Analitika hiralnih jedinjenja

nerecenzirani materijal

vanr. prof. dr Biljana Otašević

Katedra za analitiku lekova

1
 Hiralni molekuli predstavljaju posebnu vrstu molekula koji se odlikuju nekim od
elemenata hiralnosti, što može biti hiralni centar, osa ili ravan. Atomi za koji su vezani
različiti supstituenti u određenom prostornom rasporedu koji onemogućava preklapanje datog
molekula sa slikom u ogledalu predstavljaju hiralne centre. Hiralni centri mogu biti
četvorokoordinacioni C, Si, Ge, N, P i As, trokoordinacioni S, P, As, Sb i N sa fiksiranom
strukturom, kao i atomi metala u nekim kompleksima. Ukoliko jedinjenje ima jedan hiralni
centar, moguće su dve konfiguracije koje ne mogu da se preklope u prostoru. Ovakvo
jedinjenja, sa različitim stereohemijskim konfiguracijama nazivaju se enantiomeri (Slika 1).

Slika 1. Enantiomerni par molekula sa jednim hiralnim centrom

U ahiralnoj sredini, enantiomeri pokazuju identične fizičko-hemijske osobine, što
sugeriše postojanje i istovetnih MS, NMR i IR spektara. Međutim, u hiralnoj sredini,
enantiomeri se razlikuju u zavisnosti od smera skretanja ravni linearno polarizovane svetlosti.
Onaj enantiomer koji skreće ravan linearno polarizovane svetlosti u smeru kretanja kazaljke
na satu naziva se dekstrogiri i obeležava se sa (+), dok je drugi levogiri, (–) i on skreće ravan
linearno polarizovane svetlosti u smeru suprotnom od kretanja kazaljke na satu. Ekvimolarna
smeša dva enantiomera naziva se racemat i, u skladu sa činjenicom da enantiomeri okreću
ravan linearno polarizovane svetlosti za iste vrednosti ugla (suprotnog predznaka), sama
smeša ne okreće ravan linearno polarizovane svetlosti.
Hiralnost je bitno posmatrati sa farmaceutskog stanovišta iz razloga što humani
organizam ima sposobnost da se ponaša kao hiralni selektor i kao takav da prepoznaje
različite konfiguracije biomolekula kao što su proteini, enzimi, aminokiseline i ugljeni
hidrati, ali i aktivnih farmaceutskih supstanci. Iz tog razloga se sagledava potencijalni uticaj
pojedinačnih enantiomera na farmakološki, toksikološki, farmakokinetički profil leka, kao i
analitiku i komercijalni aspekt primene ovih jedinjenja.
Što se tiče farmakološkog aspekta, potrebno je izvršiti procenu racemata u kliničkoj
praksi imajući u vidu da se hiralni lekovi mogu razlikovati prema biološkoj aktivnosti
njihovih enantiomera. Zabeleženi su slučajevi da oba enantiomera imaju istu in vivo
aktivnost, zatim da je jedan enantiomer aktivan, dok je drugom aktivnost smanjenja ili je u
potpunosti inaktivan i konačno slučaj da jedan od enantiomera prouzrokuje neki sasvim
drugačiji željeni ili neželjeni efekat. U slučaju jednako aktivnih enantiomera, nema problema
sa primenom leka u racemskom obliku (primer, antiaritmik flekainida i antidepresiv
2
fluoksetin). Međutim, u slučaju različitih biološkoh aktivnosti, potpuno je opravdano zalagati
se za primenu formulacija koje sadrže samo jedan od enantiomera, čak i nasuprot najčešće
većoj ceni finalnog proizvoda. Tako, R-(–) enantiomer antiasmatika salbutamola ispoljava
biološku aktivnost za razliku od distomernog S-(+) oblika koji je ujedno odgovoran za
neželjena dejstva leka u smislu povećane osetljivosti organizma na prisustvo alergena. U
skladu sa tim, komercijalni R-(–) levosalbutamol, je čak 5 puta skuplji od racemske smeše,
ali njegova inhalacija dovodi do efikasnije bronhodilatacije u poređenju sa ekvivalentnom
dozom racemata. Sa druge strane, β-blokatori se na tržištu nalaze u obliku racemskih smeša.
Ako uzmemo za primer lek propranolol, dokazano je da je S-(–) enantiomer 100 puta
aktivniji od R-(+) oblika. Međutim, potentniji oblik se u prometu ne nalazi kao pojedinačni
terapeutski agens, s obzirom da je uočena mogućnost R-(+) propranolola da inhibira
konverziju hormona T4 u T3, čime je iskorišćen njegov potencijal u lečenju
hipertireoidizma. Konačno, farmakološki aspekt se manifestuje kroz mogućnost da jedan ili
oba enantiomera podležu hiralnoj inverziji u organizmu. Kao primer hiralne inverzije se
navodi ibuprofen čiji S-(+) enantiomer je 100 puta aktivniji od R-(–) oblika, ali 60% R-(–)
enantiomera, pod dejstvom hepatičnih enzima, prelazi u S-(+) oblik.
Što se tiče toksikološkog aspekta hiralnosti, on se manifestuje kada jedan od
enantiomera ima veći potencijal za izazivanje neženjenih reakcija u organizmu u odnosu na
drugi. Najpoznatiji primer različitog toksikološkog dejstva enantiomera je talidomid usled
čije primene tokom rane trudnoće za suzbijanje jutarnje mučnine je, početkom 60-tih godina
prošlog veka, rođeno na hiljade dece sa kongenitalnom fokomelijom. Kasnije je dokazano da
je samo S-enantiomer talidomida teratogen, ali zbog hiralne konverzije u in vivo uslovima,
oba enantiomera se smatraju genotoksičnim.
Tek nedavno je ustanovljeno da enantiomeri mogu da imaju i različit
farmakokinetički profil u smislu da metaboliti iste aktivne farmaceutske supstance pokazuju
različite osobine metabolizma i distribucije. Na ovaj način su objašnjene neke do tada
zapažene nelogičnosti u odnosu doza-odgovor.
I pored činjenice da upotreba hiralnih lekova u formi monoizomera donosi brojne
prednosti, dosta hiralnih lekova se i dalje proizvodi u obliku racemata bilo iz razloga
problematične separacije ili visoke složenosti i cene postupka dobijanja čistog enantiomera.

3
 Analitika enantiomera

Metode koje se najviše koriste za analizu hiralnih jedinjenja u cilju dobijanja čistih
enantiomera i/ili za određivanja enantiomerne čistoće su polarimetrija, gasna hromatografija,
tečna hromatografija pod visokim pritiskom, kapilarna elektroforeza i superkritična fluidna
hromatografija.
Polarimetrija se zasniva na merenju optičke rotacije, odnosno intenziteta kojom ravan
linearno polarizovane svetlosti rotira pod dejstvom optički aktivne supstance. Iako se najčešće
upotrebljava zbog toga što je brza, jednostavna za izvođenje i jeftina, polarimetrija ima dosta
nedostataka koji se uglavnom vezuju za pripremu uzorka. Uzorci moraju biti homogeni, ne sme
doći do kristalizacije, ugao rotacije čistog enantiomera mora biti poznat, a pri tome treba voditi
računa da njegova vrednost zavisi od promene temperature i koncentracije rastvora. Takođe,
kod koncentrovanih rastvora, specifična optička rotacija i koncentracija nisu u linearnoj
zavisnosti.
Kod ostalih metoda, da bi se obezbedilo različito ponašanje enantiomera, neophodno je
obezbediti posebne uslove najčešće stvaranjem tzv. hiralnog okruženja. Kod gasne
hromatografije, koristi se hiralna stacionarna faza koja sadrži hiralni agens visoke
enantiomerne čistoće adsorbovan na površinu silike. Za razdvajanje enantiomera su bitne
reverzibilne dijastereoizomerne interakcije sa ovim hiralnim agensom. Nakon uspostavljanja
ovih interakcija, moguće je postići hromatografsku razdvojenost pojedinih enantiomera,
odnosno enantioseparaciju. Što se tiče karakteristika primene metode gasne hromatografije, ona
je brza, osetljiva i jednostavna metoda kod koje nečistoće iz uzorka u tragovima ne utiču na
rezultate. Osim za određivanje enantiomerne čistoće farmaceutskih supstanci, gasnom
hromatografijom je moguće odrediti i jačinu interakcije između pojedinačnih enantiomera i
hiralne stacionarne faze na osnovu izračunate vrednosti faktora selektivnosti α, kao i
određivanje apsolutne konfiguracije (uz odgovarajući referentni standard). Međutim, u
praktičnom smislu, nedostatak primene gasne hromatografije je njena visoka cena. Takođe
zahteva lakoisparljive i termostabilne uzorke kojih je u farmaciji malo.
Zbog svega navedenog, tečna hromatografija pod visokim pritiskom (HPLC) se
ističe kao najkorisnija metoda u analitici hiralnih jedinjenja. Razdvajanje pojedinačnih
enantiomera se može postići na različite načine. HPLC metoda se može koristiti na klasičan
način, kao i u slučaju analize nehiranih jedinjenja, s tim što je pre same analize potrebno
primeniti ahiralni derivatizacioni agens sa kojim se analiti prevode u dijastereoizomerne soli.
Nastala jedinjenja se dalje analiziraju kao nehiralna jer se pod određenim uslovima može
postići da dijastereoizomerne soli imaju dovoljan stepen razlikovanja fizičko-hemijskih
osobina, odnosno različitu retenciju. Klasičnu HPLC analizu je moguće izvesti na još jedan
način, tačnije nakon prethodne enzimske razgradnje određenog enantiomera iz racemske smeše
primenom specijalizovanih sojeva mikroorganizama. Sa druge strane, u farmaceutskoj industriji
najzastupljeniji način analize hiralnih jedinjenja predstavlja primena hiralne hromatografije.
4
 Prema načinu izvođenja, razlikuje se direktna i indirektna hiralna HPLC analiza. U oba
slučaja dolazi do građenja dijastereozomernih jedinjenja sa hiralnim analitom.
Dijastereoizomeri su jedinjenja koja sadrže dva ili više stereocentara,a razlikuju se po
konfiguraciji na bar jednom od više ponuđenih hiralnih centara. Kod direktne HPLC, u toku
trajanja hromatografske analize, u reakciji sa hiralnim selektorom, grade se prolazni
(tranzitorni) dijasteroizomerni kompleksi koji se odlikuju različitim energijama vezivanja
zavisno od pojedinačnog enantiomera, što uslovljava hromatografsko razdvajanje. Sa druge
strane, kod indirektne HPLC, pre same hromatografske analize, u reakciji hiralnog
derivatizacionog agensa sa parom enantiomera, grade se stabilni dijasteroizomerni parovi koji
imaju različite fizičke osobine zbog čega različitim brzinama putuju kroz hromatografsku
kolonu, a ovo za rezultat ima postizanje hromatografskog razdvajanja.
U direktnoj hiralnoj HPLC analizi, hiralno okruženje se postiže primenom hiralnog
selektora, a to je hiralni entitet za koji se enantiomeri vezuju formirajući prolazne (tranzitorne)
dijastereoizomerne komplekse. Hiralni selektor može da bude u formi hiralne mobilne ili
hiralne stacionarne faze. Hiralna stacionarna faza može biti čvrsta ili tečna.
Bez obzira na pristup koji se primeni, rezultat hromatografske analize se procenjuje na
osnovu vrednosti faktora selektivnosti α, koji se izračunava na isti način kao i u klasičnoj
hromatografiji. Jedina razlika je kriterijum prihvatljivosti. Pošto razdvojenost enantiomera na
baznoj liniji vrlo često nije idealna već problematična, odnosno nepotpuna, u hiralnoj
hromatografiji se uglavnom postavlja zahtev koji se odnosi na gornju granicu vrednosti faktora
selektivnosti, a to je da ne bude veća od 3. Na ovaj način se zapravo obezbeđuje tačna
interpretacija hromatografskog nalaza jer, ukoliko je faktor selektivnosti veći od 3, ne radi se
uopšte o paru pikova na hromatogramu koji potiču od para enantiomera istog analita. Ovo se
oslanja na pretpostavku da, bez obzira na građenje dijastereoizomernih jedinjenja, njihove
osobine i sledstveno njihovo hromatografsko ponašanje nikada nisu veoma različiti.
Hiralne mobilne faze se pripremaju na lak način, mešanjem malih količina hiralnih
agenasa sa pogodnim rastvaračem, a separacija se odvija na stacionarnoj fazi koja pri tome nije
hiralna. Hiralni agens iz mobilne faze gradi dijastereoizomerne komplekse sa parom
enantiomera ispitivanog analita. Nagrađeni kompleksi se različito raspodeljuju između
stacionarne i mobilne faze, odnosno imaju različite distribucione koeficijente, što uslovljava
razliku u retenciji i postizanje željene separacije. Upotreba hiralnih mobilnih faza ima svoje
prednosti, kao i nedostatke. Prednost ove metode je što postoji veliki izbor odmah dostupnih ili
lakih za sintetisanje hiralnih aditiva. Takođe, njihova upotreba u malim količinama, kao i
upotreba ahiralnih stacionarnih faza, koje su znatno jeftinije od hiralnih, idu u prilog ukupnoj
ekonomičnosti metode. Fleksibilnost pristupa ogleda se u činjenici da hiralni aditivi mobilne
faze mogu lako da budu isprani iz hromatografskog sistema i eventualno zamenjeni drugim
adekvatnijim agensom, kao i da ne postoje ograničenja prilikom izbora stacionarne faze.
Hiralni agens takođe ne mora da se odlikuje visokim stepenom optičke čistoće, ali, naravno, ne
sme da bude ni u obliku racemata. Sa druge strane, kao jedan od glavnih nedostataka
predstavljaju komplikacije prilikom detekcije zbog prisustva hiralnog aditiva u mobilnoj fazi.
5
Hiralni agensi koji izraženo apsorbuju zračenje u UV delu spektra smanjuju mogućnost
detekcije razdvojenih enantiomera kada se koristi UV detektor. Takođe, disocijacija
enantiomera iz formiranih dijastereoizomernih kompleksa nakon završene hromatografske
analize je u nekim slučajevim onemogućena, što je takođe nedostatak opisanog pristupa.
Primer direktne HPLC analize predstavlja razdvajanje enantiomera N-(1-
feniletil)ftalamske kiseline uz upotrebu hinina kao hiralnog agensa u mobilnoj fazi.
Hromatografski uslovi koji uključuju stacionarnu fazu LiChrosorb SI 100 veličine čestica 5 μm i
mobilna fazu u formi smeše dihlormetan–butan-1,2-diol (99:1, V/V) koja sadrži 0,35 mM hinina
i sirćetnu kiselinu i UV detektor omogućavaju snimanje hromatograma prikazanog na slici 2.

Slika 2. Hromatografska analiza enantiomera N-(1-feniletil)ftalamske kiseline uz upotrebu hinina

Veću efikasnost razdvajanja enantiomera u farmaceutskoj industrijskoj praksi, pokazala
je ipak upotreba hiralnih stacionarnih faza. Hiralne HPLC kolone napravljene su
inkorporiranjem jednog čistog enantiomera u stacionarnu fazu. Interakcijom između para
enantiomera i hiralne površine, formiraju se prolazni dijastereoizomeri čije se energije
vezivanja razlikuju, onaj enantiomer koji je slabije i u manjoj meri vezan, eluira se ranije. Pri
tome, stacionarne faze mogu da budu tečne ili čvrste.
Kada hiralna tečna faza prekriva površinu čvrste stacionarne faze (adsorbovana na
čvrst nosač u hromatografskoj koloni), pri čemu je nehiralna mobilna faza zasićena tečnom
hiralnom stacionarnom fazom, dobija se tečno – tečni hromatografski sistem raspodele. Primer
predstavlja razdvajanja β-aminoalkohola norefedrina na (+)-dibutil tartarat stacionarnoj fazi.
Hromatografski uslovi koji uključuju stacionarnu fazu Phenyl LiChrosorb SI 100 veličine
čestica 5 μm i mobilnu fazu sastavljenu od fosfatnog pufera (pH 6,0) koji sadrži
heksafluorofosfat, a koja je zasićena dibutil tartaratom i UV detekciju na 254 nm, omogućavaju
snimanje hromatograma prikazanog na slici 3.

6
 Slika 3. Hromatografska analiza norefedrina na (+)-dibutil tartarat stacionarnoj fazi
Korišćenjem čvrstih hiralnih stacionarnih faza moguće je na veoma jednostavan
način razdvojiti enantiomere. Međutim, nedostatak ovakvog pristupa predstavlja činjenica da
ne postoji „univerzalna“ stacionarna faza koja bi omogućila separaciju enantiomera svih
poznatih hiralnih jedinjenja. U skladu sa tim, izbor odgovarajuće hiralne kolone predstavlja
jedan od najvećih analitičkih izazova u hiralnoj hromatografiji. Da bi hiralna čvrsta
stacionarna faza mogla da stupa u interakciju sa svakim enantiomerom i prevede ga u
odgovarajuće dijastereoizomerne komplekse koji imaju različitu retenciju u hromatografskom
sistemu, potrebno je da se ostvare interakcije na najmanje 3 mesta, odnosno najmanje 3
interakcije koje po tipu mogu pripadati grupi od 5 navedenih tipova interakcija: vodonične
veze, π-π i dipol interakcije, stvaranje inkluzionih kompleksa i sterno uslovljene interakcije.
Pri tome, neophodno je da bar 1 od 3 interakcije mora biti steroselektivno zavisan tip
interakcije. U tom slučaju, unutar nagrađenih dijastereoizomernih kompleksa, jačina veza će
biti različita, odnosno oni će imati različiti stabilnost, različito će trajati kontakt sa pojedinim
parom enantiomera, što za posledicu ima razliku u retenciji i obezbeđenu odgovarajuću
enantioselektivnost.
U zavisnosti od iskorišćenog mehanizma enantioseparacije, razvijene su brojne vrste
hiralnih čvrstih stacionarnih faza, među kojima su najznačajnije:
1) ”Brush-type” u kojima su za površinu silike vezani mali molekuli koji u svojoj
strukturi najčešće sadrže grupe koje imaju 𝜋 – elektrone;
2) spiralni polimeri u koje spadaju uglavnom celuloza i njeni derivati;
3) šuplje faze tipa ciklodekstrina, policikličnih etara i makrocikličnih glikopeptidnih
antibiotika koji, prilikom separacije, formiraju inkluzione komplekse sa analitom;
4) proteinske faze;
5) ligand – izmenjivačke faze.
“Brush-type“ hiralne stacionarne faze dobijaju se vezivanjem malih hiralnih
molekula za površinu silike. Ova velika i značajna klasa hiralnih stacionarnih faza
proistekla je iz ideje da što je veći broj specifičnih, diskretnih i istovremenih interakcija
između hiralnih analita i hiralnog mesta na stacionarnoj fazi, veća je verovatnoća da će doći

7
do hiralne diskriminacije i, sledstveno, do zadovoljavajuće rezolucije enantiomernih uzoraka.
U skladu sa tim, danas je razvijeno preko 100 “Brush-type“ hiralnih stacionarnih faza, od
kojih svaka ima relativno jednostavnu strukturu i u blizini hiralnog centra sadrži najmanje
jednu od sledeća tri tipa funkcionalnih grupa:
1) 𝜋 - kisele ili 𝜋 - bazne aromatične grupe sposobne za postizanje akceptor-donor
interakcija;
2) polarne vodonične veze;
3) glomazne grupe koje obezbeđuju sterne smetnje, Van der Vals-ove interakcije i/ili
favorizuju ograničen broj konformacija.
Prva sintetisana i najšire korišćena “Brush-type“ čvrsta hiralna stacionarna faza se
naziva se Pirkle faza prema izumitelju William H. Pirkle-u koji ju je razvio još 1981. godine,
a sastojala se od dinitrobenzoilfenilglicina vezanog jonskim vezama za aminopropilsiliku,
kao što je prikazano na slici 4. U njenoj strukturi se može uočiti dinitrobenzoil grupa koja je
akceptor π – elektrona i stupa u interakciju sa donorima π – elektrona. Iz ovog razloga je, za
postizanje enantioseparacije, neophodno da hiralno jedinjenje u svojoj strukturi ima
aromatičan prsten. Osim toga, u građi Pirkle “Brush-type“ stacionarne faze prisutne su i dve
amidne grupe koje dodatno mogu da ostvare dipol-dipol interakcije i vodonične veze sa
hiralnim analitom. Danas se Pirkle stacionarna faza koristi za razdvajanje velikog broja
jedinjenja uključujući benzodiazepine, ftalide, aromatične sufokside, laktame itd.

Slika 4. Pirkle “Brush-type“ čvrsta hiralna stacionarna faza

Osim Pirkle faze, “Brush-type“ čvrsta hiralna stacionarna faza može sadržavati i
druge hiralne selektore, kao što je prikazano na slici 5.

8
 Slika 5. Primeri strukture “Brush-type“ čvrstih hiralnih stacionarnih faza
Primer uspešne primene“Brush-type“ faze za razdvajanje racemske smeše
propranolola u obliku oksazolidonskih derivata predstavljen je na slici 6. Hromatografski
uslovi su uključivali kolonu sa Pirkle fazom (250 mm x 4,6 mm, 5 μm), mobilnu fazu
sastavljenu od heksana, izopropanola i acetonitrila (97:2:1, V/V/V) koja protiče brzinom od 2
mL min-1, dok se detekcija vrši na 290 nm.

9
 Slika 6. Hromatografska analiza propranolola na Pirkle “Brush-type“ stacionarnoj fazi
Čvrste hiralne stacionarne faze na bazi spiralnih polimera uglavnom sadrže
mikrokristalnu celulozu. Hemijski posmatrano, celuloza je polisaharid koji se sastoji od nekoliko
hiljada molekula D-glukoze povezanih međusobno 𝛽 (1-4) glikozidnim vezama. Međutim, čista
celuloza je pokazala slabu enantioselektivnost, pa su iz tog razloga razvijene brojne modifikacije
koje se razlikuju po jedinjenjima koja su korišćena za derivatizaciju. Utvrđeno je da se
modifikacijom hidroksilnih grupa sa aromatičnim supstituentima, npr. benzil estrima dobijaju
stacionarne faze poboljšanih osobina u smislu većeg stepena hiralnog prepoznavanja. Međutim, i
sami supstituenti aromatičnog prstena i njihove pozicije dokazano utiču na enantioselektivnost.
Takođe, dostupni su i derivati sa fenilkarbamatnim grupama koji takođe pokazuju dobru
enantioselektivnost zahvaljujući svojim NH i C=O delovima koji mogu da formiraju vodonične
veze sa ispitivanim enantiomerima. Primeri strukture spiranih polimera na bazi derivatizovane
celuloze prikazani su na slici 7.

Slika 7. Primeri strukture spiralnih polimernih faza

10
 U grupu policikličnih etara spadaju tzv. krunski etri koji mogu da se definišu kao
jedinjenja koja se sastoje od ponavljajućih (−X − C2 H4 −) jedinica pri čemu je sa X označen
heteroatom koga najčešće predstavlja kiseonik. Izgled strukture jednostavnog krunskog etra,
18-kruna-6 etra, u kompleksu sa alkil- amonijum solima prikazan je na Slici 10. Prvi broj u
imenu kruna etra označava ukupan broj atoma koji čine makrociklus, dok drugi broj
predstavlja broj atoma kiseonika u makrociklusu. Svaki atom kiseonika poseduje dva
slobodna elektronska para. U strukturi 18-kruna-6 etra svih šest atoma kiseonika su
postavljeni tako da obezbeđuju dipol-jon privlačne interakcije između domaćina i gosta
prisutnog u unutrašnjosti prstena. Na ovaj način, unutrašnjost kruna etra se diferencira u
hidrofilnu sredinu, dok spoljašnjost postaje lipofilna.

Slika 10. Struktura 18-kruna-6 etra u kompleksu sa alkil amonijumovim solima

Na bi se poboljšala enantioselektivnost, na prikazanu relativno jednostavnu strukturu
policikličnih etara se dodaje voluminozna i rigidna funkcionalna grupa sa ciljem da se
obezbede dodatne interakcije sa hiralnim analitom. Izgled takvog jednog rešenja, tj. krunskog
etra sa naftalenskim prstenovima kao supstitentima, dat je na slici 11.

Slika 11. Struktura hiralnog krunskog etra naftalenske strukture

Policiklični etri naneseni na silika gel koriste se kao stacionarne faze i pogodni su za
enantioseparaciju aminokiselina, kao i jedinjenja sa primarnom amino grupom blizu hiralnog
centra, kada do interakcije dolazi između kiseonika policikličnih etara i protonovane amino
grupe enantiomera. Primeri struktura hiralnih stacionarnih faza dati su na slici 12.

12
 Slika 12. Primer strukture hiralne stacionarne faze tipa policikličnih etara
Makrociklični antibiotici kao što su delbavancin (slika 13, gore), teikoplanin
(slika 13, dole) ili vankomicin (slika 14) su voluminozni molekuli u kojima se razlikuje ciklični
aglikonski deo i glikon sastavljen od šećera. Ovi antibiotici sadrže raznovrsne funkcionalne grupe
(aromatične, alkoholne, amino, amidne itd.) koje omogućavaju formiranje velikog broja
interakcija sa enantiomernim analitima. Kovalentnim vezivanjem ovih makrociklčnih
glikopeptida za visokoprečišćenu siliku dobija se hiralna stacionarna faza koja se koristi u tečnoj
hromatografiji za razdvajanje enantiomera. Do enantioseparacije na ovakvom tipu stacionarnih
faza dolazi zahvaljujući 𝜋 − 𝜋 i jonskim interakcijama, formiranju vodoničnih veza i inkluzionih
kompleksa, sternim smetnjama ili kombinaciji ovih uticaja. U skladu sa tim, moguće je izvršiti
razdvajanje brojnih klasa jedinjenja koja, što se tiče naelektrisanja, po tipu mogu da budu
anjonska, katjonska, ili neutralna. Bitnim osobinama ovakvih stacionarnih faza smatra se i to što
su stabilne u većini rastvarača, bilo koja promena u stacionarnoj fazi je reverzibilna i što su
pogodne za optimizaciju i razvoj metode. Takođe, mogu se koristiti sa nepromenjenom
selektivnošću u hromatografiji normalnih, kao i u hromatografiji reverznih faza.

13
Slika 13. Struktura dalbavancina (gore ) i teikoplanina (dole)

14
Slika 14. Struktura vankomocina sa ooznačenim mestima za interakciju sa hiralnim analitom
Kovalentnim vezivanjem proteina iz grupe transportnih proteina ili enzima za silika
gel, dobijene su visoko enantioselektivne stacionarne faze. Kod proteinskih stacionarnih faza,
uspešna enantioseparacija ostvaruje se prvenstveno zahvaljujući velikom broju hiralnih mesta
inkorporiranog proteina. Sposobnost hiralne diskriminacije ovih makromolekula sa više
stereocentara u svojoj strukturi se definiše putem minimalnog broja grupa prikačenih za
stereocentre makromolekula koje moraju da uđu u vezujuće, ne-vezujuće ili odbojne
interakcije sa receptorskim mestima. Izraz 𝑁 + 2, pri čemu 𝑁 predstavlja broj stereocentara u
strukturi makromolekula, sugeriše da protein sa dva hiralna centra (obeležena sa CI i CII na
slici 15) mora da poseduje najmanje 4 grupe oko hiralnih centara čiji raspored omogućava
jednoznačnu interakciju i vezivanje samo jednog od 4 moguća stereoizomera (deo slike
označen sa (a)).

Slika 15. Prikaz interakcije proteinskog makromolekula sa hiralnim analitom

Neke od najpoznatijih, komercijalno dostupnih HPLC kolona sa proteinskim
stacionarnim fazama su: Chiral AGP (α-kiseli glikoprotein), HSA (humani albumin seruma),
BSA (goveđi albumin seruma) i Ultron ES-OVM-C (ovomukoid). Što se tiče praktičnih
15
 aspekata njihove primene, za proteinske faze važi da su skupe, teške za rukovanje zbog
osetljivosti na visoku temperaturu, a zapremine uzorka koje se mogu analizirati na njima su
male. Međutim, u mnogim slučajevima, njihova izvanredna enantioselektivnost nadomešćuje
ove nedostatke.
Ligand-izmenjivačka hromatografija predstavlja vrstu hromatografije tokom koje se
formiraju kompleksi. U sastav ovakvih kompleksa ulazi metalni katjon (Fe3+, Co2+, Ni2+ ili
Cu2+) u asocijaciji sa ligandima (anjonima ili neutralnim molekulima) koji mogu da doniraju
elektronske parove praznoj orbitali upotrebljenog metala. U hiralnoj ligand-izmenjivačkoj
hromatografiji, aminokiseline rigidno vezane za površinu stacionarne faze u prisustvu Cu2+
jona grade dijastereoizomerne komplekse jona sa aminokiselinama iz vodenog rastvora u
vidu stereoselektivne reakcije. Uprošćen prikaz jednog takvog kompleksa D- i L-fenilalanina
sa Cu2+ jonom na L-prolin silika stacionarnim fazama dat je na slici 16. Osim aminokiselina,
ligand – izmenjivačke stacionarne faze se koriste za razdvajanje β-aminoalkohola i sličnih
struktura jer sadrže dve polarne funkcionalne grupe na odgovarajućem rastojanju. Upotreba
ovih stacionarnih faza je ograničena zbog niske efikasnosti HPLC kolona, kao i problema
prilikom detekcije zbog prisustva metalnih jona u mobilnoj fazi i problema sa detekcijom
nederivatizovanih uzoraka.

Slika 16. Kompleks D- i L-fenilalanina na L-prolin silika stacionarnoj fazi

U svim opisanim primerima, dijatereoizomerni kompleksi se grade u toku
hromatografske analize. Koncept koji podrazumeva građenje stabilnih kompleksa između
enantiomera hiralnog jedinjenja sa hiralnim derivatizacionim agensom neposredno pre
započinjanja hromatografske analize, označava se kao indirektna hiralna HPLC analiza.
Ukoliko se pažljivo izabere hiralni derivatizacioni agens, nagrađeni dijasteroizomeni parovi
imaju različite fizičke osobine zbog čega različitim brzinama putuju kroz hromatografsku
kolonu i dolazi do njihovog razdvajanja. Da bi reakcija derivatizacije bila moguća, neophodno

16
je da analit poseduje adekvatnu funkcionalnu grupu (npr. —OH, Ar—OH, —SH, —COOH, —
CO—, —NH2, —NRH) koja može da reaguje sa hiralnim derivatizacionim agensom.
Efikasnost indirektnog pristupa zavisi vrlo često od rigidnosti dobijenih struktura, kao i od
međusobnog prostornog položaja hiralnih centara analita. U tom smislu, teži se formiranju
dijastereoizomera koji sadrže relativno rigidne strukturama, što je slučaj npr sa amidima,
karbamatima ili ureom u poređenju sa npr. estrima. Takođe, poželjno je da funkcionalna grupa
koja se derivatizuje bude prostorno bliska hiralnom centru u molekulu. Preveliko rastojanje od
centra asimetrije može da onemogući razdvajanje dijastereoizomera. Takođe, reakcija
derivatizacije mora biti brza, jednosmerna, bez ili sa minimalno sporednih produkata, da su
reaktanti stabilni i da se derivatizacioni agens dodaje u višku zbog kvantitativnosti reakcije.
Međutim, reakcija hiralne derivatizacije mora da ispuni i dodatne, specifične kriterijume.
Naime, neophodno je korišćenje derivatizacionih agenasa visoke optičke čistoće. U suprotnom,
došlo bi do formiranja četiri izomera koji bi se na hromatogramu uočili kao dva pika, s
obzirom da ne bi bilo moguće razdvojiti nagrađene parove enantiomera u nehiralnom sistemu
i dobili bi se lažno pozitivni rezultati. Zatim, važno je izbeći racemizaciju i hiralnog jedinjenja i
hiralnog derivatizacionog agensa. Konačno, višak hiralnog derivatizacionog agensa
neophodan za reakciju, mora se otkloniti pre početka hromatografske analize kako bi se
eliminisala mogućnost pojave neželjenog interferirajućeg pika na hromatogramu što otežava
pronalaženje optimalnih uslova za separaciju pikova od interesa.
Indirektna hiralna HPLC analiza se često koristi u slučajevima kada analit ima više od
jednog tipa funkcionalnih grupa prema kojima hiralni derivatizacioni agens pokazuje različit
reakcioni afinitet. Ovaj tip hiralne separacije je pogodan za analizu bioloških uzoraka.
Karakterističan primer je reakcija (R,S)-metoprolola sa (S)-terc-butil-3-(hloroformoksi)-
butiratom kao hiralnim derivatizacionim agensom prikazana na slici 17 koja se koristi za
određivanje odnosa enantiomera metoprolola u humanoj plazmi.

17
 Slika 17. Reakcija (R,S)-metoprolola sa hiralnim derivatizacionim agensom
Za hromatografsku analizu dobijenih derivata metoprolola, koristi se oktadecil silika
kao stacionarna faza, mobilna faza se sastoji od smeše fosfatnog pufera i acetonitrila (50:50,
V/V), dok se detekcija analita vrši uz pomoć fluorescentnog detektora podešenog na talasne
dužine 272/312 nm. Pri ovakvim hromatografskim uslovima, dobija se hromatogram prikazan
na slici 18.

Slika 18. Hromatogram dobijen indirektnom hiralnom HPLC analizom metoprolola iz

uzorka humane plazme
Kapilarna elektroforeza se zasniva na različitim migracionim svojstvima jonizovanih
analita koji, pod uticajem jakog električnog polja, putuju kroz usku kapilaru punjenu silikom
postavljenu između katodnog i anodnog prostora koji sadrže rastvore elektrolita. Kao i u slučaju
hiralne HPLC analize, i hiralna kapilarna elektroforeza može biti direktna i indirektna. Kod
direktnog pristupa, enantioseparacija je rezultat razlike u migracionim svojstvima i stabilnosti
dijatereoizomernih kompleksa koji se grade u reakciji enantiomera sa hiralnim selektorom koji je
kovalentno vezan za siliku ili je deo separacionog medijuma (najčešće vodeni rastvor
ciklodekstrina). Hiralno okruženje separacionog medijuma se može postići i korišćenjem hiralnih
surfaktanata koji u vodenoj sredini grade strukture micela kada govorimo o hiralnoj micelarnoj
kapilarnoj elektroforezi. Primenom indirektnog pristupa, vrši se građenje stabilnih
dijastereoizomera u kojima su enantiomeri ispitivanog jedinjenja kovalentno vezani sa hiralno
čistim derivatizacionim reagensom, a razdvajanje rezultat razlika u njihovim fizičko-hemijskim
osobinama. Iako se direktan pristup više zastupljen u praksi, kapilarna elektroforeza se, bez
obzira na način primere, odlikuje brzinom analize, jednostavnošću građe instrumenata i njihovim
lakim rukovanjem (dostupni su i prenosivi uređaji) i ekonomičnošću koja se ogleda u malom
utrošku rastvarača i maloj količini uzoraka koji se analiziraju.
Hiralna superkritična fluidna hromatografija je tip hromatografije u kome mobilnu
fazu predstavljaju tzv. superkritični gasovi (najčešće CO2) koji prelaze u tečno agregatno stanje
(fluid) pod superkritičnim uslovima (visok pritisak i temperatura). Pri tome, kao stacionarne faze
mogu se koristiti skoro sve vrste čvrstih hiralnih stacionarnih faza koje su već opisane kod
hiralne HPLC analize. To takođe znači da su i svi mehanizmi retencije kao i uslovi za postizanje
enantioselektivnosti isti. Da bi se povećala eluaciona moć fluidnog CO2, uobičajeno se u
mobilnu fazu dodaju organski rastvarači pri čemu ovaj tip hromaografije može da se koristi i u
18
NP i u RP modu. Praktično, osim specijalizovanog modula koji služi za proizvodnju i ubacivanje
fluidnog CO2 u hromatografski sistem, odnosno mešanje sa organskim rastvaračima, građa
uređaja koji se koriste u superkritičnoj fluidnoj hromatografiji je vrlo slična građi HPLC sistema.
Za razliku od HPLC metode, u ovom tipu hromatografije se na separaciju analita može dodatno
uticati promenom gustine mobilne faze variranjem radnog pritiska i temperature. Osim toga,
analiza je brža, ekonomičnija zbog manjeg utroška rastvarača i odlikuje se svojstvima ekološke
prihvatljivosti po okruženje jer se, nakon njene primene, generiše manje otpada od upotrebljenih
mobilnih faza (promenom uslova, moguće je fluidni CO2 prevesti u gas i otpariti iz sistema).
Međutim, zbog većeg broja faktora koji se moraju kontrolisati tokom rada na opremi, razvoj
optimalne metode može biti zahtevniji, dok je nekadašnja loša robusnost razvijenih metoda u
današnje vreme prevaziđena konstruisanjem novih unapređenih instrumenata.

Literatura
1. Chankvetadze B. Liquid Chromatographic Separation of Enantiomers. In: Fanali S,
Haddad P, Poole C, Schoenmakers P, Lloyd D, editors. Liquid Chromatography:
Applications. Elsevier Inc. 2013. p. 75-91.
2. Grinberg N, Burakowski T, Stalcup AM. Chiral separation. In: Kazakevich Y,
Lobrutto R, editors. HPLC for pharmaceutical scientists. New Jersey: John Wiley &
Sons, Inc; 2007. p. 987-1041.
3. Ward T, Ward K. Chiral separations: a review of current topics and trends. Analytical
chemistry 2012; 84: 626-635.
4. Chiral Recognition Mechanisms in Enantiomers Separations: A General View. In:
Berthod A, editor. Chiral Recognition in Separation Methods. Springer-Verlag Berlin
Heidelberg; 2010.
5. Sundaresan V, Abrol R. Biological Chiral Recognition: The Substrate’s Perspective.
Chirality 2005; 17(S1): S30-9.
6. Zhang Y, Wu D, Wang-Iverson D, Tymiak A. Enantioselective chromatography in
drug discovery. Drug discovery today 2005; 10(8): 571-577.

19