Professional Documents
Culture Documents
BT Amino Acid Peptide
BT Amino Acid Peptide
B. Nội dung
I. AXIT AMIN
1
I.1. Gọi tên. Các axit amin có danh pháp hệ thống nhưng chúng ta thường tránh gọi tên hệ thống
mà hay dùng tên gọi cũ phổ biến. Bản thân thuật ngữ gốc “axit amin” là viết tắt cho axit α-amin.
Chúng có nhóm amino nằm ở cacbon-α kề bên cacbon cacboxylat và đây là sự khác biệt của axit α-
amin với các hợp chất ít quan trọng hơn là các đồng phân-β và γ- (H. 23.1).
Theo một hệ thống gọi tên khác, chúng ta dùng số “2” thay cho “α”, và gọi tên axit α-amin
như thành viên của dãy các axit cacboxylic với nhóm amino thế ở vị trí 2 (H. 23.2).
Trên thực tế, rất ít khi dùng tên hệ thống, và tên thông thường được giữ nguyên cho hầu hết
các phân tử này. Các nhà sinh học có xu hướng xem axit amin như là dẫn xuất thế của axit α-
aminoaxetic. Lưu ý, nếu R≠H thì các axit amin sẽ có cacbon tâm lập thể (H. 23.3).
Hình 3 Phần lớn các axit α-amin đều chứa cacbon lập thể.
Ngoài ra, người ta cũng xây dựng các mã số gồm ba chữ cái cho các axit amin, và chúng
được dùng rất phổ biến, đặc biệt khi miêu tả tập hợp các axit amin dưới dạng polime như polipeptit
hoặc các ví dụ đặc biệt lớn như protein. Ranh giới giữa các peptit nhỏ hơn, hay “polipeptit” và
protein lớn hơn luôn luôn không rõ ràng và không xác định. Và đôi khi các thuật ngữ này được dùng
hoán đổi cho nhau. Gần đây nhất, các kí hiệu gồm một chữ cái cũng bắt đầu được sử dụng. Bảng
2
23.1 tập hợp 20 axit α-amin, đưa ra tên thông thường, kí hiệu và đối chiếu các tính chất vật lí của
chúng. Lưu ý, nhóm R bao gồm từ các mạch hidrocacbon đơn giản đến các nhóm phức tạp có tính
axit hoặc bazơ.
2.a Cấu trúc của axit amin. Chỉ ngoại trừ prolin là amin bậc hai, còn 19 axit amin còn lại đều là
amin bậc một (H.23.4). Tất cả các axit amin có tầm quan trọng về sinh học (trừ glyxin không quang
hoạt) đều có cấu hình (S). Có nhiều axit amin được tìm thấy trong tự nhiên nhưng phần lớn chúng
không giữ vai trò quan trọng về mặt hóa sinh của con người. Tại sao? Đây là câu hỏi hay nhưng
không có câu trả lời. Có phải (S) axit amin được tạo ra trước, rồi sau đó nó quyết định đặc tính
quang hoạt của tất cả các axit amin còn lại tạo thành sau đó? Có phải đây là sự ưu tiên cho cấu hình
(S) chứ không phải là kết quả của một vài sự tình cờ ban đầu? Không ai biết. Nếu đây là sự ngẫu
nhiên thì một ngày nào đó chúng ta có thể gặp ở đâu đó một nền văn minh có axit amin với cấu hình
(R), cho rằng chúng ta khá may mắn và thông minh để sống đủ lâu đến ngày ấy.
BÀI TẬP GIẢI 1 Vẽ cấu trúc tứ diện ba chiều cho (S) và (R) valin và axit aspartic.
LỜI GIẢI Vẽ hình tứ diện, xác định nhóm ưu tiên (hơn cấp) (Chương 4, tr. 157) và vẽ mũi tên
1→2→3. Nếu mũi tên quay theo chiều kim đồng hồ thì phân tử có cấu hình (R); nếu ngược kim
đồng hồ là (S).
3
Thông thường không biểu diễn axit amin theo cấu hình (S) hay (R), thay vào đó, người ta
dùng hình chiếu Fischer (Chương 22, tr. 1225). Nhóm axit được vẽ ở đỉnh, và giống như ở đường,
các liên kết nằm thẳng là hướng đi xa người quan sát còn các liên kết nằm ngang là hướng về người
qaun sát. Vị trí của nhóm amino ở bên trái hay bên phải quyết định axit amin là D (bên phải) hay L
(bên trái). Như dẫn ra ở Hình 23.5, (S) axit amin đơn giản cũng là L theo cách viết Fischei áp dụng
cho đường.
BÀI TẬP GIẢI 2 Vẽ hình chiếu Fischer cho đồng phân L- của valin và xystein.
LỜI GIẢI Nhắc lại ở hình chiếu Fischer các liên kết nằm ngang là hướng về người quan sát, vòn
các liên kết nằm thẳng là đi xa người quan sát.
Như đã thấy ở từ Bảng 23.1, các axit amin là các chất rắn nóng chảy cao. Điều này có vẻ kì lạ? Các
axit amin phổ biến có trọng lượng phân tử giữa 90 và 150, và trọng lượng phân tử này có vẻ như
không đủ để tạo ra chất rắn. Câu hỏi này hắc búa này sẽ được diễn giải ở Mục 23.c
2.b Tínhh chất axit-bazơ của các axit amin. Tại sao các axit amin lại là chất rắn? Để trả lời câu
hỏi này, ta thử đặt một câu hỏi khác. Những phản ứng nào xẩy ra giữa amin gốc và axit gốc (xem H.
22.6)?
Hình 6 Phản ứng nào xẩy ra giữa hai phân tử
này?
Một axit hữu cơ đơn giản có pKa khoảng 4,5 còn ion ammonium có pKa khoảng 8-10. Amin
và axit phải phản ứng để cho muối ammonium (xem H. 22.7) vì axit cacboxylic là axit mạnh hơn
nhiều so với ion ammonium. Chính xác, một phản như vậy phải xẩy ra trong mỗi phân tử axit amin
để tạo ra “muối nội phân tử” hay zwitterion (ion lưỡng cực), là phân tử cùng tồn tại các điện tích
hoàn toàn dương và âm (H. 23.7).
4
Hình 7 Amin và axit phải tham gia phản ứng axit-bazơ để cho muối của axit.
Ở điềuỞkiện thường,
axit amin cáctácaxit
tương nộiamin
phân là
tử hợp ion, điều
chất phản
của dạng nàytạo
ứng này giảirathích vì sao chúng có điểm
zwitterion.
nóng chảy cao. Các tính chất khác của axit amin cũng phù hợp với nhận định này. Chúng tan được
trong nước, nhưng hoàn toàn không tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực điển hình.
Chúng có moment lưỡng cực cao. Tất nhiên, trạng thái điện tích của một axit amin thùy thuộc vào
pH của môi trường nơi nó có mặt. Dưới điều kiện trung tính, hoặc gần như trung tính chúng sẽ tồn
tại như ion lưỡng cực (xem H. 22.7). Nếu giảm pH, thì cuối cùng anion cacboxylat sẽ bị proton hóa,
và axit amin sẽ tồn tại chủ yếu ở dạng ion ammonium. Ngược lại, nếu tăng pH, thì cuối cùng ion
ammonium sẽ bị deproton hóa (loại proton), còn phân tử sẽ tồn tại như anion cacboxylat (H. 22.8).
BÀI TẬP 3 pKa của một axit hữu cơ đơn giản là 4-5. Tại sao axit amin lại có tính axit cao hơn?
Axit amin có một vài giá trị pKa. Giá trị đầu là qui cho sự deproton hóa nhóm axit, và như
chúng ta thấy ở Bảng 23.1 đối với 20 axit amin phổ biến giá trị này nằm trong khoảng 1,7-2,6.
Giá trị pKa thứ hai là cho sự deproton hóa ion ammonium (+NH3CHRCOOH) và nó nằm trong
khoảng 9-10,8 (Bảng 23.1).
Giá trị pH mà ở đó nồng độ của ion ammonium (+NH3CHRCOOH) bằng nồng độ của ion
cacboxylat (NH2CHRCOO-) được gọi là điểm đẳng điện.
BÀI TẬP .4 Tính pH của điểm đẳng điện của alanin (pKa=2,3 cho COOH và pKa=9,7 cho +NH3).
Gợi ý. Viết biểu thức Ka cho hai cân bằng xẩy ra, sau đó nhân chúng với nhau. Lưu ý ở điểm đẳng
nhiệt nồng độ của +NH3CHRCOOH bằng nồng độ của NH2CHRCOO-).
Ở pH này axit amin chủ yếu ở dạng zwitterions, và số tiểu phân tích điện dương bằng chính
xác số phân tử tích điện âm.
Bảng 23.1 cho thấy nhiều axit amin chứa mạch nhánh có tính axit hoặc tính bazơ. Sự phức tạp này
làm cho việc xác định điểm đẳng điện khó thêm khó hơn. Các nhóm nhánh này cũng tham gia vào
5
phản ứng axit-bazơ nên chúng cũng liên quan đến giá trị pKa. Ví dụ, arginin ở pH rất thấp sẽ bị
proton hóa hai lần
BÀI TẬP 5 Nitơ nào ở nhóm guanidine của arginin sẽ bị proton hóa đầu tiên?
Nhóm có tính axit cao nhất là axit cacboxylic, pKa=2,2. Sau đó là ion ammonium pKa=9,1. Ion
guanidinium có pKa=12,5 và sẽ bị deproton hóa sau cùng khi tăng pH.
BÀI TẬP 6 Nitơ nào của vòng trong histidin sẽ bị proton hóa đầu tiên?
Trên cơ sở của tính chất axit-bazơ này, đã xây dựng một phương pháp phân tách đặc biệt hữu hiệu,
được sử dụng rộng rãi trong phân tích hỗn hợp các axit amin. Phương pháp này gọi là điện di.
Phương pháp này như sau. Một hỗn hợp của các axit amin được cho lên giấy tẩm ướt. Ở pH
cho trước, các axit amin sẽ tồn tại ở hỗn hợp của các ion dương và âm khác nhau. Khi cho một dòng
điện chạy qua giấy, các ion dương sẽ di chuyển đến catôt (cực âm) còn các ion âm sẽ đi về anot (cực
dương) với tốc độ tùy theo pH và cường độ của trường (có thể điều kiển thay đổi), và kích thước và
điện tích thực của axit amin đặc trưng cho mỗi axit amin riêng biệt. Và do các axit amin di chuyển
với tốc độ khác nhau nên chúng được tách ra. Ví dụ, ở pH 5,5 axit amin Lys, Phe và Glu tồn tại ở
dạng như dẫn ra ở Hình 23.10.
6
Hình 10 Trạng thái điện tích của Lys, Phe và Glu ở pH=5,5
Khi cho dòng điện chạy qua, Phe không di chuyển, Lys sẽ chuyển về catot còn Glu về anot
(H. 23.11).
2.c Tổng hợp axit amin. Một phương pháp rất đơn giản là ankyl hóa amoniăc, sử dụng phản ứng
SN2 của ammoniăc với α-haloaxit (H. 23.12).
7
TRƯỜNG HỢP CỤ THỂ
Hình 23.12 Ankyl hóa đơn giản α-haloaxit sẽ cho α-axit amin.
BÀI TẬP 7 Viết các phản ứng tổng hợp các α-brômo axit sau xuất phát từ ancol không quá bốn
cacbon và các chất vô cơ cần thiết (tr. 1012).
BÀI TẬP 8 Tại sao các α-brômo axit (hoặc muối cacboxylat của chúng) dễ bị ankyl hóa hơn các
ankyl bromua đơn giản trong phản ứng SN2 (Chương 12, tr.585)?
Một phương án thành công của tổng hợp ankyl hóa đơn giản có liên quan đến bảo vệ nhóm
amin, phương pháp này có tên là tổng hợp Gabriel hoặc đôi khi gọi là tổng hợp malonic este
Gabriel. Theo qui trình này, đầu tiên este bromomalonic được xử lí với kali phtalimit thông qua
phản ứng SN2 thế ion bromua. Ở bước này nitơ được đưa vào để trở thành nhóm amin của axit amin,
và nó không có tính nucleophin do nằm cạnh nhóm cacbonyl. Ở bước tiếp theo, sản phẩm este
malonic được xử lí với bazơ và ankyl halogenua để đưa nhóm R vào axit amin này. Cuối cùng xử lí
với axit hoặc bazơ, tiếp theo trung hòa để cho amin. Nhóm phtalimit bị thủy phân thành axit phtalic
còn este malonic bị thủy phân thành axit malonic. Đun nóng nhẹ, xẩy ra decacboxyl hóa và cho axit
amin. Có nhiều phương án tiến hành các phản ứng tổng hợp này (H. 23.13).
8
Hình 13 Tổng hợp este malonic Gabriel.
BÀI TẬP GIẢI 10 Có thể tiến hành phản ứng này đơn giản hơn khi dùng este axetamidomalonic.
Hãy viết các phản ứng tổng hợp phenylalanine như sau.
BÀI TẬP GIẢI Về cơ bản bài này giống như tổng hợp đã nêu ở Hình 23.13 và Bài tập 23.9. Đầu
tiên, sử dụng ưu thế của tính axit của hidro α-kép (nằm gần hai nhóm hút e) để đưa nhóm R vào.
9
Sau đó dùng axit hoặc bazơ để chuyển este thành axit cacboxylic, và để thủy phân amit. Đun nóng
gây ra decacboxyl hóa axit malonic và giải phóng axit amin.
Ở tổng hợp Strecker (Adolph Strecker, 1822-1871), người ta dùng xianua để làm nguồn
cho phần axit của axit amin. Andehit được xử lí với ammoniăc (là nguồn cho nhóm amin) và ion
xianua. Ở bước đầu tiên của phản ứng, cacbinolamin được tạo thành (Chương 16, tr.852) và nước bị
loại để tạo ra imin. Sau đó xianua tấn công imin để cho α-amino xianua. Thủy phân axit của nitril
cho axit (Chương 19, tr. 1059; H. 23.14)
10
Hình 14 Tổng hợp axit amin Strecker.
Ở bước đầu tiên của phản ứng này, sự tạo thành imin cũng giống như bước đầu tiên trong
phản ứng ngưng tụ Mannich, ở đó vai trò của amin cũng để tạo ra imin hoạt động (tr. 949). Tiếp
theo imin này có thể bị tấn công bởi bazơ xianua để cho α-amino xianua (H. 23.15).
Như chúng ta đã thấy hầu hết các axit amin gặp trong thiên nhiên đều là các đồng phân
quang hoạt dạng (S) hoặc (L) (ngoại trừ glyxin không quang hoạt). Không có một phương pháp tổng
hợp đã nêu trên sẽ tự động tạo ra đồng phân thiên nhiên (S). Do vậy chúng ta hoặc cần phải có
phương pháp phân tách (phân giải) cặp đối quang raxemic tạo thành hoặc phương pháp điều chế
chọn lọc đối quang (S).
2d Phân tách axit amin. Trước đây chúng ta đã thảo luận một phương pháp phân tách chuẩn ở
chương nói về quang hoạt (Chương 4, tr. 176). Phương pháp này liên quan đến việc chuyển hóa cặp
đối quang có cùng tính chất vật lí thành một cặp các đồng phân dia (không phải đối quang) khác
11
nhau về tính chất này. Do vậy chúng có thể phân tách bằng các phương pháp vật lí (thông thường
nhất là kết tinh lại hoặc sắc kí).
BÀI TẬP 23.11 Thực tế, các đối quang phân biệt nhau bởi một tính chất vật lí, đó là gì?
Các amin quang hoạt được dùng để chuyển các axit amin đối quang thành muối ammonium của các
đồng phân dia để sau đó phân tách bằng cách kết tinh lại. Các amin quang hoạt được chọn thường là
các ankaloit do dễ kiếm chúng ở dạng tinh khiết quang hoạt từ nguồn thiên nhiên (Chương 6, tr.
266). Quá trình phân tách được nêu ra ở Hình 23.16.
Hình 16 Phân
tách
Tuy nhiên, chắc phải có một cách khác để tránh sự tẻ nhạt của phương pháp kết tinh phân đoạn,
và điều chế trực tiếp được các hợp chất quang hoạt. Suy cho cùng, thiên nhiên làm được điều này thì
chúng ta cũng phải đủ thông thái để tìm ra quá trình này xẩy ra như thế nào và bắt chước. Một
phương pháp mà thiên nhiên sử dụng để tổng hợp axit amin có liên quan đến phản ứng amin hóa-
khử. Ammoniăc và α-xeto axit phản ứng khi có mặt của enzim và một nguồn cung cấp hidrit thường
là NADH (Chương 16, tr. 879) tạo ra axit amin quang hoạt (H. 23.17).
12
Hình 17 Tổng hợp L-axit amin quang hoạt qua phản ứng amin hóa-khử.
Các phản ứng hóa học của axit amin sẽ là sự kết hợp của các phản ứng dặc trưng cho axit (Chương
18 và 19) và amin (Chương 6). Thực ra, chúng ta đã xét một số phản ứng axit-bazơ ở mục 23.2c.
Một số tính chất quan trọng hơn sẽ được nêu ra qua các ví dụ hữu ích dưới đây.
13
3a Phản ứng axyl hóa. Có thể axyl hóa nhóm amino với các loại tác nhân axetyl hóa. Ví dụ như
anhidrit axetic, benzoyl clorua và axetyl clorua (23. 19).
3b Phản ứng este hóa. Nhóm chức axit của axit amin có thể bị este hóa khi dufngcasc phản ứng
este hóa đặc trưng. Este hóa theo Fischer là quá trình đơn giản nhất (H. 23.20).
Hình 23.20 Este Fischer của nhóm axit của axit amin.
BÀI TẬP .12 Viết cơ chế cho phản ứng axyl hóa nêu ra ở Hình 23.19.
BÀI TẬP 13 Nếu axit amin thực sự nằm ở dạng lưỡng cực thì phản ứng axyl hóa và este hóa sẽ xẩy
ra như thế nào vì chúng phụ thuộc vào sự có mặt của nhóm amin và nhóm axit tự do?
3c Phản ứng với ninhydrin. Các axit amin phản ứng với ninhydrin tạo ra các phân tử màu tím
sẫm. Chính sự tạo màu này được dùng để phát hiện axit amin. Điều này có vẻ kì lạ nhưng tất cả các
axit amin, ngoại trừ prolin cho dù chúng có gốc R khác nhau nhưng đều cho phân tử có cùng màu
tím với ninhydrin. Phản ứng xẩy ra như thé nào?
Ninhydrin là hidrat của indan-1,2,3-trion, và giống như tất cả các hidrat, nó cân bằng với
hợchấtcacbonyl tương ứng (H. 23.21).
của indan-1,2,3-trion.
14
BÀI TẬP 14 Tại sao trion ở Hình 23.21 bị hidrat hóa ở nhóm cacbonyl nằm giữa chứ không phải ở
cacbonyl bên cạnh?
Đầu tiên axit amin phản ứng với trion để tạo ra imin thông qua một lượng nhỏ amin tự do có
mặt trong cân bằng. Chúng ta đã gặp loại phản ứng này nhiều lần rồi (Chương 16, tr.852).
Decacboxyl hóa tạo ra imin thứ hai, rồi nó bị thủy phân để tạo thành amin. Chính ở bước thủy phân
này nhóm R ban đầu của axit amin bị lọai bỏ. Tiếp theo, amin được tạo thành lại phản ứng với một
phân tử ninhydrin khác để tạo ra phân tử imin thứ ba có màu tím (H. 23.22). Sự liên hợp mở rộng
trong sản phẩm dẫn đến sự hấp thụ năng lượng rất thấp ở vùng khả kiến (Chương 12, tr. 506), và
đấy là lí do phân tử có màu tím.
Hình 23.23 Polipeptit là poliamino axit nối với nhau qua liên kết amit.
15
TÓM TẮT
Nhiều phản ứng của axit và amin xuất hiện trong hóa hohc của axit amin. Phản ứng axyl hóa và este
hóa Fischer là hai ví dụ. Tuy nhiên, có những phản ứng mới có sự tham gia của cả hai nhóm chức
axit và amin. Phản ứng với ninhydrin là một ví dụ về loại này.
4a Gọi tên và cấu trúc. Hình 23.24 dẫn ra cấu trúc của ba axit amin peptit (tripeptit) cấu thành từ
alanin, serin và valin. Đừng nhầm lẫn hình minh họa này với qui trình tổng hợp thực tế. Các peptit
luôn được viết và gọi tên bắt đầu từ axit amin với nhóm amino nằm ở bên trái, rồi lần lượt cho đến
axit amin cuối cùng với nhóm cacboxy ở bên phải. Như vậy, tripeptit ở Hình 23.24 là
alanylserinylvalin, hay Ala.Ser.Val hay A.S.V.
Hình 23.24 Tripeptit, alanylserinylvalin, Ala.Ser.Val. Gọi tên của gốc axit amin trước,
và kết thúc với tên của axit amin có đầu cuối cacboxy.
BÀI TẬP 15 Vẽ cấu trúc cho các peptit có tên ở ô vuông dưới đây.
16
BÀI TẬP 16 Gọi tên các peptit
Thứ tự của chuỗi các axit amin ở peptit hay protein gọi là cấu trúc bậc một. Thông thường
các cấu trúc phức tạp hơn của các axit amin liên quan đến cách liên kết liên phân tử. Sự kết nối giữa
các chuỗi thường được thực hiện thông qua các cầu disunfua. Thông thường xystein là axit amin
tham gia vào việc tạo cầu này thông qua sự oxi hóa nhóm thiol (H. 23.25). Về phản ứng oxi thiol
thành disunfua, xem Chương 16, tr. 874.
Có những đặc điểm cấu trúc quan trọng khác của poliamino axit. Nhóm amit có xu hướng
phẳng, liên kết hidro nội phân tử giữa các hidro của NH và các nhóm cacboxy của cacbonyl, cùng
với sức căng gây ra bởi các liên kết disunfua dẫn đến các vùng có bậc cấu trúc khác nhau trong
nhiều polipeptit phân tử lớn.
BÀI TẬP GIẢI .14 Giải thích tỉ mỉ tại sao amit có xu hướng phẳng.
17
Sự bền hóa cộng hưởng này đạt cực đại khi các ocbital 2p trên N, C và O xen phủ cáng nhiều càng
tốt. Do vậy cần phải có lai hóa sp2 và đồng phẳng.
Các vùng quay về bên phải hay vùng xoắn-α đặc biệt phổ biến, còn các phần gấp khúc lặp lại được
gọi là các tấm gấp nếp -β. Cả hai cách sắp xếp này cho phép hình thành các kiểu sắp xếp tuần tự
các liên kết hidro, do vậy tạo nên cấp bậc cấu trúc trên chuỗi thẳng của các axit amin. Ở vùng α-
xoắn ốc, các liên kết hidro được hình thành giữa các vòng của chuỗi xoắn, trong khi đó ở các tấm
gấp nếp-β chúng giữ cho các chuổi bền vững qua các đường liên kết gần như song song (H. 23. 26).
Còn có những vùng khác gồm các vòng xoắn hoàn toàn ngẫu nhiên vô trật tự của các axit amin.
Sự kết hợp của các đặc điểm cấu trúc này tạo thành kiểu xoắn gập hay cấu trúc bậc hai của
polipeptit.
Hình 26 Hai ví dụ về
cấu trúc
chuỗi xoắn-α và
tấm gấp khúc-β
Thậm chí còn có những bậc cấu trúc cao hơn đối với các phân tử này nhưng không rõ ràng.
Có thể miêu tả cấu trúc polipeptit như là trình tự của các vùng cấu trúc bậc hai (vòng xoắn-α hoặc
tấm gấp nếp-β) được nối với nhau bởi các phần của vòng xoắn ngẫu nhiên. Trong trường hợp này,
18
protein sẽ không có cấu trúc tổng thể cố định, nghĩa là khác với cấu trúc đã được xác định bởi cấu
trúc bậc hai. Nhưng điều này không phải vậy. Xác định bằng tia X cấu trúc của các protein kết tinh
cho thấy rằng các chất này có cấu trúc đặc hiệu, ba chiều*. Đây là cấu trúc ba chiều của protein
được xác định một phần bởi liên kết hidro, nhưng cũng bởi lực van der Waals và lực tĩnh điện. Các
đại phân tử này cấu tạo từ khung cacbon có các mạch nhánh R gắn vào. Nhóm R có thể là
hidrocacbon không phân cực như metyl, isopropyl hoặc benzyl hay các nhóm phân cực cao như
amino, hydroxyl hay sunfonyl. Trong môi trường thiên nhiên của protein, không phải ngạc nhiên
nhận ra rằng protein điều chỉnh hình dạng sao cho các nhóm phân cực ưu nước (hidrophilic) chĩa về
phía dung môi phân cực, còn phần hidrocacbon “dầu” kị nước (hydrophobic) tụ lại ở phía trong
phân tử để bảo vệ tối đa khỏi môi trường nước đối lập (H. 23. 27).
Nhiều protein có dạng hình cầu để tăng tối đa sự tương tác ưu nước ở bên trong và tương tác
kị nước ở bên ngoài, nhưng các protein khác lại là hình sợi, theo dạng siêu xoắn gồm các vòng
xoắn- α cuộn lại giống như dây thừng. Hình 23.28 nêu một poliamino axit điển hình là enzim lactat
dehidrogenaza, trong cấu trúc của nó kết hợp năm vòng xoắn- α và sáu tấm gấp nếp-β.
Vấn đề chung là cho đến tận ngày nay cấu trúc của protein chỉ có thể xác định bởi phương
pháp nhiễu xạ tia X trên chất kết tinh. Công việc này bị hạn chế do khó tạo được tinh thể và sự kết
tinh những phân tử này thường gặp khó khăn. Tạo được thành công tinh thể đủ chất lượng cho phân
tích tia X cũng đáng để ca tụng (và công bố) thậm chí còn trước cả khi công trình xác định cấu trúc
bắt đầu. Nhưng làm sao chúng ta biết được cấu trúc của phân tử đang xác định lại giống như cấu
trúc của ở tinh thể dạng rắn? Lưu ý là hoạt tính sinh học liên quan mật thiết với cấu truscchi tiết của
các phân tử này. Liệu chúng ta có thể không bị sai lệch với cấu trúc có được khi ở tinh thể dạng rắn
và nó hoàn toàn khác với cấu trúc đang xác định? Cũng có thể xẩy ra. Ngày nay các nhà hóa học bắt
đầu sử dụng máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) phân giải rất cao và áp dụng các kĩ thuật rất
tinh vi để suy trực tiếp cấu trúc phân tử. Ghi nhớ là máy cộng hưởng từ trường cao rẻ tiền; giá của
nó khoảng $103 tiền đóng thuế của bạn trên megahezt.
Cấu trúc bậc ba này của protein là cực kì quan trọng để xác định hình dạng của đại phân tử và hoạt
tính sinh học phụ thuộc nhiều vào hình dạng này. Sự tiến hóa tạo ra các protein trong đó có các túi
hay hõm để những phân tử nào đó, hay còn gọi là cơ chất đi vào vừa khớp và có thể gắn vào theo
định hướng phù hợp để phản ứng xẩy ra. Phản ứng có thể là phức tạp, hoặc là đơn giản như thủy
phân este. Ở các phân tử khác sự gắn kết chỉ với mục đích vận chuyển. Những vùng hoạt động này
là gồm một chuỗi trực tiếp của các cấu trúc bậc một, chúng sẽ tham quan vào việc thiết lập cấu trúc
bậc hai và cấu trúc bậc ba. Hình 23.29 biểu diễn quá trình gắn kết này.
19
Hình 23.29 Ở mặt gắn
kết
20
Hình 23.31 Cấu trúc hem của hemoglobin chưa bị oxi hóa và đã oxi hóa
Protein bao quang hem được gọi là globin, và trong mỗi tiểu đơn vị của globin, imidazol
được giữ cân bằng để để giữ hem vào đúng vị trí. Có bốn tiểu đơn vị ở trong hemoglobin, hai trong
số đó có chuỗi peptit khác nhau tí chút. Những chuỗi này được giữ với nhau bởi lực tĩnh điện và lực
van der Waals cũng như bởi liên kết hidro, và chúng có hình dạng của một tứ diện khổng lồ (H.
23.32).
Khi đã được biết hết các thông tin chung về cấu trúc, chúng ta vẫn còn phải đối mặt với hai
vấn đề khó khăn nữa. Thứ nhất, làm thế nào để chúng ta xác định được cấu trúc bậc một (thứ tự liên
kết của các axit amin) và thứ hai, khi đã biết được cấu trúc này thì chúng ta sẽ tổng hợp chúng như
thế nào?
d Xác định cấu trúc của protein. Nếu có thể nhận được các tinh thể phù hợp của protein và nếu
phương pháp nhiễu xạ tia X có thể phân giải được trong một thời lượng phù hợp thì cấu trúc của
protein sẽ được làm sáng tỏ. Tuy nhiên, quá trình này không phải là một qui trình chung. Kết tinh lại
vẫn còn khó khăn, mặc dù bây giờ việc xác định cấu trúc của các phân tử nhỏ bằng tia X là nhanh và
thông dụng, nhưng việc xác định cấu trúc của protein vẫn còn khó và mất nhiều thời gian.
21
Về nguyên tắc, chúng ta có thể thu được một bức tranh tổng thể về thành phần của protein
bằng cách trước tiên phân cắt các liên kết disunfua có trong phân tử, rồi sau đó thủy phân tất cả các
liên kết peptit. Lưu ý: các peptit này là amit và sự thủy phân đơn giản bằng axit sẽ chuyển chúng
thành axit (Chương 19, tr. 1054). Qui trình này cho tất cả các axit amin tham gia vào kết cấu nên
phân tử protein. Hình 23.33 nêu ra một ví dụ giả định. Tất nhiên kĩ thuật phân tích này không cho
biết cấu trúc bậc một, hoặc các cấu trúc cao hơn.
Hình 23.33 Phân cắt một hexapeptit thành các axit amin
hợp phần. Đầu tiên, các liên kết disunfua bị cắt tạo ra hai
mảnh, sau đó chúng bị thủy phân để phân cắt các liên kết
amit.
Trên thực tế, đầu tiên người ta tách riêng các mảnh tạo thành khi phân cắt các liên kết disunfua rồi
sau đó đem thủy phân. Sự phân tách là một công việc quan trọng, hiện nay đã có một vài phương
pháp phân tách. Như chúng ta đã thấy, điện di là một phương pháp hữu ích để phân tách các axit
amin (tr.1278) và nó cũng được áp dụng để phân tách các poliamin axit. Các phương pháp sắc kí
cũng rất hiệu quả cho việc phân tách này. Ở phương pháp sắc kí lọc-gel người ta cho hỗn hợp chất
qua một cột nhồi hạt polime; ở mức độ phân tử, các hạt này chứa các lỗ trống (hốc) để các mảnh
peptit nhỏ hơn có thể chui vào khít hơn so với các mảnh lớn hơn. Như vậy, các mảnh lớn hơn sẽ đi
qua cột xuống nhanh hơn và bị tách ra trước. Sắc kí trao đổi ion sử dụng sự tương tác tĩnh điện để
giữ các mảnh có tích điện cao hơn ở lại trên cột lâu hơn so với các phân tử gần như trung tính. Ở bất
kì kĩ thuật sắc kí nào, các hạt bị môi trường thực nghiệm giữ bởi chặt hơn sẽ di chuyển chậm hơn so
với các phân tử bị giữ yếu (H. 23.34).
Khi các mảnh peptit đã được tách ra, chúng được thủy phân riêng biệt để thu các axit amin
cấu thành. Bay gờ chúng ta cần phải có xác định thứ tự các axit amin có mặt trong chuỗi peptit. Một
22
lần nữa sắc kí lại được sử dụng. Các axit amin được tách ra trên cột trao đổi ion. Mỗi axit amin tách
ra khỏi cột sẽ được cho vào ống nghiệm (hoặc lọ) để làm phản ứng tạo màu tím với ninhydrin (tr.
1286). Cường độ màu tím tỉ lệ thuận với hàm lượng axit amin có mặt, và sau đó có thể dùng để vẽ
đồ thị theo thời gian hoặc theo lượng dung môi rửa giải cột. Qui trình này tạo ra một sắc đồ gồm
một dãy các đỉnh (pik) có kích thước khác nhau. Làm thế nào chúng ta biết được đỉnh nào ứng với
axit amin nào? Sự nhận dạng được thực hiện bằng cách chạy các mẫu axit amin đã biết qua cột như
tương tự và xác định thời gian lưu của chúng, rồi đối chiếu với thời gian lưu của các axit amin chưa
biết (H. 23.35).
Nhưng kĩ thuật này chỉ cho chúng ta bức tranh thô nhất về cấu trúc của protein: chúng ta biết được
các axit amin hợp phần và hàm lượng tương đối của chúng, nhưng không biết về thứ tự liên kết của
chúng, tức là cấu trúc bậc một. Nhiệm vụ quan trọng là tìm ra cách tốt nhất để biết được thứ tự thực
sự của các axit amin trong protein. Bước đầu tiên lại là phá hủy liên kết disunfua và phân tách các
polipeptit hợp phần. Một phương pháp đơn giản để xác định đầu cuối amino gọi là thoái phân
Sanger, gọi theo tên của nhà hóa học Frederik Sanger (sinh năm 1918). Cho peptit phản ứng với
2,4-dinitroflobenzen. Sản phẩm cộng được tạo thành giữa 2,4-dinitroflobenzen với nhóm amino đầu
cuối (đánh dấu là đầu N).
23
Hình 36 Axit amin ở đầu cuối amino có thể nhận dạng bằng
Chỉ có axit amin ở đầu cuối amino của chuỗi peptit được đánh dấu.
Sau đó, thủy phân cho các axit amin và hợp chất cộng của 2,4-dinitroflobenzen với axit amino đánh
dấu đầu cuối N. Đáng tiếc, để xác định chúng ta buộc phải phá hủy toàn bộ peptit!
Cũng có thể xác định axit amin có đầu cuối cacboxy của chuỗi peptit. Có thể chọn phản ứng xúc tác
enzim, dùng một trong các cacboxypeptidaza để phân cắt đặc hiệu axit amin có nhóm cacboxy nằm
cuối chuỗi peptit. Khi axit amin đầu cuối bị phân cắt, một axit amin khác (nằm kế trên) lại thành đầu
cuối mới và phản ứng tiếp enzim cacboxypeptidaza. Do vậy, cần theo dõi thận trọng sự tạo thành
axit amin theo thời gian để suy ra về thứ tự liên kết của các axit amin này (H. 23.37). Ngoài ra, việc
xác định này trở nên rắc rối khi các peptit mạch dài chuyển thành một dịch gồm hỗn hợp phức tạp
của các axit amin.
24
Hình 37 Cacboxypeptidaza
BÀI TẬP 18 Viết cơ chế tạo thành sản phẩm cộng ở Hình 23.36. Vai trò của nhóm nitro là gì
(Chương 14, tr. 726)?
Một phương pháp tốt hơn không cần phải thủy phân toàn bộ, dễ kiểm soát hơn và không phải
theo dõi các bước phân cắt như khi xử lí với cacboxylaza. Chúng ta cần một phương pháp phân cắt
protein từ đầu này hoặc từ đầu kia của chuỗi, và ở mỗi bước phát hiện được các axit amin nằm ở
cuối mạch. Ngày naychúng ta đã phát triển được các phương pháp xác định thứ tự chuỗi của peptit
theo từng bước. Một phương pháp hiệu quả gọi là thoái phân Edman, gọi theo tên của nhà hóa học
Pehr Edman (1916-1977), và dùng phân tử phenylisothiothioxianat, Ph-N=C=S (H. 23.38).
Isoxianat đã được đề cập trước đây (Chương 19, tr.1098; H. 23.38), còn isothioxianat thì giống như
một đồng đẳng của isoxianat.
25
BÀI TẬP 19 Viết cơ chế của sự tạo thành isoxianat ở Hình 23.38 (Chương 19, tr.1098).
Giống như isoxianat isothioxianat phản ứng nhanh với nucleophin. Phản ứng của isoxianat với
ammoniắc hay với amin cũng cho urê. Isothioxianatxianat cho thiourê là chất trung gian được tạo
thành đầu tiên (H. 23.39).
Hình 23.39 Isothixianat phản ứng với amin cho thiourê. Phenylisoxianat có thể dùng
Thiourê có thể cắt ra trong axit nhưng các liên kết amit khác trong peptit không bị phân cắt. Như
chúng ta đã thấy ở Chương 21 (tr. 1183), lưu huỳnh một nhóm liền kề (cận kề?) hoạt động, và đưa
thiourê vào có ảnh hưởng đến việc đặt nguyên tử lưu huỳnh vào đúng vị trí để hỗ trợ cho việc cắt
axit amin ở cuối mạch. Cacbonyl nằm kề bên bị proton và sau đó chính lưu huỳnh kề bên cộng vào
đó, khơi mào phản ứng cắt để cho một phân tử gọi là thiazolinon (H.23.40).
26
Hình 40 Qui trình Edman sử dụng phenylisothioxianat để xác
định thứ tự chuỗi poliamino axit. Amion đầu cuối được nhận
dạng bởi cấu trúc của phenylthiohydantoin tạo thành. Lưu ý là
phương pháp này không phá hủy chuỗi peptit như ở qui trình
Sanger.
Xử lí axit tiếp chuyển thiazolinon thành phenylthiohydantoin chứa nhóm R của axit amin
nằm cuối mạch, cho nên có thể nhận dạng ra axit amin này (H. 23.40). Quá trình này là gián trực
tiếp và sản phẩm ban đầu của phản ứng không phải là phenylthiohydantoin mà thiazolinon. Mấu
chốt quan trọng là ở chỗ phần peptit còn lại vẫn không bị tác động, cho nên bây giờ qui trình Edman
có thể được lặp lại; và về nguyên tắc cần nhiều lần để xác định xong thứ tự các axit amin trong toàn
bộ peptit (H. 23.41).
BÀI TẬP 20 Đề nghị cơ chế cho sự tạo thành phenylthiohydantoin từ thiazolin (H. 23.40).
27
Nhưng cuộc sống thực tiễn luôn phức tạp, qui trình Edman thậm chí tốt như vậy mà cũng không có
hiệu quả đối với các polipeptit có mạch dài hơn trên 20-30 axit amin. Tạp chất sinh ra từ mỗi bước
xác định thứ tự chuỗi, cuối cùng làm cho hỗn hợp phản ứng trở nên quá phức tạp không thể thu
được một kết quả rõ ràng khi tạo ra phenylthiohydantoin. Do vậy, các nhà hóa học đã phát triển các
phương pháp để cắt protein thành các mảnh nhỏ hơn ở các vị trí đã biết trong chuỗi axit amin. Các
phương pháp này vừa có ưu điểm của phản ứng sinh học trong đó enzim chỉ cắt peptit ở axit amin
nhất định, cũng như phân cắt rất đặc hiệu bởi các tác nhân nhỏ dùng trong phòng thí nghiệm.
Có lẽ, phương pháp phân cắt hóa học tốt nhất (enzim cũng là hóa chất) là sử dụng xianogen
bromua (BrCN) và sử dụng lợi thế tính nucleophin của lưu huỳnh và hiệu ứng nhóm liền kề gây
nên sự phân cắt vùng cacboxy của các gốc methionin trong chuỗi polipeptit
Hình 23.42 Đầu cacboxy của mỗi phân tử methionin bị cắt khi xử
lí polipeptit với xianogen bromua (BrCN).
Đầu tiên, nguyên tử lưu huỳnh của methionin thế bromua ra khỏi xianobromua để tạo ra ion
sunfonium. Sự tấn công nhóm carbonyl bên cạnh của methionin loại đi nhóm tách rất tốt là
methylthioxianat và tạo ra vòng năm-cạnh gọi là homoserin lacton. Sau đó bước thủy phân cho phép
tạo ra sản phẩm cuối, hai peptit nhỏ hơn. Cơ chế đầy đủ được nêu ra ở Hình 23.43.
28
Hình 43 Cơ chế phân cắt sử dụng BrCN.
Hầu hết các phương pháp được dùng để cắt các peptit lớn thành các chuỗi axit amin nhỏ hơn
là sử dụng ưu thế của phản ứng enzim. Ví dụ, Chymotrypsin là một enzim được dùng để phân cắt
nhóm cacboxyl của axit amin chứa mạch nhánh là vòng thơm (phenylalanin, tryptophan hay
tyrosin).
29
Trypsin chỉ cắt ở đầu cacboxy của lysin và arginin. Chúng ta sẽ xét một vài ví dụ về sự phân cắt đặc
hiệu kiểu này. Peptit mạch dài có thể phân cắt thành các phân tử ngắn hơn, sau đó dùng qui trình
Edman để xác định thứ tự chuỗi. Thông thường, kết hợp dùng các bước phát hiện nhỏ để xác định
toàn bộ chuỗi peptit. Trước hết chúng ta xét một ví dụ đơn giản và sau đó sẽ làm các bài tập thực sự.
Xét decapeptit ở Hình 23.44. Thông qua qui trình Sanger, chúng ta có thể xác định đầu cuối
amino là Phe. Tiếp theo, chúng ta dùng enzim trypsin để cắt phân tử thành ba mảnh. Như vậy, peptit
này phải bắt đầu bằng Phe, tạo thành một chuỗi gồm 4 axit amin là Phe.Tyr.Trp.Lys. Chỉ có một
điểm cắt khác ở Arg, do vậy mảnh Asp.Ile.Arg phải nằm ở giữa. Vì nếu tripeptit này nằm ở cuối, với
Arg là đầu cacboxy thì không thể xẩy ra sự phân cắt. Thứ tự chuỗi phải là
Phe.Tyr.Trp.Lys.Asp.Ile.Arg.Glu.Leu.Val.
Hình 44 Một ví dụ xác định chuỗi peptit khi sử dụng qui trình Edman và Sanger, cũng
như các phản ứng phân cắt bằng enzim.
BÀI TẬP 21 Nonapeptit bladykinin có thể bị thủy phân hoàn toàn trong axit để cho ba phân tử Pro,
hai phân tử của mỗi loại axit amin Arg và Phe, và một phân tử của Ser và của Gly. Xử lí với
chymotrypsin cho pentapeptit Arg.Pro.Pro.Gly.Phe, tripeptit Ser.Pro.Phe và Arg. Phân tích nhóm
cuối cho thấy cả hai nhóm cuối amino và cacboxy đều giống nhau. Hãy đề nghị thứ tự chuỗi trong
bradykinin.
4c Tổng hợp peptit. Bây giờ chúng ta biết dược cách phân tích thứ tự chuỗi protein, vậy quá trình
ngược lại- làm thế nào để nối các axit amin lại với nhau theo bất kì thứ tự nào mong muốn? Làm thể
nào để tổng hợp protein? Việc tạo nên các liên kết amit có vẻ là một nhiệm vụ dễ dàng. Tuy nhiên
khi bắt đầu suy nghĩ về công việc này chúng ta sẽ bắt gặp hai trở ngại lớn. Thứ nhất, có khá nhiều
công việc để điều chế thậm chí một protein nhỏ. Hãy hình dung là chúng ta chỉ muốn tạo ra chin liên
kết amit của một decapeptit như ở Hình 23.44. Thậm chí nếu chúng ta có thể tạo ra mỗi liên kết amit
với hiệu suất 95% thì vẫn gặp rắc rối.
Một dãy chín phản ứng, mỗi phản ứng với hiệu suất 95% thì khá tốt đối với bất kì ai làm việc
trong phòng thí nghiệm hữu cơ, và cho hiệu suất tổng thể là (0.95)9=63%. Rõ rằng là trong thế giới
thực của protein, trong đó chiều dài của chuỗi peptit thường gồm hàng trăm axit amin, thì chúng ta
30
buộc phải làm tốt hơn nhiều so với hiệu suất trên. Thứ hai là tính đặc hiệu. Giả sử chúng ta muốn
điều chế một dipeptit Ala.Leu. Nếu chúng ta tránh được phản ứng axit-bazơ đơn giản thì phản ứng
ngẫu nhiên giữa hai axit amin này có thể cho ít nhất bốn phân tử dime, và trên thực tế, cũng có thể
có các peptit khác lớn hơn được tạo thành (H.23.45).
Hình 45 Các cách kết hợp có thể của hai axit amin chưa được bảo vệ
Một chiến lược nhằm tránh phản ứng ngẫu nhiên là hoạt hóa nhóm cacbonyl của alanin bằng cách
chuyển nhóm axit của alanin thành clorua axit, và sau đó xử lí nó với leuxin (H. 23.46).
31
Hình 46 Có thể thu được tính đặc hiệu bằng cách cho axit clorua của một axit
amin (hoạt hóa) phản ứng với axit amin khác.
Tuy nhiên, cách này cũng vô vọng! Làm cách nào để ngăn nhóm amino ban đầu của alanin
không phản ứng với axit clorua được tạo ra từ alanin? Không có cách nào cả! Như vậy, lại nhận
được một hỗn hợp (H. 23.47). Công việc này khá phức tạp nếu chúng ta cần phải tạo ra hàng tá hay
có thể hàng trăm liên kết amit. Chúng ta đành phải chấp nhận một hiệu suất khá thấp nếu hy vọng
điều chế được sản phẩm với hàm lượng hữu ích. Chúng ta cần phải tìm được các cách hiệu quả nhất
để tạo ra liên kết amit ở vị trí mong muốn và tránh được các phản ứng phụ.
Hình 47 Ở đây, không thể tránh được có trên hai sản phẩm được tạo thành.
Ở trường hợp đơn giản này, chúng ta không chỉ cần hoạt hóa nhóm cacboxyl của analin mà
còn phải khóa phản ứng ở nhóm amino của alanin và nhóm cacboxyl của leuxin. Như vậy, có ba vị
trí cần phải sửa đổi: nhóm cacboxyl của alanin, và leuxin và nhóm amino của alanin. Còn lại hai vị
trí tự do để phản ứng là nhóm cacboxyl đã được hoạt hóa của alanin và nhóm amino chưa bị sửa đổi
32
của leuxin. Lưu ý rằng, bước cuối cùng sau khi đã nối xong các axit amin là loại bỏ các nhóm đã bị
khóa hoặc bảo vệ (H. 23.48).
Nhóm amino có thể bị vô hoạt bằng cách chuyển chúng thành cacbamat thông qua phản ứng
cộng-tách đơn giản (Chương 19, tr.1099). Có hai phương pháp phổ biến được dùng để chuyển hóa
nhóm amino tự do thành cacbamat là phản ứng với di-tert-butyl dicacbonat hoặc với benzyl
cloformat (benzyloxicacbonyl clorua). Các nhà hóa sinh thích dùng kí hiệu viết tắt hơn các nhà hóa
hữu cơ, và các nhóm bảo vệ này được gọi tương ứng là tBoc và Cbz (H. 23.49).
Hình 49 Hai nhóm bảo vệ (khóa) cho đầu amin của các axit amin.
Như vậy, bây giờ chúng ta đã có hai cách vô hoạt một nhóm amin, ở trường hợp này là alanin để nó
không thể tham gia tạo liên kết amit-peptit. Chúng ta cũng cần vô hoạt đầu cacboxy của axit amin
kia (leuxin). Có thể thực hiện vô hoạt (bảo vệ) bằng cách chuyển hóa đơn giản axit thành este (H.
23.50).
33
Hình 50 Đầu cacboxy có thể
Bây giờ chúng ta cần phải làm hai việc nữa. Thứ nhất, chúng ta phải nối nhóm amino chưa
(bị) bảo vệ của leuxin với nhóm cacboxyl chưa (bị) bảo vệ của alanin. Việc này phải được tiến hành
ở điều kiện êm dịu nhất có thể được. Thứ hai, chúng ta cần loại nhóm bảo vệ gắn vào các nhóm
amino và cacboxyl sau khi liên kết amit đã được hình thành.
Dixiclohexylcacbodiimit (DCC) là một tác nhân được chọn cho phản ứng tạo liên kết amit. Sự tạo
thành liên kết amit là phản ứng dehidrat hóa (nước là sản phẩm thứ hai), và DCC là một tác nhân
loại nước mạnh. Sau phản ứng nó chuyển thành dixiclohexylurê (DCU), là dạng hidrat của DCC (H.
23.51).
Hình 51 Có thể hoàn thành phản ứng ghép đôi khi sử dụng dixiclohexylcacbodiimit (DCC).
Cơ chế của phản ứng ghép đôi này là gì? Xin nhớ lại rằng các hệ nối đôi liền kề trong xeten
(Chương 19, tr.1061), isoxianat (Chương 19, tr.1098) và isothioxianat (Chương 23, tr.1297) đều
phản ứng nhanh với nucleophin. DDC có cấu trúc tương tự cũng không phải ngọai lệ, nó bị amin tấn
công để cho phân tử gọi là guanidine. Cacboxylat cũng là nucleophin và cũng cộng vào DDC (H.
23.52).
34
Hình 23.52 Các hệ nối đôi
anion cacboxylat.
Nhóm axit cacboxylic chưa bảo vệ của alanin cộng vào DDC để cho chất trung gian, chất
này lại phản ứng axit cacboxylic thứ hai để cho anhidrit. Sau đó, axit amin leuxin cộng vào thông
qua cơ chế cộng-tách để cho dipeptit. Lưu ý rằng dipeptit này vẫn còn bị bảo vệ ở hai chỗ. Cơ chế
ghép axit amin sử dụng DDC được dẫn ra ở Hình 23.53.
35
Hình 53 Cơ chế ghép đôi axit amin sử dụng DDC
Bây giờ chúng ta phải loại nhóm bảo vệ và điều chế được dipeptit, Ala.Leu. Nhóm khóa Cbz bị loại
dễ dàng bằng hidro hóa xúc tác, còn loại nhóm tBoc bằng xử lí với axit rất yếu để không phân cắt
liên kết amit. Axit này có thể tái sinh nhờ xử lí este với bazơ. Este này sẽ bị thủy phân nhanh hơn
amit (H. 23.54).
36
Hình 23.54 Các phương pháp
loại nhóm bảo vệ nhóm, sử
dung trong sơ đồ điều chế.
Còn về hiệu suất thì sao? Nên nhở rằng quá trình này, với tất cả các bước bảo vệ, loại bảo vệ
được lặp lại nhiều lần khi tổng hợp một phân tử peptit lớn. Các bước này có hiệu suất cao vì xẩy ra
chủ yếu không kèm theo các hướng phụ. Các bước tổng hợp cách tẻ nhạt đã được giải quyết bằng
cách tự động hóa tổng hợp. Polipeptit có thể được tổng hợp vằng máy do R. Bruce Merrified (sinh
năm 1921) sáng chế. Theo qui trình Merrified, đầu tiên đầu cacboxy của axit amin đã được bảo vệ
tBoc được gắn vào một vật liệu polime làm từ polistyren trong phân tử của chất này một số vòng
phenyl được thay bởi nhóm clometyl. Gắn axit amin vào polime này bằng cách thế clo thông qua
phản ứng AN2
BÀI TẬP 22 Nhóm chức của vòng benzene của polistyren là gì? Có phải polime chứa bất kì vòng
nào cũng được? Chẳng hạn xiclohexan có dùng được không?
37
Sau đó nhóm tBoc bị loại bằng thủy phân với axit yếu, và một axit amin mới được bảo vệ tBoc lại
gắn vào axit amin thông qua phản ứng ghép đôi với sự có mặt của DCC. Bây giờ các bước tổng hợp
axit amin có thể thực hiện trên axit amin cố định (H.23.56).
Hình 56 Bây giờ các bước của tổng hợp axit amin có thể tiến hành trên axit amin cố định này.
Qui trình này có thể lặp lại bao nhiêu làn tùy theo yêu cầu. Chuỗi phát triển không thể biến
mất vì nó được gắn vào polistyren; các tác nhân có thể cộng vào, còn sản phẩm phụ có thể được rửa
loại đi sau mỗi phản ứng. Bước cuối cùng là loại peptit ra khỏi nhựa polime, thông thường thông
qua với hidro florua (HF) hoặc một axit khác (H. 23.57).
38
Hình 57 Khi tổng hợp kết thúc polipeptit có thể tách ra khỏi polime nền bằng phản ứng với HF.
BÀI TẬP 23.23 Hãy đề nghị tổng hợp dipeptit Leu.Ala xuất phát từ leuxin và alanin và các tác nhân
khác được nêu ra ở chương này. Không cần nêu ra cơ chế.
Máy tổng hợp tự tạo thô sơ đầu tiên của Merrifield có thể điều chế được một chuỗi gồm 125
axit amin với hiệu suất tổng là 17%, hoàn thành một cách ngoạn mục . Merrifield xứng đáng được
nhận giải thưởng Nobel năm 1984.
Ở mục 23.3c đã miêu tả sự tổng hợp protein được thực hiện bởi con người. Trong thiên
nhiên, một kĩ thuật hoàn toàn khác được sử dụng, và sự phát hiện ra cách protein được tổng hợp như
thế nào là một trong các khám phá vĩ đại nhất của lịch sử nhân loại.
Axit nucleic, deoxyribonucleic (ADN) và axit ribonucleic (ARN) là các polime của
nucleotide (nucleozit bị photpho hóa). Nucleozit là β-glycozit được tạo thành từ đường và một phân
tử dị vòng (là một bazơ). Ở phân tử ribonucleozit, đường ribozơ (Chương 22, tr.1227) được gắn với
bazơ thông qua liên kết β-glycozit. Ở phân tử deoxyribonucleozit, đường deoxyribozơ được thay
cho ribozơ. Nucleozit bị photpho hóa ở vị trí 5 được gọi là nucleotide (H.23.58).
39
Hình 23.58 Đường ribozơ và deoxyribozơ,
Trong
tương ứng.polime (axit nucleic ADN và ARN), các đường ribozơ ở AND và deoxyribozơ ở AND được
nối với nhau qua nhóm axit photphoric được gắn ở vị trí 5‟ của một phân tử đường và vị trí 3‟ của
một phân tử đường khác. Mỗi phân tử đường vẫn còn mang một bazơ dị vòng được gắn vào vị trí
cacbon-1‟. Chúng ta đã gặp các bazơ dị vòng này lần đầu tiên ở Chương 13, tr. 66 (H.23.59).
Một trong những nét nổi bật của qui trình sao chép này là chính xác. với cái chúng ta bắt đầu
miêu tả và hoạt động kinh tế. Cho đến nay chúng ta biết axit photphoric và hai đường, ribozơ và
deoxyribozơ nối với nhau trong chuỗi polime. Người ta có thể nhầm rằng mọi bazơ đều có thể gắn
40
vào, và sự đa dạng của thế giới sinh vật được tạo ra từ việc gắn một chất cụ thể theo cách này.
Nhưng điều này sai: chỉ có năm bazơ được gắn vào C(1) ở phân tử AND và ARN, và trên thực tế,
chỉ có ba trong số đó (xytosin, adenine và guanin) là phổ biến đối với cả hai loại axit nucleic và hai
loại khác (thymin và uraxil) chỉ khác nhau về sự có mặt của một nhóm metyl trong phân tử. Các
bazơ được viết tắt cho nhanh sử dụng một chữ cái, G,A,G,T và U (H. 23.60). Đưa một thông tin chi
tiết vào phải đi theo một cách khác.
Lưu ý rằng sự tương ứng giữa các polime này và các phần polime khác đã được xem xét ở
protein. Ở các poliamino axit, các đơn vị được nối với nhau bởi liên kết amit. Ở AND và ARN
chúng được gắn với nhau bởi liên kết photphat. Thông tin về protein được các mạch nhánh mang
theo, các nhóm R có các yêu cầu chính xác về lập thể và electron sẽ xác định các bậc cấu trúc cao
hơn (bậc hai, bậc ba và bậc bốn) của các phân tử này.
Trong AND và ARN chính các bazơ đảm nhiệm chức năng của nhóm R của protein. Chỉ có
20 nhóm R phổ biến nhưng chỉ có bốn bazơ cho mooic axit nucleic. Tuy nhiên, các cấu trúc bậc cao
hơn cũng tìm thấy ở các axit nucleic. Nhiệm vụ tiếp theo của chúng ta là xét điều này xẩy ra như thế
nào.
Năm 1950, Erwin Chargaff (1905-2002) đã có một khám phá quan trọng, nhận ra rằng trong
nhiều AND khác nhau số lượng các bazơ adenine (A) và thymin (T) luôn bằng nhau, và giống như
số lượng của guaini (G) và cytosin (C). Dường như bốn bazơ này của AND được tìm thấy theo cách
ghép cặp. Sự quan sát này này dẫn đến một ý kiến rất hợp lí, cho rằng các thành viên của các cặp
phải liên kết theo một cách nào đó, và ở cấu trúc dime của các cặp bazơ, liên kết hidro luôn được
hình thành giữa A với T và G với C. Sự kết hợp này là kết quả của sự thuận tiện đặc biệt cho sự hình
thành liên kết hidro do các phân tử rất khớp với nhau (H. 23.61).
Sự tồn tại các cặp bazơ cho thấy thứ tự của các bazơ ở trên một chuỗi polime của AND có thể dùng
để xác định cấu trúc của chuỗi kia qua việc xét liên kết hidro nối giữa hai chuỗi. Ví dụ, đối với chuỗi
các bazơ G G T A C G A T thì chuỗi nối tương ứng phải là C C A T G C T A để có thể tạo tối ưu
liên kết hidro giữa các cặp bazơ (H. 23. 62).
41
Hình 62 Thứ tự của nucleotide
trên một polime xác định thứ tự ở
chuỗi kia thông qua sự tạo thành
liên kết hidro giữa các cặp bazơ.
Quan niệm này cũng là công cụ để Jame D. Watson (sinh năm 1928) và Francis H. C. Crick (sinh
năm 1916) hiểu rõ cấu trúc AND, và sau này nhờ sự hỗ trợ đắc lực của phương pháp nhiễu xạ tia X,
Rosalind Franklin
(1920-1958) và Maurice Wilkins (sinh năm 1916) đã xác định được rằng cấu trúc của AND là hình
xoắn sợi kép; hai chuỗi AND ở hình xoắn này được giữ với nhau bởi các cặp bazơ tạo liên kết hidro
A-T và G-C. Đường kính của đường xoắn này khoảng 20 Å, và có 10 gốc trên mỗi vòng xoắn của
hình xoắn này. Mỗi vòng xoắn có chiều dài khoảng 34 Å (H. 23.63).
Bây giờ chúng ta vẫn còn hai vấn đề chưa được giải quyết: 1) Mật độ thông tin xuất phát từ
đâu? Sự góp chung có vẻ như không đầy đủ của năm bazơ để chuyển thành một tập hợp thông tin
phong phú hơn rồi sau đó phải được chuyển giao cho quá trình tổng hợp các protein có thứ tự đặc
hiệu tạo ra từ 20 axit amin sẽ được thực hiện như thế nào? 2) Cơ chế thực sự của việc truyền thông
tin là gì? Vấn đề thứ hai này có lẽ dễ giải quyết hơn.
Quá trình tự nhân đôi (sao chép) AND liên quan đến phần không bị uốn của hình xoắn để tạo
ra hai khuôn mẫu cho sự phát triển chuỗi AND mới. Lưu ý, chính trình tự của các bazơ trong mỗi
sợi sẽ xác định sự phát triển của sợi tiếp theo. Nơi no có T thì A phải xuất hiện, nơi nào có G thì C
phải gắn vào, v.v. Mỗi sợi của AND gốc phải sao lại một sợi chính xác như sợi mà trước đó nó đã
gắn vào (H.64).
Hình 23.63 Hình xoắn kép
Hình 64 Đầu tiên sự sao chép được thực hiện để tạo ra một sợi. Sự hình thành
sợi polime khác được xác định bởi chuỗi thứ tự các bazơ gốc. Ở đâu có A thì T
phải được cộng vào và G thì cần có C.
42
Tổng hợp protein bắt đầu với một quá trình tương tự nhưng không hoàn toàn giống nhau. Sợi
AND cũng có thể dùng như một khuôn mẫu cho việc điều chế polime ARN. Sự khác nhau là ở chỗ,
trong ARN chính đường ribozơ hỗ trợ cho việc kết cấu khung đường-photphat chứ không phải
deoxyribozơ, ngoài ra bazơ uraxil thay chỗ thymin. ARN tạo ra được gọi là ARN thông tin
(mARN) (H. 23.65).
Phân tử ARN mới này điều khiển sự tổng hợp protein theo một cách đơn giản ngoạn mục
như sau: tổng hợp mỗi một axit trong số 20 axit amin phổ biến được điều khiển bởi một hoặc nhiều
chuỗi ba bazơ, được gọi là codon. Có thể tạo ra được bao nhiêu chuỗi ba bazơ từ bốn bazơ ARN đã
có? Câu trả lời là 43=64, đủ nhiều để mã hóa cho 20 axit amin phổ biến. Ngoài ra, một số axit amin
được mã hóa bởi nhiều hơn một codon. Ngoài ra, cần có thêm một số codon để xử lí vấn để như, khi
nào bắt đầu sản xuất axit amin và khi nào thì kết thúc sản xuất. Bảng 23.2 dẫn ra các condon gồm
ba-bazơ cho 20 axit amin phổ biến và một số hiệu lệnh thường dùng.
Bảng 2 Các codon cho các axit amin và các hiệu lệnh đơn giản
43
Bắt đầu Thr Lys Arg G
G Val Ala Asp Gly U
Val Ala Asp Gly C
Val Ala Glu Gly A
Val Ala Glu Gly G
Ta lấy một ví dụ để hiểu quá trình này hoạt động như thế nào. Giả sử một sợi AND có thứ tự
như sau: T A C C G A A G C A C G A T T. Cặp bazơ phải tạo ra được mảnh mARN: A U G G C U
U C G U G C U A A (lưu ý là ở ARN bazơ U thay cho T). Dựa vào Bảng 23.2 mảnh này có thể
phiên dịch thành thông tin sau: “ Bắt đầu- cộng Ala- cộng Ser- cộng Cys- Dừng”.
BÀI TẬP GIẢI 24 Tại sao 20 axit amin được mã hóa bởi tổng 64 chuỗi ba-bazơ? Tại sao có nhiều
trùng lặp như vậy? Giả sử dùng phương pháp khác với chuỗi hai-bazơ để mã hóa sự sản xuất axit
amin. Có thể có bao nhiêu chuỗi hai-bazơ được tạo ra từ bốn bazơ?
LỜI GIẢI Chỉ có 24 kiểu có thể xẩy ra khi mỗi lần lấy hai trong số bốn bazơ để kết hợp. Như vậy,
chỉ có thể mã hóa được 16 axit amin khi dùng chuỗi hai-bazơ tạo ra từ bốn bazơ khác nhau, nghĩa là
không đủ để mã hóa 20 axit amin phổ biến. Do vậy các condon gồm ba-bazơ là cách kinh tế nhất để
mã hóa cho 20 axit amin.
Một vấn đề khác còn tồn tại. mARN điều khiển sự tổng hợp axit amin như thế nào? Các
ARN khác gọi là ARN vận chuyển (tARN) được dùng cho mục đích này. Chúng tương đối nhỏ và
được thiết kế để tương tác với enzim, aminoaxyl tARN synthetaza, lấy một axit amin đặc hiệu rồi
mang nó đến mARN ở nơi nó sẽ được cộng vào mạch polime đang phát triển ở vị trí của codon
đúng.
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------
6 TÓM TẮT
Các quan niệm mới
Cho đến nay quan niệm chính mới ở chương này Các cấu trúc mới này đòi hỏi các kĩ thuật phân
là thứ tự kết nối của các axit α-amin vào mạch tịc và tổng hợp mới. Các phương pháp xác định
polime dài để cho cấu trúc bậc cao hơn. Cấu trúc trình tự chuỗi peptit và protein dùng các kĩ thuật
bậc hai của peptit và protein này liên quan đến vật lí như nhiễu xạ tia-X, cũng như các kĩ thuật
vùng thứ tự nằm trong polime. Cấu trúc này hóa học để nhận ra các đầu cuối của mạch axit
thường hay gặp nhất ở sự sắp xếp theo vòng amin, và có thể cả thứ tự của toàn bộ polime.
xoắn-α hoặc ở tấm gấp nếp-β, chúng được tách Các polime sinh học (biopolime) như axit
khỏi nhau bởi các phần vô trật tự của mạch nucleic không được kết cấu từ các axit amin mà
(vòng xoắn ngẫu nhiên). Liên kết disunfua, cũng từ các nucleotit, đường có gắn nhóm bazơ dị
như các lực tĩnh điện và lực van der Waals và vòng và dược nối qua liên kết với axit
liên kết hidro làm xoắn cong các phân tử này photphoric. Các phân tử này cũng có bậc cấu
thành các hình dạng đặc trưng cho mỗi protein trúc cao, chẳng hạn như chuỗi xoắn kép của
riêng biệt, tức là tạo ra cấu trúc bậc ba. AND. Điểm nổi bật nhất là các phân tử này
44
Đôi khi cấu trúc bậc hai và hai chỉ bị phá vỡ tạm mang mã di truyền, làm duỗi vòng xoắn, điều
thời bởi một quá trình biến tính bất kì nào. Cuối khiển sự sắp xếp không chỉ bản sao của chính
cùng các lực liên phân tử cũng có thể giữ một số chúromuang mà còn thông qua sự điều hòa của
phân tử này lại với nhau để tạo ra các siêu phân ARN, sự sắp xếp các poliamin axit (tức là các
tử. Chúng ta gọi đây là cấu trúc bậc bốn. protein). Ở axit nucleic, thông tin được chứa
Các cấu trúc có bậc cao này bị ảnh hưởng không chỉ ở các nhóm R khác nhau như ở các
bởi tính đồng nhất của các nhóm R có mặt trong peptit và protei, mà còn ở trong một số ít các
các axit amin hợp phần. Các tính chất electron nhóm bazơ. Liên kết hidro có trong các cặp bazơ
và tính chất lập thể của các nhóm R có vai trò cho phép thực hiện các phản ứng sao chép và các
lớn trong việc hình thành các cấu trúc bậc hai, đơn vị ba-bazơ (condon) điều khiển sự sắp xếp
bậc ba và bậc bốn của protein. các axit amin vào phân tử protein.
Vùng hoạt động (tr. 1292) Điện di (tr. 1278) Phenylisothioxianat (tr. 1297)
Tác nhân axyl hóa (tr. 1286) Axit amin thiết yếu (tr. 1275) Tấm gấp nếp-β (tr. 1290)
Axit α-amin (tr. 1272) Tổng hơp Gabriel dùng Cấu trúc bậc 1 (tr. 1289)
Đầu cuối amino (tr. 1288) malonic este (tr. 1281) Protein (tr. 1273)
Cặp bazơ (tr. 1314) Sắc kí lọc gel (tr. 1294) Cấu trúc bậc bốn (tr. 1293)
Đầu cuối cacboxy (tr. 1288) Hình xoắn-α (tr. 1291) Vòng xoắn ngẫu nhiên (tr.
Cbz (tr. 1305) Hemoglobin (tr. 1293) 1290)
Sắc kí đồ (tr. 1295) Tính ưu nước (tr. 1291) Thời gian lưu (tr. 1295)
Chymotrypsin (tr. 1301) Tính kị nước (tr. 1291) Axit ribonucleic (ARN) (tr.
Codon (tr. 1316) Sắc kí trao đổi ion (tr. 1294) 1311)
Xianogen bromua (tr. 1300) Điểm đẳng điện (tr. 1278) Thoái phân Sanger (tr. 1296)
Biến tính (tr. 1292) Phân tách động học (tr. 1285) Cấu trúc bậc hai (tr. 1290)
Axit deoxyribonucleic (ADN) ARN thông tin (mARM) (tr. Tổng hợp Strecker (tr. 1282)
(tr. 1310) 1315) tBoc (tr. 1305)
Dixyclohexylcacbodiimit Ninhydrin (tr. 1286) Cấu trúc bậc ba (tr. 1291)
(DCC) Axit nucleic (tr. 1311) Thiourê (tr. 1298)
(tr. 1306) Nucleozit (tr. 1311) Trypsin (tr. 1302)
Cầu disunfua (tr. 1289) Nucleotit (tr. 1311) Urê (tr. 1298)
Thoái phân Edman (tr. 1297) Peptit (tr. 1273) Zwitterions (tr. 1277)
Các phản ứng quan trọng trong việc xác định hơn, sau đó trình tự của chúng sẽ được xác định
trình tự của các axit amin bao gồm các kĩ thuật qua qui trình Edman. Các tác nhân này bao gồm
dùng cho phân tích nhóm ở đầu mạch. Có các các loại enzim và các tác nhân hóa học nhỏ như
enzin (cũng chính là protein) cắt axit amin, đánh xyanogen bromua.
dấu đầu cuối cacboxy của polime. Đầu cuối Sự tổng hợp các phân tử polime này không
amino cũng có thể nhận ra qua phản ứng Sanger. đòi hỏi gì ngoài trình tự tạo thành nhiều liên kết
45
Về nguyên tắc, toàn bộ chuỗi peptit có thể bị amit. Qui trình ghép đôi nhờ DCC có hiệu quả
cắt lần lượt khi sử dụng thoái phân Edman khi nhưng đòi hỏi các axit amin-monome phải ở
dùng phenylisothioxyanat trong qui trình này để dạng trong đó đầu bị gắn sẽ được hoạt hóa, hoặc
cắt axit amin nằm ở đầu amino tách ra ở dạng ít nhất còn tự do, còn các điểm dễ phản ứng khác
phân tử phenylthiohydantoin phải được khóa hay được bảo vệ. Các nhóm bảo
Các tác nhân khác cũng được dùng để phân vệ và hoạt hóa phải được đưa vào các vị trí phù
cắt đặc hiệu polime thành các phân mảnh polime hợp và loại bỏ sau khi phản ứng đã kết thúc (H.
nhỏ 23.66).
Hình 23.65 Sự ghéo đôi được DDC điều chỉnh. Các nhóm bảo vệ và hoạt hóa phải được đưa
Bây giờ chúng ta cần nguồn cung cấp axit hiện ở dạng L. Có thể phân tách các đồng phân
vào các vị trí phù hợp và loại bỏ sau khi phản ứng kết thúc
amin. Đối với các amin đơn giản, phản ứng thông qua các kĩ thuật cổ điển như tạo ra các dẫn
ankyl hóa SN2 trực tiếp không thích hợp. Phản xuất đồng phân dia, sau đó kết tinh lại hay qua
ứng tổng hợp axit amin tốt nhất đã được biết là các phương pháp khác. Một phương pháp thông
qui trình Gabriel và Strecker. minh nhất là phân tách động học, sử dụng ưu
Các axit amin có trong thiên nhiên đều có điểm của enzim chỉ tấn công một đồng phân
tính quang hoạt (trừ glyxin không quang hoạt) và thiên nhiên (S), còn đồng phân (R) còn nguyên
xuất (H. 23.18).
Tổng hợp
1. AXIT AMIN
2. CẦU DISUNFUA
46
3. GUINIDIN 4. CÁC AXIT AMIN QUANG HOẠT
47
6. THIOHYDANTOIN 7. THIOURÊ
BÀI TẬP 34
(a) Một peptit chưa biết cấu trúc được xử lí với tác
nhân Sanger, 2,4-dinitroflobenzen, sau đó thủy
phân với axit. Kết quả là tạo được một hợp chất
có 8 hidro vòng thơm (phổ 1H NMR). Có thể rút
ra thông tin gì về cấu trúc của peptit này?
(b) Một peptit thứ 2 cũng được xử lí tương tự, thu
được một hợp chất có một hidro xuất hiện trong
phổ 1H NMR phân giải cao ở dạng tín hiệu 8-
vạch trong vùng δ 3,5 ppm. Có thể rút ra thông
tin gì về cấu trúc của peptit này?
48
BÀI TẬP 35 Một tripeptit chưa biết cấu trúc bị
thủy phân trong axit cho tỉ lệ phân tử, một Ala,
một Cys và một Met. Tripeptit này phản ứng
với phenylisothioxianat, sau đó được xử lí với
axit thì cho phenylthiohydantoin. Trong phổ 1H
NMR của chất này chỉ có một doublet của 3-
hidro ở khoảng δ 3,0 ppm. Tripeptit này không
bị phân cắt bởi BrCN. Từ các dữ kiện này hãy
suy ra cấu trúc của tripeptit.
BÀI TẬP 31
Các axit amin Asp và Lys sẽ di chuyển về điện
cực nào (anot hay catot) khi ở pH=7?
49
BÀI TẬP 37 Ở mục 23.4 chúng ta đã thấy rằng có BÀI TẬP 39
thể dùng nhóm tBoc để bảo vệ (khóa) nhóm amino Phản ứng của N-phenylalanin (1) với axit
của axit amin trong quá trình tổng hợp peptit. Coa nitrơ cho N-nitroso axit amin (2), chất này
thể đưa nhóm này vào bằng cách cho axit amin khi xử lí với anhidrit axetic cho “sydnon” (3).
phản ứng với di-tert-butyl dicacbonat (1). Khi liên Sydnon thuộc nhóm các
kết amit được tạo thành thì có thể loại bỏ nhóm bảo hợp chất mesoionic. Chúng được biểu diễn
vệ tBoc bằng “thủy phân” trong axit yếu. Cả hai bởi công thức Lewis với các điện tích tách rời
phản ứng được minh họa như dưới đây. Hãy đề nhau. Tên của sydnon xuất phát từ trường Đại
nghị cơ chế cho phản ứng đưa nhóm tBoc vào và học Sydney nơi các chất dạng này đã được
loại bỏ nó. Gợi ý: một trong số sản phẩm thủy phân điều chế lần đầu tiên vào năm 1935. Phản
là isobutene. ứng của (3) với dimetyl axetylendicacboxylat
(MDAD) cho pyrazol (4). Hãy đề nghị cơ chế
tạo thành 2, 3 và 4.
Gợi ý: Để tạo thành 4, nên biểu diễn sydnon 3
ở dạng cấu trúc Lewis khác.
51