Lipaze

Lipaze
Lipolitički enzimi, kojima pripadaju lipaze su vrlo važna
skupina enzima nađenim u gotovo svim organizmima.
Glavna uloga triacilglicerol lipaza u metabolizmu je razgradnja
i sinteza triacilglicerola.
Lipaze hidroliziraju triacilglicerole, pri čemu nastaje smjesa di-
i monoacilglicerola, te masne kiseline i glicerol.
Lipaze kataliziraju sintezu mono-di- i triacilglicerola iz masnih
kiselina i glicerola.
Katalitičko djelovanje lipaza i triacilglicerola netopljivih u vodi
odvija se preko međugranične površine. U vodi su lipaze
neaktivne, ali su zato aktivne u prisutnosti druge faze
(lipidne).
Takvo svojstvo je zasnovano na strukturnom obliku lipaza.
 Struktura lipaza
Svaka lipaza podjednako srodnih organizama pokazuje izrazitu
različitost sekvenci.

Unutar sekvenci ostaje ista opća osobina, kao pentapeptid

GXSXG (gdje je G je glicin, S je serin, X je bilo koja
aminokiselina). Ova je sekvenca pronađena kod svih lipaza.

U ovoj trijadi, serin je jedini pronađen u pentapeptidu.

Druga osobina je prisutnost serina, asparginske kiseline i

histidina, odnosno u svakom žljebu ostatka proteina (aktivnom
središtu) nalaze se serin, asparginska kiselina i histidin i
označavaju katalitičku trijadu.
Sekvencije aminokiselina različitih lipaza
Enzimi Sekvencija Opaska
Porodica gena humanih lipaza Smatra se da ova tri enzima
Pankreasna lipaza imaju istu tercijarnu strukturu.
NVHVIGHSLGAHAA
Do sada je dostupna samo X-
Lipoproteinska lipaza NVHLLGYSLGAHAA ray od pankreasne lipaze.
Lipaza iz jetre HVHLIGYSLGAHVS
Porodica lipaza dobivenih iz Ovi enzimi imaju istu strukturu
gljiva nabiranja i dostupan je njihov
X-ray.
Rhizopus delamar KVIVTGHSLGGAQA
Mucor miehei (RmL) KVAVTGHSLGGATA
Bakterijske lipaze Imaju promjenjivu sekvencu
aminokiselina i sastav, do
Pseudomonas fragi RVNLIGHSQGALTA
sada nije dostupna X-ray
Moraxella TA144 (Lip3) NTHVGGNSMGGAIS struktura.
Ostali Ove lipaze nemaju sličnosti u
Geotricum candidum lipaze genskoj mapi, aktivno središte
KVMIFGESAGAMSV
serina (Ser) u Pseudomonas
Pseudomonas sp. KVGLVGYCLGGALA sp. je zamijenjeno sa cisteinom
(Cys)
Aktivno središte RmL

Asp 203
O O
H H O
N N Ser 144
His 257
Stereo- i regiospecifičnost lipaza
Prema regiospecifičnosti, lipaze se mogu podijeliti u tri skupine:
¾ u prvu grupu se svrstavaju nespecifične lipaze (npr. Candida
cylindracae, Corynebacterium acnes, Staphylococcus aureus),
odnosno ove lipaze nespecifično napadaju acilglicerol dajući
smjesu masnih kiselina i glicerola koji odmah reagiraju dajući
monogliceride i digliceride
¾ drugoj grupi pripadaju one lipaze koje napadaju masne
kiseline na poziciji 1- i 3- triacilglicerola (npr. Aspergillus niger,
Mucor javanicus i Rhizopus arrbizus)
¾ trećoj grupi pripadaju one lipaze koje su specifične za
pojedinu masnu kiselinu (npr. Geotrichum candidium specifičan
za oleinsku kiselinu).
 Lipaza

Cijele stanice Slobodna lipaza

Kotlasti ili cijevni reaktor

Oleokemikalije Transesterificirane
masti - Strukturirani
Djelovanje lipaze
lipidi
na ulja i masti
Lijekovi
Posebne masti
Arome
 Transesterifikacija

Hidroliza
Esterifikacija
Lipazom katalizirane reakcije

Konstanta ravnoteže
Sustav sa reverznim Emulzijski sustav
micelama (micele)

R
E
E A,R

A
E
E
Lipazom katalizirana hidroliza
(esterifikacija)
 Hidroliza masti i ulja

• hidroliza maslinova ulja

(Yamane, T., et al., Ann.N.Y.Acad.Sci. 501 (1987) 224-228)
• hidroliza palmina ulja
(Knežević, Z.D., et al., Appl. Microbial. Biotechnol. 49 (1998)
267-271)
• hidroliza ulja iz srdele i ulja iz tune
(Shimada, Y., et al., JAOCS 72 (11)(1995) 1323-1327)
• hidroliza repičina ulja
(McNeill, G.P. i Sonnet, P.E. JAOCS, 72(2)(1995) 213-218)
 Esterifikacija

• esterifikacija etanola oleinskom kiselinom

(Colombié, S.C., et al., Biotechnol. Bioeng. 60(3) (1998) 362-
368)
• esterifikacija metanola oleinskom kiselinom
(Ramamurthi, S. i McCurdy, A.R., JAOCS 71 (9) (1994) 927-
930)
• esterifikacija glicerola oleinskom kiselinom
(Castillo, E., et al., JAOCS 74(2) (1997) 77-85)
• esterifikacija glicerola linoleinskom kiselinom
(Arcos, J.A., et al., Biotechnol.Lett. 20(6) (1998) 617-621)
• esterifikacija glicerola kaprinskom kiselinom
(Kwon, D.Y., et.al., JAOCS 74(10)(1997) 1287-1289)
• esterifikacija propilenglikola PUFA-ma
(Liu, K.J. i Shaw, J.F., JAOCS 72(11)(1995) 1271-1274)
Lipazom katalizirana transesterifikacija

a. transesterifikacija triglicerida

CH2OX CH2OZ CH2OX CH2OZ CH2OZ

CHOY + CH2 OY CHOY + CH2 OY + CH2 OY
CH2 OX CH2 OZ CH2 OX CH2 OX CH2 OZ

b. transesterifikacija triglicerida + masna kiselina

CH2OX CH2OX CH2OZ CH2OZ

CHOY + HOZ CHOY + +
CH2 OY CH2 OY + HOZ + HOX
CH2 OX CH2 OX CH2 OX CH2 OZ
 Transesterifikacija ulja i masti

• transesterifikacija palmina ulja stearinskom kiselinom

(Macrae, A.R., Phil.Trans.R.Soc.Lond.B 310 (1985) 227-233)
• transesterifikacija maslinova ulja stearinskom kiselinom
(Macrae, A.R., JAOCS 60(2)(1983) 291-294)
• transesterifikacija palmina ulja tristearinom
(Castillo, E., et al., JAOCS 74(2) (1997) 77-85)
• transesterifikacija tripalmitina tristearinom
(Basheer, S., et al., JAOCS 72(2) (1995) 231-237)
• transesterifikacija ulja bakalara PUFA-om
(Akoh, C.C., et al., JAOCS 72(11) (1995) 1317- 1321)
• transesterifikacija trioleina maslačnom i kapronskom
kiselinom
(Fomuso, L.B. i Akoh, C.C., JAOCS 74(3) (1997) 269-272)
• transesterifikacija trioleina kaprilnom kiselinom
(Akoh, C.C. i Huang, K.H., J.Food Lipids 2(1995) 219-230)
 Transesterifikacija

• transesterifikacija trioleina etilkaprilatom

(Huang, K.S. i Akoh, C.C., JAOCS 72(2) (1996) 245-250)
• transesterifikacija ribljeg ulja i trikaprilina
(Lee, K.T. i Akoh, C.C., JAOCS 75(4)(1998) 495-499)
• transesterifikacija trikaproina trilinoleinom
(Fomuso, L.B. i Akoh, C.C., JAOCS 75(3) (1998) 405-410)
• transesterifikacija svinjske masti i suncokretova ulja
(Seriburi, V. i Akoh, C.C., JAOCS 75(10) (1998) 1339-1345)
• transesterifikacija trioleina stearinskom kiselinom
(Seriburi, V. i Akoh, C.C., JAOCS 75(4) (1998) 511-516)

• transesterifikacija maslinova ulja kaprilnom kiselinom

(J.Giacometti, Č.Milin, Đ.Vasić-Rački, EFB Working Party on
Applied Biocatalysis, 22-26 September 1998,
Portorož, Slovenia)
Enzimska modifikacija u triacilglicerolnom za
dobivanje zamjenskog produkta kakao maslaca

• transesterifikacija palmina ulja stearinskom kiselinom

P P P St
O + HSt O + O + O + HP +HSt
P P St St

Transesterifikacija je provođena u kotlastom reaktoru.

Palmino ulje i stearinska kiselina, u omjeru 1,0:0,5 (w/w) su
otopljeni u petroleteru i miješani 16 sati na 40oC uz lipazu iz
Aspergillus nigera.
Analiza dobivenih triacilglicerola pokazuje da je
transesterifikacija palmina ulja stearinskom kiselinom 1- i 3-
regiospecifična sa većom proizvodnjom POSt (1(3)-palmitoil-
3(1)-steroil-2-monoolein) i StOSt (1,3-disteroil-2-monoolein).
POSt i StOSt su najvažniji triacilgliceroli u kakao maslacu, pa
se ova reakcija može provoditi za dobivanje zamjenskog
produkta kakao maslaca.
Enzimska modifikacija ulja bakalara polinezasićenim
dugolančanim masnim kiselinama (PUFA) ili etilnim
esterima polinezasićenih dugolančanih masnih kiselina
(PUFEE)

Transesterifikacija ulja bakalara polinezasićenim dugolančanim

masnim kiselinama ili etilnim esterima polinezasićenih
dugolančanih masnih kiselina, provođena je u omjeru 1:3 (w/w)
uz miješanje pri 60-65oC. Reakcije su provođene 48 sati, uz
10% Lipozyma u inertnoj atmosferi dušika.

O R O R'
O OR R'COOR''
+ R'COOR'' O O R'
+
O O R O O R' RCOOR''
PUFA ili
O PUFEE O

trigliceridi iz ulja bakalara

ili triolinolein
 Esterifikacija propilenglikola i PUFA
(EPA – C20:5, DHA – C22:6)

OH EPA
OH + EPA OH
H H

Enzimska esterifikacija propilen glikola i PUFA (EPA i DHA)

provođena je pri molnom omjeru 4,5:1, pri 40oC, tijekom 24
sata uz smjesu otapala (n-heksan/t-butanol, 9:1). U
esterifikaciji su testirane lipaze iz Aspergillus niger, Mucor sp.,
Pseudomonas fluorescens, Rhizopus sp., Candida cylindracea,
Chromobacterium viscosum. Imobilizirana lipaza iz Mucor
miehei je najbolji enzim za sintezu estera propilen glikola i
PUFA. Produkt dobiven esterifikacijom primjenjuje se za
sniženje hipertrigliceridemiju.
Hidroliza masti i ulja u cilju proizvodnje
slobodnih masnih kiselina kao sirovina

• lipazom katalizirana hidroliza maslinova ulja

• lipazom katalizirana hidroliza palmina ulja
• lipazom katalizirana hidroliza ulja iz srdela i ulja iz tune
• lipazom katalizirana hidroliza repičinog ulja
Hidroliza repičinog ulja provođena je radi dobivanja
eručinske kiseline (C22:1, ∆13).
 Rezolucija racemične smjese u organskoj
sintezi
Produkt Međuprodukt ili produkt Optimalni uvjeti Izvori
PPL/BuOH:97%ee, Wünsche,K.,et al.,
OH OH konv. 49% 1996.
ArO NHR Cl OTos

(S)-β-bloker “C3 kiron”

Cl L/H2O:99,8% ee, Mitsuda, S., et al.,
49% konv. 1989.
O
H
O
H HO
O CN CN
O

(S,S)-fenvalerat (piretroidni
insekticid)
H
esteraza NP: Sonawane, H.R.,et al., 1992.
H Me
Me 98% ee, 39% conv.
COOMe COOMe

MeO MeO

(S)-naproxen
PPL: 95% ee Bianchi, D., et.al., 1988.
OH O
COOH
Me3N COO

(R) karnitin