1

§3. GEN TRỊ LIỆU

(Gene Therapy)

Mục tiêu bài dạy học

➢ Trình bày nguyên lý các kỹ thuật tạo vector chuyển gen.

➢ Phân tích các ứng dụng y - dược quan trọng của gen trị liệu.

Gen trị liệu là một phương pháp điều trị mới trong đó, các gen hoặc các đoạn oligonucleotide ngắn
được sử dụng làm tác nhân trị liệu, thay vì các thuốc là các hợp chất hóa học điều trị thông thường. Trị
liệu gen là đưa một hoặc một số gen lạ vào một cơ thể sinh vật để chữa bệnh mắc phải hoặc một số các
khiếm khuyết di truyền. Trong liệu pháp gen, ADN mã hóa cho một protein trị liệu được đóng gói trong
một “vector”, sau đó ADN này được chuyển vào trong tế bào bên trong cơ thể. Khi đó, việc điều trị bệnh
sẽ được giảm độc tính ở mức thấp nhất, nhờ sự biểu hiện của đoạn ADN chèn xen vào bộ máy di truyền
của tế bào. Vào năm 1990, FDA lần đầu tiên thông qua một thử nghiệm lâm sàng gen trị liệu trên đối
tượng người mắc bệnh ADA-SCID tại Hoa Kỳ, sau khi điều trị trên Ashanti DeSilva. Sau đó, khoảng
1.700 ca thử nghiệm lâm sàng đã được tiến hành trên các bệnh nhân với các kỹ thuật và các gen chữa trị
số lượng lớn các bệnh khác nhau. Với phương pháp sử dụng gen để chữa bệnh, hay gọi vắn tắt là gen trị
liệu, đã chữa được nhiều bệnh di truyền như bệnh xơ nang, bệnh đau cơ Duchenne, bệnh Huntington, hội
chứng gẫy nhiễm sắc thể X, u nguyên bào võng mạc, bệnh Alzheimer, bệnh xơ cứng teo cơ cột bên, bệnh
tiểu đường, bệnh ung thư v.v.. Trong tương lai các bệnh như cholesterol cao có tính chất gia đình, các
bệnh về gan, bệnh Lesh- Nyhan, bệnh Gaucher và bệnh ưa chảy máu cũng sẽ được cứu chữa bằng gen trị
liệu.

Phân loại gen trị liệu

Các phương pháp trị liệu sử dụng gen phần lớn đều dựa trên nguyên tắc bổ cứu những gen sai hỏng; cách
thường dùng là chèn đoạn mã hóa của một gen bình thường vào một vùng đặc hiệu trong hệ gen người
bệnh nhằm thay thế gen đã mất chức năng. Hai kiểu gen trị liệu thường được sử dụng là liệu pháp gen tế
bào soma và liệu pháp gen tế bào sinh dục.

1. Gen trị liệu tế bào soma

Trong liệu pháp gen này, các tế bào sinh dưỡng của người bệnh là đích nhắm để chuyển gen. trong
trường hợp chuyển gen thành công, các hiệu ứng do gen ngoại lai gây ra chỉ tác động vào cá nhân
người bệnh chứ không được di truyền cho thế hệ con cái hoặc các thế hệ sau.

2. Gen trị liệu tế bào sinh dục

 2

Trong liệu pháp gen này, các gen quy định chức năng, được chuẩn bị để cài xen vào bộ gen người
bệnh, sẽ đượ chuyển vào các tế bào sinh dục, trứng hoặc tinh trùng. Bằng cách chuyển gen vào các
tế bào sinh dục, ảnh hưởng của gen trị liệu sẽ được di truyền cho các thế hệ sau.

Nguyên lý ứng dụng của gen trị liệu

Việc sử dụng gen trị liệu dựa trên 3 nguyên lý chung:

1. Thay thế hoặc chỉnh sửa một gen để tạo ra sản phẩm thiết yếu cho tế bào hoặc tổ chức mô trong
cơ thể hoạt động bình thường;
2. Đưa một gen lạ vào trong tế bào đích nhằm sản xuất ra một chất mà cơ thể đó không tự sản xuất
được;
3. Làm ngừng sự biểu hiện của một gen bị sai hỏng gây nên rối loạn di truyền trong tế bào.

Nguyên lý hoạt động của gen trị liệu

Tăng hoạt động gen GAT (Gene Augmentation Therapy)
Trong liệu pháp gen này, sự thêm các alen quy định chức năng bình thường được sử dụng để điều trị các
sai hỏng di truyền do sự thiếu hụt sản phẩm gen, ví dụ, GAT được áp dụng điều trị các khiếm khuyết di
truyền do gen lặn. Điều trị các bệnh di truyền do gen trội ít sử dụng phương pháp GAT.

Tấn công vào các tế bào đặc thù

Phương pháp này sử dụng các gen mã hóa cho các sản phẩm có độc tính (gọi là các gen tự tử), hoặc tiền
dược (prodrug)- chất hóa học cấp cho tính mẫn cảm với điều trị dùng thuốc ở bước kế tiếp- nhằm tiêu diệt
các tế bào bị nhiễm hoặc bị chuyển dạng. Chiến lược điều trị này thường được sử dụng trong điều trị khối
u. Ví dụ, enzym thymidine kinase (TK) phosphoryl hóa ganciclovir- một prodrug được dùng trong điều
trị. Prodrug này được phosphoryl hóa bởi endokinase để tạo thành sản phẩm ganciclovir triphosphate, một
chất ức chế cạnh tranh của deoxyguanosine triphosphate. Ganciclovir phosphate gây ra dừng tổng hợp
chuỗi ADN khi gắn vào ADN trong tế bào.

Nhằm vào sự ức chế biểu hiện gen

Liệu pháp này nhằm mục đích khóa sự biểu hiện của bất cứ một gen bệnh nào hoặc gen tạo ra sản phẩm
protein có hại cho một loại tế bào xác định. Phương pháp điều trị này phù hợp đối với các bệnh nhiễm
trùng và một số bệnh ung thư.

Nhằm vào sửa chữa các gen đột biến

Liệu pháp này được sử dụng để sửa chữa một gen mất chức năng nhằm bổ cứu chức năng của nó, và có
thể được thực hiện ở mức độ di truyền bằng tái tổ hợp tương đồng; ở mức mARN bằng cách sử dụng các
ribozyme hoặc bằng liệu pháp biên tập phân tử ARN.

Phương pháp chuyển gen

 3

Phương pháp này dựa trên nguyên lý như sau: một đột biến lặn mất chức năng ở một gen đơn lẻ, khi
bổ sung một bản sao gen bình thường (kiểu dại) vào trong tế bào, thì tế bào sẽ lấy lại được chức năng bình
thường và làm giảm kiểu hình do gen bệnh. Hai chiến lược đưa gen bình thường vào cơ thể được sử dụng:

• Ex vivo: đưa gen bình thường vào một quần thể tế bào được phân lập và nuôi cấy từ cơ thể một
người bệnh; sau đó, quần thể tế bào mang bản sao gen bình thường được đưa trở lại cơ thể người
bệnh.
• In vivo: gen bình thường được đưa trực tiếp vào vị trí tế bào, mô hoặc cơ quan bị bệnh trên cơ thể
người bệnh.

Tuy khái niệm này đơn giản, nhưng các phương pháp chuyển gen lại dẫn tới nhiều khó khăn ở khía
cạnh lâm sàng. Ví dụ, cả hai phương pháp ex vivo và in vivo đều cần có hai yếu tố chủ chốt: (i) một phức
hệ biểu hiện gen, bao gồm một trình tự gen kiểu dại và một vài trình tự ADN đi kèm nhằm giúp cho sự
biểu hiện gen này trong các tế bào người; và (ii) một phương tiện chuyển gen (gọi là các vector chuyển
gen) với mục đích đưa được gen kiểu dại này vào trong các tế bào. Phương tiện chuyển gen nói trên có
thể là một yếu tố gen kiểu dại mang qua màng phospholipid kép của tế bào, hoặc là một sản phẩm từ vi
rút. Một số ví dụ về các thử nghiệm chuyển gen lâm sàng và các hệ thống chuyển gen tương ứng đã được
sử dụng trong đó, bao gồm việc chuyển gen mã hóa yếu tố VIII (F8) vào các nguyên bào sợi để chữa trị
bệnh ưa chảy máu A, chuyển gen CFTR vào biểu mô mũi và khí quản đểu chữa bệnh xơ nang, chuyển gen
ornithine transcarbamylase (OTC) vào gan để chữa trị chứng khuyết transcarbamylase, chuyển gen
glucocerebrosidase (GBA) vào máu và tủy xương để chữa bệnh Gaucher’s, và chuyển gen ά1-antitrypsin
(SERPINA1) để chữa thiếu hụt ά1-antitrypsin.

Liệu pháp gen Ex vivo:

‣ Các tế bào từ người bệnh được phân lập và nuôi cấy in vitro; sau đó, gen trị liệu được chuyển
vào trong các tế bào đang sinh trưởng này. Các tế bào bị biến nạp được lựa chọn, nhân lên và
đưa trở về cơ thể người bệnh;
‣ Việc sử dụng các tế bào đồng thể này tránh được sự đào thải do hệ miễn dịch của người bệnh
khi đưa các tế bào này vào cơ thể.
‣ Các tế bào bắt nguồn từ cơ thể người bệnh được bổ cứu và sinh trưởng trong điều kiện nuôi cấy
trước khi được đưa trở lại cơ thể người bệnh đó.
‣ Phương pháp này được sử dụng đối với các tế bào máu và tế bào da; các mô được tách ra từ cơ
thể người bệnh, sau đó, được sửa chữa về di truyền bên ngoài cơ thể, rồi mới được đưa trở lại cơ
thể người bệnh. Tại đó, các mô này được ghép vào cơ thể và sống sót trong thời gian dài.

Liệu pháp gen In vivo

‣ Liệu pháp gen in vivo bao gồm việc gen đã được tạo dòng được trực tiếp chuyển vào trong mô
và tế bào của cơ thể người bệnh.
 4

‣ Quá trình này được thực hiện trong trường hợp các tế bào từ mô của người bệnh không thể được
nuôi cấy in vitro do chúng không thể sinh trưởng đạt tới số lượng tế bào đủ để được đưa lại vào
cơ thể người bệnh, hoặc vị trí cơ thể của người bệnh khi các tế bào được nuôi cấy này chuyển
lại vào không có hiệu quả.
‣ Liposom và một số vector virut được sử dụng với mục đích chuyển gen trị liệu trong phương
pháp này vì chúng thiếu cơ chế chọn lọc.
‣ Trong trường hợp sử dụng các vector virut, người ta sử dụng một loại tế bào nuôi cấy; các tế bào
này được gây nhiễm với retrovirus tái tổ hợp in vitro để sản xuất thường xuyên các vector virut
đã được chỉnh sửa. Các tế bào như vậy được gọi là các tế bào sản xuất vector Vector-Producing
cells, VPCs). Các VPC sẽ chuyển các gen tới các tế bào bị bệnh ở xung quanh. Các vector virut
bị loại bỏ những gen độc tính, và chỉ những gen cần thiết cho quá trình nhân lên và gây nhiễm
tế bào mới được giữ lại.
Hiệu quả chuyển gen và biểu hiện của gen chuyển sẽ quyết định sự thành công của phương pháp gen
trị liệu.
Bảng 1: Sự khác nhau trong gen trị liệu ex vivo và in vivo

In vivo Ex vivo
Ít xâm lấn Xâm lấn nhiều
Kỹ thuật đơn giản Kỹ thuật phức tạp
Dùng vector chuyển gen một cách trực tiếp Không có vector chuyển gen trực tiếp
Khó khăn trong kiểm tra tính an toàn của phương Có thể kiểm tra tính an toàn của phương pháp
pháp
Khó khăn trong khống chế các tế bào đích Có thể khống chế các tế bào đích

Vector được sử dụng trong gen trị liệu

Có hai loại vector và nhóm các phức hệ chuyển gen thường được sử dụng trong gen trị liệu: vector virut,
vector tổng hợp và phức hệ chuyển gen.

Vector vi-rút
Ưu điểm của vector vi-rút là thuận lợi cho việc đưa gen vào tế bào, còn nhược điểm là tồn tại nhiều
tranh cãi do có thể gây ra các hiệu ứng khi sự nhiễm vi-rút có thể dẫn tới tổn thương tế bào hoặc gây ung
thư. Bên cạnh đó, các vector vi-rút chỉ mang được những đoạn gen ngoại lai có kích thước hữu hạn, việc
nuôi cấy vi-rút và thu nhận vector cũng có giá thành cao hơn so với vector plasmid. Thu nhận vector vi-
rút cần thực hiện các bước: (i) xác định trình tự cần cho việc nhân bản hạt vi-rút; (ii) xác định cấu trúc hạt
vi-rút; (iii) quy trình đóng gói bộ gen vi-rút, và (iv) cách phóng thích của gen ngoại lai và tế bào chủ.
Vector tổng hợp
 5

Bản chất của vector tổng hợp được sử dụng trong gen trị liệu là một phân tử plasmid mang được đoạn
gen lớn. Ưu điểm của vector plasmid là mang được gen trị liệu vào tế bào mà không phát sinh nguy cơ
đột biến và dễ dàng được sản xuất với số lượng lớn. Ngoài ra, các plasmid chuyển gen trị liệu được chèn
thêm một promoter (thường sử dụng promoter vi-rút) để gen chèn được phiên mã trong tế bào chủ. Vector
plasmid thường được biến nạp vào tế bào vi khuẩn và lưu giữ cho sự cải biến về sau trong quá trình trị
liệu gen.
Bảng 2: Các vector được sử dụng trong chuyển gen.

Vector virut Vector tổng hợp, phức hệ chuyển gen

Adenovirus Phức lipid

Retrovirut Liposom

Adenovirus kết hợp (AAV) Peptid/ protein

Lentivirus Các polymer

Vaccinia virus

Herpes simplex virus

Một số phương pháp cơ học được sử dụng để chuyển gen trực tiếp vào tế bào: biến nạp bằng điện,
sử dụng súng bắn gen.

Phức hệ chuyển gen

Ba phức hệ chuyển gen thường được sử dụng, bao gồm: liposom, lipoplex, và đạn sinh học.

− Liposom là một màng kép lipid bao quanh một hạt nước và có thể chứa nhiều loại chất, bao gồm
ADN và plasmid. Bề mặt ngoài của liposom có thể được gắn them protein hoặc oligosaccharide,
nhờ đó, giúp phức này định hướng chuyển gen tới tế bào đích, làm tang tính đặc hiệu trong chuyển
gen. Ưu điểm của phức chuyển gen này là sự dung hợp phức với màng sinh chất để phóng thích
gen vào tế bào.
− Phức lipoplex là cấu trúc gồm ADN dính với một phân tử lipid hay oligomer tích điện dương.
Toàn bộ cấu trúc tích điện dương, sau đó, được đưa vào tế bào bằng hình thức thực bào. Phức
chuyển gen này có ưu điểm: bảo vệ plasmid và chỉ cần lượng ADN nhỏ, gây đáp ứng miễn dịch
tốt nhờ vận chuyển theo cơ chế thực bào (ưu thế trong chế tạo vắc-xin ADN), có thể xâm nhập tốt
vào tế bào do kích thước nhỏ và qua nhiều con đường (niêm mạc mũi, miệng), và cấu trúc ổn định
ở dạng đông khô.
− Đạn sinh học (súng bắn gen) là kỹ thuật chuyển gen vào tế bào đơn lẻ thông qua việc ADN được
hấp phụ trên bề mặt đạn kim loại với đường kính từ 0,6 µm đến 2 µm. Các hạt đạn gắn ADN được
phóng vào tế bào thông qua súng bắn gen và xuyên qua da nhờ helium ở áp suất cao. Ưu điểm của
kỹ thuật là có hiệu suất chuyển gen cao do gen được đưa trực tiếp vào bên trong tế bào đích, do
đó, cấu trúc biểu hiện gen không bị phân hủy.
 6

Trị liệu gen đối với tế bào soma

Hình 1a mô tả một hệ thống biểu hiện gen điển hình. Một gen nguyên bản (được gọi là gen chuyển)
có một trình tự khởi động phiên mã (promoter) gắn vào đầu 5’ của gen, giúp gen được nhận biết bởi bộ
máy phiên mã của tế bào, và một chuỗi tín hiệu poly-adenin hóa ở đầu 3’, giúp hình thành đuôi polyA và
làm ổn định cấu trúc của sản phẩm mARN từ gen này. Các phương pháp hiện đại thường dùng ADN bổ
sung (cADN) của gen kiểu dại này, do nó không chứa các trình tự intron. Hình 1b đến 1f mô tả một vài
phương pháp chuyển gen khác nhau. Mỗi hệ thống chuyển gen có một hệ thống biểu hiện phù hợp và tiềm
năng lớn nhất của riêng nó về khía cạnh kích cỡ gen được chuyển (transgene) mà vector có thể mang theo.
Để chuyển gen một cách thành công, cả hai loại vector là màng lipid kép hoặc vi-rút cải biến đều phải
thuận lợi đi vào tế bào thông qua việc xâm nhập qua màng sinh chất của tế bào đích, sau đó, chúng phải
cho phép cassette biểu hiện đi vào bên trong nhân tế bào, sau đó được phiên mã thành sản phẩm mARN.
Một khi đã vào trong nhân tế bào, cassette biểu hiện gen chèn có thể được gắn xen vào hệ gen của tế bào
hoặc tồn tại trong dịch nhân nhưng tách biệt với nhiễm sắc thể. Điều này tùy thuộc vào loại vector chuyển
gen. Nếu gen được chuyển chèn vào vào NST, gen này sẽ được biểu hiện ngay sau đó. Nhưng cơ chế gen
được chèn của vào vị trí ngẫu nhiên trên NST cũng gây nên một số vấn đề, ví dụ gây ung thư trong trường
hợp gen chuyển được chèn vào và gây ra hậu quả phá vỡ chức năng của gen khác. Mặt khác, nếu vector
biểu hiện gen tồn tại ngoài NST, thì sự biểu hiện của gen mong muốn có thể bị mất đi do sự phân bào.
Một khó khăn khác trong sử dụng vector biểu hiện là tính cân bằng trong mức độ biểu hiện của gen
được chuyển. Tính chất biểu hiện phải được duy trì ở mức độ đủ cao để bổ cứu kiểu hình do gen bệnh gây
nên, nhưng nó cũng phải được duy trì ở mức đủ thấp để ngăn ngừa cơ chế đáp ứng miễn dịch trong cơ thể
người bệnh.
Tác động tới ARN để chữa bệnh di truyền do gen trội

Các phương pháp chuyển gen đặc biệt hữu dụng khi một đột biến liên quan tới bệnh lý mã hóa cho
một protein mất chức năng, gọi là đột biến mất chức năng; trong trường hợp này, chức năng tế bào bình
thường được khôi phục khi một bản sao gen kiểu dại tương ứng được đưa vào tế bào, do các đột biến mất
chức năng thường là gen lặn. Tuy nhiên, một số bệnh di truyền ở người lại do đột biến gen trội gây nên
và những gen này thường mã hóa cho các enzym hoạt hóa quá mức, loại đột biến này được gọi là đột biến
tăng chức năng. Hơn nữa, một vài bệnh di truyền ở người cũng có thể liên quan tới các đột biến gen trội,
trong đó, các protein bị đột biến gây suy giảm chức năng của các protein kiểu dại, được gọi là các đột biến
âm tính trội.
 7

Hình 1: Các vector chuyển gen dùng trong điều trị các bệnh do rối loạn di truyền. Hình 1a mô phỏng cấu trúc của một
cassette biểu hiện điển hình. Các hình 1b – 1f mô tả năm nhóm vector chuyển gen được dùng trong điều trị các bệnh
do rối loạn di truyền (theo O'Connor, T. P. & Crystal, R. G. (2006), “Genetic medicines: treatment strategies for hereditary
disorders”. Nature Reviews Genetics, 7, 266).

Trong trường hợp một đột biến gen trội, việc đưa một gen kiểu dại tương ứng vào tế bào có thể không
đủ để khắc phục các kiểu hình gen bệnh; tuy nhiên, các nhà nghiên cứu lại ưu tiên “tắt” sự biểu hiện của
gen đột biến này, hoặc ngăn chặn chức năng của protein đột biến mà gen đột biến này mã hóa. Để đạt
được mục đích trên, các nghiên cứu đã chuyển sự chú ý sang các phương pháp sử dụng ARN, theo đó, đối
tượng nghiên cứu là phân tử ARN (cả phân tử mARN tiền thân, pre-mARN, và mARN hoàn thiện) được
 8

phiên mã từ một gen đột biến âm tính đã biết và protein đột biến của gen này cũng được ngăn chặn biểu
hiện một cách hiệu quả.
ARN nhiễu là việc sử dụng các phân tử ARN mạch kép (dsRNA) thường có độ dài 22 cặp base, tương
ứng với một vùng trên trình tự gen đích (Hình 2b). Phân tử ARN mạch kép này được biến đổi khi đi vào
trong tế bào theo một con đường chuyển hóa với kết quả là, nó trở thành một phần của phức hệ cảm ứng
ARN làm câm biểu hiện gen (RNA-Induced Silencing Complex, RISC), cuối cùng, phức hệ này sẽ nhận
biết mARN đích và phân hủy sợi mARN đó.

Hình 2: Các chiến lược cải biến ARN được ứng dụng trong di truyền y học. Năm phương pháp sử dụng ARN được
cải biến: (a) các oligo nucleotid đối nghĩa (AntiSense Oligonucleotides, ASO), (b) ARN gây nhiễu (RNAi), (c) ghép
khác phân tử (trans-splicing), (d) ghép các đoạn khác phân tử (segmental trans-splicing), và (e) các ribozym (theo
O'Connor, T. P. & Crystal, R. G. (2006), “Genetic medicines: treatment strategies for hereditary disorders”, Nature Reviews
Genetics, 7, 270).

Trans-splicing (ghép khác phân tử) là phương pháp chuyển gen tác động vào đối tượng pre-mARN.
Phân tử pre-mARN này mang một đột biến trong các exon của nó liên quan tới bệnh (Hình 2c). Việc
chuyển gen nhằm mục đích thay mỗi exon mang đột biến gen bệnh (exon C* trong hình 2c) bằng một bản
sao của exon kiểu dại (gen bình thường). Cấu trúc gen được chuyển bao gồm một vùng lai, vùng này có
trình tự bổ sung với một intron nằm kế bên đầu 5’ ở giữa vị trí cho và điểm phân nhánh của ghép nối ARN,
tiếp đến là vị trí cắt điểm phân nhánh, vị trí nhận sau khi cắt intron ở điểm phân nhánh, trình tự exon kiểu
 9

dại, và phần còn lại của gen. Sự ghép khác phân tử có kết quả là sự sản xuất một bản sao gen bình thường
của phân tử mARN trưởng thành và nhờ đó, tạo thành sản phẩm protein bình thường tương ứng.
Phương pháp ghép các đoạn khác phân tử được dùng để thu thập các hạn chế về kích thước liên kết
tới các phương pháp chuyển gen dùng các vector (có lúc, một trình tự cADN nào đó có kích thước quá
lớn đối với phương tiện mang là một vector vi rút riêng lẻ). Trong những trường hợp đó, gene chuyển sẽ
được phân chia thành các mảnh nhỏ hơn, chúng được chuyển cùng nhau bằng cách sử dụng hai vector
chuyển gen tách biệt (Hình 2d). Vector mang mảnh gen thứ hai có một vùng lai bổ sung với một intron
nằm ở đầu cuối 3’ của mảnh gen chuyển thứ nhất, phần gen này giống với cấu trúc chuyển gen bằng
phương pháp ghép khác phân tử. Trong phương pháp này, ghép khác phân tử dẫn tứi sự sản xuất một phân
tử mARN trưởng thành mã hóa cho trình tự đầy đủ của một protein kiểu dại mà chúng ta mong muốn.
Các ribozym là các phân tử ARN có tiềm chất xúc tác, nhằm nhật biết một phân tử mARN đặc trưng
và cắt phân tử đó (Hình 2e). Các ribozym bao gồm một vùng lai có motif của một ribozym thủy phân
nucleotid và có khả năng nhận biết được một trình tự mARN đích; sử dụng trình tự gen kiểu dại tương
ứng để cắt có chọn lọc một mARN đích mang một đột biến nằm sau vị trí cắt của ribozym này. Một khi
gen đích bị cắt, motif lai có nguồn gốc ribozym sẽ gắn vào, và sự cắt – nối ARN dẫn tới sự hình thành
một bản sao kiểu dại của mARN trưởng thành đó.
Nhiều chiến lược chuyển gen sử dụng ARN đã được phát triển trong những năm gần đây, nhưng còn nhiều
câu hỏi mở về các cơ chế trong tế bào liên quan tới việc cải biến mARN đích. Ngoài ra, các nhà nghiên
cứu cần phải thử nghiệm cẩn thận về tính đặc hiệu của bất cứ một phương pháp nào nhằm vào đối tượng
là mARN để đảm bảo chỉ trình tự mARN đích mới bị ảnh hưởng.

Bảng 3. Các phương pháp chuyển gen trong gen trị liệu tế bào soma*
Hiệu quả Thời gian biểu
Phương pháp Ứng dụng Chọn lọc mô
chuyển nạp hiện
Liposom, lắng Ex vivo Tạm thời
Hóa học không Thấp
Ca-phosphate In vivo Bền
Vật lý Vi tiêm Ex vivo
không Trung bình Tạm thời
Biến nạp điện In vivo
Không virut: Thấp – trung
Sinh học có Tạm thời
phối tử/thụ thể Ex vivo bình
Virut: retro-; In vivo Tạm thời
Một số Trung bình- cao
adeno-, AAV Bền

* theo Nonviral Gene transfer system in somatic gene therapy, O. Kayser (2004).

Gen trị liệu trong lâm sàng

(1) Gen trị liệu In vivo điều trị bệnh suy giảm miễn dịch kết hợp nặng- chứng thiếu adenosine
deaminase (ADA) sử dụng vector retrovirus;
(2) Gen trị liệu In vivo điều trị đột biến gen lặn (mất chức năng) đối với người bệnh xơ nang (CF);
 10

(3) Gen trị liệu In vivo điều trị khối u não: sử dụng tiền dược gancyclovir không độc, gây độc in situ
với các tế bào được gây nhiễm Hs-Tk bên trong khối u;
(4) Gen trị liệu ex vivo điều trị suy giản miễn dịch kết hợp nặng SCID- ADA.

Hình 3: Gen trị liệu khối u gancyclovir sử dụng vector retrovirus chuyển gen Hs-Tk.

(5) Gen trị liệu HIV: gendicine, ức chế mARN virut.

(6) Gen trị liệu ex vivo antisense ARN điều trị các bệnh sai hỏng di truyền về máu, sử dụng retrovirus.

(7) Gen trị liệu kết hợp liệu pháp tế bào gốc.
 11

Hình 4: Sử dụng vector retrovirus điều trị bệnh về máu trong liệu pháp gen ex vivo.

Khả năng ứng dụng của gen trị liệu

1. Các thiếu hụt miễn dịch
Một vài bệnh thiếu hụt miễn dịch di truyền có thế được chữa trị thành công bằng liệu pháp gen. Phổ
biến nhất, các tế bào gốc máu được phân tách khỏi người bệnh, được vector retrovirus thay thế bản sao
gen sai hỏng. Sau khi đã chuyển gen thành công, các tế bào gốc này lại được đưa trở lại cơ thể người bệnh.
Do các tế bào được xử lý bên ngoài cơ thể người bệnh, vector virut mang gen sửa chữa chỉ được chuyển
nạp vào tế bào đích.
Bệnh suy giảm miễn dịch kết hợp nặng (SCID) là sai hỏng di truyền đầu tiên được chữa trị thành
công bằng liệu pháp gen. Tuy nhiên, ca thử nghiệm lâm sàng đầu tiên dừng lại khi vector virut cảm ứng
gây nên bệnh ung thư máu ở một số người bệnh. Từ đó, các nhà khoa học tái khởi động thử nghiệm lâm
sàng với các vector chuyển gen an toàn và ít khả năng gây ung thư hơn.
Bệnh khuyết adenine deaminase (ADA) là một sai hỏng di truyền khác ở hệ miễn dịch, cũng được
điều trị khỏi nhờ liệu pháp gen. Trong nhiều các thử nghiệm lâm sàng nhỏ, tách và thu nhận các tế bào
gốc tạo máu của người bệnh, chuyển nạp các vector retrovirus mang bản sao bình thường của gen mã hóa
cho ADA vào các tế bào đó, kế tiếp, chuyển các tế bào đã được chuyển nạp thành công trở lại vào cơ thể
bệnh nhân. Đối với nhiều trường hợp người bệnh trong các thử nghiệm này, chức năng hệ miễn dịch được
cải thiện, đó là họ không cần phải tiếp tục tiêm enzym ADA vào cơ thể nữa; và quan trọng nhất là, không
ai trong số đó khởi phát bệnh máu trắng. Năm 1990, một vector retrovirus- LASN, từ Murine leukemia
 12

virus (MuLV) - được sử dụng trong gen trị liệu ADA. Một đoạn cADN của gen dài 1,5 kb mã hóa cho
ADA được cài xen vào vector virut, nằm xuôi dòng với promoter virut ở trình tự LTR (Long Terminal
Repeat). Một gen đánh dấu neob do promoter của Simian virus SV 40 điều khiển. Sử dụng các tế bào tạo
vỏ PA317 để đóng gói vector LASN. Các tế bào lympho T được phân tách từ hai bệnh nhân và nuôi trong
môi trường bổ sung interleukin-2. Chuyển nạp vector virut đã chuẩn bị ở trên vào các tế bào này với hiệu
suất từ 0.1 đến 10%; vừa theo dõi quá trình vừa bổ sung thêm vector. Các tế bào đã biến nạp được rửa với
albumin 0.5% trước khi chuyển trở lại vào cơ thể người bệnh. Hai năm sau trị liệu gen, gen mới vẫn được
duy trì biểu hiện. Cho tới nay, liệu pháp gen vẫn được sử dụng cho điều trị SCID.
2. Bệnh mù di truyền
Một số bệnh mù do di truyền đang được áp dụng gen trị liệu- đặc biệt là dạng mù do sự thoái hóa tế
bào, các bệnh nhân mất dần các tế bào cảm giác ánh sáng ở mắt của họ. Các kết quả đáng khích lệ trên
mô hình động vật thí nghiệm (trên chuột nhắt, chuột cống, và chó) cho thấy tiềm năng làm chậm hoặc
thậm chí đảo ngược sự mất này.
Mắt là bộ phận dễ tiếp cận với liệu pháp gen. Võng mạc, tạo phần nằm trong mắt, đều dễ dàng để tiếp
cận và phần nào thoát khỏi sự bảo vệ của hệ miễn dịch. Và các virut không thể di chuyển từ mắt sang các
phần cơ thể khác. Hầu hết các vector gen trị liệu ở mắt đều dựa trên cơ sở AAV.
Trong một thử nghiệm cỡ nhỏ bao gồm các bệnh nhân bị mù do thoái hóa tế bào võng mạc, LCA
(Leber Congenital Amaurosis), gen trị liệu cải thiện lớn tầm nhìn trong vòng ít nhất vài năm tiếp đó. Tuy
nhiên, việc điều trị không làm ngừng diễn biến thoái hóa ở tế bào võng mạc. Trong một thử nghiệm khác,
6 trên 9 bệnh nhân với bệnh thoái hóa choroiedermia đã cải thiện được tầm nhìn sau khi virut chuyển một
bản sao bình thường của gen REP1 vào cơ thể.
3. Bệnh ưa chảy máu
Người mắc bệnh ưa chảy máu thiếu hụt các protein tạo cục máu đông. Những người ở thể bệnh nặng
có thể làm mất một lượng máu lớn do chảy máu trong hoặc thậm chí do một vết cắt nhỏ.
Trong một thử nghiệm quy mô nhỏ, nhà khoa học đã thành công trong sử dụng một vector AAV để
đưa gen mã hóa cho yếu tố IX, và người bệnh đã giảm chảy máu.
4. Các bệnh về máu
Các bệnh nhân mắc β-thalassemia có gen β-globin sai hỏng, mã hóa cho một protein vận chuyển oxy
trong các tế bào hồng cầu. Do khiếm khuyết ở gen nói trên, các bệnh nhân không có đủ các tế bào hồng
cầu để vận chuyển oxy tới toàn bộ mô trong cơ thể. Nhiều người mắc rối loạn di truyền này phải phụ thuộc
vào truyền máu để sống sót. Năm 2007, một bệnh nhân tiếp nhận liệu pháp điều trị bằng gen cho
thalassemia thể nặng. Các tế bào máu được phân tách từ tủy xương người bệnh này được chuyển nạp với
vector retrovirus để đưa một bản sao gen β-globin bình thường vào trong tế bào. Các tế bào gốc đã gây
nhiễm thành công được truyền trở lại cơ thể người bệnh, tại đó, chúng tăng sinh và tăng số lượng tế bào
máu khỏe mạnh. Bảy năm sau quy trình chuyển gen, người bệnh này sống khỏe mạnh mà không cần phải
truyền máu.
 13

Phương pháp điều trị tương tự cũng được sử dụng cho người bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm.
5. Rối loạn chuyển hóa chất béo
Năm 2012, Glybera trở thành thuốc gen trị liệu sử dụng virut đầu tiên được thông qua tại châu Âu.
Thuốc điều trị này sử dụng một AAV để chuyển một bản sao gen LPL (Lipoprotein lipase) bình thường
vào các tế bào cơ. Gen LPL mã hóa cho một protein phân giải các chất béo, ngăn chặn các nồng độ chất
béo tăng cao tới các liều gây độc.
6. Ung thư
Một số phương pháp điều trị hứa hẹn sử dụng gen trị liệu đang được phát triển trên đối tượng bệnh
nhân ung thư. Thứ nhất, một phiên bản cải biến của HSV-1 (thường gây mụn giộp) đã cho thấy hiệu quả
chống lại ung thư sắc tố da- melanoma (một loại ung thư da) đang lan rộng trên cơ thể. Thuốc trị liệu này,
được gọi là T-VEC, sử dụng một vi-rút đã cải biến để (1) nó sẽ không gây giộp miệng; (2) chỉ diệt các tế
bào ung thư, thay vì các tế bào khỏe mạnh; và (3) tạo ra các tín hiệu hấp dẫn các tế bào miễn dịch trong
toàn bộ cơ thể của chính người bệnh. Vi-rút này được tiêm trực tiếp vào các vị trí khối u của người bệnh.
Nó nhân lên (tạo ra nhiều bản sao vi-rút) bên trong các tế bào khối u cho tới khi phá vỡ tế bào, giải phóng
nhiều vi-rút hơn và có thể gây nhiễm vào các tế bào khối u.
Một phương pháp điều trị khác được sử dụng trên 59 bệnh nhân mắc bệnh máu trắng, một loại ung
thư máu. Tách lấy các tế bào miễn dịch của từng người bệnh, nuôi và gây nhiễm các tế bào này bằng virut
đã được cải biến để nhận biết một protein trên bề mặt các tế bào ung thư. Sau khi các tế bào miễn dịch đã
gây nhiễm được đưa trở lại cơ thể người bệnh, 26 người đã khỏi bệnh hoàn toàn.
7. Bệnh Parkinson’s
Bệnh nhân mắc Parkinson’s thường dần dần mất đi tế bào trong não bộ sản sinh phân tử tín hiệu
dopamine. Khi bệnh tiến triển, người bệnh mất khả năng điều khiển các vận động của mình. Một thử
nghiệm lâm sàng trên số ít các bệnh nhân mắc Parkinson’s đã được điều trị bằng một vector retrovirus
mang ba gen vào các tế bào tại một vùng nhỏ trong não bộ. Các gen này mang lại cho các tế bào bình
thường không sản sinh dopamine khả năng sản sinh dopamine. Sau quá trình điều trị, tất cả người bệnh
trong thử nghiệm đều cải thiện khả năng điều khiển vận động.
8. Bệnh cholesterol cao có yếu tố gia đình
Bệnh cholesterol cao có yếu tố gia đình là một bệnh di truyền, do đột biến ở nhiễm sắc thể 19 gây
nên. Biểu hiện bệnh là mức LDL (Low-Density Lipoprotein) tăng dần, dẫn tới các bệnh về động mạch
chủ, thậm chỉ ở lứa tuổi rất sớm.
Nguyên nhân bệnh do khiếm khuyết gen mã hóa cho thụ thể LDL. Các thụ thể sai hỏng chức năng
làm giảm chuyển hóa cholesterol, ở các thể dị hợp, số thụ thể chỉ còn một nửa so với ở người bình thường,
trong khi ở thể đồng hợp lặn, số lượng thụ thể chỉ còn 0 – 20%.
Người bệnh đầu tiên được điều trị trong thử nghiệm lâm sàng có kiểu gen đồng hợp về alen đột biến
mã hóa cho thụ thể LDL. Phương pháp điều trị là ex vivo. Các tế bào gan từ một mảnh gan của người bệnh
 14

được phân tách. Một vector retrovirus mang bản sao gen mã hóa cho thụ thể LDL bình thường được gây
nhiễm vào các tế bào gan. Gen này hoạt động nhờ promoter của gen β-actin từ gà và đoạn trình tự khuếch
đại từ Cytomegalovirus. Vector retrovirus mang bản sao gen bình thường được gây nhiễm vào các tế bào
gan, các tế bào mang gen được sàng lọc và kiểm tra khả năng thu nhận vector dựa trên tín hiệu gắn nhãn
huỳnh quang ở gen mã hóa LDL.
Sau đó, các tế bào gan đã chuyển nạp được đưa lại vào cơ thể người bệnh. Mức LDL giảm dần trong
khi mức HDL tăng dần. Ngoài ra, hiệu quả lovastatin, trước liệu pháp gen không xảy ra, lại được biểu
hiện. Lovastatin ức chế 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzym A (HMGR), ngăn cản sự tổng hợp
megalonate, một tiền chất của cholesterol. Hiệu quả gen trị liệu này kéo dài 2,5 năm mà không xảy ra đáp
ứng miễn dịch nào so với sử dụng một gen tái tổ hợp. Sử dụng gen trị liệu ex vivo trên đối tượng các bệnh
nhân khác cũng tạo ra hiệu quả khả quan tương tự.
Như vậy, gen trị liệu là một công cụ đầy hứa hẹn trong điều trị ung thư, sửa chữa các sai hỏng di
truyền, và các bệnh nhiễm trùng. Mặc dù còn ở giai đoạn sớm nhưng vẫn đầy tiềm năng mở rộng các điều
trị hiệu quả đối với các bệnh dường như không thể chữa được.

References
1. Cavazzano-Calvo, M. (2010). Transfusion independence and HMGA2 activation after gene therapy of human
beta-thalassaemia. Nature 467, 318-322. doi:10.1038/nature09328
2. Cideciyan, A.V. et al (22 January 2013). Human retinal gene therapy for Leber congenital amaurosis shows
advancing retinal degeneration despite enduring visual improvement. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, Earline Online Publication. doi: 10.1073/pnas.1218933110
3. MacLaren, R.E. et al (16 January 2014). Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings
from a phase 1/2 clinical trial. The Lancet, Early Online Publication. doi:10.1016/S0140-6736(13)62117-0
4. Nathwani, A.C. (2011). Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New
England Journal of Medicine, 365(25), 2357-2365.
5. Nienhuis, A.W. (2013). Development of gene therapy for blood disorders: an update. Blood 122(9), 1556-1564.
doi: 10.1182/blood-2013-04-453209
6. Palfi, S. et al (10 January 2014). Long-term safety and tolerability of ProSavin, a lentiviral vector-based gene
therapy for Parkinson's disease; a dose escalation, open-label, phase 1/2 trial. The Lancet, Early Online
Publication. doi: 10.1016/S014006736(13)61939-X
7. Penn Medicine (7 December 2013). Penn medicine team reports findings from research study of first 59 adult
and pediatric leukemia patients who received investigational, personalized cellular therapy CTL019. Retrieved
from http://www.uphs.upenn.edu/news/News_Releases/2013/12/ctl019/
8. Persons, Derek A. (2010). Gene therapy: Targeting beta-thalassaemia. Nature 467, 277-278. doi:
10.1038/467277a.

9. Petrs-Silva, H. & R. Linden (2014). Advances in gene therapy technologies to treat retinitis pigmentosa. Clinical
Opthalmology 2014(8), 127-136. doi: 10.2147/OPTH.538041.
 15

Câu hỏi lượng giá

1. Nêu nguyên lý của trị liệu gen. Trình bày phương pháp được sử dụng trong trị liệu gen.
2. Nêu ưu/ nhược điểm gen trị liệu tế bào dòng sinh dục và dòng soma.
3. Nêu tên và đặc điểm các vector được sử dụng trong gen trị liệu (những ưu/ nhược điểm):
− Retrovirus
− Adenovirus
− Adeno-associated virus (AAV)
− Vector tổng hợp
4. Liệu pháp gen in vivo và ex vivo: So sánh kỹ thuật tiến hành, hiệu quả trị liệu.
5. Phân tích một ví dụ về liệu pháp gen điều trị rối loạn di truyền đơn gen.
6. Trình bày các bước sản xuất sản phẩm dược dụng bằng liệu pháp gen. Phân tích một ví dụ minh họa?
7. Trình bày nguyên lý sử dụng gen trị liệu sử dụng phân tử ARN. Nêu hướng ứng dụng của liệu pháp gen
sử dụng ARN ?