ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Lê Thị Tú Anh

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC LOÀI MÍT LÁ ĐEN
ARTOCARPUS NIGRIFOLIUS C.Y.WU

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012
 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Lê Thị Tú Anh

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC LOÀI MÍT LÁ ĐEN
ARTOCARPUS NIGRIFOLIUS C.Y.WU

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Nguyễn Văn Tuyến

Hà Nội - 2012
 LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn
Tuyến, người đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Xin cảm ơn quỹ NAFOSTED và PGS.TS Trần Minh Hợi chủ nhiệm đề tài
“Nghiên cứu tính đa dạng và hoạt tính sinh học của một số loài thuộc chi Mít
(Artocarpus Forst. & Forst. f.), họ Dâu tằm (Moraceae) ở Việt Nam” mã số
106.05.74.09, đã cung cấp kinh phí để thực hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn CN. Nguyễn Bích Thuận, Ths Bá Thị Châm đã
tận tình giúp đỡ và chỉ bảo trong suốt thời gian tôi làm luận văn.
Xin cảm ơn các cô bác, anh chị và bạn đồng nghiệp phòng Hóa Dược và
phòng Thử hoạt tính sinh học, những người đã luôn theo sát, giúp đỡ tôi.
Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo viện Hóa học- Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam, Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc
gia Hà Nội, các thầy cô trong khoa Sinh học đã tạo mọi điều kiện để tôi học tập,
nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè, đã động viên và
giúp đỡ về mọi mặt để tôi hoàn thành tốt luận văn này!
Học viên: Lê Thị Tú Anh
 MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm thực vật của loài Artocapus nigrifolius C. Y. Wu ....................... 03
1.2. Ứng dụng trong y học cổ truyền của chi Artocapus .................................... 04
1.3. Hoạt tính sinh học và thành phần hóa học một số loài thuộc chi Artocapus ..
1.3.1 Hoạt tính kháng sinh ............................................................................. 07
1.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư .......................................................... 09
1.3.3 Hoạt tính chống oxy hóa....................................................................... 14
1.3.4 Một số hoạt tính sinh học khác ............................................................ 18
1.4. Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro ............................ 19
1.4.1 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng sinh in vitro ........................ 19
1.4.2 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro .... 22
1.4.3 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa in vitro ................. 23
Chương 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Mẫu thực vật và thiết bị, hóa chất ............................................................... 25
2.1.1. Mẫu thực vật ....................................................................................... 25
2.1.3. Thiết bị và hóa chất thử hoạt tính sinh học ......................................... 25
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 26
2.2.1. Phương pháp tách chiết ....................................................................... 26
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc ........................................................... 26
2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học .................................................... 27
2.2.4 Phương pháp sử lý số liệu .................................................................... 30
2.3. Thực nghiệm ............................................................................................... 30
2.3.1. Chiết mẫu thực vật .............................................................................. 31
2.3.2. Sàng lọc sơ bộ hoạt tính dịch chiết các bộ phận................................. 31
2.3.3. Phân lập chất ...................................................................................... 31
2.3.4. Thử hoạt tính các chất ......................................................................... 33
`Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Sàng lọc sơ bộ hoạt tính dịch chiết các bộ phận ............................................... 35
3.2. Thành phần hóa học cây Mít lá đen (Artocapus nigrifolius C. Y. Wu) ...... 39
3.3. Hoạt tính sinh học của các chất................................................................... 45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................. 52
PHỤ LỤC
 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Resonance Spectroscopy proton
13
C-NMR Carbon – 13 Nuclear Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Magnetic Resonance cacbon 13
Spectroscopy
HMBC Heteronuclear Mulitiple Phổ tương tác dị hạt nhân qua
Bond Coherence nhiều liên kết
HMQC Heteronuclear Single Phổ tương tác dị hạt nhân qua
Quantum Coherence một liên kết
s singlet
d doublet
t triplet
q quartet
J (Hz) hằng số tương tác tính bằng Hz
δ(ppm) ppm= part per million độ dịch chuyển hóa học tính bằng
ppm
KB human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô
HepG2 hepatocellular carcinoma Ung thư gan ở người
human
MCF7 Ardeno carcinoma Ung thư vú
LU Human lung carcinoma Ung thư phổi
IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% cá thể
ED50 Effective dose 50% Liều hiệu quả đáp ứng 50%
SKC Sắc ký cột
DMSO dimethyl sulfoxide
 DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Đặc điểm thực vật loài Mít lá đen Artocapus nigrifolius C.Y.Wu 4
Hình 1.2 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro 21
Hình 1.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro sinh ký tự 22

Hình 2.1 Quy trình chiết mẫu vỏ và thân cây Mít lá đen 32

Hình 2.2: Phân lập các chất từ cao chiết diclometan 33

Hình 3.1 Sắc ký cột cao chiết DCM và SKBM một số phân đoạn cao chiết mẫu vỏ
thân. 40
Hình 3.2 Sắc ký bản mỏng so sánh của ADF2 và β-sitosterol 41
Hình 3.3: Tỉ lệ phần trăm ức chế vi sinh vật theo các nồng độ của AFD6 47
Hình 3.4 Minh họa ảnh hưởng của AFD6 trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB 48
Hình 3.5 Minh họa ảnh hưởng của AFD6 trên dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 49
Hình 3.6 Minh họa ảnh hưởng của AFD6 trên dòng tế bào ung thư vú MCF7 50
Hình 3.7 Minh họa ảnh hưởng của AFD6 trên dòng tế bào ung thư phổi Lu 51
Hình 3.8 Minh họa thử nghiệm chống oxy hóa theo phương pháp sử dụng DPPH
của AFD6 52
 DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3.1 Hiệu suất ngâm chiết các bộ phận cây mẫu 35
Bảng 3.2 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của cao chiết Artocarpus nigrifolius

C. Y. Wu 36

Bảng 3.3 Hoạt tính chống ôxy hoá của các mẫu lá, vỏ thân, rễ và cành Artocarpus
nigrifolius C. Y. Wu 38

Bảng 3.4 Hoạt tính gây độc tế bào của các cao dịch chiết các bộ phận loài
Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu 39
Bảng 3.5: 13C – NMR của các chất AFL2 và AFD3 (CDCl3) và (CDCl3 + CD3OD) 44

Bảng 3.6 Hoạt tính kháng sinh của các chất chiết tách từ loài Artocarpus nigrifolius
C.Y.Wu 46
Bảng 3.7 Hoạt tính gây độc trên dòng tế bào KB và Hep-G2 của các chất 48

Bảng 3.8 Hoạt tính gây độc trên dòng tế bào MCF7 và Lu của các chất 50
Bảng 3.9 Hoạt tính chống oxy hóa của AFD6 51
 MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng. Tổng số loài thực
vật đã ghi nhận ở Việt Nam khoảng 10.500 loài trong tổng số 12.000 loài theo ước
tính. Trong số đó, nguồn tài nguyên cây làm thuốc chiếm khoảng 30%. Kết quả điều
tra nguồn tài nguyên cây thuốc của Viện Dược liệu (2006) cho biết ở Việt Nam có
3.948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp và nấm lớn được dùng làm thuốc. Trong thời
gian qua, nước ta đã có hơn 3.000 loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược được cấp số
đăng ký, chiếm gần 1/3 trong tổng số thuốc mới được cấp số đăng ký lưu hành hàng
năm. Như vậy nhu cầu sử dụng cây dược liệu chế xuất thuốc trong nước là rất lớn.
Không những vậy, việc sử dụng dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên cũng đang
được các nước trên thế giới hết sức quan tâm.
Chi Artocarpus (họ Dâu tằm, Moraceae) là một chi thực vật khá phổ biến ở
Việt Nam với 15 loài. Trong đó, ngoài giá trị làm thực phẩm nhiều loài còn được sử
dụng trong y học dân gian để chữa các bệnh như thấp khớp, hạ huyết áp, tiểu đường
như mít (Artocarpus heterophyllus), xa kê (Artocarpus altilis)…Thành phần hóa
học cũng như hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Artocarpus đã được các nhà
khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu từ lâu, nhiều hợp chất mới với những
hoạt tính tốt đã được công bố [31]. Tuy nhiên, ở Việt Nam mới có một số ít loài
được nghiên cứu như: Chay Bắc bộ (Artocarpus tonkinensis), Chay lá to
(Artocarpus lakoocha Roxb.) và cây Mít dai (Artocarpus heterophyllus Lamk.). Các
nghiên cứu này cũng đã tìm ra được một số chất thuộc nhóm auronol glucosid có
hoạt tính sinh học tốt có thể ứng dụng vào cuộc sống và là tiền đề cho các nghiên
cứu tiếp theo [6]. Ở Việt Nam loài mít lá đen Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu mới
được tìm thấy và bổ sung vào danh mục loài của chi mít (Artocarpus) năm 2011 do
nhóm tác giả PGS.TS Trần Minh Hợi, viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật . Nhóm
tác giả cũng đã công bố hoạt tính sinh học của cây và cho các kết quả rất đáng quan
tâm. Do vậy, chúng tôi đã lựa chọn loài cây này làm đối tượng nghiên cứu và thực
hiện đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt chất sinh học loài mít lá đen
Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu”.
Mục tiêu của luận văn là nghiên cứu thành phần hóa học và phát hiện các
hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học của loài Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu. Để
đạt được mục tiêu trên chúng tôi thực hiện các nội dung sau:
- Thu hái và định tên cây
- Xử lý mẫu
- Tách chiết, phân lập, xác định cấu trúc các thành phần hóa học của cây
- Thử hoạt tính sinh học các mẫu cao chiết và các hợp chất tinh sạch được.
 Chương 1 - TỔNG QUAN
1.1 Đặc điểm thực vật của loài Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu
Chi Artocarpus thuộc họ dâu tằm (Moraceae), là một họ thực vật lớn gồm
khoảng 60 chi và hơn 1400 loài, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt
đới châu Á. Trên thế giới chi này gồm khoảng 60 loài, phần lớn là cây thân gỗ, có
nhựa mủ màu trắng. Hoa đơn tính cùng gốc. Hoa đực gồm hai hay bốn phiến, một
nhị với chỉ nhị ở giữa với 2 bao phấn ở hai bên, mở bởi hai kẽ nứt. Hoa cái có màu
hơi xanh, nhỏ phát triển thành gié nạc, ngắn. Sau khi thụ phấn chúng phát triển
thành quả tụ, có thể phát triển rất to. Lá kèm từ nhỏ như ở Artocarpus integer
(Thunb.) Merr (mít tố nữ) và nguyên cho tới lớn và xẻ thùy Artocarpus communis
Forst. & Forst.f. ( Xa kê). Một số loài trong chi có quả ăn được nên được trồng ở
nhiều nước trên thế giới như Artocarpus heterophyllus, Artocarpus integer,
Artocarpus rigidus, Artocarpus tokinensis . Theo Phạm Hoàng Hộ, chi Artocarpus
ở Việt Nam có 15 loài và dưới loài [4].
Loài Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu
Cây thân gỗ cao 15m, mọc thẳng, cành nâu sậm, vỏ sần sùi có nếp nhăn dày
1- 2,5 mm. Chồi non ngắn lá có lông màu nâu đen rỉ sắt. Cuống lá đen, mỏng, dài
1,8 -2,8 cm có lông màu nâu đen khi còn non, phiến lá hình elip hoặc elip hẹp, kích
thước 5-11 x 2-4 cm, mỏng như giấy, phía xa gân giữa lá có màu xanh nâu và lông
rất nhỏ màu trắng, phía gần gân giữa lá có màu gần như đen và không lông, gần
cuống lá có hình nêm rộng, gân lá không đối xứng; phần đuôi lá có chóp nhọn dài
0,5-1,5cm. Phần gân lá chính và gân loại 2 nổi rõ ở cả hai mặt lá, gân loại 3 không
lộ. Cụm hoa đơn tính mọc ở nách lá. Cụm hoa đực có kích thước 4-7mm hoa đôi,
cụm hoa cái có màu trắng khi còn non, màu xanh sậm khi khô, hình nón ngược, 5-
9mm, có nốt sần, chỏm cánh hoa có dạng tù, cuống dài 1-1,5 cm, mỏng.
Tiến hành thu mẫu tại các tỉnh: Sơn La, Phú Thọ thu tiêu bản và vật mẫu
cành, lá, quả .
 Hình 1.1: Đặc
ặc điểm
đ ể thực vật loài Mít lá đen Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu.

1. Cành Mít lá đen ồi Mít lá đen.

2. Chồi
Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu là một loài mới được
ợc nghiên
nghi cứu và bổ sung
ước ta, do đó, các tài liệu ghi nhận
vào hệ sinh vật của nư ậ vềề chúng ch
chưa nhiều; rất
cần được nghiên cứu.
1.2 Ứng dụng
ng trong y học
h cổ truyền của chi Artocarpus
oài trong chi Artocarpus được dùng trong y học
Nhiều loài ọc cổ truyền ở các nước
Đông Nam Á đểể điều
đ ều trị các bệnh như kháng viêm, sốt
ốt rét, trị ung nhọt,
nh áp xe, tiêu
chảy. Thịt quả và hạt được
đư sử dụng như thuốc bổ có tác dụng làm
àm mát, hạ
h huyết áp, rễ
cây uống để trị bệnh tiêu
êu chảy ế sữa
ch và hạ sốt, lá giúp tăng tiết ữa cho phụ
ph nữ, động vật có
vú; tro đốt của lá là loại
ại thuốc ền nhiều nước …[31]
thu trị giun trong y học cổ truyền
Ở nước ta,
a, dân gian dùng
dù lá xa kê (Artocarpus altilis)) chữa
ch phù thũng, viêm
ằng cách nấu
gan vàng da bằng n là tươi để uống. Ngoài
ài ra, theo lương
lươ y Nguyễn Công
Đức, lá xa kêê còn có thể ốc khác trị được
th phối hợp với một số loại thuốc đ một số bệnh
ậ tiểu
như gút, sỏi thận, ểu đđường týp 2, chứng huyết áp cao dao động [[2]. Thịt quả xa kê
thường dùng để ăn, quả còn xanh có bột dùng để làm thực phẩm. Hạt xa kê luộc
hoặc rang ăn ngon như hạt rẻ có tác dụng lợi trung tiện, kích dục.
Artocarpus altilis không chỉ làm thức ăn chăn nuôi, lá của nó được sử dụng
để điều trị xơ gan, tăng huyết áp và bệnh tiểu đường ở Indonesia [30].
Ở Tân đảo, rễ cây được dùng để trị hen và các rối loạn dạ dày, ruột, một số
rối loạn khi mang thai, đau răng miệng và trị bệnh về da.
Ở Papua Niu- Guinea, vỏ cây được dùng để trị bệnh ghẻ; nhựa cây được pha
loãng uống trị ỉa chảy và lỵ; lá dùng phối hợp với lá đu đủ giã với vôi cho đến khi
có màu vàng, lấy hỗn hợp này đắp trị sưng háng, lá cũng được dùng trị đinh nhọt,
sưng háng [3].
Thân và rễ loài Artocarpus altilis đã được sử dụng ở Đài Loan từ lâu để điều
trị bệnh xơ gan và chứng tăng huyết áp. Ngoài ra chúng còn được dùng để kháng
viêm, giải độc.
Ở Ấn Độ, trong một nghiên cứu sàng lọc tác dụng dược lý của cao khô chiết
từ vỏ và lá xa kê bằng cồn 500, các tác giả nhận thấy cao thô có tác dụng lợi tiểu rõ
rệt trong thí nghiệm với chuột cống trắng so với lô đối chứng.
Ở Trinidad và Banhamas, người ta dùng nước sắc lá xa kê để hạ huyết áp và
trị hen suyễn, lá giã nát đắp trị tưa lưỡi, nước ép từ lá dùng như thuốc nhỏ tai, tro
đốt từ lá dùng bôi lên da chữa nhiễm trùng và bột lá khô dùng để điều trị lá lách mở
rộng. Quả giã nát làm thuốc đắp lên vết sưng tấy giúp mau mưng mủ, hoa chữa đau
răng bằng cách hơ nóng chà lên niếu xung quanh chỗ đau. Nhựa cây dùng để chữa
trị bệnh về da và giảm đau thần kinh tọa, pha loãng uống trị tiêu chảy.
Ở nước ta, hạt mít dai ( A. heterophyllus) được dùng trị ghẻ lở, sản hậu ít
sữa. Múi mít dùng chữa sốt rét rừng và giải say rượu [1]. Hạt mít nướng hay luộc ăn
thì hạ khí, thông trung tiện. Lá mít được dùng làm thuốc lợi sữa, chữa ăn uống
không tiêu, ỉa chảy, và trị huyết áp cao. Lá mít giã đắp cũng làm mụn nhọt bớt sưng
đau. Gỗ và lá mít còn được dùng làm thuốc an thần, chữa huyết áp cao hay những
trường hợp co quắp: mài gỗ mít lên miếng đá nháp hay chỗ nháp của trôn bát, cho
thêm ít nước đến khi nước trở nên đục nhiều thì uống với liều hàng ngày là 6-10g.
Gỗ và nhựa mít làm tiêu sưng, giải độc, chữa sưng tấy, mụn nhọt, dưới dạng sắc
nước uống (gỗ) và bôi (nhựa). Rễ cây sắc nước uống trị ỉa chảy và cùng với vỏ trị
các loại viêm gây sốt. Dịch nhựa cây thường được dùng đắp rút mủ mụn nhọt, còn
dùng trị bệnh giang mai và trừ giun. Dái mít dùng chữa sa dạ con và lõi mít có tính
gây sảy thai[2]. Ở Ấn Độ người ta dùng lá chữa các bệnh ngoài da và trị rắn cắn
[31]. Rễ sắc uống trị tiêu chảy và vàng da. Dịch ép của cây đắp vào chỗ sưng hạch
và áp xe để làm mưng mủ. Quả xanh có tác dụng làm săn, quả chin nhuận tràng.
Nhựa mủ bôi trị vết thương [2].
Ở Indonesia, dịch ép quả mít non có trong thành phần một thuốc uống trị sốt.
Quả non trộn với cao khô từ lá cây Uncaria gambir ăn trị đau bụng. Lá hoặc quả có
trong thành phần bài thuốc chữa uồng trị tiêu chảy, nước sắc lá giã nát dùng làm
thuốc chữa đau răng.
Hạt Chay lá to (Artocarpus lakocha) ở Ấn Độ được dùng làm thuốc xổ, vỏ
cây dùng tán bột đắp vết thương để rút mủ hoặc pha thuốc đắp mụn nhọt và các vết
nứt nẻ ở da. Ở Thái Lan, nạc của trái được xem như thuốc bổ gan, gỗ, quả chay sắc
nước uống dùng trị giun kim, giun đũa, sán xơ mít và dùng ngoài da trị ghẻ. Ở nước
ta, vỏ, mủ trị đau lá lách; hột làm thuốc xổ.
Các loại trái cây Artocarpus lakocha thường được ăn tươi. Bột trái cây ăn
được và dùng như là một loại thuốc bổ cho gan. Ở Thái Lan, bột Artocarpus
lakoocha Roxb còn gọi là Puag-Haad được sử dụng làm thuốc trị sán dây truyền
thống [8].Vỏ cây có chứa 8,5% tannin được nhai như trầu và cũng được sử dụng để
điều trị bệnh về da.
Chay Bắc bộ (Artocarpus tonkinensis) có quả dùng để chữa phổi nóng, ho ra
máu, thổ huyết, chảy máu mũi, đau họng, dạ dày thiếu toan, kém ăn. Nếu không có
quả chay tươi có thể dùng quả chay khô hay rễ chay sắc uống. Rễ chay dùng chữa tê
thấp, đau lưng, mỏi gối và chữa rong kinh, bạch đới; còn dùng làm chắc chân răng.
Liều dùng 20-40g dạng thuốc sắc.
Ngoài ra, những loài khác trong chi Artocarpus cũng được sử dụng trong y
học dân gian ở các nước Đông Nam Á từ lâu: nhựa từ Artocarpus lowii truyền
thống được sử dụng như một loại dầu ăn và thuốc mỡ trong y học dân gian.
Artocarpus chempeden là một trong các loại thuốc dân tộc Indonesia; hạt cây đã
được sử dụng để chống lại tiêu chảy và rễ của nó chống lại bệnh sốt rét. Phía Tây
Java, Artocarpus elasticus Reinw. ex Blume đã được sử dụng để điều trị viêm,
tránh thai cho nữ (vỏ cây), bệnh lỵ và lá non cho điều trị bệnh lao. Bên cạnh việc sử
dụng làm thuốc, các loài trong chi Artocarpus được sử dụng như một loại thực
phẩm và vật liệu xây dựng nhà ở [31].
1.3 Hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của một số loài thuộc chi
Artocarpus
Với việc được sử dụng khá phổ biến và hiệu quả trong y học cổ truyền, chi
Artocarpus đã sớm được các nhà khoa học trên thế giới để ý. Từ chi này, rất nhiều
các hợp chất sinh học thứ cấp đã được tách chiết, tinh sạch, sàng lọc hoạt tính và
nhiều trong số chúng có hoạt tính tốt, hứa hẹn khả năng được áp dụng vào thực tiễn.
Các hoạt tính thường được thăm dò là: hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, gây độc
với các tế bào ung thư và khả năng chống các gốc oxy hóa. Ngoài ra, tùy theo
những tác dụng của loài trong y học dân gian, tùy theo tính chất của các nhóm chất,
người ta có thể thăm dò các hoạt tính khác như: tính kháng virus, ức chế các
enzyme, chống tiểu đường… Dưới đây, chúng tôi xin giới thiệu về những hoạt tính
sinh học của các hợp chất đã được tách từ các loài thuộc chi Artocarpus.
1.3.1 Hoạt tính kháng sinh:
Cao chiết methanol vỏ cây loài Artocarpus communis và một số hợp chất tự
nhiên tinh sạch được từ loài này như artonin E (1), 2-[(3,5-dihydroxyl)-(Z)-4-(3-
methylbut-1-enyl) phenyl]benzofuran-6-ol (2) có khả năng kháng nhiều chủng vi
sinh vật như : P.seudomonas stuartii (ATCC29916), P.aeruginosa (PAO1),
Klebsiella pneumonia (ATCC11296); S.aureus (ATCC25922), S.typhi
(ATCC6539), E.coli (ATCC8739), C.albican (W3100). Trong đó (1) và (2) cho giá
trị MIC là 32 µg/ml với P.aeruginosa, giá trị này cao hơn cả chất kháng sinh đối
chiếu là chloramphenicol [32].
 (1) (2)
Từ vỏ cây loài Artocarpus rigida Blume người ta cũng tìm thấy hợp chất
artonin E (1) với hoạt tính kháng sinh rất tốt tương đương với các chất kháng sinh
đối chứng. Điều này cho thấy khả năng ứng dụng của artonin E trong thực tế như
một chất kháng sinh [28].
Hợp chất pyranocycloartobiloxanthone A (3) được tìm thấy ở loài
Artocarpus obtusus thể hiện hoạt tính kháng sinh tốt với một số chủng vi sinh vật
như: Staphylococcus aureus kháng methicillin (ATCC33591) với đường kính
vòng vô khuẩn là 20mm tương đương với hoạt tính của chất đối chứng là
streptomycin sulfat, hay kháng Bacillus subtilis với đường kính vòng vô khuẩn là
12mm, ngoài ra nó cũng thể hiện hoạt tính với các chủng B.subtillis (ATCC 6633),
E.coli (ATCC 25922), S.aureus (ATCC 6538) và Salmonella typhimurium (S865B)
với đường kính nhỏ hơn 10 mm. Mặc dù không cao như tính kháng khuẩn,
Pyranocycloartobiloxanthone A cũng thể hiện hoạt tính kháng nấm trên các chủng
Candida albicans (ATCC 1023) và Saccharomyces cerevisiae (S617) với đường
kính vùng ức chế lần lượt là 7 và 8 mm [19].
HO OH

O O

OH

OH O CH3

(3)
Cao chiết thô methanol của thân, vỏ thân, vỏ rễ, lá, hạt, quả, gỗ của
Artocarpus heterophyllus và các phân đoạn dịch chiết sau đó với dichloromethane,
ethyl acetate và butanol đã cho phổ kháng vi sinh vật
ậ rộng
ộng vớ
với nhiều chủng như:
Bacillus cereus, B.coagulans, B.megaterium, B.subtilis, Lactobacillus casei,
Micrococcus luteus, M.roseus, Staphylococcus albus, S.aureus,
S.epiderepidermidis, Streptococcus faecalis,
faecalis, St.pneumoniae, Agrobacterium
tumaefaciens, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli,
Klebsiella pneumonia, Neisseria gonorrhoeae, Proteus mirabilis, P.vulgaris,
Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Serratia
marcescens, Trichomonas vaginalis. Trong đó, phân đoạn
ạn butanol (nồng
(n độ
4mg/đĩa) vỏ rễ và quảả của Artocarpus heterophyllus có hoạt
ạt tính tốt
t nhất . Dịch
chiết nước của loài
ài cũng
c thể hiện hoạt tính ức chế với
ới các chủng
chủ như S.aureus
(15mm), E. faecalis (14 mm),
mm S. typhimurium (13 mm) và E. coli (11,3 mm) [16].
1.3.2 Hoạt tính gây độc
độ tế bào
Suhartati và cộộng sự đã tách được một số hợp
ợp chất phenol từ rễ cây
Artocarpus rotunda là artoindonesianin L (4), artonin M (5),
(5) artonin E (1) và
ày đều
artonin O (6), cycloartobiloxanthone (7) . Những hợp chất này đ thể hiện hoạt
tính gây độc tế bào đốối với dòng tế bào P388 bạch cầu
ầ chuột
ột vớ
với LC50 lần lượt là
0,6; 7,9; 0,06; 4,6 và 0,9 µg/ml [27].
ộng sự đã tách được
Từ loài Artocarpus lanceifolius, Euis và cộng
artobiloxanthone (8),, artoindonesianin P (9),, cycloartobiloxanthone (7) và artonol B
(10) các chất này đều
ều có khả
kh năng ức chế dòng tế bào P388 với
ới giá trị
tr IC50 lần lượt
6; 100 µg/ml. Các
là 5,9; 1,7; 4,6; C hợp chất (1) and (6), (7) và (8) được tách chiết từ
thân Artocarpus kemando thể hiện hoạt tính gây độc tế bào
ào KB (ung thư
th biểu mô
người) với giá trị IC50 lần lượt là 3,0; 0,5; 3,5; 2,5 µg/ml [31].

(4) (7)
 (5) (8)

(6) (9)

(10)
ư cycloartobiloxanthone (7),, artoindonesianin C (11) có hoạt
Một số hợp như
tính ức chế dòng tếế bào
b ung thư biểu mô (KB); hợp chất (7),, (11), artorigidusin
ạt tính kháng dòng
(12), có hoạt d ung thư vú (BC); xanthone artonol B (10),
ne (7) và artoindonesianin C (11) có khảả năng
cycloartobiloxanthone nă gây độc với các
ổi người
tế bào ung thư phổi ng (NCI-H187) , đặc biệt hợp chất artonol có hoạt tính tốt
µg/ml trong khi chất đối chứng ellipticine đạt giá trị
nhất với IC50 1,26µg/ml tr IC50 lần lượt
với các dòng tế bào 0, µg/ml. Tất
ào trên là at 1,33; 1,46; 0,39 ấ cảả các hợp
h chất trên đã
được tìm thấy ở rễ loài
ài Artocarpus rigidus Blume [20].

O O

OH
OH O

(11) (12)
Năm
m 2004, Syah và cộng
c sự đã tách được hai hợp
ợ chất
ất isoprenyl flavones llà
artoindonesianin U (13) và artoindonesianin V (14) từ lõi
õi thân Artocarpus
chempeden, chúng thểể hiện
hi hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên
ên dòng tế
t bào P388
với IC50 lần lượt làà 2,0 và 0,5µg/ml
0, (Syah và cộng sự, 2004).
). Nhóm
N nghiên cứu sau
đó tiếp tục tách được
ợc các hợp
h chất artoindonesianin A-2, artoindonesianin A-3 (15),
heterophyllin (16),, cudraflavone C (17),, artoindonesianin T (18) từ dịch chiết
chempeden các hợp chất này đều
chloroform Artocarpus chempeden; ề thểể hiện
hiệ hoạt tính ức chế
ạ cầu
dòng tế bào bạch ầu chu
chuột P388 với giá trị IC50 lần lượt làà 3,66; 5,45; 4,50; 4,50;
7,33µg/ml [30].

(13) (14)
 (15) (16)

(17) (18)
ại prenyl flavones tách chiết
Chín loại chi từ Artocarpus altilis viz. là
cycloartocarpin (19),, artocarpin (20), chaplashin (21), morusin (22),
(22) cudraflavone B
(23),, cycloartobiloxanthone (7), artonin E (1),, cudraflavone C (17),
artobiloxanthone (8);; các hợp ăng gây độc
h chất này thể hiện khả năng độ tế bào với các
v giá trị IC50 tương tự nhau từ 2,9–14,77 µg/ml
dòng KB, BC và Vero với µ [33].

(19) (20)
 (21) (22)

(23)
Từ trái xa kê ất 5’-geranyl-2’,4’,4-
k (Artocarpus communis) các chất 5’
trihydroxychalcone (24)
(24 và 3,4,2’,4’-tetrahydroxy-3’-geranyldihydrochalcone
geranyldihydrochalcone (25)
thể hiện hoạt tính ức chế nhiều dòng tế bào ung thư trong nghiên cứu
c thử nghiệm in
vitro [trên các dòng ung thư
th nguyên bào gan (HepG2, Hep3B), ung thư
th trực tràng
(HT-29, COLO 205),
), ung thư
th gan (PLC5, Huh7)] [32].

O OH

OH O

(24)
HO OH

OH

OH O

(25)
 (26)
Yong-Hong Wang và cộng sự (2004) tiến hành tách chiết và thử hoạt tính
gây độc tế bào các chất artochamin C (26), artocarpin (20), artonin E (1) từ loài
Artocarpus chama trên một số dòng tế bào ung thư. Kết quả nghiên cứu cho thấy,
artochamin C (26) có hoạt tính ức chế mạnh trên các dòng MCF-7, 1A9, HCT-8 và
SKMEL-2 với giá trị ED50 trong khoảng 2,0-2,3 µg/mL; yếu hơn với A549, KB,
KB-VIN với ED50 là 3,0-3,4 µg/mL, tuy nhiên (26) không thể hiện hoạt tính đáng
kể nào với các dòng tế bào CAKI-1, U-87-MG, PC-3, MDA-MB- 231 khi ED50
của chúng đều lớn hơn 4,0 µg/mL. Artocarpin (20) cũng có hoạt tính ở mức trung
bình với các dòng tế bào thử nghiệm như A549, MCF-7, 1A9, HCT-8, U-87-MG,
MDA-MB-231, KB, và KB-VIN với giá trị ED50 trong khoảng 3,2-3,8 µg/mL, và
cũng không thể hiện hoạt tính trên các dòng CAKI-1, SK-MEL-2, PC-3 ở nồng độ
dưới 4,0 µg/mL. Artonin E (1) gây độc mạnh với dòng tế bào 1A9 (ED50 < 1,25
µg/ml), MCF-7 (ED50 = 2,2 µg/ml), gây độc yếu hơn trên các dòng HCT-8,
MDAMB-231 (lần lượt ED50 = 3,3 và 3,0 µg/ml)
1.3.3 Hoạt tính chống oxy hóa
Các chất chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên từ thực vật ngày càng thu hút
sự quan tâm của các nhà khoa học do khả năng tăng cường sức khỏe, giảm các bệnh
tật kinh niên của chúng. Thành phần hóa học của loài thuộc chi Artocarpus chứa
nhiều hợp chất phenol là nhóm hợp chất có tính chống oxy hóa cao, có khả năng
ứng dụng vào thực tiễn như là thực phẩm bổ sung. Do đó, việc phân lập các chất có
hoạt tính này từ các loài trong chi đã được tiến hành từ lâu và cho nhiều kết quả khả
quan.
 Các chất cycloheterophyllin (27), artonin A (28),, artonin B (29) được tìm
thấy trong một số loài thu chi Artocarpus ức chế sự peroxy hóa lipid
ài thuộc lipi do sắt trong
dịch treo mô não chuộột, loại bỏ 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl
picrylhydrazyl (DPPH) và các gốc
peroxyl O22-, gốc
ốc hydroxyl OH-
OH được tạo ra bởi 2,2’-azobis
azobis (2-amidinopropane)
(2
dihydrochloride và hệệ Fe3+–ascorbate–EDTA–H2O2 đã được
ợc Ko và
v cộng sự nghiên
cứu từ lâu. [31]

(27) (28)

(29)
ống oxy hóa của
Hoạt tính chống c các hợp chấtt geranyl flavonoid phân lập
l từ quả
Artocarpus nobilis đãã được Jayasinghe và cộng sự nghiên cứu.
ứu. Tính chất
ch chống oxi
ợ chất
hóa của các hợp ất được
đ đánh giá bằng khả năng loại
ạ bỏỏ gốc
ốc DPPH theo phương
ph
pháp sinh tự ký TLC ( TLC bio-autography
bio ủa Takao. Tất
method) của Tấ cả các hợp chất
đều thể hiện vết
ế trắng
ắng nh
nhạt trên nền màu tía ở nồng độ 1,0 µg/m
g/ml. Các hợp chất 3 -
geranyl - 2, 3’, 4, 4’ - tetrehydroxychalcon (30), 8 – geranyl - 3’, 4’, 7 -
trihydroxyflavon (31)) và isonymphaeol-B ấ vết
isonymphaeol (32) cho thấy ết trắ
trắng nhạt mạnh trên
TLC ngay cảả khi ở nồng độ thấp là 0,1 µg/ml. Do đó, tính chất
ất chống
ch oxy hóa của
các chất này được
ợc so sánh với
v α-tocopherol bằng phương
ương pháp đo
đ ảnh phổ. Giá trị
EC50 của các chất được xác định: 30 (5 µg/ml), 31 (6,3 µg/ml), 32 (4,4 µg/ml), α-
tocopherol (13,8 µg/ml). Kết quả này cho thấy các chất này đều có hoạt tính mạnh
hơn so với chất đối chứng α-tocopherol. Do đó, quả loài A. nobilis có thể giúp ích
cho con người như là nguồn giàu chất chống oxy hóa tự nhiên.[15].

(30)

(31)

(32)
Trong một nghiên cứu khác của Lin và cộng sự năm 2009, các chất
prenylflavonoid được phân lập từ vỏ rễ loài Artocarpus communis bao gồm:
cyclogeracommunin (33), artoflavone A (34), artomunoisoxanthone (35),
artocommunol CC (36), artochamin D (37), artochamin B (38),
dihydroartomunoxanthone (39), và các prenylflavonoid từ Artocarpus elasticus
như cycloartelastoxanthone (40), artelastoheterol (41), artonol A (42),
cycloartobiloxanthone (7) tất cả đều thể hiện hoạt tính ức chế các tác nhân gây oxy
hóa. Đặc biệt là các chất (34), (40), (41), (7) có hoạt tính khá cao trong thử nghiệm
chống oxy hóa DPPH với EC50 lần lượt là 24,2±0.8; 18,7±2.2; 42,2±2,8, 26,8±1,2
µM.
 (33) (34)

(35) (36)
 (37) (38)

(39) (40)

(41) (42)
1.3.4 Một số hoạt tính sinh học khác:
Ngoài hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào trên các dòng ung thư, chống oxy
hóa; những hợp chất được tách chiết từ chi Artocarpus còn có nhiều hoạt tính khác
có thể ứng dụng trong lĩnh vực y dược học.
Trong nghiên cứu chất kháng vi khuẩn lao, những hợp chất prenyl flavon
được tách ra từ rễ Artocarpus altilis gồm: cycloartocarpin (19), artocarpin (20),
chaplashin (21) , cudraflavone B (23), cycloartobiloxanthone (7), artonin E (1),
cudraflavone C (17), artobiloxanthone (8) đều thể hiện khả năng kháng lại vi khuẩn
lao Mycobacterium tuberculosis H37Ra với MIC trong khoảng từ 3.12 đến
100µg/ml, đây là một giá trị tương đối tốt khi so sánh với chất hiện đang dùng làm
thuốc lao là kanamycin với giá trị MIC đạt 2,5µg/ml [31].
Tác dụng bảo vệ tế bào, chống xơ vữa động mạch đã được chứng minh với
dịch chiết ethyl acetate của loài Artocarpus altilis, nhóm nghiên cứu cũng đã phát
hiện ra nhóm chất chính mang lại hiệu quả này trong dịch chiết là flavonoid trong
đó có β-sitosterol [33].
Bằng những thử nghiệm trên chuột, các nhà khoa học đã bước đầu chứng
minh được khả năng làm tăng đường huyết, giảm tác hại tiểu đường type II của dịch
chiết nước A.communis.
Năm 2005, Goncalves và cộng sự nghiên cứu tác dụng kháng rotavirut in
vitro của các loại thuốc truyền thống từ thực vật, trong đó có loài Artocarpus
integrifolia Lamk. Nhóm nghiên cứu nhận thấy, loài cây này có tác dụng đặc biệt
với các chủng rotavirut của người (HCR 3) và khỉ (SA-11). Ở nồng độ 480µg/ml
dịch chiết, 99,2% virut HCR 3 và 96,4% SA-11 bị ức chế. Do đó, dịch chiết của loài
này rất có tiềm năng ứng dụng để ngăn chặn dịch ỉa chảy nếu nguyên nhân được
xác định là do rotavirut.
1.4. Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro:
Với sự phát triển của khoa học công nghệ, hiện nay trên thế giới đã phát triển
nhiều phương pháp thử các hoạt tính sinh học in vitro cho kết quả chính xác cao và
thời gian thực hiện tương đối ngắn. Ở phần tiếp theo, chúng tôi sẽ đề cập đến những
phép thử phổ biến nhất.
1.4.1 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro:
Có nhiều phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro. Có thể phân
loại các phương pháp này bằng kỹ thuật đưa chất thử vào hệ thử [5].
Phương pháp dùng khoanh giấy trên môi trường đặc:
Nguyên tắc của phương pháp là xác định khả năng của chất nghiên cứu được
tẩm vào khoanh giấy, khuếch tán vào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi
khuẩn ở xung quanh ống trụ đựng chất. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của
thuốc càng mạnh.
 Phương pháp dùng ống trụ trên môi trường đặc:
Nguyên tắc của phương pháp là xác định khả năng của chất nghiên cứu được
cho vào ống trụ, khuếch tán vào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở
xung quanh ống trụ. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh.

(a) (b)

(c) (d)
Hình 1.2 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro
(a) Phương pháp dùng khoanh giấy trên môi trường đặc; (b) Phương pháp dùng ống
trụ trên môi trường đặc; (c) Phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng;
(d)Phương pháp vi định lượng trong môi trường lỏng
Phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng:
Nguyên tắc của phương pháp là dùng hang loạt ống nghiệm chứa môi trường
lỏng, có chất dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn định nghiên cứu.
Thêm những nồng độ khác nhau của chất nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn vào các
ống. Xác định nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu ức chế được sự phát triển của
vi khuẩn. Nồng độ này được gọi là nồng độ tối thiểu ức chế (MIC: minimal
inhibitory concentration). Phương pháp này còn được gọi là phương pháp hòa loãng
2 lần liên tiếp hoặc phương pháp hệ nồng độ.
Phương pháp vi định lượng trong vi môi trường lỏng (Microbroth
microtitre technique)
Phương pháp này, về nguyên tắc, chủ yếu cũng như phương pháp hòa loãng
2 lần liên tiếp, nhưng phải có dàn máy ELISA ( Enzyme linked immunosorbent
assay: thử nghiệm miễn dịch gắn enzyme), nên hiện đại hơn, nhạy hơn, nhanh hơn,
tự động, tiết kiệm và có tính định lượng cao hơn so với phương pháp hệ nồng độ
thông thường ở chỗ:
• Kỹ thuật thông thường chỉ dùng một hoặc vài ba dãy thí nghiệm, trong khi
ở đây dùng 8 dãy thí nghiệm.
• Kỹ thuật thông thường dùng 6-8 độ pha loãng khác nhau của chất thử còn ở
đây có thể dùng đến 11 độ pha loãng.
• Kỹ thuật thông thường đọc kết quả bằng mắt thường (có thể cho thêm chỉ
thị TTC), nhưng ở đây, được xác định bằng cách đo mật độ quang học ở bước sóng
492 nm của dàn máy ELISA.
Phương pháp sinh tự ký ( Bioautography)

Hình 1.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng

kháng sinh in vitro sinh ký tự
 Phương pháp này sử dụng khi đã xác định được dịch chiết toàn phần của một
dược liệu nghiên cứu có tác dụng kháng khuẩn trên một loại vi khuẩn nào đó và
muốn xác định xem thành phần nào trong dược liệu này có tác dụng.
Nguyên tắc tương tự như các phương pháp sử dụng môi trường đặc, sau khi
chạy sắc ký dịch chiết tổng có hoạt tính trên bản mỏng, tiến hành láng môi trường
thạch đặc có chứa vi khuẩn nghiên cứu, ủ 18-24h để xác định vùng vết chất làm vi
khuẩn không mọc được; đó là chất có tác dụng kháng khuẩn. Để phát hiện vi khuẩn
mọc được dễ dàng nên dùng chỉ thị màu TTC (Triphenyl tetrazolium Chloride)
1.4.2 Các phương pháp nghiên cứu tính gây độc tế bào
Một vài phép so màu nhanh đã được miêu tả trong thử nghiệm trên các dòng
tế bào ung thư ở mức độ in vitro, trong đó hiện nay người ta thường sử dụng hai
phương pháp là: phương pháp MTT và phương pháp SRB.
Phương pháp MTT:
Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng
phổ biến. Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp
chí Immunological Methods năm 1983 [1]. Theo tác giả, muối tetrazolium được
dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng
phát triển của tế bào động vật. Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám
chặt vào ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu
vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan. Kết quả đọc trên máy quang phổ
và có độ chính xác cao. Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu,
khả năng phát triển và hoạt động của tế bào.

. Tetrazolium (màu vàng) Formaran (màu tím)

 Phương pháp SRB

Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để
đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng
dụng sàng lọc thuốc ở qui mô lớn. Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu
của SRB lên protein¸ SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế
bào không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm.
Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào
pH của các dư lượng amino acid của các protein. Dưới các điều kiện môi trường
axit nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào
đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Tris-base
để hòa tan và đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng.
1.4.3. Các phương pháp nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro của chất:
Oxy không thể thiếu với sự sống, khi đi vào cơ thể, oxy tham gia nhiều quá
trình sinh hóa học. Trong quá trình đó, chúng tạo ra những tiểu phân trung gian gọi
là gốc tự do. Các gốc này có thể gây hại cho sức khỏe, do đó trong cơ thể cần thiết
duy trì sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa. Đó là
trạng thái cơ bản của cân bằng nội môi. Tuy nhiên, do nhiều tác động, cân bằng này
di chuyển theo hướng gia tăng dạng oxy hoạt động. Vì vậy việc bổ sung vào cơ thể
các dạng chất chống oxy hóa là cần thiết.
Để nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro của các chất, hiện nay có một
số phương pháp sau:
Phương pháp sử dụng DPPH
Nguyên tắc: 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do
được dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa
của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc giảm màu của
DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước song λ = 517nm.
Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II
Nguyên tắc: Ion sắt hoặc đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc
tự do. Đánh giá khả năng phòng ngừa sinh ra gốc tự do của chất nghiên cứu thể hiện
qua sự khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, không để cho tồn tại ở
trạng thái tự do, sẽ làm mất khả năng xúc tác gốc. Hoạt tính chống oxy hóa được thể
hiện qua việc ngăn chặn tạo thành phức chất có màu giữa ion sắt II và 2,2’-bipyridyl
(thuốc thử ferrozine, đặc hiệu với ion sắt II).
-
Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc superoxyd O2*
Nguyên tắc: Đánh giá khả năng phòng vệ loại bỏ gốc tự do đã sinh ra của
-
chất nghiên cứu thông qua việc ngăn chặn sự tạo thành gốc superoxyd O2* . Gốc
superoxyd được tạo thành trong phản ứng giữa xanthin và xanthin oxydase sẽ được
định lượng bằng phương pháp khử sử dụng nitroblue tetrazolim (NBT) cho phức
chất có màu tím được đo ở bước song λ = 550nm. Hoạt tính của mẫu thử được thể
hiện qua việc giảm sự hình thành phức màu tím.
Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc peroxyhydro H2O2
-
Nguyên tắc: Hai tiểu phân O2* và H2O2 sinh ra từ các chuyển hóa trong cơ
thể với nồng độ vô cùng thấp, dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại trong cơ thể
nhưng nếu hiện điện ở nồng độ cao chúng sẽ tạo ra 1O2 ,*OH là phân tử và gốc có
khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các
peroxyd và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào. Hoạt tính chống oxy hóa
của mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm H2O2 đưa đến làm giảm phản ứng
màu giữa H2O2 và đỏ phenol (màu của đỏ phenol sẽ chuyển sang màu tím sau phản
ứng với H2O2 trong sự hiện diện của enzyme peroxydase ).
 Chương 2 - THỰC NGHIỆM
2.1. Mẫu thực vật và thiết bị, hóa chất
2.1.1 Mẫu thực vật
Mẫu thực vật loài Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu thu tại khu Bảo tồn thiên
nhiên Copia, huyện Thuận Châu, tỉnh Sơn La vào tháng 6 năm 2010. Số hiệu mẫu
PVT 419. Tiêu bản do TS. Nguyễn Tiến Hiệp định tên và được lưu giữ tại Phòng
tiêu bản thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.
Mẫu lá, cành, rễ và vỏ thân sau khi thu được phơi trong bóng râm và xử lý sơ
bộ trước khi tách chiết.
2.1.2 Thiết bị và hóa chất tách chiết mẫu thực vật
Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60
F254 Merk, độ dày 0,2mmm.
Sắc ký cột tổng sử dụng silica gel cỡ hạt 0,063- 0,1 mm
Sắc ký cột thường sử dụng silica gel cỡ hạt 0,040- 0,063 mm.
Các loại cột sắc ký với kích cỡ khác nhau.
Bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254, 365nm sau đó
hiện màu bằng thuốc thử Ce(SO4) (thành phần); thuốc thử vanilin-H2SO4 (vanilin
1,2g; MeOH 200ml, CH3COOH 25ml; H2SO4 11ml)
Điểm nóng chảy đo trên máy BUCHI Melting Point B545 (Thụy Sĩ) của viện
Hóa học, viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Brucker Avance
500MHz viện Hóa học, viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Các dung môi như n-hexan, etyl axetat, diclometan, metanol, aceton, etanol
đều được cất lại trước khi sử dụng để chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng.
2.1.3 Thiết bị và hóa chất thử hoạt tính sinh học
Các môi trường nuôi cấy Merk: MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA
(Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth), TSA ( Tryptic Soy Agar ) cho vi
khuẩn; SDB (Sabouraud Dextro Broth), SDA (Sabouraud Dextro Agar) cho nấm.
 Chất tham khảo (Sigma) sử dụng trong phép thử hoạt tính kháng sinh: kháng
sinh ampicillin cho các chủng vi khuẩn Gram (+) và chủng Escherichia coli; kháng
sinh streptomycin cho chủng Pseudomonas aeruginosa; kháng sinh amphotericin B
cho nấm.
Môi trường nuôi cấy tế bào: môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào
Hep-G2, MCF-7, KB; môi trường DMEM cho LU-1; huyết thanh bò FBS
Chất tham khảo Ellipticine (Sigma) trong phép thử hoạt tính gây độc tế bào
ung thư.
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH): chất tạo ra gốc tự do
Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170);
Tủ cấy sinh học an toàn cấp II;
Máy li tâm (Universal 320R);
Kính hiển vi ngược (Zeizz);
Tủ lạnh sâu -250C,-800C;
Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ);
Máy quang phổ (Genios Tecan);
Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp chiết tách
Mẫu cành, vỏ thân, rễ và lá cây Mít lá đen được làm sạch, sấy khô ở nhiệt độ
400C, xay nhỏ và chiết riêng biệt từng loại nhiều lần ở nhiệt độ phòng với methanol.
Gộp các dịch chiết của từng lần và từng loại tương ứng, lọc và loại dung môi dưới
áp suất giảm thu được cao chiết MeOH.
Cao chiết MeOH được chiết lại lần lượt qua các dung môi có độ phân cực
tăng dần n-hexan, diclometan, etyl axetat. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu
được các cao chiết tương ứng.
Phân lập các cao chiết nhận được bằng phương pháp sắc ký cột thường, sắc
ký cột nhanh với các dung môi thích hợp.
2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc
 Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các
phương pháp phổ hiện đại như phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ
hạt nhân một chiều (1H-, 13
C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H-
COSY).
2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.2.3.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh:
Những chủng vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người do ATCC
cung cấp:
- Bacillus subtilis (ATCC 6633): là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử,
thường không gây bệnh.
- Staphylococcus aureus (ATCC 13709): cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết
thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng.
- Escherichia coli (ATCC 25922): gram (-), gây một số bệnh về đường
tiêu hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn.
- Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442): gram (-), trực khuẩn mủ xanh,
gây nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết
niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột.
- Candida albicans (ATCC 10231): là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi
ở trẻ em và các bệnh phụ khoa.
- Lactobacillus fermentum (Lp B14: )gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột
lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật.
- Enterococcus faecium (B650): gram (+), vi khuẩn gây bệnh viêm đường
tiết niệu, viêm ruột thừa, viêm màng trong tim, viêm màng não.
Phương pháp tiến hành: thực hiện dựa trên phương pháp vi định lượng trên
môi trường lỏng. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và
nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các
giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (nồng độ ức chế
50%), MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu)
 - Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất vô trùng thành một
dãy 05 nồng độ là 128 µg/ml, 32 µg/ml, 8µg/ml, 2µg/ml, 0,5µg/ml
- Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ 5.105CFU/ml khi
tiến hành thử.
- Chuẩn bị mẫu đối chứng: mẫu đối chứng (+) kháng sinh được pha trong
nước cất theo nồng độ 10mg/ml và khử trùng bằng màng lọc Millipore 0,22µm; tiến
hành các bước thì nghiệm tiếp theo tương tự như các chất thử khác . Mẫu đối chứng
(-) chất thử được thay thế bằng nước cất vô trùng.
- Sau 24h, đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại giếng
có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật.
- Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy
quang phổ TECAN bước sóng λ = 492nm và phần mềm raw data
Thí nghiệm được lặp lại với n = 3
2.2.3.2 Phương pháp thử độc tế bào
Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm:
- KB (Human epidermic carcinoma), ung thư biểu mô, là dòng luôn luôn được
sử dụng trong các phép thử độ độc tế bào.
- Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan.
- LU (Human lung carcinoma) - ung thư phổi.
- MCF-7 (Human breast carcinoma) - ung thư vú.
Phương pháp thử độ độc tế bào: được Viện Ung thư Quốc ga Hoa Kỳ (NCI)
xác nhận là phép thử nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự
phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.
Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường
nuôi cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành
phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng
tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy
chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc
tính.
 Thử độc tế bào:
- Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128 µg/ml; 32µg/ml; 8µg/ml;
2µg/ml; 0,5µg/ml. Bổ xung 200µl dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế
bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế
bào Hep-G2, MCF-7, KB; môi trường DMEM cho LU-1. Giếng điều khiển có 200
µl dung dịch tế bào 3x104 tế bào/ml. Ủ ở 370C/ 5% CO2 trong 72h.
- Sau 72h thêm 50 µl MTT (1mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không
huyết thanh) và ủ tiếp ở 370C/4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 µl DMSO lắc đều
đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.
OD điều khiển − OD mẫu
GI % = x 100
OD điều khiển
GI: Phần trăm kìm hãm sự phát triển
Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát
triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.
Thí nghiệm được lặp lại với n = 3
2.2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để
sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu.
Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được
xác định bằng cách đo quang ở bước sóng λ = 517 nm.
Cách tiến hành:
- Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1 mM trong Methanol (MeOH).
- Mẫu thử được pha loãng trong DMSO 100% theo dãy nồng độ là 128
µg/ml; 32µg/ml; 8µg/ml; 2µg/ml; 0,5µg/ml.
- Để thời gian phản ứng 30 phút ở 370C, đọc mật độ hấp thụ của DPPH chưa
phản ứng bằng máy đọc Genios Tecan ở bước sóng 517 nm. Phần trăm quét gốc tự
do DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau:
OD mẫu trắng – OD mẫu thử
% = x 100
ODtrắng
 EC50 được tính theo giá trị SC tương quan với các nồng độ khác nhau của
chất thử, thí nghiệm được lặp lại với n = 3.

Đồ thị tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ DPPH

1.8000
y = 0.3225x + 0.0241
1.6000
R 2 = 0.9938
Mật độ quang học (OD) 1.4000
1.2000

1.0000

0.8000
0.6000

0.4000

0.2000

0.0000
0.0000 1.0000 2.0000 3.0000 4.0000 5.0000 6.0000
Nồng độ DPPH mM

2.2.4 Phương pháp sử lý số liệu:

Các số liệu được xử lý bằng phương pháp xác suất thống kê.
Giá trị trung bình: X=∑ xi / n
Phương sai: S2 = ∑( xi – x)2 / (n-1)
Độ sai chuẩn: Sx= S/√
Sai số tuyệt đối: ∆x = t(α,ƒ).Sx
Kết quả: x= x ± ∆x
Khoảng giới hạn tin cậy: x = t (α,ƒ).Sx
TRong một số trường hợp còn tính sai số tương đối: A= ∆x. 100/x
Trong đó:
xi: giá trị số liệu thực nghiệm
x: trung bình cộng
n: số lần thí nghiệm
t(α,ƒ) tra theo bảng với α = 0,95; ƒ = n-1
2.3 Thực nghiệm chiết tách, tinh chế và số liệu phổ, thử hoạt tính sinh học của các
hợp chất từ loài nghiên cứu
2.3.1 Chiết mẫu thực vật
Các mẫu lá, vỏ thân, cành, rễ được nghiền nhỏ và tiến hành chiết riêng biệt.
Từng bộ phận của loài được ngâm chiết nhiều lần ở nhiệt độ phòng với methanol.
Gộp các dịch chiết của từng lần và từng loại tương ứng, lọc, loại dung môi dưới áp
suất giảm thu được cao chiết MeOH. Các mẫu chiết được gọi theo tên bộ phận cây sử
dụng.
2.3.2 Sàng lọc hoạt tính các cao chiết bộ phận:
Cao chiết lá, vỏ thân, cành, rễ sau khi loại hết dung môi, làm khô tiến hành cân và
pha loãng theo các nồng độ được sử dụng thử các hoạt tính : kháng sinh, gây độc tế bào
và chống oxy hóa DPPH theo các phương pháp đã trình bày trong phần trên (2.2.3)
2.3.3 Chiết tách và phân lập các chất từ cao chiết vỏ thân:
Tiến hành tách chiết mẫu vỏ thân theo quy trình như sau:

Mẫu vỏ thân nghiền nhỏ 1kg

Chiết siêu âm (3 lần) trong MeOH

Dịch chiết tổng MeOH 153,7g

Chiết diclometan Cất loại dung môi

Dịch chiết diclometan Cao tổng 1

Chiết
Cất loại dung môi EtOAc

Cất loại dung môi

Cao chiết diclometan 20,9g
Cao chiết EtOAc 37g Cao chiết MeOH 2 95,8g

Hình 2.1 Quy trình chiết mẫu vỏ thân cây Mít lá đen

Phân lập các chất từ cao chiết

Tiến hành phân lập các chất từ cặn chiết diclometan thân sử dụng sắc ký cột
với chất hấp phụ silica gel, dung dịch rửa giải là n-Hexan/EtOAc tăng dần tỷ lệ từ
 0-100% thu phân đoạn. Sau khi xử lý các phân đoạn bằng phương pháp sắc ký cột
lặp lại với các dung môi thích hợp, kết tinh lại thu đươc các hợp chất AFD2, AFL2,
AFD3, AFD6.

Quá trình phân lập các chất từ cao chiết DCM được khái quát theo sơ đồ sau:

Cao chiết
Diclometan (20g)

SKC silicagel n-hexan: EtOAc

(0-100%)

5% EtOAc 15% EtOAc 40% EtOAc

PHĐ B PHĐ C PHĐ E
1,3g 15mg 64mg

SKC silica-gel hệ n-hexan: EtOAc

Kết Kết tinh
(0-10%)
tinh phân đoạn
Kết tinh phân phân
đoạn đoạn
AFD2 AFL2 AFD3 AFD6
26mg 11mg 8mg 20mg

Hình 2.2: Phân lập các chất từ cao chiết DCM

Chất AFD2:
Sắc ký cột cao chiết Diclometan bằng hệ dung môi n-hexan: EtOAc với tỷ lệ
tăng dần, ở hệ dung môi n-hexan: EtOAc (95:5) thu được phân đoạn B giàu chất
AFD2 và AFL2. Tiếp tục tiến hành sắc ký cột PĐ B với hệ n-hexan: EtOAc từ 0-
5%, chúng tôi thu được các phân đoạn giàu chất ADF2, chất này sau đó được kết
tinh lại trong n-hexan thu được chất màu trắng, kết tinh dạng chùm hình kim.
AFD2 được xác định là β –sitosterol dựa trên các kết quả sắc ký bản mỏng so sánh
với chất chuẩn Rf = 0,54 (TLC, silica gel, n-hexan: EtOAc = 80:20), điểm nóng
chảy 140-1420C. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 3,52 (1H, m, H-3);
5,35 (1H, dd; 3,0 Hz, 3,0 Hz, H-6); 0,68 (3H, s, H-18); 1,01 (3H, s, H-19); 0,93
(3H, d, J = 7,0 Hz, H- 21); 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-26); 0,84 (3H, d, J = 7,0 Hz,
H-27); δH 0,85 (3H, t, J = 7,5 Hz, H- 29).
Chất AFL2:
Tương tự AFD2, sau khi sắc ký cột PĐ B và tiến hành SKBM kiểm tra các
phân đoạn, để kết tinh thu được tinh thể trắng AFL2, điểm nóng chảy 262 – 2640C;
TLC: Rf 0.78 (n-hexan-EtOAc =6:4); 1H NMR (500 MHz, CDCl3) d (ppm): 0,73
(3H, s, H-24), 0,88 (3H, s, H-25), 0,89 (3H, d, J = 2.7 Hz, H-23), 0,96 (3H, s, H-
30), 1,01 (3H, s, H-26), 1,02 (3H, s, H-27), 1,06 (3H, s, H-28), 1,19 (3H, s, H-29),
1,26 (3H, s, H-30), 1,97 (1H, m, H-1a), 2,28 (2H, m, H-2b, H-4), 2,40 (1H, m, H-
2a), 1,29-1,78 (m);
Chất AFD3:
Khi giải hấp với hệ n-hexan: EtOAc (85:15) thu được phân đoạn C chứa một
cấu tử chính. Tiến hành kết tinh lại nhiều lần bằng EtOAc thu được chất AFD3 dưới
dạng chất rắn hình vảy màu trắng; Rf = 0, 43 (TLC, silica gel, n-hexan: EtOAc =
80:20); điểm nóng chảy 276-2800C.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) d (ppm): 4;68 (2H, d, J = 32 Hz, H-29); 3,18
(m), 3,02 (m); 2,29(q); 1,96 (d); 1,69 (s, 3H, H-30); 0,76-1,66(m);
Chất AFD6:
Phân đoạn E tiếp tục được phân tách trên cột silicagel bằng hệ dung môi n-
hexan: EtOAc = 60:40 và kết tinh nhiều lần trong MeOH thu được chất bột vô định
hình màu vàng.
1H NMR (MeOD, 500MHz) δ 12,89 (1H, s, OH-5); 7,18 (1H, s, H-6’), 6,28
(1H, s, H-3’), 6.31 (1H, s, H-6), 6,08 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-11), 5,45 (1H, br d,
J=9.45Hz, H-12), 5,28 (1H, br t, J = 6,5 Hz, H-17), 3,52 (1H, br dd, J = 7,5; 15 Hz,
H-16a), 3,44 (1H, br dd, J = 7,5; 15 Hz, H-16b), 1.93 (3H, br s, H3-15), 1.84 (3H,
br s, H3-20), 1.69 (6H, br s, H3-14, 19);
2.3.4 Thử hoạt tính các chất đã phân lập
Các chất đã tinh sạch được tiến hành thử hoạt tính theo các phương pháp đã
nêu trong phần 2.2.
 Cân 3mg chất cần thử, hòa tan bằng DMSO (150µl) có giếng chất nồng độ
đầu là 20mg/ml. Tiến hành pha loãng tiếp theo tỉ lệ ¼ để được các nồng độ chất thử
tiếp theo. Chất sau khi hòa tan trong DMSO được pha loãng về các nồng độ thấp
hơn bằng nước cất cho các nồng độ lần lượt là 2,56 mg/ml; 0,64 mg/ml;0,16 mg/ml;
0,04 mg/ml; 0,01 mg/ml. Sử dụng 10 µl chất thử đã pha loãng cho mỗi giếng thử
nghiệm để được các nồng độ 128 µg/ml; 32µg/ml; 8µg/ml; 2µg/ml; 0,5µg/ml.
Tiến hành thử theo các phương pháp đã nêu.
 Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả sàng lọc sơ bộ hoạt tính các dịch chiết tổng từ Artocarpus
nigrifolius C. Y. Wu
Tiến hành ngâm chiết riêng các mẫu (theo phương pháp đã nêu ở phần 2.3),
lượng cao chiết mỗi bộ phận thu được như sau:
Bảng 3.1 Hiệu suất ngâm chiết các bộ phận cây mẫu
STT Tên mẫu Khối lượng mẫu Khối lượng cao chiết Hiệu suất
khô (gam) thu được (gam) chiết (%)
1 Vỏ thân 40 2,46 6,15
2 Thân 40 1,30 3,25
3 Rễ 40 1,28 3,20
4 Lá 40 2,65 6,62
Vậy, bộ phận lá và vỏ thân cho hiệu suất chiết cao nhất đạt hơn 6%.
Để lựa chọn bộ phận mẫu có khả năng chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh
học tốt, chúng tôi tiến hành các phép thử.
3.1.1 Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng sinh các cao chiết tổng Artocarpus
nigrifolius C. Y. Wu
Theo tài liệu đã công bố chi Artocarpus phân bố ở các nước trên thế giới có
hoạt tính kháng sinh nên chúng tôi tiến hành thử hoạt tính này đối với các bộ phận
khác nhau của cây thu hái ở Việt Nam. Theo phương pháp đã được mô tả ở phần
2.2.3.1 chúng tôi đã thu được các kết quả trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.2 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của cao chiết
Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu
Tên mẫu IC50 (µg/ml)
Chủng vi sinh vật Lá Vỏ thân Cành Rễ
Gram Lactobacillus fermentum 4,25 91,4 >128 95,09
(+) Bacillus subtilis 3,65 71,62 >128 64,32
Staphylococcus aureus 5,49 20,97 88,80 74,13
Gram Salmonella enterica >128 >128 >128 >128
(-) Escherichia coli >128 >128 >128 >128
Pseudomonas aeruginosa >128 >128 >128 >128
Nấm Candida albican >128 >128 >128 >128

Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của các mẫu trên các chủng vi sinh vật gram
(+), gram (-) và nấm được trình bày ở bảng 3.1 cho thấy mẫu lá, vỏ thân, cành và rễ
đều có hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật gram (+) nhưng hầu như không kháng
các chủng vi khuẩn gram (–) và nấm kiểm định trên. Trong đó mẫu lá có hoạt tính
mạnh nhất thể hiện giá trị IC50 nhỏ nhất với chủng Lactobacillus fermentum,
Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus lần lượt là 4,25; 3,65; 5,49 µg/ml. Ngoài ra
mẫu vỏ thân cũng cho hoạt tính khá tốt, đặc biệt kháng với chủng Staphylococcus
aureus với giá trị IC50 là 20,97µg/ml.
Các nghiên cứu hoạt tính kháng sinh cao chiết lá, thân, vỏ, rễ của các loài
khác trong chi Artocarpus cũng cho phổ kháng sinh tương đối rộng với nhiều chủng
vi khuẩn. Như kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng sinh cao chiết nước loài
Artocarpus heterophyllus của Khan và cộng sự ( 2003) cho thấy hoạt tính ức chế
của cao chiết với các chủng như S.aureus, E. faecalis, S. typhimurium và E. coli.
Kết quả này chứng minh tác dụng kháng viêm của cây này đã đươc dùng
trong y học cổ truyền; góp phần định hướng cho việc sử dụng và khai thác loài như
một kháng sinh thực vật chữa các bệnh do vi khuẩn gram (+) gây ra.
3.1.2. Kết quả thử hoạt tính chống ôxy hoá DPPH
Hoạt tính chống oxy hóa gần đây được quan tâm nhiều hơn bởi nó như một
chìa khóa vạn năng cho các nghiên cứu hoạt tính sinh học khác. Các chất chống oxy
hóa được biết đến như vitamin E, vitamin C, lycopen, resveratrol, và một số chất
trao đổi thứ cấp khác trong cây. Các chất này được bổ sung vào dược phẩm và thực
phẩm chức năng có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể, phòng và
điều trị các bệnh do gốc tự do sinh ra như tiểu đường, tim mạch, alzheimer, ung
thư….Các chất chống oxy hóa nguồn gốc thực vật đang được ưa chuộng do đặc
điểm lý hóa của chúng như thân thiện với cơ thể, bền nhiệt … các chất này thường
có bản chất là các polyphenon. Theo như tài liệu đã công bố, chi Mít rất giàu
polyphenon và cũng có hoạt tính chống oxy hóa tương đối cao. Do vậy chúng tôi
tiến hành thử hoạt tính chống oxy hóa nhằm tìm kiếm các hoạt chất có hoạt tính
chống oxy hóa mới có nguồn gốc thực vật. DPPH là gốc tự do có màu tím hấp thụ
cực đại ở bước sóng 517 nm nó đại diện cho các gốc tự do có bản chất hóa học.
Chất thử có khả năng khử gốc tự do này nghĩa là chúng làm mất màu DPPH, quan
sát khả năng làm mất màu DPPH của chất thử nhiều hay ít để có thể đánh giá mức
độ chống oxy hóa của chất thử. Ở đây chúng tôi tiến hành thử khả năng bẫy gốc tự
do DPPH của các cao chiết tổng methanol của lá, vỏ thân, rễ và cành. Kết quả được
chỉ ra sau đây.
Bảng 3.3. Hoạt tính chống ôxy hoá của các mẫu lá, vỏ thân, rễ và cành
Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu
EC50
STT Ký hiệu mẫu
(µg/ml)
1 Vỏ thân 42,08
2 Lá 80,09
3 Rễ 61,05
4 Cành >128
Đối chứng dương Resveratrol 8,50

Kết quả ở bảng trên cho thấy, cao chiết methanol của mẫu vỏ thân, lá, rễ có
hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Đặc biệt, mẫu vỏ thân có hoạt tính mạnh nhất thể
hiện ở nồng độ có hiệu quả bẫy gốc tự do DPPH (EC50) là 42,08 µg/ml. Kết quả
này gấp 5 lần so với chất tham khảo là resveratrol (chất này được sử dụng như là
một chất chống oxy hóa hiệu quả). Do đó có thể tiến tới nghiên cứu sâu hơn để tìm
kiếm hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa có giá trị như resveratrol đã được tìm
thấy trong quả nho từ dịch chiết vỏ thân của loài Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu
này.
 Theo nghiên cứu của Lin và cộng sự năm 2009, nhóm nghiên cứu cũng đã
phân lập được các chất prenylflavonoid từ cao chiết vỏ rễ loài Artocarpus
communis có hoạt tính chống oxy hóa mạnh với giá trị ED50 đạt từ 18,7 đến 45µM.
3.1.3. Thử hoạt tính gây độc tế bào
Rất nhiều hợp chất có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư đã được phân
lập từ chi Artocarpus, hứa hẹn khả năng ứng dụng của chúng trong việc chữa trị
ung thư, một căn bệnh nan y hiện nay.
Tiến hành sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết các bộ phận cây
theo phương pháp đã mô tả ở phần 2.2.3.2, chúng tôi đã thu được những kết quả
như sau:
Bảng 3.4. Hoạt tính gây độc tế bào của các cao dịch chiết các bộ phận
loài Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu
IC50 (µg/ml)
Tên mẫu
TT KB HepG2 Lu MCF7
1 Vỏ thân 21,03 52,45 56,20 20,10
2 Lá 24,20 50,28 35,84 22,68
3 Rễ 55,62 54,48 86,64 75,46
4 Cành 19,21 10,06 71,66 46,03
ĐC Ellipticine 0,51-1,25

Kết quả bảng 3.3 và hình 3.1 chỉ ra rằng bốn cao chiết methanol từ vỏ thân,
lá, cành và rễ của Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu đều thể hiện hoạt tính gây độc
tế bào trên cả 4 dòng ung thư thực nghiệm KB, HepG2, Lu và MCF7 sau 72 h nuôi
cấy. Hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu thử phụ thuộc vào nồng độ, nồng độ
càng cao thì khả năng gây độc càng mạnh. Giá trị IC50 của các mẫu thử đối với cả
bốn dòng tế bào trên trong khoảng 10µg/ml – 86µg/ml. Trong đó, cao chiết
methanol từ cành có hoạt tính tốt thể hiện ở giá trị IC50 thấp nhất lần lượt là 10,06
và 19,21 µg/ml trên dòng tế bào HepG2 và KB. Cao chiết methanol từ rễ cho hoạt
tính yếu thể hiện ở giá trị IC50 lớn hơn là 55,62 - 86,64 µg/ml. Cao chiết vỏ thân có
hoạt tính trung bình
ình nhưng
nh đặc biệt có hoạt tính gây độc
độ chọn
ọn lọc
lọ với 2 dòng tế bào
KB và MCF7 thểể hiện
ện ở giá IC50 là 21,03 và 20,10 µg/ml thấp
ấp hơn
h so với giá trị
IC50 trên dòng HepG2, Lu.
ậ kết
Như vậy, ết quả cho thấy bộ phận vỏ thân loài Artocarpus nigrifolius
nigrifol
ệ hoạt
C.Y.Wu thể hiện ạt tính tốt sinh, gây độc tế bào và
t với cả ba hoạtt tính : kháng sinh
chống oxy hóa hệệ DPPH.
DPPH Do đó, chúng tôi quyết định chọn
ọn bộ ph
phận này để nghiên
cứu sâu hơn về thành
ành phần ọ của
ph hóa học và hoạt tính sinh học ủa các chất
ch đã tách được
ếm các chất
nhằm tìm kiếm chấ có hoạt tính sinh học cao có khảả năng
nă ứng dụng trong
phòng và điều trịị bệnh.
ệnh.
ần hóa học
3.2. Thành phần họ của loài Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu:
ầ mẫu
Chọn phần ẫu vỏ thân để phân lập các chất,
t, chúng tôi tiế
tiến hành quy trình
phân lập các chất theo các bước
b đã được đưa ra trong phần thực
ực nghiệm.
nghi Sắc ký cột
ết dichlometan với hệ dung môi rửa giải làà hỗn
silica-gel cao chiết h hợp n-hexan:
EtOAc theo tỷỷ lệệ tăng
ăng dầ
dần EtOAc (0-100%) thu được các hợp
ợp chất:
ch AFD2, AFL2,
ADF3, ADF6.

Hình 3.1 Sắc ột số phân đoạn cao

S ký cột cao chiết DCM và SKBM một
chiết mẫu vỏ thân
 • Chất AFD2: β –sitosterol
–

H H β-sitosterol
sitosterol
3
HO
6

Chất thu được

ợc dưới
d ắng trong hỗn
dạng kết tinh hình kim màu trắng h hợp n-hexan
và EtOAc. Dựa trên
ên các kết ận thấy
k quả sắc ký bản mỏng so sánh nhận th hợp chất tách
được từ cao chiết
ết thân AFD2 với mẫu β-sitosterol chuẩn cùng có Rf = 0,54 (TLC,
silica gel, n-hexan: 80:20 Phổ 1H-NMR củaa AFD2 tr
hexan: EtOAc = 80:20). trùng với phổ của β-
ẩn: có tín hiệu
sitosterol chuẩn: hi δ= 3,52 ppm đặc trưng cho H-3 và δ= 5,35 ppm đặc
ậy, hợp
trưng cho H-6. Vậy, hợ chất AFD2 được xác định là β-sitosterol,
sitosterol, một hợp chất
steroid tồn tại phổổ biến trong thực
th vật.

AFD2 β

Hình 3.2 Sắc ký bản mỏng so sánh của ADF2 vàà β-sitosterol
• Chấtt AFL2 : friedelan
friedelan-3-one
Phổ 1H-NMR bi đây là mộtt triterpen khung friedelan th
NMR cho biết thể hiện qua tín
hiệu củaa 8 nhóm metyl bao ggồm 7 tín hiệu singlet ở δH 0,73,
,73, 0,87, 0,96, 1,00, 1,01,
ới 1 tín hiệu
1,05, 1,18 cùng với hi double ở δH 0,88 (3H, d; J=6,4
6,4 Hz;
Hz H-23). Trên phổ
1
ấy các tín hiệu
H-NMR còn cho thấy Hz được
hi tại 2,39 (1H, ddd; J = 2,0; 5,0 & 13,8 Hz)
gán cho 2H-a và 2,30 (1H, dd; J=7,2 & 13,0Hz) được gán cho 2H-b ; 2,24 (1H, q;
J=6,5 Hz) cho H4.

Friedelan-3-one

Phổ 13C-NMR được nêu trong bảng 3.4 cho thấy phân tử AFL2 có 30 nguyên
tử carbon bao gồm 7 carbon bậc 4 trong đó có tín hiệu của một nhóm carbonyl ở δC
= 213,1ppm ; 4 tín hiệu CH, 11 tín hiệu CH2 và 8 tín hiệu CH3. Ngoài tín hiệu ở
213,1 ppm, tất cả các tín hiệu của các carbon còn lại đều ở trong vùng từ 6,82 –
59,54 ppm cho thấy trong phân tử chỉ có một nhóm chức carbonyl.
Các số liệu phổ thu được hoàn toàn đồng nhất với số liệu phổ của friedelan-
3-one trong tài liệu [22]. Do đó, cấu trúc của hợp chất được xác định là friedelan-
3-one (friedelin). Trong một nghiên cứu gần đây, thử nghiệm hoạt tính gây độc tế
bào cho thấy friedelan-3-one có hoạt tính gây độc với dòng tế bào lympho T (T-
lymphoblastic leukemia, CEMSS) ở giá trị LD50 là 5,8 µg/ml [25]. Ngoài ra, các
nghiên cứu khác cũng cho thấy chất này có tác dụng kháng viêm, giảm đau và hạ
sốt trên chuột thực nghiệm [25].
• Chất AFD3: axit betulinic
Đây là chất kết tinh ở dạng tinh thể hình kim không màu trong MeOH,
không hấp thụ tia tử ngoại, điểm nóng chảy 276-280oC.
 Axit betulinic

Phổ 1H- NMR cho các thấy sự hiện diện của hai proton nhóm exometylen [
δH 4,61 (1H, br s, H-29) và 4,74 (1H, br s, H=29)], một tín hiệu OH [ δH = 3,19
(1H, dd, J =11,3 và 4,8 Hz, H-3)], một proton allyl [ δH 3,00 (1H, dt, J =11,0 và
4,8 Hz,H-19)], một nhóm metyl vinyl [ δH 1,69 (3H, s, H3-30)], và 5 nhóm metyl
bậc ba [ δH 0,76 (3H, s, H3-24), 0,83 (3H, s, H3-25), 0,94 (3H, s, H3-23), 0,97 (3H,
s, H3-26) và 0,98 (3H, s, H3-27)].
13
Phổ C - NMR cho các pic cộng hưởng ứng với sự hiện diện của 30
carbon, trong đó có hai carbon của nhóm exometylen [ δc 151,0(s, C-20) và
109,5(t, C-29)], một carbon của nhóm –COOH [ δc 179,4(s, C-28)] và một carbon
sp3 mang oxygen [ δc 78,9(d, C-3)].
Tổng hợp các số liệu trên cho thấy chất AFD3 có công thức phân tử là
C30H48O3 với độ bất bão hòa bằng 7. Trừ đi một nối đôi C=C của nhóm
exometylen và một nhóm –COOH thì hợp chất này phải có 5 vòng. Do đó có thể
kết luận hợp chất này là một triterpen acid mang một nhóm exometylen, một
nhóm metyl vinyl, một nhóm –OH tự do và 6 nhóm metyl. Ngoài ra sự hiện diện
của nối đôi exometylen và một nhóm metyl vinyl cho thấy trong phân tử có nhóm
isopropenyl [δc 151,0(s, C-20) và 109,5(t, C-29) và 19,1(q, C-30)].
Các số liệu phổ trên phù hợp với số liệu phổ của acid bentulinic trong các
tài liệu [14].
Axít bentulinic được phân lập từ rất nhiều loài thực vật như Cornus florida,
Zizyphus vulgaris, Arbutus menziesii,… Gần đây người ta đã phát hiện ra nhiều
hoạt tính sinh học lý thú của nó như hoạt tính kháng HIV, kháng khuẩn, kháng
nấm, kháng viêm, kháng sốt rét, chống ung thư. Axit betulinic là tác nhân ức chế
cọn lọc đối với các u ác tính ở người bằng cách gây ra hiện tượng apoptosis.
Trong nghiên cứu kháng khuẩn kháng nấm, axit betulinic ức chế sự phát triển của
nhiều loại nấm khác nhau với MIC trong vùng 12-47 µg/ml. Tốt nhất với chủng
Microsporum canis (12 µg/ml) [14].
Bảng 3.5: 13C – NMR của các chất AFL2 và AFD3 (CDCl3)
và (CDCl3 + CD3OD)
Chất Axit betulinic Friedelan - 3 - one
C
1 t38,8t 22,3
2 27,1t 41,5t
3 78,9d 213,1s
4 38,7s 58,3d
5 55,3d 42,1s
6 18,3t 41,3t
7 34,3t 18,3t
8 40,7s 53,1d
9 50,5d 37,5s
10 37,1s 59,5d
11 20,9t 35,7t
12 25,5t 30,5t
13 38,3d 39,7s
14 42,4s 38,3s
15 30,6t 32,5t
16 32,2t 36,0t
17 56,2t 30,0s
18 46,9d 42,9d
 19 49,5d 35,4t
20 150,6s 28,2s
21 29,6t 32,8t
22 37,2t 39,3t
23 27,9q 6,8q
24 15,3q 14,7q
25 15,9q 17,9q
26 16,0q 20,3q
27 14,6q 18,7q
28 179,3s 32,1q
29 109,4t 35,0q
30 19,3q 31,8q

• Chất AFD6 : artochamin B

Artochamin B

AFD6 được tách ra từ cây có dạng bột vàng cấu trúc vô định hình, có công
thức phân tử là C25H24O7 được xác định nhờ các phổ NMR, HMQC,HMBC.
Phổ 1H NMR của AFD6 trùng lặp với phổ 1H-NMR artochamin B [34], có
tín hiệu proton của nhóm hydroxyl δ = 12,89(1H, s,OH), tín hiệu của một nhóm
isoprenyl đóng vòng [δ= 6,08 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-11), δ= 5,45 (1H, br d, J= 9,5
Hz), và hai nhóm metyl singlet ở δ=1,93 và 1,69ppm. Tín hiệu của một nhóm
isoprenyl không đóng vòng có δ= 5,28ppm (1H, t, J = 6,5 Hz, H-17), tín hiệu δ=
3,52ppm (1H, dd, J = 7,5; 15Hz, H-16a) và 3,44 (1H, dd, J = 7,5; 15Hz, H-16b),
nhóm metyl δ 1,84 và 1,69ppm (mỗi 3H, br s)]. Phổ 1H NMR cũng cho thấy 3 tín
hiệu singlet của vòng thơm tại δ 7,18ppm được gán cho H-4 (1H, s), δ= 6,35 và
6,21ppm được gán cho H-7 và H-10.
Cấu trúc phân tử của AFD6 được khẳng định rõ hơn dựa trên dữ liệu phổ
13
C-NMR và các phổ 2D HMQC, HMBC phù hợp với các dữ liệu đã công bố trong
tài liệu [34]. Do đó, cấu trúc phân tử của artochamin B (AFD6) được xác định là:
2,3,8,10-tetrahydroxy-11-(3-methyl-2-butenyl)-6-(2-methyl-1-propenyl)-6H,7H-
[1]benzopyrano[4,3-b][1]benzopyran-7-one.
Đây là lần đầu tiên thành phần hóa học của cây Mít lá đen được nghiên cứu ở
Việt Nam. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ cao chiết
diclometan cho thấy cây có chứa các hợp chất triterpenoid (axit bentulinic,
friedelin), hợp chất steroid (β-sitosterol) và hợp chất flavon (artochamin B). Qua kết
quả thử hoạt tính sinh học của cao chiết và các tài liệu tham khảo về các nhóm chất
trên, có thể hy vọng đây chính là các hợp chất góp phần tạo nên hoạt tính của cây.
3.3. Hoạt tính sinh học của các chất:
Tiến hành thử hoạt tính kháng sinh, hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính
chống oxy hóa DPPH của các chất ta thu được những kết quả như sau:
3.3.1 Hoạt tính kháng sinh:
Thử nghiệm với các chủng vi khuẩn gram (-); gram (+) và nấm thu được các
kết quả như trong bảng:
Bảng 3.6 Hoạt tính kháng sinh của các chất chiết tách từ loài
Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu
TT 1 2 3 4
Tên mẫu AFD2 AFL2 AFD3 AFD6
Gram Lactobacilus fermentum >128 >128 nt >128
(+) Bacillus subtilis >128 >128 nt 21,79
Staphylococcus aureus >128 >128 nt 25,14
 Gram Salmonella enterica >128 >128 nt >128
(-) Escherichia coli >128 >128 nt >128
Pseudomonas aeruginosa >128 >128 nt >128
Nấm Candida albican >128 >128 nt >128
Bảng kết quả trên cho thấy: Các chất gồm AFD2, AFL2 không thể hiện hoạt
tính trên các chủng vi sinh vật kiểm định ở nồng độ thấp hơn 128µg/ml.
Hợp chất artochamin B (AFD6) có hoạt tính khá mạnh với các dòng Bacillus
subtilis, Staphylococcus aureus với giá trị IC50 đạt được lần lượt là 21,79 và 25,14
µg/ml.
Hoạt tính kháng khuẩn còn thể hiện rõ hơn ở phần trăm ức chế sự phát triển
của vi sinh vật phụ thuộc vào nồng độ chất thử. Nồng độ chất thử càng cao thì phần
trăm ức chế càng lớn. Ở nồng độ 128 µg/ml AFD6 ức chế hoàn toàn sự phát triển
của Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus (hình 3.3).

Bs Sa

100
87
70

0 0 0
0,5 2 8 32 128
nồng độ chất thử (µg/ml)

Hình 3.3: Tỉ lệ phần trăm ức chế vi sinh vật theo các nồng độ của AFD6
Theo một số tài liệu axit betulinic (AFD3) cũng có hoạt tính kháng E.coli và
một số chủng khác, tuy nhiên kết quả đưa ra là giá trị MIC tương đối cao
(250µg/ml) [14]. Do vậy AFD3 không phải là hoạt hoạt chất có hoạt tính kháng
sinh chính trong cây này. Kết quả nghiên cứu trên cho phép chúng tôi dự kiến chất
artochamin B là hoạt chất chính gây hoạt tính kháng sinh của cây Mít lá đen thu hái
ở Việt Nam.
3.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào:
Tiến hành thử độc tế bào với các chất AFD2 và AFD6 đã phân lập được trên
các dòng tế bào ung thư; chúng tôi thu được các kết quả như sau:
Bảng 3.7 Hoạt tính gây độc trên dòng tế bào KB và Hep-G2 của các chất
Dòng tế % ức chế tại nồng độ IC50
STT Tên mẫu
bào 128 32 8 2 0,5 (µg/ml)
KB 99 75 50 32 11 8
1 AFD2
Hep-G2 58 53 49 39 36 14
KB 100 100 96 90 17 1,18
2 AFD6
Hep-G2 99 97 88 35 32 3,6
KB 0,51
ĐC Ellipticin
Hep-G2 0,35

Ctr+ 32 µg/ml

8 µg/ml 0,5 µg/ml

Hình 3.4 Minh họa ảnh hưởng của AFD6 trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB
 Ctr + 32 µg/ml

8 µg/ml 0,5 µg/ml

Hình 3.5 Minh họa ảnh

ả hưởng của AFD6 trên dòng tế bào ào ung thư
th gan Hep-G2
ết quả 3.7 ta nhận thấy: khả năng ức chếế của
Từ bảng kết ủa AFD6 với các tế bào
ạnh, thể hiện ở giá trị IC50 thấp đạtt 3,6 µg/ml và 1,18 µg/ml lần
ung thư là khá mạnh,
lượt với các dòng
òng KB và Hep-G2.
Hep ươ đương với
Kết quả này cũng tương v các kết quả đã
ạt tính gây độc tế bào của các chất tách được
công bố về hoạt ợ từ
ừ chi Mít.
ũng có khả năng ức chế dòng Hep-G2,
AFD2 cũng G2, tuy nhiên hoạt
ho tính này không
cao, ở nồng độ 128 µg/ml AFD2 ức chế được 58% số lượng
ợng tế bào Hep-G2 và đạt
IC50 tương đối tốt là 8 µg/ml với dòng KB.
Hoạt tính gây độc
đ tế bào trên 2 dòng ung thư
ư MCF7 và Lu của
c AFD6 và
ử nghiệm
AFD2 trong thử ự: chất ADF2 có hoạt
nghiệ tiếp theo cũng cho kết quả tương tự:
tính không cao đặc
ặc biệt ạt tính tốt
biệ với dòng tế bào Lu; AFD6 có hoạt tố hơn. Với dòng tế
bào MCF7, artochamin B (AFD6) cũng
c ức chế hơn 95% lượng
ợng tế bào ở các nồng độ
ơn 8 µg/ml và đạt giá trị IC50 là 4,59 µg/ml. Trên dòng tế
chất thử lớn hơn t bào Lu thì
 ất thử nghiệm đều thấp hơn, giá trị IC50 củủa AFD6 chỉ đạt: 20
hoạt tính của các chất
µg/ml . Kết quảả thử
ử nghiệm
nghiệ được trình bày trong bảng dưới
ớ đây:
ảng 3.8 Hoạt tính gây độc trên dòng tế bào
Bảng ào MCF7 của
c các chất

Dòng tế % ức chếế tại

ạ nồng
ồng độ IC50
STT Tên mẫu
bào 128 32 8 2 0,5 (µg/ml)
MCF7 60 55 45 42 25 20
1 AFD2
Lu 28 17 13 4 1 >128
MCF7 99 96 95 15 15 4,59
2 AFD6
Lu 99 95 8 5 1 20
MCF7 0,53
ĐC Ellipticin
Lu 0,45
Như vậy, ở hoạtạt tính gây độc tế bào, hợp chất AFD6 đã thểể hiện hoạt tính khá
mạnh.
ế quảả thử nghi
Các kết nghiệm hoạt tính gây độc tế bào đối
ố với
ới các ddòng tế bào ung
ên đây
thư thực nghiệm trên đ cho phép sử dụng AFD6 như một
ột hoạt
hoạ chất có nguồn gốc
ệc ph
thảo dược trong việc phòng và điều trị ung thư đặc biệt làà ung thư gan.

Ctr+ 32 µg/ml

8 µg/ml 0,5 µg/ml

h ảnh hưởng của AFD6 trên dòng tế bào

Hình 3.6 Minh họa ào ung thư vú MCF7
 Ctr+ 32 µg/ml

8 µg/ml 0,5 µg/ml

Hình 3.7 Minh họa ảnh hưởng của AFD6 trên dòng tế bào ung thư phổi Lu
3.3.2 Hoạt tính chống oxy hóa:
Sử dụng phương pháp thử nghiệm chất chống oxy hóa với 1,1-diphenyl- 2-
picrylhydrazyl (DPPH) là các gốc tự do; chúng tôi tiến hành thử hoạt tính của hợp
chất artochamin B phân lập được từ loài Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu, thu được
kết quả như sau:
Bảng 3.9 Hoạt tính chống oxy hóa của AFD6
Hoạt tính chống oxy hóa
STT Tên mẫu % ức chế tại nồng độ
EC50(µg/ml)
128 32 8 2 0,5
AFD6 91,4 85,34 30,94 4,6 0 20,51
ĐC Resveratrol 8,50
 Hình 3.8 Minh họa thử nghiệm chống
ng oxy hóa theo
phương pháp sử dụng DPPH của AFD6
Từ kết quả trên,
ên, chúng tôi nhận
nh thấy,
y, artochamin B llà chất có khả năng
ốt. Giá trị ức chế có hiệu quả các gốc tự
chống oxy hóa tốt. ự do DPPH của
c chất đạt EC50
= 20,51 µg/ml; điều này
ày là bởi ấ thuộc
b artochamin B là hợp chất ộc nhóm flavonoid, một
m
nhóm chất đã được chứ
ứng minh có khả năng chống oxy hóa rất
ất hiệu
hiệ quả.
ậy, qua kết
Như vậy, ọc của các hợp
kế quả thử nghiệm hoạt tính sinh học h chất được
phân lập từ loài thể thấy:
ài Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu có thể ấy: artochamin B có hoạt
ho
ất cả các thử nghiệm. Trong đó, artochamin B có tác động đặc
tính tốt nhất trong tất
biệt tốt với các dòng
òng ung thư ă ức chế cả 4 dòng tế bào
th thử nghiệm, nó có khả năng
và đạt IC50 tốt nhất trên
ên dòng KB là 1,18 µg/ml.
 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Về hoạt tính dịch chiết các bộ phận của cây:
Bốn dịch chiết các bộ phận cây mít lá đen gồm: vỏ thân, lá, cành, rễ đều thể
hiện hoạt tính trong các thử nghiệm. Trong đó:
- Hoạt tính kháng sinh: các dịch chiết lá, vỏ thân, cành, rễ đều có hoạt tính
kháng chủng vi sinh vật gram (+) với IC50 trong khoảng 3,65- 95,09 µg/ml.
- Hoạt tính chống ô xy hoá DPPH: ngoài mẫu cành, các mẫu đều có hoạt
tính, đặc biệt mẫu vỏ thân có hoạt tính mạnh nhất với giá trị EC50 là 42,08 µg/ml.
- Hoạt tính gây độc tế bào: bốn cặn chiết đều thể hiện hoạt tính gây độc tế
bào trên cả 4 dòng ung thư thực nghiệm KB, HepG2, Lu và MCF7 với các giá trị
IC50 trong khoảng 10µg/ml – 86µg/ml.
2. Về thành phần hóa học của cây:
Từ vỏ thân loài mít lá đen (Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu) thu hái tại Sơn
La đã phân lập được các chất:
- Hai hợp chất triterpenoid: axit bentulinic, friedelin
- Một hợp chất steroid là β-sitosterol
- Một hợp chất flavon là artochamin B
3. Về hoạt tính sinh học các chất phân lập được:
Các chất phân lập được thể hiện hoạt tính khác nhau trong mỗi thử nghiệm,
trong đó, artochamin B là hợp chất có hoạt tính tốt nhất; với khả năng ức chế
Bacillus subtilis (IC50 là 21,79 µg/ml), Staphylococcus aureus (IC50 là 25,14
µg/ml), gây độc trên cả bốn dòng tế bào ung thư KB, HepG2, Lu và MCF7 với các
giá trị IC50 lần lượt là 1,18; 3,6; 20,0; 4,59 µg/ml, hoạt tính chống oxy hóa mạnh với
giá trị EC50 là 20,51 µg/ml.
KIẾN NGHỊ:
Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính của các chất, đặc biệt là artochamin
B để có thể áp dụng vào thực tiễn.
Những dịch chiết bộ phận khác của cây cũng có nhiều hoạt tính tốt và cần
tiếp tục được nghiên cứu.
 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam,
Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật- Hà Nội.
2. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học.
3. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học- Hà Nội.
4. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản trẻ - TP. Hồ Chí Minh
5. Viện Dược liệu- Bộ Y tế (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của
thuốc từ dược thảo, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật- Hà Nội.
6. Nguyễn Chí Bảo (2012), Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế
bào của cây Chay lá to (Artocarpus lakoocha Roxb.) và cây Mít dai
(Artocarpus heterophyllus LamK.) ở Việt Nam, Luận văn Tiến sĩ Hóa học ,
Viện Hóa học.
Tiếng Anh
7. Anima Pandey and S.P.Bhatnagar (2009), “Preliminary photochemical screening
and antimicrobial studies on Artocarpus lakoocha Roxb”, Ancient science of
life, Vol 28, No 4, pp. 21-24
8. Charoenlarp, P.Radomyos, P.Harinasuta (1981), “Treatment of taeniasis with
Puag-Haad: a crude extract of Artocarpus lakoocha wood”, The Southeast
Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health 12, 568–570.
9. Euis Holisotan Hakima, Asnizara, Yurnawilisa, Norio Aimib, Mariko Kitajimab,
Hiromitsu Takayamab (2002), “Artoindonesianin P, a new prenylated
flavones with cytotoxic activity from Artocarpus lanceifolius”, Fitoterapia,
vol.73, pp. 668–673
10. R.I John Fresney (1993): “Culture of animal Cells: A manual of basis
techniques, 3rd Edition”, Wiley & Sons Inc., New York.
11. Hadacek, F., Greger, H. (2000), “Test of antifungal natural products
methodolagies, comparability of result and assay choise”, Phytochem. Anal.,
90, 137-147.
12. Iqbal Musthapa, Lia D. Juliawaty, Yana M. Syah, Euis H. Hakim, Jalifah Latip,
and Emilio L. Ghisalberti (2009), “An Oxepinoflavone from Artocarpus
elasticus with Cytotoxic Activity Against P-388 Cells”, Arch Pharm Res,
Vol 32, No 2, pp. 191-194
13. Junichi Kitajima, Toru Ishikawa, Eiko Fujimatu, Kyoko Kondho, Tomomi
Takayanagi (2003), “Glycoside of 2-C-methyl-D-erthritol from the fruits of
anise, coriander and cumin”, Phytochemistry, Vol.62, pp.115-120
14. L.J. Shai, L.J.McGaw, M.A.Aderogha, L.K.Mdee, J.N.Eloff (2008), “Four
pentacyclic triterpenoids with antifungal and antibacterial activity from
Curtisia dentate (Burm.f) C.A.Sm.leaves”, Journal of Ethnopharmacology,
vol.119, pp.238-244.
15. Lin, K.W., Liu, C.H., Tu, H.Y., Ko, H.H., Wei, B.L., 2009, “Antioxidant
prenylflavonoids from Artocarpus communis and Artocarpus elasticus”,
Food Chemistry 115, 558–562.
16. M.R. Khan, A.D. Omoloso, M. Kihara (2003), “Antibacterial activity of
Artocarpus heterophyllus”, Fitoterapia , Vol.74, pp. 501–505
17. Manjeshwar Shrinath Baliga, Arnadi Ramachandrayya Shivashankara,
Raghavendra Haniadka, Jerome Dsouza, Harshith P. Bhat (2011),
“Phytochemistry, nutritional and pharmacological properties of Artocarpus
heterophyllus Lam (jackfruit): A review”, Food Research International, vol.
44, pp.1800–1811.
18. Mossmann, T., (1983) “Rapid colorimetric assay for cellular growth and
survival: application to proliferation and cytotoxicity assays”, J. Immunol.
Meth.65, 55-63.
19. NajihahMohd Hashim, M. Rahmani, G.Cheng Lian Ee, Mohd A. Sukari, M.
Yahayu, W.Oktima, A. Ali and Rusea Go (2012), “Antiproliferative Activity
 of Xanthones Isolated from Artocarpus obtusus”, Journal of Biomedicine
and Biotechnology, Volume 2012, Article ID 130627
20. Namdaung, U., Aroonrerk, N., Suksamrarn, S., Danwisetkanjana, K.,
Saenboonrueng, J., Arjchomphu, W., Suksamrarn, A., (2006), “ Bioactive
constituents of the root bark of Artocarpus rigidus subsp. rigidus”,
Chemical & Pharmaceutical Bulletin, vol.54, pp.1433–1436.
21. Pual Cos, Louis Maes, Jean-Bosco Sindambiwe, Arnold J. Vlietinck, Dirk
Vanden Berghe; “ Bioassay for antibacterial and antifungal activities”;
Laboratory for Microbiology, Parasitology and Hygien, Faculty of
Pharmaceutical, Biomedical and Veterinary Sciences, University of
Antwerp, Belgium,1-13 (2005)
22. Ratna Asmah Susidarti, M.Rahmani, A.Manaf Ali, M.Aspollah Sukari, Hazar
B.M.Ismail, “ Friedelin from Kelat merah” , Eugenia chlorantha Duthie.
23. Scudiero D. A., Shoemaker R. H., Kenneth D. P., Monks A., et al, (1988),
“Evaluation of a soluable tetrazolium/ formazan assay for cell growth and
drug sensibility in culture using human and other tumor cell lines.”, Cancer
Reaseach. 48: 4827-4833.
24. Shashi B. Mahato and Asish P. Kundu (1994), “13C-NMR spectra of
pentacyclic triterpenoids, a compilation and some salient features”,
Phytochemistry, Vol. 37, No. 6, pp. 1517-1575
25. Sisay Feleke and Abeba Brehane (2005), “ Triterpene compounds from latex of
Ficus sur I”, Chemical Society of Ethiopia, Vol.19(2), pp. 307-310
26. Stefan Berger, Dieter Sicker (2009), “Classic in spectroscopy – Isolation and
structure elucidation of natural products”, Wiley – VCH, pp. 481-499.
27. Suhartati, T., Achmad, S.A., Aimi, N., Hakim, E.H., Kitajima, M., Takayama,
H., Takeya, K., (2001), “Artoindonesianin L, a new prenylated flavone with
cytotoxicity activity from Artocarpus rotunda”, Fitoterapia, vol. 72,
pp.912–918.
28. Suhartati, T., Yandri, Hadi, S. (2008), “ The bioactivity test of artonin E from
the bark of Artocarpus rigida Blume”, European Journal of Scientific
Research, vol.23, pp.330–337.
29. Supawatchara Singhatong, Donrawee Leelarungrayub and Chaiyavat Chaiyasut
(2010), “Antioxidant and toxicity activities of Artocarpus lakoocha Roxb.
heartwood extract”, Journal of Medicinal Plants Research, Vol. 4(10), pp.
947-953.
30. Syah, Y.M., Achmad, S.A., Ghisalberti, E.L., Hakim, E.H., Mujahidin, D.
(2004), “ Two new cytotoxic isoprenylated flavones, artoindonesianin U and
V from heartwood of A. chempeden”, Fitoterapia , vol.75, pp. 134–140.
31. U.B. Jagtap, V.A. Bapat (2010), “Artocarpus: A review of its traditional uses,
phytochemistry and pharmacology”, Journal of Ethnopharmacology 129
(2010) 142–166.
32. Victor Kuete, Patrick Y Ango, Ghislain W Fotso, Gilbert DWF Kapche, Jean P
Dzoyem, Arlette G Wouking, Bonaventure T Ngadjui and Berhanu M
Abegaz (2011), “Antimicrobial activities of the methanol extract and
compounds from Artocarpus communis (Moraceae)”, BMC Complementary
and Alternative Medicine.
33. Wang, Y., Deng, T., Lin, L., Pan, Y., Zheng, X., (2006), “Bioassay guided
isolation of antiatherosclerotic phytochemicals from Artocarpus altilis”,
Phytotherapy Research 20, 1052–1055
34. Yong-Hong Wang, Ai-Jun Hou, Lei Chen, Dao-Feng Chen, Han-Dong Sun,
Qin-Shi Zhao, Kenneth F. Bastow, Yuka Nakanish, Xi-Hong Wangn, Kuo-
Hsiung Lee (2004), “New Isoprenylated Flavones, Artochamins A-E, and
Cytotoxic Principles from Artocarpus chama”, J. Nat. Prod 67, 757-761
 PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của chất AFD2 58

Phụ lục 2: Các phổ của chất AFL2 59
Phụ lục 3: Các phổ của hợp chất AFD3 60
Phụ lục 4: Phổ 1H-NMR của chất AFD6 61
Phụ lục 5: Phổ 13C-NMR của chất AFD6 62
Phụ lục 7: Phổ 13C CPD & DEPT của chất AFD6 63
Phụ lục 8: Phổ HSQC và HMBC của chất AFD6 64
Phổ HMBC của chất AFD6