BÀI 5

Nhóm 7:
Bùi Quốc Bảo –1901.066 
Ninh Văn Hải-1901.187 
Nguyễn Thu Huyền-1901.321 
Trịnh Khánh Ly-1901.421 
Võ Thị Ngọc Nga-1901.478 

Thí nghiệm 5.1. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH

 ĐÁNH DẤU GẮN ENZYM (ELISA: ENZYM LINK IMMUNO-SORBENT
ASSAY) ĐỂ XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN/ KHÁNG THỂ CỦA VIRUS VIÊM
GAN B
I. PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH ELISA
1. Nguyên lý  
 Dựa vào nguyên lý của phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể.
 Các kháng nguyên hoặc kháng thể được gắn lên bản nhựa, sau đó cho kháng thể
hoặc kháng nguyên đặc hiệu tương ứng vào để tạo phản ứng kết hợp kháng
nguyên – kháng thể. Các kháng thể hoặc kháng nguyên đã biết trước được gắn với
enzym. Enzym sẽ phân hủy cơ chất không màu thành một sản phẩm có màu đặc
trưng. Mật độ màu được nhận định sơ bộ bằng mắt thường hoặc được đọc chính
xác bằng máy ELISA.
2. Các bước tiến hành 

 Bước 1:

- Sát khuẩn và lấy 2ml máu tĩnh mạch của người thử rồi đem đi ly tâm.

- Rửa các giếng thử bằng dung dịch rửa, rửa 4-5 lần/giếng, thể tích rửa 350μl/giếng

=> Rửa để loại bỏ lớp màng bảo vệ kháng thể được gắn dưới đáy giếng.

 Bước 2:  Chuẩn bị các giếng, tổng số giếng bằng số mẫu cần định lượng và 3
giếng chứng âm , chứng dương và chất hiệu chuẩn
 - Giếng trắng đặt ở vị trí A1=> để làm ống chứng , kiểm tra sai sót trong thao
tác.

- Thêm 150 μl chứng âm vào 3 giếng B1, C1, D1

- Thêm 150 μl chất hiệu chuẩn vào giếng E1, F1

- Thêm 150 μl chứng dương vào giếng G1

- Thêm 150 μl huyết tương của người thử vào từng giếng tiếp theo sau giếng G1

- Kiểm tra sơ bộ các giếng bằng mắt thường hoặc đo quang

 Bước 3: Thêm 100 μl dung dịch liên hợp vào từng giếng trừ giếng A1

=> Dung dịch liên hợp là kháng thể đặc hiệu với HbsAg nhưng được gắn thêm enzym
thích hợp

 Bước 4: Đậy bản giếng và ủ 120 phút ở nhiệt độ 37°C ±1°C

=> Mô phỏng môi trường giống như trong máu ở cơ thể người

-120’: thời gian để phản ứng KN-KT xảy ra

- Nhiệt độ 37°C ±1°C: nhiệt độ cơ thể người
-Ngoài ra các chứng âm, chứng dương, hiệu chuẩn có hệ đệm pH xấp xỉ
7,4 giống pH trên máu người

Sau khi ủ các trường hợp có thể xảy ra:

-Mẫu xét nghiệm có HbsAg: HbsAg sẽ gắn với các kháng thể có sẵn trên bề
mặt giếng (gắn vào Fab). Kháng thể đặc hiệu trong dung dịch liên hợp lại gắn vào
HbsAg
- Mẫu xét nghiệm không có HbsAg: không có phản ứng KN - KT xảy ra,
KT kháng enzym lơ lửng trong dung dịch

 Bước 5:  Sau khi ủ xong đem rửa 5 lần bằng dung dịch rửa, rửa 4-5 lần/giếng, thể
tích rửa 350μl/giếng

=> Nếu mẫu có HbsAg, kháng thể - enzym sẽ vẫn còn gắn trên bề mặt giếng. Nếu mẫu
không có HbsAg, kháng thể - enzym sẽ bị rửa trôi hết

 Bước 6: Ngay sau khi rửa, thêm 200 μl dung dịch chất nền vào từng giếng
=> Dung dịch chất nền chứa các cơ chất, cơ chất này có thể gắn với enzym theo cơ
chế chìa khóa - ổ khóa và có thể làm enzym đó đổi màu ( sau khi ủ )

 Bước 7: Đậy bản giếng và ủ ở nhiệt độ phòng 18° - 24°C  trong 30 phút

=> Đây là thời gian và điều kiện nhiệt độ thích hợp cho phản ứng kết hợp Enzym- cơ
chất xảy ra. Nếu mẫu có HBsAg -> enzym- kháng thể được giữ lại, phản ứng enzym
-cơ chất có xảy ra -> Enzym có bị đổi màu. Nếu không co HBsAg thì Enzym không bị
đổi màu

 Bước 8: Thêm 100 μl H SO /giếng để dừng phản ứng

2 4

=> H2SO4 là acid mạnh, thêm vào để thay đổi pH của dd trong giếng xuống mức Acid
làm biến tính Enzym và ngăn phản ứng của Enzym-cơ chất

III. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

  Yêu cầu

Giếng trắng < 0.100

Chứng âm (NC) < 0.050

Chất hiệu S/Co >

chuẩn 2

Chứng dương > 1.000

Tính toán

Giếng H2 có màu đậm hơn chứng dương G1 => H2 dương tính

-Bằng mắt thường: Đo độ đậm màu của phản ứng tỉ lệ thuận với kháng nguyên
-Định lượng bằng đo quang: Các mẫu từ H1-G2 đều có thể đo được quang.

Giá trị Cut-off (Co): Co = NC + 0.05 = 0,033 + 0,005 = 0,083

S/Co:

H1: 0,044/0,083 =0.53 => Âm tính

A2: 0,052/0,083 =0.62 => Âm tính

B2: 0,063/0,083 =0.76 => Âm tính

C2: 0,027/0,083 =0.325 => Âm tính

D2: 0.180/0,083 =2.168=> Dương tính

E2: 0.070/0,083 = 0.84=> Âm tính

F2: 0.098/0,083 = 1.18=> Dương tính

G2: 0.078/0,083 =0.94=> nghi ngờ

S/Co Kết quả

< 0.9 Âm tính

0.9 – Nghi ngờ

1.1

> 1.1 Dương tính

 Thí nghiệm 5.2. TEST LẨY DA

I.NGUYÊN LÝ

-Khi đưa một lượng dị nguyên đã được pha loãng tới nồng độ thích hợp vào lớp
thượng bì của da người bệnh để kiểm tra phản ứng của cơ thể người bệnh với loại dị
nguyên đó. Nếu kháng thể IgE đặc hiệu với dị nguyên trong máu của bệnh nhân sẽ biểu
hiện trên da với các mức độ khác nhau.

II.TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

-Chuẩn bị bệnh nhân

-Tiến hành

Bước 1:

- Sát khuẩn 1/3 mặt trước trong cẳng tay (lưu ý: vị trí thử test là những vị trí rộng rãi
không có tổn thương da như mặt trước trong cẳng tay, lưng), đợi khô.

- Đánh dấu các vùng test trên da bằng bút bi. Ghi rõ tên dung dịch bên cạnh (Các vị trí
chích trên da sẽ được thực hiện ngay cạnh vị trí đánh dấu để tránh nhầm lẫn).

- Nhỏ các giọt dung dịch cách nhau 3-5 cm vào vùng da đã sát khuẩn:

         1 giọt dung dịch NaCl 0,9% (chứng âm)

         1 giọt dung dịch dị nguyên nghi ngờ

         1 giọt dung dịch Histamin 1mg/ml (chứng dương)

- Dùng kim tiêm lẩy da cắm vào giữa giọt dung dịch trên (mỗi giọt một kim riêng), qua
lớp thượng bì tạo với mặt da một góc 45 độ rồi lẩy nhẹ, không được làm chảy máu

- Đọc kết quả sau 20 phút

( Lưu ý: Theo dõi bệnh nhân trong suốt quá trình làm test . Nếu có xảy ra phản vệ, chẩn
đoán và xử trí theo sơ đồ phản vệ )

III. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

-Test lẩy da dựa trên quá mẫn typ 1 : là quá mẫn tức khắc hay phản vệ do IgE
-Chứng dương: Dương tính (+) xuất hiện sần ở vị trí dị nguyên .

-Chứng âm, sữa, ổi , đậu không xuất hiện nốt sần.

Giải thích: Khâu quan trọng nhất trong cơ chế quá mẫn typ I là sự hoạt hóa tế bào mast,
ái kiềm.
Khi có kháng nguyên đặc hiệu vào cơ thể từ lần 2 , sẽ có sự kết hợp kháng nguyên với
IgE.: Hai epitop của phân tử KN gắn vào hai Fab của hai phân tử IgE với nhau xảy ra trên
bề mặt tế bào Mast và bạch cầu ái kiềm làm giải phóng hóa chất trung gian :
Histamin,Serotonin, Heparin… Các chất này có tác dụng co thắt cơ trơn, giãn mạch, tăng
tính thấm thành mạch