủ lấy ở quả xanh còn trên cây, khoảng 10 tuần tuổi.
• Dùng dao inox có đầu nhọn rạch vài đường dọc theo quả ở chổ đường kính to
nhất, các khía cách nhau 1 - 2cm (không rạch sâu quá 2mm, nếu không dịch
nước và tinh bột từ quả sẽ trộn lẫn vào nhựa và làm giảm chất lượng dịch nhựa
thu được).
• Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thuỷ tinh màu miệng rộng trong 4 - 6 phút, sau
khi lấy nhựa đậy nắp kín, giữ trong bóng tối.
• Bảo quản lạnh. Mục đích của giai đoạn này là tránh không cho nhựa tiếp xúc
với không khí và để đảm bảo hoạt tính của papain có trong nhựa.
• Khi lấy nhựa cần tránh không cho các chất bẩn hoặc có côn trùng lẫn vào.
• Không nên trộn nhựa tươi với nhựa khô vì như vậy sẽ làm giảm chất lượng
papain thu được.
• Quả có thể rút nhựa trong suốt khoảng thời gian 4 - 7 ngày. Lần đầu tiên có
thể chỉ rạch một lần là đủ, ở những lần thu nhựa sau, rạch 2 - 3 đường giữa
những đường rạch trước.
• Khi tiến hành thao tác với nhựa tươi, tránh không cho nhựa tiếp xúc với da vì
nó sẽ gây bỏng. Đồng thời cũng không nên để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ
làm từ kim loại nặng như sắt, đồng, ... vì nó làm biến màu và làm giảm hoạt
tính của enzyme, lọ, dao, muỗng,... phải được làm bằng nhựa hoặc thép không
gỉ.
• Nhựa tươi thu được sẽ không bền, vì thế phải sấy khô tới khoảng 5% độ ẩm.
Phương pháp tinh chế papain bằng cồn
Nhựa đu đủ sau khi thu được tiến hành quá trình tinh chế. Quá trình tinh chế
papain thô sử dụng dung môi hữu cơ (cồn 90o làm lạnh) được thực hiện theo sơ
đồ sau:

XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME

Trong phần này, hoạt lực xúc tác của papain được xác định dựa vào
phương pháp Kunitz (theo nhóm đo lượng sản phẩm tạo thành) trên cơ sở khả
năng hấp thụ ánh sáng của Tyrosine sinh ra trong quá trình thủy phân bởi
papain, sử dụng cơ chất casein.
Nguyên tắc đo hoạt tính Phương pháp đo hoạt tính enzyme dựa vào độ hấp
thụ của acid amin (chủ yếu là Tyrosine) ở bước sóng cực tím 280 nm, sản phẩm
của phản ứng thủy phân cơ chất casein bởi papain.
Đối tượng thực hiện thí nghiệm: Chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết thu
từ nhựa đu đủ xanh và cơ chất casein. Phản ứng thủy phân được thực hiện
trong 20 phút, sau đó được dừng lại bằng Acid tricloacetic (TCA). Nồng độ sản
phẩm sinh ra được xác định dựa vào độ hấp thụ của Tyrosine ở 280 nm theo
một đồ thị đường chuẩn.
Đơn vị đo hoạt tính của papain: Hoạt tính của papain được thể hiện bằng đơn
vị Tyrosine (Tu: Tyrosine unit) với 1Tu là lượng sản phẩm sinh ra tương ứng
với số µmol Tyrosine do sự thủy phân casein bởi enzyme có trong 1mg chế
phẩm khô trong thời gian 1 phút ở điều kiện nhiệt độ và pH môi trường nhất
định.
Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị hóa chất
• Dung dich đệm Disodium hydro phosphate (Na2HPO4.12H2O),
sodiumdihydro phosphate (NaH2PO4.2H2O) có bổ sung EDTA 5mM ở các
mức pH khác nhau.
• Chất hoạt hóa cho enzyme Cystein 0,02M
• Casein 1%: Hòa tan 1 g casein dạng bột với 100 ml dung dịch đệm phosphat
0,05M ở pH 7,5 có bổ sung EDTA 5mM. Tiến hành đun cách thủy dung dịch ở
nhiệt độ 90 – 95oC trong 1,5 giờ đến khi hòa tan hoàn toàn casein. Bảo quản
dung dịch thu được ở 4oC. Trước khi sử dụng thí nghiệm thuỷ phân dung dịch
casein này phải được ủ ở 37oC khoảng 30 phút.
• Dung dịch Acid triacetic (TCA) 5%: cân 5g TCA dạng tinh thể hòa tan với
nước cất trong một cốc, sau đó thêm nước cất vào cho đủ 100 ml bằng bình
định mức.
Các bước thực hiện thí nghiệm
Tiến hành thí nghiệm song song hai mẫu trong đó có một mẫu đối chứng. Các
bước thực hiện theo sơ đồ hình 12, mẫu đối chứng tiến hành tương tự nhưng
cho dung dịch TCA vào trước (nhằm vô hoạt enzyme), casein vào sau.

Đầu tiên, một đường chuẩn được xác lập dựa vào khả năng hấp thụ ánh
sáng của Tyrosine có dãy nồng độ khác nhau ở bước sóng ánh sáng 280 nm.
Thí nghiệm được tiến hành trên một hỗn hợp được chuẩn bị gồm papain
cần xác định hoạt tính; dung dịch đệm phosphate (hòa tan papain và casein);
EDTA (giúp gây kết tủa kim loại trong chế phẩm papain), cơ chất casein 1%
trong dung dịch đệm phosphate.
Sau 20 phút thủy phân, phản ứng sẽ được dừng lại bởi TCA 5%. Hỗn hợp
dung dịch được lọc và đo độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm.
Dựa vào phương trình đồ thị của dãy Tyrosine chuẩn, từ độ hấp thụ ánh sáng
của sản phẩm thủy phân (Tyrosine), ta xác định được nồng độ Tyrosine tương
ứng trong từng thí nghiệm ở những nồng độ enzyme khác nhau. Khi đó ta tính
được lượng sản phẩm sinh ra tương ứng với lượng tyrosine tạo thành trong
dung dịch.
Đơn vị đo hoạt tính của papain trong thí nghiệm này được thể hiện bằng đơn vị
Tu (Tyrosine unit).
Hoạt tính đặc hiệu của papain là số đơn vị hoạt tính enzyme có trong 1 mg
protein (Tu/mg)
Đường chuẩn Tyrosine
Chuẩn bị các ống nghiệm lập đường chuẩn tyrosin
Hóa chất Đơn Các ống nghiệm
vị Ống Ống Ống Ống Ống Ống
0 1 2 3 4 5
Tyrosin 1mM ml 0,0 1 2 3 4 5
Dung dịch HCL 0,2N ml 5,0 4 3 2 1 0
Dung dịch NaOH 0,5N ml 10 10 10 10 10 10
Thuốc thử Folin 1/3N ml 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Lắc mạnh 30 giây, để yên trong 10 phút
Đo OD tại  =595nm 0
Chú ý: Ống 0 là ống kiểm chứng, các ống khác là ống thí nghiệm

Tính toán kết quả

Ta xác định được đơn vị hoạt tính của enzyme trong 1 mg chế phẩm theo công
thức:

( x . Vhh.1000
Tu=
T . Ve ). k
Trong đó:
Tu: hoạt tính của enzyme (Tu/ml)
x: nồng độ Tyrosine (µmol/ml)
Vhh: thể tích tổng dung dịch phản ứng (ml)
T: thời gian phản ứng (phút)
Ve: thể tích enzyme (ml)
k: hệ số pha loãng
Nồng độ Tyrosine (x) trong công thức trên được xác định dựa vào đường chuẩn
Tyrosine.