EKSPRESI GEN

Dr.Febriani, M.Si
 Central dogma of bioinformatics and genomics

DNA RNA protein phenotype

genomic cDNA protein

DNA ESTs sequence
databases UniGene databases

Jurusan Kimia FMIPA Universitas Syiah Kuala

 Ekspresi gen
 merupakan rangkaian proses penerjemahan
informasi genetik (dalam bentuk
urutan basa pada DNA atau RNA menjadi protein,
dan lebih jauh lagi: fenotipe.

 Informasi yang dibawa bahan genetik tidak

bermakna apa pun bagi suatu organisme apabila
tidak diekspresikan menjadi fenotipe.
 Protein

 Protein merupakan molekular biologi yang

sangat penting
 Protein terdiri dari asam-asam amino
 Ada 20 jenis asam amino yang membangun
protein
 Fungsi protein tergantung pada urutan asam
amino

4
From gene to
protein

5
Kontrol ekspresi gen
bakteri
Regulasi Gen
Gene Control in Prokaryotes

 An operon can be defined as a cluster gene that encode

the proteins necessary to perform coordinated function

 Genes of the same operon have related functions within

the cell and are turned on (expressed) and off together
(suppressed).

 The first operon discovered was the lac operon so named

because its products are involved in lactose breakdown.
An operon consists of:

 a promoter (binding site for RNA polymerase)

 a repressor binding site called an operator that overlaps

the promoter.

 structural genes
Operator
 Repressor proteins encoded by repressor genes, are
synthesized to regulate gene expression.

 They bind to the operator site to block transcription by RNA

polymerase.

Promoter
 The promoter sequences are recognized by RNA polymerase.

 When RNA polymerase binds to the promoter, transcription

occurs
Activators
 The activity of RNA polymerase is also regulated by
interaction with accessory proteins called activators

 The presence of the activator removes repression and

transcription occurs
 Pengikatan aktivator atau represor pada promoter ditentukan oleh
keberadaan suatu molekul efektor yg biasanya berupa molekul kecil,
misalnya asam amino, gula atau metabolit serupa lainnya
 Molekul efektor yg mengaktifkan ekspresi suatu gen disebut induser,
sedangkan yg bersifat menekan ekspresi suatu gen disebut represor

Promotor Gen
daerah daerah
represor represor
promotor operator

12
13
 Gen daerah daerah Tiga gen struktural operon laktosa
represor promotor operator

Tiga gen struktural penyandi enzim-enzim pengurai laktosa tidak diekspresi

14
An Inducible Operon in the Absence of an Inducer
(The Lactose Operon)

repressor
gene

15
 Gen daerah daerah Tiga gen struktural operon laktosa
represor promotor operator

Tiga gen struktural penyandi enzim-enzim pengurai laktosa diekspresi

16
 Gen daerah daerah
represor promotor operator lima gen struktural operon laktosa

lima enzim yang

diperlukan untuk
sintesis triptofan

17
A Repressible Operon in the Absence of a Corepressor
(The Tryptophan (trp) Operon)

Gen
represor

18
 Gen daerah daerah
represor promotor operator lima gen struktural operon laktosa

19
A Repressible Operon in the Presence of a Corepressor
(The Tryptophan (trp) Operon)

repressor
gene

Without the transcription of the five genes, the five enzymes needed for
the bacterium to synthesize the amino acid tryptophan are not made.

20
 Overview of bacterial
expression systems for
heterologous protein production
 Ekspresi protein asing pada sistem prokariot
merupakan pendekatan yang telah digunakan
secara luas untuk mendapatkan protein yang
diinginkan
 Pemilihan Jenis vektor ekspresi dan sel inang yang
sesuai sangat menentukan keberhasilan ekspresi
dari gen yang telah di klon.
 Contoh : Gen lipase thermostabil dari G
thermoleovorans CCR11

 4 kontruksi genetik untuk lipase rekombinan

didisain dan diekspresikan diE.coli
1, gen struktural lipase dalam vektor Pinpoint Xa
2.Gen struktural lipase dalam ventor pET 28 a
3.Gen struktural lipase tanpa signal peptida dalam
vektor pET-3b
4,Gen struktural lipase beserta promotor nativenya
dalam vektor p.GEM-T
 Ekspresi dibawah kontrol T7 dan T7 Lac
menghasilkan peningkatan aktivitas lipase
sebanyak 40 dan 36 kali dibandingkan aktivitas
aslinya,
 Keempat lipase memiliki pH optimum yang sama
namun memiliki suhu optimum dan spesifisitas
substrat yang berbeda dengan induknya. Terutama
untuk rekombinan yang mengandung fusin taq
 Sangat perlu menemukan sisterm eksprsi yang
sesuai tanpa mengganggu folding proteinnya
 Contoh Ekspresi di Vektor Ekspresi

Skema kontrol ekspresi gen dibawah kendali promoter T7lac (Novagen).

 RNA polimerase dari E. coli tidak mengenali promotor T7 maupun
turunannya seperti promoter T7lac sehingga gen lipase yang
berada dibawah kontrol promoter ini hanya akan
ditranskripsikan oleh T7 RNA polimerase.
 Tidak semua galur E.coli yang digunakan sebagai sel inang
memiliki gen yang mengkode T7 RNA polimerase.
 Sel inang yang mampu mengekspresikan T7 RNA polimerase
merupakan lysogen dari bacteriophage DE3, yaitu suatu turunan
lambda yang membawa fragmen DNA yang mengandung gen
lacI, promotor lacUV5 dan gen T7 RNA polimerase.
 Salah satu galur yang sering digunakan adalah E. coli BL21(DE3)
(Novy et al., 2001, Studier et al., 1986). Ekspresi dari T7 RNA
polimerase berada dibawah kontrol promotor lacUV5 yang hanya
akan aktif dengan induksi IPTG atau laktosa.
 Promotor T7lac, tidak seperti promoter T7 pada umumnya,
memiliki tambahan kontrol ekspresi gen dari adanya ekstra 25
pb operator lac di hilir dari 17 pb daerah promotor T7.
 Pengikatan represor lac pada daerah operator secara efektif
mengurangi transkripsi gen lipase oleh T7 RNA polimerase.
 Mekanisme kontrol ganda ini diperlukan untuk mencegah
ekspresi dari gen asing oleh T7 RNA polimerase walaupun tanpa
adanya IPTG.
 Promotor T7 sangat kuat sehingga jika diinduksi secara penuh
hampir semua sumber daya dari sel inang digunakan untuk
mengekspresikan gen asing (Dubendorff et al., 1991). Hal ini bisa
berbahaya terutama jika ekspresi protein asing dapat menjadi
racun bagi sel inang sehingga menghambat pertumbuhannya.
CONSTRUCTION OF EXPRESSION VECTORS
 Elektroforesis Protein Hasil Ekspresi

Elektroforegram SDS-PAGE (1) Marker protein (2) ekstrak kasar E.

coli yang membawa plasmid pET30(a) (3) ekstrak kasar E. coli yang
membawa plasmid pITBlip1.2 Ekstrak kasar diperoleh dengan cara
sonikasi.
Elektroforegram SDS-PAGE (1) Marker protein (2) ekstrak kasar lipase ITB1.2
(3) Protein hasil pemanasan pada 60oC, 30 menit (4) protein hasil ultrafiltrasi
(5) Protein hasil pemurnian dengan kromatografi Ni-NTA.
Figure 3: The life cycle of SARS-CoV-2 in host cells; begins its life cycle when S protein
binds to the cellular receptor ACE2. After receptor binding, the conformation change
in the S protein facilitates viral envelope fusion with the cell membrane through
the endosomal pathway. Then SARS-CoV-2 releases RNA into the host cell.
Genome RNA is translated into viral replicase polyproteins pp1a and 1ab, which are
then cleaved into small products by viral proteinases.
The polymerase produces a series of subgenomic mRNAs by discontinuous
transcription and finally translated into relevant viral proteins. Viral proteins and
genome RNA are subsequently assembled into virions in the ER and Golgi and
then transported via vesicles and released out of the cell.
Figure 4: Betacoronaviruses genome organization; The Betacoronavirus for human
(SARS-CoV2, SARS-CoV and MERS-CoV) genome comprises of the 5'-untranslated
region (5'-UTR), open reading frame (orf) 1a/b (green box) encoding non-structural
proteins (nsp) for replication, structural proteins including spike (blue box),
envelop (maroon box), membrane (pink box), and nucleocapsid (cyan box) proteins,
accessory proteins (light gray boxes) such as orf 3, 6, 7a, 7b, 8 and 9b in
the SARS-CoV-2 genome, and the 3'-untranslated region (3'-UTR).
The doted underlined in red are the protein which shows key variation between
SARS-CoV-2 and SARS-CoV. The length of nsps and orfs are not drawn in scale.