BÀI 5: ENZYME

1)Xác định hoạt tính enzyme amylase theo Wohlgemuth

1.1) Lý thuyết
Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và có tính đặc hiệu cao. Mỗi enzyme có
khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định
-amylase (Endo -1,4-glucanase) có trong nước bọt, hạt hòa thảo nảy mầm, tụy tạng, nấm mốc,
vi khuẩn. Enzyme này phân giải liên kết 1,4 - glycoside ở giữa chuỗi polysaccharide tạo thành
maltose, dextrin phân tử thấp. Dưới tác dụng của enzyme này, dung dịch tinh bột nhanh chóng bi
thủy phân mất khả năng tạo màu với iod
Enzyme amilase là enzyme thủy phân tinh bột. Nó cắt Amylose và Amylopectin của tinh bột
thành dextrin và các loại đường Maltose, Glucose,…

Phương pháp Wohlgemuth là phương pháp dựa vào việc tìm nồng độ của enzyme nhỏ nhất để
thủy phân tinh bột đến các sản phẩn không màu với iod.
Đơn vị Wohlgemuth là lượng enzyme cần thiết dể thủy phân 1 mg tinh bột sau 30 phút ở 370C có
Cl- (NaCl) làm chất hoạt hóa.
1.2) Chuẩn bị
Hóa chất Dụng cụ
-Malt -Ống nghiệm
-NaCl 0.5% -Cân 4 chữ số
-Tinh bột 0.5% -Pipette 1ml
-H2SO4 10% -Bình định mức 100ml
-Thuốc thử Lugol -Phễu, giấy lọc
-Cối sứ

1.3)Tiến hành thí nghiệm

A. Chuẩn bị dịch chiết Amylase
-Cân 5g malt (cả vỏ) bằng cân 4 chữ số

-Chuẩn bị cối và bình mức 100ml sạch khô.

-Đem lượng malt vừa cân vào cối nghiền rồi chuyển tất cả vào bình định mức 100ml.
-Định mức đến 100 ml bằng nước cất (lấy sạch malt dính trên các dụng cụ)

-Ngâm trong 30 phút, thỉnh thoảng lắc đều dịch trong bình định mức.
-Lọc dịch qua 2 lần giấy lọc mịn thu được dịch trong suốt chứa enzyme amylase.
B. Tiến hành khảo sát hoạt tính enzyme amylase
-Lấy 10 ống nghiệm sạch khô đánh số từ 1 đến 10
-Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml NaCl 0.5% bằng pipette 1ml
-Cho vào ống nghiệm (1) 1ml dung dịch chứa enzyme amylase đã chuẩn bị ở trên bằng pipette
1ml, lắc kĩ, lau sạch đầu pipette.
-Sau đó lấy 1ml dung dịch từ ống nghiệm (1) bằng pipette 1ml cho vào ống nghiệm (2), lắc kĩ,
lau sạch đầu pipette để thực hiện lần hút tiếp theo.
-Lặp lại tương tự đến ống nghiệm thứ (10), sau khi lắc kỹ thì dùng pipette 1ml hút 1ml ở ống
nghiệm thứ (10) bỏ đi, cuối cùng tất cả các ống nghiệm đều chứa 1ml dung dịch.
-Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml tinh bột 0.5% bằng pipette 1ml, lắc đều, để vào tủ nhiệt ở 370C.
-Thỉnh thoảng lắc đều để lôi kéo tất cả các tinh bột dính trên thành ống nghiệm xuống.
-Để trong 30 phút, thêm vào mỗi ống nghiệm 1ml H 2SO4 10% (có thể dùng pipette 1ml cho vào
theo thứ tự từ ống nghiệm (1) đến (10) để thời gian tính từ lúc cho tinh bột vào ống nghiệm đến
khi cho H2SO4 giữa các ống nghiệm gần như bằng nhau)
-Cho 2 giọt lugol vào mỗi ống nghiệm lắc đều
-Lấy ống nghiệm 11 cho vào 3ml nước cất, sau đó cho 2 giọt lugol để làm mẫu (có màu vàng
sáng của lugol)
-Ghi lại kết quả thí nghiệm, đánh dấu ở ống ghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất nơi đó xảy ra sự
thủy phân hoàn toàn tinh bột.
C) Thực hiện các bước tương tự thí nghiệm trên, thay 5g malt bằng 10g, thay tinh bột 0.5%
bằng tinh bột 0.1%
D. Giải thích một số bước thí nghiệm
-Chuẩn bị môi trường hoạt hóa: ion Cl- trong NaCl là chất hoạt hóa của enzyme amylase, nó làm
thay đổi trung tâm hoạt động của enzyme cho phù hợp với cơ chất.
-Pha loãng dịch chiếc enzyme: Để tìm nồng độ pha loãng mà tại enzyme không thủy phần hoàn
toàn tinh bột
-Bất hoạt enzyme: H2SO4 10% làm enzyme amylase bị biến tính bất thuận nghịch, trở nên bất
hoạt
-Thêm lugol: Để xác định tinh bột có còn sau quá trình thủy phân hay không.
-Lấy hết tinh bột trên thành ống nghiệm xuống để khi thêm thuốc thử lugol vào không tạo phức
với tinh bột trên thành tạo màu xanh tím dẫn đến kết quả không chuẩn xác.
1.4) Kết quả thí nghiệm
TH1: 5g malt, tinh bột 0.5%
 STT ống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
nghiệm
Độ pha 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024
loãng (F)
Nồng độ n/2 n/4 n/8 n/16 n/32 n/64 n/128 n/256 n/512 n/1024
enzyme
Màu dd X X X X X X X X X X

TH2: 10g malt, tinh bột 0,1%

STT ống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
nghiệm
Độ pha 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024
loãng (F)
Nồng độ n/2 n/4 n/8 n/16 n/32 n/64 n/128 n/256 n/512 n/1024
enzyme
Màu dd v v tím x x x x x x x

Nhận xét kết quả thu được:

TH1:
-Tất cả các ống nghiệm đều thu được màu xanh tím do tinh
bột không bị thủy phân hoàn toàn, kết quả thí nghiệm không
như mong muốn do chất lượng của malt chứa hàm lượng
enzyme amylase quá ít và trong lúc làm thí nghiệm lượng tinh bột vẫn còn dính trên thành ống
nghiệm
TH2:
-Ở ống nghiệm 1,2 thì xuất hiện màu vàng do tinh bột đã bị enzyme amylase thủy phân hoàn
toàn thành maltose và glucose, nên khi thêm lugol vào chỉ thấy màu vàng của lugol
-Ống nghiệm 5,6,7,8,9,10 có màu xanh đen do trong dung dịch còn tinh bột kết hợp với iod tạo
phức xanh đen, điều đó chứng tỏ khi pha loãng tới nồng độ n/8 thì enzyme không còn thủy phân
được hoàn toàn tinh bột.
-Khi so sánh màu với mẫu thử 11 thì ta thấy màu trùng với ống nghiệm có nồng độ enzyme thấp
nhất là ống nghiệm số 2.
1.6) Tính toán kết quả
Lượng enzyme cho vào ống nghiệm (1):
TH1:
m. V 1 5001,4.1
n= = =50.014
V2 100
TH2:
m. V 1 10000.1
n= = =100
V2 100

Trong đó V1: thể tích dịch chiết enzyme cho vào ống (1) (ml)
V2:Thể tích dịch chiết enzyme (ml)
m : Khối lượng malt có chưa enzyme (mg)
Một đơn vị Wohlgemuth (W)
TH1: không chọn được F
TH2: F = 4
n 100
W= = =25
F .1 4.1
Trong đó : F là độ pha loãng ta chọn được từ bảng trên
Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1ml dịch chiết enzyme
n 100
Nw= = =4
V 1.W 1.25

2) Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ đến khả năng thủy phân tinh bột của enzyme amylase
2.1) Lý thuyết
-Enzyme là xúc tác sinh học có bản chất là protein, vì thế hoạt tính xúc tác của enzyme bị giới
hạn bởi những điều kiện phản ứng như nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme.
-Amylase là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột thành các loại dextrin, maltose và
glucose. Trong hệ tiêu hóa, enzyme alpha amylase có trong nước bọt sẽ bắt đầu thủy phân tinh
bột đã hồ hóa trong thức ăn, và các amylase còn lại sẽ kết thúc quá trình thủy phân tạo glucose
thấm qua thành ruột.
Mục đích bài thí nghiệm này là kiểm tra ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ đến khả năng thủy
phân tinh bột của enzyme amylase.
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân tinh bột của enzyme amylase

2.2) Chuẩn bị
Hóa chất Dụng cụ
-Dung dịch tinh bột 1.0% -Ống nghiệm
-Dung dịch glucose 0.5% -Đĩa thủy tinh
-Thuốc thử lugol -Pipette 5ml, 10ml, 1ml
-Dung dịch đệm
-Dịch chiếc enzyme amylase

2.3) Tiến hành thí nghiệm

-Tạo ống màu mẫu:
Chuẩn bị 2 ống nghiệm sạch khô
(1) Dùng pipette 5ml cho vào ống nghiệm 2ml dung dịch tinh bột 1% sau đó thêm vào ba
giọt thuốc thử Lugol
(2) Dùng pipette 5ml cho vào 2ml dung dịch glucose 0.5% sau đó thêm vào 3 giọt thuốc thử
lugol
-Pha loãng lugol 10 lần: 1 giọt lugol, 9 giọt nước dùng ống bóp nhựa
-Chuẩn bị 3 ống nghiệm sạch khô, đánh số từ 1 tới 3
-Dùng pipette 10ml hút 5.5ml dung dịch đệm pH=6.0 cho vào mỗi ống nghiệm
-Dùng pipette 5ml cho vào mỗi ống nghiệm 4ml dung dịch tinh bột 0.5%.
-Dùng pipette 1ml cho 0.5 ml dịch chiếc enzyme amylase vào mỗi ống nghiệm
-Để một ống nghiệm ở nhiệt độ phòng, 2 ống nghiệm còn lại 1 cho vào tủ 500C và 1 cho tủ 700C
-Xác định thời gian thủy phân: Lấy mẫu định kì 3 phút, từ mỗi ống nghiệm lấy ra 1 giọt mẫu,
nhỏ phân biệt trên đĩa thủy tinh, thêm một giọt thuốc thử lugol và xem màu. Tiếp tục cho đến khi
giọt mẫu giống ống mẫu số (2), ghi nhận thời gian thủy phân
Kiểm tra kết quả: Sau 15 phút, lấy từ mỗi ống nghiệm một giọt mẫu, nhỏ phân biệt trên đĩa thủy
tinh, thêm 1 giọt thuốc thử lugol, xem màu nhận xét và giải thích

Ống nghiệm 1 2 3
Ống màu mẫu
Dung dịch tinh bột 0.5%, ml 2
Dung dịch glocose 0.5%, ml 2
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme amylase
Nước cất, ml 5.5 5.5 5.5
Dung dịch tinh bột 0.5%, ml 4 4 4
Dịch chiết enzyme amylase, ml 0.5 0.5 0.5
pH 6 6 6
0 0
Nhiệt độ, C 30 (t
50 70
phòng)

2.4)Kết quả thí nghiệm

Sau 3 phút

Sau 6 phút Sau 9 phút

Sau 12 phút Sau 15 phút

2.4) Kết quả thí nghiệm

-Ở ống nghiệm 1: Ở nhiệt độ phòng, sau 3 phút khi nhỏ lugol vào ta thấy có màu xanh tím; sau 6,
9 phút vẫn còn màu xanh tím, sau 12 phút thì khi nhỏ lugol vào giọt mẫu ta thấy màu xanh tím
nhạt và có chút vàng; sau 15 phút thì giọt mẫu sau khi nhỏ lugol màu vàng rõ.
Giải thích: Ở nhiệt độ phòng, độ hoạt động của enzyme amylase thấp (thấp hơn ở 50 0C hay
700C) nên thời gian thủy phân thủy phân tinh bột kéo dài.
-Ở ống nghiệm 2: Ở 500C, sau 3 phút khi nhỏ lugol vào giọt mẫu thì giọt mẫu đã có màu vàng
lẫn màu xanh tím, trong các lần tiếp theo, xuất hiện màu vàng sáng hơn.
Giải thích: Do enzyme hoạt động mạnh nhất trong khoảng nhiệt độ từ 50-60 0C, nên thời gian
thủy phân cùng một lượng tinh bột so với ống nghiệm 1 nhanh hơn
-Ở ống nghiệm 3: Ở 700C, sau 3 phút nhỏ lugol vào giọt mẫu thì màu vàng không rõ có lẫn màu
xanh tím, sau 6, 9, 12, 15 phút thì có màu vàng sáng
Giải thích: Ở nhiệt độ này enzyme cũng hoạt động tốt nhưng mà độ hoạt động thấp hơn ở nhiệt
độ ở ống nghiệm 2, lý thuyết thì sẽ xuất hiện màu vàng nhanh hơn ở ống nghiệm 1 và chậm hơn
ống nghiệm 2 nhưng màu vàng sáng lại xuất hiện trước ống nghiệm 2 có thể do:
- Nhiệt độ của tủ sấy chưa đạt đến 700C
- Ở nhiệt độ 700C độ hoạt động của enzyme chênh lệch không nhiều so ở 50 0C nhưng lại ở gần
khoảng hoạt động tốt.
-Sai số trong quá trình thực hiện các bước thí nghiệm.
3) Tính đặc hiệu của enzyme
3.1)Lý thuyết
Do cấu trúc lý hóa đặc biệt của phân tử enzyme và đặc biệt là của trung tâm hoạt động mà
enzyme có tính đặc hiệu rất cao so với những chất xúc tác thông thường khác. Mỗi enzyme chỉ
có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng
nhất định. Đặc tính tác dụng lựa chọn cao này gọi là tính đặc hiệu hoặc tính chuyên hóa của
enzyme. Tính đặc hiệu là một trong những đặc tính cơ bản quan trọng nhất của enzyme.
Có 3 kiểu đặc hiệu:
Đặc hiệu phản ứng: Phần nhiều mỗi enzym đều có tính đặc hiệu với một loại phản ứng nhất định.
Những chất có khả năng xảy ra nhiều loại phản ứng hóa học thì mỗi loại phản ứng ấy phải do
một enzym đặc hiệu xúc tác.

Đặc hiệu cơ chất: Mỗi enzym chỉ xúc tác cho sự chuyển hóa một hoặc một số chất nhất định.
Mức độ đặc hiệu cơ chất của các enzym khác nhau không giống nhau.

Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể): Hầu như tất cả các enzym đều có tính đặc hiệu không
gian rất chặt chẽ, nghĩa là enzym chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân không gian của
cơ chất.

-Amylase là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột thành các loại dextrin, maltose và
glucose

-Invertase là một enzyme thủy phân saccharose (không phải đường khử) thành glucose và
fructose( là hai loại đượng khử)

Đường khử (reducing sugar) là các đường chứa Aldose (nhóm aldehyt R-CH=O) hoặc Cetose
(nhóm xeton C=O) tự do, có khả năng hoạt động như một chất khử. Có tính chất hóa học đặc
trưng của nhóm chức CHO, CO. Vì vậy nó vẫn còn được gọi là đường aldose hoặc đường cetose.

– Đường khử có thể bị oxy hóa bởi các tác nhân oxy hóa yếu.

Dung dịch Fehling A và B (bao gồm CuSO4 và tartrat kép trong môi trường kiểm) khử đường
khử có trong dịch phân tích  để tạo thành đồng oxít kết tủa đỏ.
Sự thủy phân của enzyme đối với dung dịch đường sacarose ở nhiệt độ khác nhau được thể hiện
thông qua phản ứng Fehling.
Phản ứng Fehling:
3.2) Chuẩn bị
Hóa chất Dụng cụ
-Dung dịch enzyme amylase -Ống nghiệm
-Dung dịch enzyme invertase -Pipette 10ml, 5ml
-Hồ tinh bột 1% -Tủ ấm
-Sacarose 5% -Nồi cách thủy
-Thuốc thử lugol
-Thuốc thử Fehling

3.3) Tiến hành thí nghiệm

-Chuẩn bị 4 ống nghiệm sạch, khô
-Lấy 5ml dung dịch sacarose 5% bằng pipette 5ml cho vào ống nghiệm 1 và 2
-Lấy 5ml hồ tinh bột 1% bằng pipette 5ml cho vào ống nghiệm 3 và 4
-Thêm vào ống nghiệm 1 và ống nghiệm 3 mỗi ống 1 ml dung dịch enzyme invertase, ống thứ 2
và ống thứ 4 mỗi ống 1ml dung dịch enzyme amylase dùng pipette 1ml
-Lắc đều và để vào tủ ấm 370C trong 15 phút.
-Lấy ra, cho vào ống nghiệm thứ nhất và ống nghiệm thứ 2 mỗi ống 5ml dung dịch Fehling bằng
pipette 5ml rồi đặt vào bể điều nhiệt đang sôi trong 2 phút thì lấy ra.
-Làm nguội tới nhiệt độ phòng.
-Cho vào ống nghiệm 3 và 4 mỗi ống nghiệm 2 giọt thuốc thử Lugol
-Lập bảng kết quả thí nghiệm viết phương trình và giải thích.
3.4) Kết quả thí nghiệm
Ống nghiệm Cơ chất Enzyme Phản ứng thử Kết quả
1 Sacarose Invertase Phản ứng thử Có kết tủa màu đỏ gạch
Fehling
2 Sacarose Amylase Phản ứng thử Dung dịch màu xanh
Fehling
3 Tinh bột Invertase Phản ứng thử lugol Màu xanh tím
4 Tinh bột Amylase Phản ứng thử lugol Có màu tím hồng
3.5) Giải thích kết quả thí nghiệm:
Ống nghiệm 1: Dung dịch saccarose được enzyme invertase xúc tác cho quá trình thủy phân diễn
ra ban đầu tạo tạo ra các dextrin trung gian. Sau khi tiếp tục đun dưới nhiệt độ cao các dextrin
này sẽ tiếp tục bị thủy phân tạo 2 sản phẩm đó là fructose và glucose và đây chính là 2 tác nhân
đường khử. Khi cho thuốc thử Fehling vào ống nghiệm, ống nghiệm xuất hiện kết tủa màu đỏ
nâu của Cu2+.
Ống nghiệm 2: Dung dịch saccarose với sự có mặt của enzyme amylase. Sau các thao tác thí
nghiệm, khi cho thuốc thử Fehling để kiếm tra xem có sự xuất hiện của đường khử hay không thì
không có phản ứng xảy ra. Bởi enzyme amylase chỉ có tác dụng thủy phân đối carbohydrate có
liên kết α-1,4-glycoside còn đối với saccarose thì liên kết trong phân từ là 1,2-glycoside.
Ống nghiệm 3: Enzyme invertase không có tác dụng thủy phân đối với liên kết α-1,4-glycoside
và α-1,6-glycoside của tinh bột. Nên khi cho thuốc thử Liugon vào mẫu ống nghiệm, ống nghiệm
có màu xanh tím đậm do tinh bột chưa bị thủy phân có trong ống nghiệm.
Ống nghiệm 4: Enzyme amylase có tác dụng thủy phân đối với liên kết α-1,4-glycoside và α-1,6-
glycoside của tinh bột. Nhưng quá trình thí nghiệm chỉ gia nhiệt nhẹ (37 oC) trong 15 phút nên
hiệu suất thủy phân không cao, nên khi cho thuốc thử liugon mẫu ống nghiệm xuất hiện màu tím
hồng do một lượng tinh bột đã bị thủy phân thành các dextrin trung gian.
Bàn luận: Enzyme amylase có tính đặc hiệu đối với tinh bột trong quá trình thủy phân và
enzyme invertase có tính đặc hiệu đối với sucrose trong quá trình thủy phân. Đây là 2 enzyme có
tính đặc hiệu cơ chất. Từ đó, chứng tỏ enzyme là một có tính đặc hiệu rất cao so với những chất
xúc tác thông thường khác. Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một
số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định. Tính đặc hiệu là một trong những đặc tính
cơ bản quan trọng nhất của enzyme.

Phương trình phản ứng:

-Saccaroza bị thủy phân bởi xúc tác:

C12H22O11 + H2O → C6H12O6 + C6H12O6

(glucose) (fructose)
-Phản ứng Fehling với đường khử:
 2Na2[Cu(C4H4O6)2] + NaOH + RCHO +H2O→Cu2O↓+ RCOONa + 2H2C4H4O6 + 2Na2C4H4O6
-Tinh bột bị thủy phân bởi amylaza:

4) Một số lưu ý khi làm thí nghiệm với enzyme

Khi tiến hành thí nghiệm đo họat tính enzyme cần chú ý những điểm sau:
-Cần tránh những yếu tố có thể làm biến tính protein enzyme.
-Các thông số nhiệt độ, áp suất, pH, nồng độ ion và thành phần dung dịch đệm có thể ảnh hưởng
lên enzyme.
-Thử hoạt tính enzyme phải được tiến hành trong điêu kiện thích hợp.
-Với những enzyme cần có chất hoạt hóa hoặc chất ổn định thì phải cho chất này vào enzyme
trước khi cho cơ chất vào hồn hợp phản ứng
-Nồng độ cơ chất phải trong giới hạn thích hợp, đủ để phản ứng nhưng không quá cao để kiềm
hãm enzyme
-Khi xác định hoạt tính phải làm mẫu thử đối chứng xong xong với mẫu thí nghiệm.