Sản xuất kháng sinh

I. Sản xuất kháng sinh nhóm β-lactam

1) Quy trình lên men sản xuất penicillin
a) Đặc điểm chủng giống
- Penicillium notatum (1928- A.flemming)
- Penicillium chrysogenum ( 1950- ĐH Wisconsin): ít sinh ra sắc tố vàng
nên sản phẩm dễ tách chiết hơn => dc xem là chủng gốc của hầu hết các
chủng công nghiệp đang sử dụng hiện nay trên toàn TG
✓ Nấm mốc, họ nấm cúc, chi mốc xanh
✓ Ưa mát; to=24-30oC
✓ Ưa ẩm
✓ Ph= 6.0-6.5
✓ Rất hiếu khí
b) Điều kiện lên men
- Nhiệt độ: nhân giống 30oC; Lên men 24oC
- pH: 6.0-6.5
- cấp khí: rất hiếu khí (1.2-1.5 VVM);
+ với lưu lượng 1.2-1.5 sục khí từ dưới lên
+ cánh khuấy có đường kính phù hợp, V nồi lên men phù hợp
+ kiểm soát nồng độ khí dựa vào hình thái bào tử nấm, sự phát triển của
sợi nấm về độ dài: thiếu khí thì bào tử nổi lên bề mặt, đủ khí thì bào tử ở
trong long môi trường
+ khi khuấy trộn sợi nấm vo viên lại với nhau tạo pellet nấm; pellet xốp
giúp khí dễ vào và lên men tốt
- thời gian: 6-7 ngày
c) Môi trường dinh dưỡng
- Hydratcacbon: đường đơn, đường đôi
• Glucose: sau 48h đầu chủng vsv đồng hóa hết nên cần bổ sung
• Lactose: cùng với glucose sử dụng nhiều theo tỷ lệ 1:1

1
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 • Saccarose, tinh bột, dextrin: nấm mốc có sinh men amylase giúp
thủy phân tinh bột; cần thủy phân tinh bột trước khi dung=> thủy
phân sơ bộ=> giúp điều chỉnh nồng độ tinh bột
• Acid hữu cơ ( a lactic, acetic,…)
- Nito
• N vô cơ: muối amoni, nitrat
• N hữu cơ, giàu aa: cao ngô (chứa nhiều cysteine, valin), bột lạc
- Kim loại vi lượng
• Mg, Mn, Fe, Zn, Na, Cu,… ( nước máy, cao ngô)
- Lưu huỳnh
• Na K sunfat; Na2S2O3
- Chất tiền thể
• Acid phenyl acetic: PeG
• Acid phenoxyacetic: PeV
• Cao ngô (2%)
 Thời điểm cho chất tiền thể: sau 48h, thời điểm chuyển giao từ
pha sinh trưởng sang pha cân bằng
- Chất điều chỉnh pH (ko nhất thiết phải điều chỉnh pH; có thể dung hệ
đệm phosphate, carbonat) , dầu phá bọt (dung trong lên men chìm)…
 Sau 24h nuôi cấy có hiện tượng bị nhiễm trùng thì loại bỏ bằng
cách bổ sung glucose, tiệt trùng, cấy giống

2) 2 phương pháp lên men sản xuất penicillin

Lên men bề mặt Lên men chìm
1. Bán rắn: hạt hoặc cám 1. Pha sinh trưởng
2. Lỏng: chai Roux (váng: • Đặc điểm pha này;
lên men lần 2) : vì chỉ + phát triển hệ sợi => sinh khối tăng
tiếp xúc vs MT dd ở + đồng hóa glucose tốc độ cao
trên BM nên vsv chậm + rất ít KS hoặc tiền KS được sinh ra
già hóa => có thể tận + vsv tiếp xúc hoàn toàn với môi trường
dụng MT sau khi tách lỏng nên hiệu suất cao, độ vô trùng tốt
váng để lên men lần 2

2
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 3. Điều kiên lên men: + quy trình phức tạp nhưng dễ kiểm soát
- Nhiệt độ: 24-30oC hơn, nhân công phải dc đào tạo
- Thời gian: 6-7 • Nguồn HC: glu-lactose với tỷ lệ 1:1
ngày • Nhu cầu oxy lớn: sục khí oxy 1.2-1.5VVM
- Cấp khí vô trùng • Ph tăng : làm giảm hiệu suất=> chỉnh pH
liên tục
- Hiệu suất thấp 2. Pha sinh kháng sinh (sau 48h)
(<200UI/ml) và • Đặc điểm
khó giữ vô trùng + sinh khối phát triển chậm, sinh KS
- UD: dịch lọc Pe=> + hệ sợi phát triển chậm
rửa vết thương + khi pH>8.0 thì hệ sợi tự phân => KS giảm
dần => nên kết thúc trước tự phân
+ KS là sản phẩm ngoại bào
• Nguồn HC: bổ sung lactose nếu hết glucose
• pH tăng 7.0-7.5
• tiền chất: bổ sung tiền chất cao ngô; acid
phenylacetic-PeG; acid phenoxyacetic-PeV)

Sinh khối

Kháng sinh

Dinh dưỡng

48h

3) Quá trình chiết xuất thu nhận penicillin

QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ PENICILIN
- Dịch lên men để ở điều kiện 4oC
- Lọc dịch lên men thu được sinh khối và dịch lọc

3
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 - Dịch lọc tiếp tục được acid hóa bằng H2SO4 30%, pH=2.5
- Chiết bằng Butyl acetat do penicillin tan tốt trong dm này (pH=2-3)
- Cô
- Tẩy màu bằng than hoạt, lọc lấy phần dịch
- Loại nước
- Kết tinh ở nhiệt độ -20oC
- Thêm acetat Na, K thu được Pe G (Na, K)
- Rửa bằng butanol và Sấy 50oC

II. Sản xuất 6-APA và các kháng sinh penicilin bán tổng hợp
- Pen G dưới td của enzyme Penicillinamidase tạo ra Acid 6-aminopenicilanic
(6-APA) và acid phenylacetic
- Tính chất 6-APA
• không có hoạt tính KS với tụ cầu
• bị phá huỷ bởi penicillinase
• tinh thể trắng, bền
• độ chảy 209 – 210oC
• tan ít trong nước và d/môi hữu cơ.

- Định hướng SX Pe bán TH từ 6-APA

• acyl hoá nhóm NH2 ở vị trí số 6
• ester hoá nhóm -COOH ở vị trí số 3.

1. CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT 6-APA. So sánh ưu nhược điểm của 2
phương pháp sản xuất
Pp hóa học Pp sinh học
Nguyên tắc: sx penG, sx enzyme=> tiến hành thủy
phân nhờ enzyme hoặc vsv
1970: từ Pe G bằng 4 Lên men từ PP enzym vi sinh vật
phản ứng Penicilium: - sử dụng enzyme penicilinamidase
- hiệu suất cao, sd phổ biến

4
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 ✓ Hiệu suất cao (90 - tương tự lên - Chiết lấy enzyme penicilinamidase
- 95%) men Pe (penicilinacylase) từ VSV để tiến
hành p/ứ thủy phân
 Không sử - Có thể tiến hành cố định enzyme
dụng hoặc VSV (E. coli, B. megatherium)
để tiến hành phản ứng liên tục,
nhiều lần
- 6-APA tạo thành được tách bằng
cách kết tủa ở điểm đẳng điện
(pH=4,3), sắc ký trao đổi
ion...

khi sd enzyme từ vsv chỉ cần tách lấy

dịch sau đó chiết 6-APA
✓ Điều kiện p/ứ rất - hiệu suất Vsv xạ khuẩn, Vk: e. coli;
khó (-40°C) thấp nấm men, nấm B.megatherium
✓ Hoá chất đắt tiền - tách chiết mốc
✓ Tiêu hao năng phức tạp ✓ P-amidase ✓ P-amidase nội
lượng, dung môi ngoại bào bào
✓ Nguy cơ ô nhiễm ✓ thuỷ phân Pe ✓ thuỷ phân Pe
môi trường K, F, V nhanh G nhanh
✓ thuỷ phân Pe ✓ pH = 9,0
G rất chậm ✓ Vk ruột nên
(<100 lần) ưa nhiệt 35-
✓ pH = 7,3 - 8,5 40OC
✓ ? enzyme
acylase

III. Sinh tổng hợp các Cephalosporin và sản xuất 7-ACA, 7-ADCA
và các kháng sinh bán tổng hợp nhóm Cephalosporin

1. Trình bày được quy trình sinh tổng hợp Cephalosprin C

❖ Chủng giống: Cephalosporium acremonium với hoạt lực 2000μg/ml

5
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 ❖ Quá trình STH tạo ra Pe-N, từ đó hình thành Cephalosporin C
❖ Các điều kiện lên men, thành phần dinh dưỡng tương tự như lên men Pe.

2. Trình bày được nguyên tắc của các pp sản xuất 7-ACA và 7-ADCA

• Nguyên tắc
7-ACA 7 - ADCA
- Cắt mạch nhánh Cephalosporin C => -Loại nhóm acetoxy của 7-ACA tạo
7-ACA bằng pp hóa học hoặc bằng thành 7-ADCA bằng pp hóa học
enzym VSV -Tổng hợp từ Pe G qua 3 p/ứ (hiệu
(tương tự SX 6-APA) suất cao <> giá thành cao)

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYM

I. Nêu được ưu nhược điểm của các nguồn nguyên liệu trong SX
enzyme
❖ Đại cương enzyme
➢ Định nghĩa enzyme : Có trong tế bào, Bản chất protein; là Chất xúc tác sinh
học:
– cường độ xúc tác mạnh
– đặc hiệu
➢ Cấu trúc
- Enzym đơn giản: protein (~100/3.000)
- Enzym phức tạp:
+ protein (apoenzym)
+ không protein (coenzym)
- Các L - α - amino acid kết hợp bằng liên kết peptit
- Trọng lượng từ 12.000 đến 1.000.000 Dalton
➢ Tính chất
- Có hoạt tính xúc tác mạnh, đặc hiệu

6
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 - Trọng lượng phân tử lớn => khó qua màng tế bào
- Lưỡng tính, tan trong nước, muối loãng, glycerin, dd hữu cơ phân cực
=> p/p tách chiết, tinh chế
- Không bền ở nhiệt độ cao, acid, kiềm mạnh, muối kim loại nặng
➢ Nguồn nguyên liệu: không tổng hợp hóa học, chủ yếu từ động vật, thực vật,
vi sinh vật
➢ PP sản xuất
Tách chiết từ động vật, thực vật hoặc Sinh tổng hợp từ vi sinh vật
- Tách chiết và tinh chế : Tách chiết từ động, thực vật=> giải phóng enzym
=>tách chiết và tinh chế dựa vào t/c
- Sinh tổng hợp từ VSV: enzym nội bào hay ngoại bào, tách chiết và tinh
chế dựa vào t/c
➢ Ứng dụng
Thuốc
- Thuốc: có > 60 E được sử dụng
+ Loại cục máu đông: streptokinase, urokinase, nattokinase...
+ Sạch vết thương: proteinase, trypsin,chymotrypsin, collagenase,
papain...
+ Trị bệnh bạch cầu: L – asparaginase
+ Hỗ trợ tiêu hoá: amylase, pepsin, pancrease, bromelain, papain...
+ Trị nhiễm khuẩn: lysozyme
- Ưu điểm của việc sử dụng thuốc chứa E
+ ít phản ứng phụ có hại
+ có tính đặc hiệu cao
- Hạn chế của việc sử dụng thuốc chứa E
+ Khối lượng p/tử lớn => khó qua màng tế bào
+ Dễ biến tính (nhiệt độ, pH acid..) ở đường tiêu hoá
+ Có thể bị bất hoạt bởi hệ dịch của cơ thể
+ Dễ gây phản ứng tạo kháng thể khi sử dụng lặp lại nhiều lần
+ Giá thành cao

7
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 Y học: Chẩn đoán
- Glucooxydase: KIT tiểu đường
- GPT - glutamic piruvat transaminase: gan
- GOT - glutamic oxalat transaminase: nhồi máu cơ tim

Công nghệ sinh học: cellulase (tạo tế bào trần), polymerase (PCR)...
SX nguyên liệu làm thuốc: penicillinacylase

❖ CÁC NGUỒN NGUYÊN LIỆU

- Hầu như không thể SX E bằng pp hóa học => nguồn ng/liệu sinh học
- Mọi sinh vật đều được coi là ng/liệu SX E
- Phân bố E không đồng đều giữa các loài, tế bào mô và cơ quan khác nhau
- Khả năng tổng hợp E giữa các tế bào khác loại không giống nhau
- Hàm lượng E trong một mô hoặc một cơ quan phụ thuộc vào:
✓ giai đoạn sinh trưởng và phát triển
✓ trạng thái sinh lý của tế bào
✓ các yếu tố bên ngoài..
- Nguồn nguyên liệu chủ yếu từ:
✓ Mô và cơ quan động vật
✓ Mô và cơ quan thực vật
✓ Tế bào VSV (VK, nấm mốc, nấm men)
Nguồn nguyên liệu – Nguồn nguyên liệu – Nguồn nguyên liệu –vi sinh
Động vật thực vật vật
- cơ thể đa bào => chỉ - Là nguồn SX Enzym - Công nghệ Enzym VSV
một số bộ phận được từ rất lâu đời phát triển mạnh cuối TK
sử dụng SX E: các - Nhóm E được SX là 20
tuyến dịch, nội tạng amylase, protease - Nguồn E VSV dần dần thay
- SP E chủ yếu là các + Amylase: từ thóc đại thế E động và thực vật
protease mạch nảy mầm (chiếm 90% thị trường)
+ Pepsin: từ màng + Papain: từ nhựa mủ - Hầu hết các E công nghiệp
nhày dạ dày đu đủ được SX từ VSV: amylase,

8
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
+ Pancreatin: từ tuỵ + Bromelin: từ chồi và protease, pectinase,
lợn, bò lõi dứa penicilinacylase...
+ Tripsin: từ dịch tuỵ + Ficin: từ sung, trị ký
bò (SX các sinh trùng đường ruột
chymotripsin)
+ Lipase, lysozyme...
• Ưu điểm: • Ưu điểm: Ưu điểm:
- hoạt tính và tính ổn - hoạt tính mạnh, ổn - VSV là những cơ thể đơn
định cao, đặc hiệu định, đặc hiệu hơn bào, tốc độ sinh sản
động vật nhanh=> nhiều Sinh Khối,
- rẻ hơn nguồn động thuận lợi hơn động thực
vật vật
- kiểm soát quá trình - Hệ E ở VSV đa dạng
lên men=>tăng hiệu (cellulose, racemase,
suất dễ hơn nitrogenase... chỉ có ở
- có thể điều khiển sinh VSV)
enzyme theo nhu cầu - Tỷ lệ E trong tế bào lớn=>
SX dễ, h/suất cao
• Nhược điểm: - Hoạt tính cao, ổn định
- nguồn nguyên liệu • Nhược điểm: trong khoảng to và pH
không ổn định - nguồn nguyên liệu rộng
- không cải tạo được không ổn định - VSV có thể cho tất cả các
- đắt (t/g lâu, h/suất - không cải tạo được loại E (mỗi thực vật hay
thấp, thực phẩm) - đắt (t/g lâu, hàm động vật chỉ cho 1 loại E)
- yếu tố rủi ro cao (dịch lượng thấp, lương - Có thể điều khiển sinh E
bệnh, thiên tai) thực) theo ý muốn, kìm hãm
- yếu tố rủi ro cao (dịch sinh enzym không mong
bệnh, thiên tai) muốn (sd chất cảm ứng)
Asp. Niger
+ MT protein=> protease
+ MT pectin=> pectinase
- Ng/liệu dễ kiếm, rẻ tiền
- SX không cần các t/bị
chống ăn mòn
- SP không cần độ tinh khiết
cao

9
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 - Không phụ thuộc thời tiết,
môi trường

II. Trình bày được các pp lên men VSV trong SX enzyme
❖ Quy trình sinh tổng hợp enzyme từ vsv
• Chủng giống:
+ vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn
+ đặc điểm VSV, enzym của VSV sinh ra
• Điều kiện lên men: to, pH, cấp khí, thời gian...(dựa vào đặc điểm VSV,
đặc điểm sản phẩm...)
• Môi trường dinh dưỡng
✓ Nguồn C: fructose, saccharose, glucose...
✓ Nguồn N: bột đậu, pepton...
- pectinase: pectin, lactose
- cellulase: bã mía, mùn cưa, lõi ngô...
✓ Chất cảm ứng để sinh sản phẩm mong muốn:
- amylase: tinh bột, dextrin, maltose...
- proteinase: casein...
✓ Các t/p khác: vi lượng, điều chỉnh pH, phá bọt...

❖ 2 phương pháp

P/pháp lên men bề mặt (xốp) P/pháp lên men chìm

• Môi trường dinh dưỡng • Ng/liệu: tinh bột, nitơ,

✓ Cám mì, cám gạo, bột đậu, bột khoáng
ngô...  Hồ hoá, khử trùng
✓ Bổ sung trấu, mùn cưa => tăng độ (30ph/1atm)
xốp (<25%) • Đk lên men
✓ Hấp chín và làm ẩm ✓ Nhiệt độ: 28 – 30oC
✓ Độ dày: 2 - 5cm ✓ pH: tùy thuộc vào VSV
(thường là trung tính)
• Điều kiện lên men

10
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 ✓ Độ ẩm: 55 – 65% ✓ Khuấy trộn, cấp khí,
✓ Nhiệt độ: 28-30 oC làm mát
✓ Làm ẩm, thổi khí, làm mát ✓ Thời gian: 48h – 96h
✓ Thời gian: 36 – 48h

Ưu điểm của lên men bề mặt

• Nồng độ enzym cao hơn lên men chìm
• Dễ sấy khô và ít hao tổn hoạt tính E
• Chế phẩm thô dễ vận chuyển
• Thiết bị đơn giản, tốn ít năng lượng
• Có thể xử lý cục bộ khi bị nhiễm

❖ Chiết enzyme
• Có thể sd enzym thô: sản xuất rượu hoặc enzym tinh khiết: y dược,
thực phẩm, CN nhẹ...
• E ngoại bào: loại sinh khối
• E nội bào: Phá vỡ tế bào
– PP vật lý: nhiệt, nghiền, siêu âm...
– PP hóa học: acid, kiềm...
– PP sinh học (enzym): lysozyme, cellulase...
 Lọc lấy dịch chứa E
• E thô: sấy khô đến 8 – 12%
• E tinh khiết: chiết bằng nước cất, nước muối (NaCl, (NH4)2SO4);
dung môi hữu cơ (cồn, aceton) ở 28 – 30 oC => hạ xuống 10 oC, cô
chân không => E tinh khiết

❖ Tinh chế
o kết tủa enzym trong dung môi hữu cơ (ethanol, isopropanol,
aceton)
o kết tủa enzym trong dd muối trung tính
o sàng phân tử
o điện di
o hấp thụ chọn lọc
o sắc ký ái lực
o siêu ly tâm

11
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
III. Trình bày được phương pháp cố định enzym và tế bào. So sánh
được phương pháp cố định enzym và tế bào.
KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH ENZYM VÀ TẾ BÀO
a. Đại cương
• Enzym: chất xúc tác sinh học Đặc hiệu có Cường độ xúc tác mạnh:
Tăng tốc độ p/ư trăm triệu – tỷ lần
• Enzym dạng tự do
✓ Thường không bền với các yếu tố: pH, to...
✓ Quá trình tách chiết, tinh chế tốn kém
✓ Không thu hồi được enzym ra khỏi hỗn hợp phản ứng sau khi sử
dụng

b. Định nghĩa
Thuật ngữ “cố định”
Enzym hoặc tế bào được định vị trong một không gian xác định sao cho
chúng bảo toàn được hoạt tính sinh học.
c. Mục đích
• Sử dụng được nhiều lần
• Dễ tách khỏi sản phẩm
• Có thể ngừng phản ứng khi cần
d. Ưu và nhược điểm của phương pháp cố định
❖ Ưu điểm
✓ Enzym và tế bào ổn định
✓ Có thể tái sử dụng E hay tế bào => giảm chi phí tinh chế SP
✓ Dễ tách Sp
✓ Chủ động ngừng phản ứng khi cần
✓ Chuyển sang phản ứng liên tục => có thể tự động hoá, cơ giới hóa
✓ Có thể phát triển hệ thống p/ứng nhiều enzyme hay tế bào
❖ Nhược điểm
✓ Hoạt tính của E cố định < E tan

12
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 ✓ Do bị giữ trong khuôn gel, cơ chất khó tiếp cận với E/tế bào =>
phản ứng khó thực hiện hơn
✓ Có thể xảy ra sự cạnh tranh cơ chất giữa enzyme và chất mang
✓ Duy trì sự sống của tế bào cố định khó hơn tế bào tự do
e. Yêu cầu enzyme; tế bào khi cố định
❖ Enzym:
✓ Đủ tinh sạch
✓ Giữ được hoạt tính
✓ Ko thủy phân chất mang
❖ Tế bào:
✓ Chứa E nội bào có hoạt tính mạnh để chuyển hóa cơ chất
✓ Không có các E can thiệp vào phản ứng E chính, tạo ra các phản
ứng phụ
✓ Sản phẩm của tế bào phải đi qua được màng tế bào
✓ Tế bào ko ăn chất mang
 Yêu cầu sản phẩm tạo ra phải là sản phẩm ngoại bào
f. Yêu cầu của chất mang và phân loại chất mang
❖ Yêu cầu của chất mang:
✓ Bền với nhiệt, pH, VSV, tác nhân hóa học
✓ PP cố định đơn giản
✓ Độ bền phù hợp, giữ được hoạt tính của hệ trong thời gian dài
✓ Không (ít) độc với E/TB/cơ thể sống
✓ Giá thành phù hợp
❖ PHÂN LOẠI CHẤT MANG
Vô cơ Hữu cơ
bentonite, silica; ❖ Polymer tự nhiên
thủy tinh, - Các polysaccharide (cellulose, dextrans, agar,
các kim loại, agarose, chitin, alginate)
oxyd kim loại... - Các protein (collagen, albumin)
❖ Polymer tổng hợp
❖ Polyacrylamide, polystyrene, polyamides...

13
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 g. ứng dụng
1. Sản xuất nguyên liệu bán tổng hợp các β –lactam: 6 – APA, 7 – ACA, 7-
ADCA
• Nguyên tắc
Penicilin G Enzym/Tế bào 6-APA + a. phenylacetic
• phương pháp
+ Cố định enzym penicilinamidase
+ Cố định tế bào E. coli, B. megatherium
✓ P-amidase nội bào
✓ thuỷ phân Pe G nhanh
✓ pH = 9,0
+ Chất mang: polyacrylamide, alginate..

2. Sản xuất acid amin bằng aminoacylase cố định

Enzym amino acylase cố định trên DEAE Sephadex để chuyển hoá hỗn hợp
racemic thành L - acid amin.
Hh racemic các aa amino acylase L – acid amin

3. Sản xuất L - acid aspartic bằng enzyme aspartase cố định

Cố định tế bào Brevibacterium flavum chứa enzym aspartase bằng cách gói
trong gel polyacrylamid.

4. Sản xuất siro fructose bằng glucose isomerase cố định

h. Các phương pháp cố định ENZYM/TẾ BÀO

PP hóa học: tạo liên kết PP vật lý: hấp phụ, bẫy –bao gói...
đồng hóa trị, tạo liên kết
chéo... (cố định tế bào; cố định enzyme)
(cố định enzyme)

14
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
Tên Pp tạo liên Phương pháp Phương pháp bẫy – Phương pháp
phg kết đồng tạo liên kết bao gói hấp phụ
pháp hóa trị ngang (chéo)

Đặc E tạo liên Gắn enzym ❖ E/TB được nhốt ❖ E/TB được
điểm kết đồng với enzym trong các mạng hấp phụ lên
hóa trị với bằng các liên lưới polymer (vd bề mặt các
các nhóm kết đồng hoá tạo etoh bởi hạt chất mang rắn
chức trên trị thành đại cố định Ca có lỗ xốp hoặc
chất mang phân tử không alginate) không có lỗ
không tan tan ❖ E/TB gói trong các xốp nhờ lực
trong nước Tác nhân hay vi nang hấp phụ, ion,
dung (microcapsule) có tạo phức...
glutaraldehyd Φ từ 1– 100 μm ❖ Chất mang:
❖ Chất mang: than hoạt,
-Các polymer tổng bentonite hay
hợp như đất sét, silica,
polyacrylamid, cao lanh,
polyvinyl, hexyl-agarose,
polyureetan... trityl-agarose,
-Phổ biến là thạch, các ester của
alginat, carageenan cellulose ...

Ưu • Bền vững • Ít bị rửa trôi - Enzym, tế bào dễ • Ít ảnh hưởng

điểm • Chất • Tăng tính định vị trong gel đến hình dạng,
mang đa chống chịu đv - Mạng lưới chất hoạt động của
dạng các yếu tố trùng hợp càng nhỏ enzym, tế bào
biến tính càng giữ • Hiệu suất cao
chặt enzym hay tế • Dễ thực hiện
bào hơn • Tái sử dụng
được chất mang

Nhược • Điều kiện • Lượng - Enzym, tế bào phân • Liên kết lỏng
điểm phức tạp enzym cố định bố không đồng đều lẻo
ít hơn pp khác - Không tái sử dụng • Dễ bị rửa trôi
được chất mang

15
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 • Có thể • Có thể gây
ảnh hưởng giảm hoạt tính
đến enzym của E
• Không • Giá thành
thể tái sử cao
dụng chất
mang

SẢN XUẤT CÁC ACID AMIN

1. Các phương pháp SX acid amin. Ưu nhược điểm
1.1. PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP HÓA HỌC
- Nguyên liệu: Khí thải của CN dầu mỏ. Nhật: 1932
+ 300 tấn glutamic acid, prolin (cracking dầu hỏa)
+ prolin, lysin (từ furfurol)
- Ưu:
+ Tận dụng phế thải của CN dầu mỏ
+ Nguyên liệu không phải thực phẩm
- Nhược:
+ Chỉ thực hiện ở những nước có CN dầu mỏ
+ Yêu cầu kỹ thuật cao
+ Tạo hỗn hợp racemic=> Chi phí tách dạng L=> đắt

1.2. PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN protein

❖ Nguyên liệu: thực động vật giàu protein: Tảo, cây họ đậu (đậu tương,
lạc...), nấm men...
❖ Ưu điểm:
- Dễ kiểm soát qui trình sản xuất
- Có thể SX qui mô công nghiệp
❖ Nhược điểm:

16
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 - Hiệu suất thấp ,giá thành cao.
- Cần thiết bị chống ăn mòn
- Đi từ nguyên liệu chứa protein
❖ Sản phẩm: L-cystin, L-Thyrosin
❖ Thủy phân bằng acid:
- HCl 6N dư
- 100-120 oC / 24 giờ
- a.a tự do (dạng hydrogenclorate)
- Bị phá huỷ (serine, threonine, tryptophan)
- Bị chuyển dạng (glutamine -> glutamic acid ; asparagine -> aspartic
acid)
- Gây ô nhiễm môi trường
❖ Thủy phân bằng kiềm:
- NaOH dư
- 100-120 oC / 24 giờ
- Chủ yếu các a.a dạng racemic và D
- Bị phá huỷ (cysteine, serine và treonine, trừ tryptophan)
❖ Thủy phân bằng enzym:
- peptidhydrogenlase
- Đặc hiệu
- Ít ô nhiễm

1.3. PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN VSV

❖ Nguyên tắc:
✓ Sử dụng VSV có khả năng siêu tổng hợp acid amin từ nguồn glucid
và đạm vô cơ
✓ 1956: (Shukuko) lên men Micrococcus SX glutamate từ glucose và
amoniac.
✓ 1957: lên men Corynebacterium SX acid glutamic.

17
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 ✓ Dùng Micrococcus glutamicus SX: lysine, tryptophan.
❖ Ưu điểm:
✓ Tạo ra acid amin dạng L
✓ Không sử dụng nguồn nguyên liệu protid
✓ Không sử dụng nguyên liệu hóa chất
✓ Không cần thiết bị chống ăn mòn
✓ Hiệu suất cao, giá thành hạ
❖ Nhược điểm:
✓ Thiết bị cồng kềnh
✓ Khó kiểm soát quy trình SX.

1.4. Phương pháp phối hợp : Phối hợp tổng hợp hoá học và sinh học
Nguyên tắc:
- Tổng hợp tiền chất của acid amin bằng phương pháp hoá học
- Sử dụng vi sinh vật chuyển tiền chất này thành acid amin.
aa vsv Tiền chất
Histidin Brevibacterium flavum Histidinol
Isoleu-cin Serratia marcescens DL-α- Aminobutyrat
Bacillus subtilis DL-α- Aminobutyrat
Corynebacterium sp. DL-α- Aminobutyrat
Enterobacter DL-α- Hydroxybutyrat
Methionin Pseudomonas denitrifficans 2-hydroxy-4-methyl-
tiobutyrat
Threonin Pseudomonas sp Glycin
Proteus rettgeri L- Homoxerin

Tryptophan Claviceps purpure Indol

Hansenula anomala Acid antranilic

Câu 2. Trình bày được quy trình nuôi cấy tạo acid glutamic từ vi khuẩn.

a.ĐẠI CƯƠNG
Công thức: C5H9NO4

18
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 - Vị: Chua
- Chỉ tồn tại dưới dạng muối trong nhiều thực phẩm như cà chua, phomat, thịt,
cá...
- hàng ngày cơ thể người tổng hợp khoảng 50 gam Glutamate tự do
- Sữa mẹ chứa khoảng 20 a.a trong đó hàm lượng Glutamate cao nhất (>50%
tổng a.a)
- Phân tử lượng: 147,13
- To nóng chảy: 247 – 249 oC
- Tinh thể hình thoi lăng kính trắng hoặc không màu
- Tan trong nước sôi, ít tan trong nước lạnh ;Không tan trong dm hữu cơ (cồn,
aceton, ether...)

b.CÔNG DỤNG
❖ Dược phẩm:
Dịch truyền; Thuốc kích thích thần kinh; Thuốc tan đờm
❖ Thực phẩm: Mì chính, bột ngọt
❖ Mỹ phẩm
❖ CN hóa chất
c.

19
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 P/p hoá học: từ dầu mỏ

P/p thủy phân:

Từ rong biển- Hiệu suất thấp;
các phương pháp sản

Từ bột mì- tạo hỗn hợp nhiều a.a

P/p sinh học: Nhật SX-Chủng SX: C. glutamicum

xuất

P/p kết hợp (2 giai đoạn): (1964)

+Tách α-cetoglutaric, acid citric
+Chuyển hoá thành glutamic acid nhờ enzym;
+VSV có aminotransferase:
Flavobacterium,Achromobacter, Micrococcus, Seratia

pp lên men

d.P/p lên men VSV

❖ Phổ biến
❖ Chủng giống: Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Micrococcus
❖ Chủng sản xuất
Brevibacterium flavum
Brevibacterium divaricatum
Corynebacterium glutamicum

ĐIỀU KIỆN
LÊN MEN
Chủng giống: Corynebacterium glutamicum

- vi khuẩn gram (+)

- Hiếu khí, kỵ khí tùy tiện

20
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 - Nhiệt độ: 34 – 37 oC => ưa nhiệt
- pH: 6,8 – 8
- hiếu khí=>Tạo sản phẩm ngoại bào

Dinh dưỡng 1. Hydrat C: (đường đơn, đường thô)

- glucose, saccarose, rỉ đường
- tinh bột đã thủy phân (khoai, sắn)
2. Nitơ: cung cấp acid amin
- ure 1,5- 2% (ổn định pH)
- (NH4)2SO4, NH4Cl
3. biotin: 2,0 – 5,0 mcg/l
=> Nếu nồng độ cao hơn thì vK tăng mạnh nhưng sinh SP phụ
nhiều (alanin, acid lactic, acid aspartic)
4. khoáng chất, vi lượng
- KH2PO4, MnSO4, MgSO4...
- CaCO3
5. Dầu phá bọt (do khuấy trộn + sục khí tạo ra bọt)
6. Kháng sinh:
- Bổ sung KS tác dụng lên thành tế bào như Penicillin G,
Polymycin => ức chế tổng hợp thành tế bào, làm mỏng
thành tế bào
- Nồng độ và thời điểm cho KS: cần phải giám sát chặt chẽ;
cho vào thời điểm sau khi vsv đã sản xuất ra sản phẩm, sau
pha sinh trưởng
- Ngoài ra, penicillin đi vào cơ thể sinh vật kích thích 1 số
gen làm kích hoạt tăng tổng hợp sản phẩm => tăng hiệu
suất tổng hợp acid glutamic lên từ 15 – 45%

Cấp khí Cấp khí: 0,8 – 1 vvm

Vk hiếu khí mạnh: có thể ức chế sự phát triển của VK kỵ khí khiến
sinh nhiều lactic acid
Thời gian 40-48h
Dễ nhiễm Dễ nhiễm phage => Kiểm tra độ vô trùng
virus Cần kiểm soát:
- Kiểm soát tiệt khuẩn môi trường
- Kiểm soát những vị trí tiếp xúc với môi trường (vd cấp khí)

21
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 - Kiểm soát nguồn nước
- Nhà xưởng đạt GMP
- Kiểm soát nguyên liệu (nước, khí, môi trường dd)
- Vsv đầu vào
Hiệu suất Hiệu suất: 80-120 g/lít
1g/l (1957); Hiện nay: 150g/l (Vedan)

TÁCH CHIẾT DỊCH LÊN MEN

Sản phẩm ngoại bào nên nàm trong dịch chiết (tách vsv ra khỏi dịch chiết bằng
cách làm vsv kết tủa và lọc loại bỏ)

PHƯƠNG PHÁP ĐẲNG ĐIỆN PHƯƠNG PHÁP TRAO ĐỔI ION

Dịch lên men Dịch lên men

Cô chân không,
50-60oC
Dịch cô
Hấp phụ trên inoid
Than hoạt

Tảy màu NH4OH

Lọc loại than Phản hấp phụ

Chỉnh pH = 3,2 Than hoạt

Dùng HCl Cô, tẩy màu

Kết tinh Loại than
Lọc, ly tâm, sấy
Kết tinh
Acid glutamic Lọc, ly tâm, sấy

Tạo điểm pI thích hợp để kết tủa sản Acid glutamic

phẩm
điện tích (+) (-) => trao đổi ion, loại
nước kết tinh

22
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 vitaminB12
1. đại cương
a. Phân bố
• VSV: VK propionic và metan
• Xạ khuẩn: Streptomyces
• Thực vật: tảo, mầm hạt
• Người: gan, ruột già, phân
• Động vật: thịt (bò), gan, thận, tim, trứng, sữa, phân...
• Hải sản: cua, cá, trứng cá...

b.Cấu trúc hóa học

+ Corin: liên kết cộng hóa trị colban với nito và gốc R
+ corin nối với -> Ribose + Adenosinphosphat -> gốc 5, 6 DMB
Vitamin B12 có gốc R là CN
Ngoài ra tùy vào gốc R có: vit B12a; 12b; 12c; coenzyme B12; methyl vit B12

c.Tính chất
Cyanocobalamin (vitamin B12)
• tinh thể hình kim màu đỏ sẫm
• không mùi vị
• dễ hút ẩm (12%)
• dễ tan trong nước, ethanol
• không tan trong ether, aceton, Chloroform

Câu 1. Trình bày 3 Phương pháp sản xuất vitamin B12

23
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 1. Chiết từ bùn 2. Chiết từ nước thải 3. Lên men công
cống của công nghiệp nghiệp

• 1951 (Frieric & • xạ khuẩn: • Chủng giống:

Berna) Str. griseus, Propionibacterium
• nhóm VK sinh Str. aureofaciens, shermanii
metan Str. rimosus... • Lên men chìm kỵ khí,
• 0,5 - 1μg B12/1g • 40mg B12/100 lít • nguyên liệu từglucose,
bùn khô (ủ) nước thải bổ sung 5, 6 DMB
• bổ sung vào thức • 150mg/l, trị giá 71
ăn gia súc triệu USD
• kiểm tra độ ô
nhiễm môi trường

Câu 2: trình bày các yêu cầu kỹ thuật trong quá trình lên men VK P.
shermanii trong sx vitamin B12

Chủng Propionibacterium shermanii

giống Propionibacterium freudenreichii
Đặc điểm vsv:
➢ trực khuẩn Gram (+)
➢ kỵ khí, hiếu khí không bắt buộc
➢ phát triển mạnh khi kỵ khí
➢ kỵ khí: hình cầu (Φ = 0,5 - 0,6μm), đơn lẻ hay chuỗi ngắn;
ưa mát; chịu được ph thấp
➢ hiếu khí: hình que, xếp đôi; chuỗi ngắn

Môi • Hydrat Cacbon:

trường +glucose, sucrose- tỷ lệ đường rất lớn
dinh + ko dùng tinh bột do ko có enzyme thủy phân
dưỡng
• Nitơ: vô cơ hay hữu cơ
+ aminoacid, muối amoni...
+ quan trọng : methionine h/suất tăng 10 – 12%

24
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 • Ion k/loại: ảnh hưởng của ion KL lên hiệu suất quá trình lên men
- Coban (Clorit, Nitrat) tăng h/suất (nồng độ phù hợp)
- Fe, Cu, Zn, Mn giảm h/suất => cần hạn chế, loại bỏ các ion này
bằng phương pháp trao đổi ion; kiểm soát nguồn nước đầu vào

•Các vitamin:
- hàm lượng thấp, vừa đủ
- td: kích thích sinh trưởng
- vd (thiamin, biotin, acid nicotinic, acid folic)

•Chất tiền thể:

- 5,6 dimethyl benzimidazol (5,6 DMB)
- Là chất cuối cùng gắn để hình thành cobalamin
- bổ sung vào giờ thứ 72 vì bổ sung lúc đó không ảnh hưởng
tới sự phát triển của vsv và lúc đó vsv đang tăng sinh khối
tạo sản phẩm
- Nồng độ : 1-10mg/l; (có thể khó hấp thu, gây phản ứng
phụ dẫn tới đào thải chất tiền thể)

Điều kiện • Nhiệt độ: 28 – 30 oC

lên men • pH: 6,8 - 7,2 (đ/c pH =NH4OH) –> điều chỉnh pH trung tính
• Cấp khí:
- 50h đầu: kỵ khí bắt buộc
- sau đó cấp khí 15ph/1h -> lượng khí thấp vừa đủ để xúc tác
quá trình oxy hóa khử -> để gắn tiền chất vào nhân tổng
hợp
- giờ thứ 72 bổ sung 5,6 DMB và đồng thời phải cấp khí
• Thời gian lên men:
6 – 7 ngày (=> sản phẩm ở pha cân bằng nhiều nhất)
• H/suất: 80 – 100mg/l

25
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
Câu 3: vẽ và giải thích Sơ đồ chiết xuất và tinh chế vit B12 từ môi
trường lên men?

Nguyên tắc và các giai đoạn chính

1. Thu sinh khối:
➢ B12 là sản phẩm nội bào
➢ lọc/ly tâm => lấy sinh khối

2. Giải phóng Vitamin B12: phá vỡ tế bào = cách acid hóa kết hợp với nhiệt độ
➢ hòa sinh khối vào nước tạo hỗn dịch
➢ chỉnh pH = 4,5 (HCl 10%);
acid hóa nhằm phá vỡ tb; chuyển dạng các chất giúp tan trong 1 số dung
môi -> dễ tách chiết
và tạo pH ổn định cho hoạt chất
➢ đun nóng 80 oC/30 phút
➢ lọc lấy dịch

3. Chiết Vitamin B12:

Chiết bằng DMHC
➢ Chiết B12 từ nước sang pha hỗn hợp DM phenol: n-butanol (1:1)
➢ V DM hữu cơ : V nước = 1:3
➢ Chiết B12 lại nhiều lần bằng nước
Chiết bằng cách hấp phụ

4. Cyanid hoá:
➢ Cyanid hoá bằng KCN
➢ Chỉnh pH về 8,0 - 8,5
➢ Để 3h: Coenzym -> Cyanocobalamin
➢ Cô chân không ở ≤ 60 oC đến 10.000 μg/ml

5. Tinh chế:

26
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 ➢ Sắc ký trên cột oxyt nhôm đã hoạt hoá 300 oC/1h
➢ Hấp phụ dung dịch B12 lên cột trong dung dịch aceton - nước 75%.
➢ Chuyển dịch B12 trên cột: aceton - nước (80%)
➢ Phản hấp phụ: aceton - nước (50%)
➢ Lấy phân đoạn đậm đặc nhất

6. Kết tinh:
➢ Pha loãng dịch bằng aceton
➢ Khuấy nhẹ, để kết tinh 12h/4°C
➢ Lọc tinh thể
➢ Rửa (aceton); sấy khô (bình hút ẩm)
➢ Hàm lượng Vitamin B12 ≥ 95%.

7. Định lượng:
➢ đo quang λ = 361nm
➢ PP vi sinh vật – (E. coli)

27
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 Chiết xuất bằng DMHC Chiết xuất bằng nhựa hấp phụ

Dịch lên men Dịch lên men

Lọc, ly tâm Lọc, ly tâm

Sinh khối Sinh khối

- Hòa trong nước cất Hòa trong nước cất

- Chỉnh ph 4,5 bằng HCl Chỉnh ph 4,5=HCl
- Đun 80oc/ 30 phút Đun 80/30 ‘
- Lọc Lọc

Dịch lọc Dịch lọc

Chiết bằng DMHC phenol:

n- butanol (1:1) Hấp phụ nhựa XAD2
Phản hấp phụ = dd
Dịch chiết DMHC aceton 20%
chiết lại nhiều lần bằngnước
Dịch phản hấp phụ
cất
Dịch chiết nước
cyanocobalamin thô

28
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 Cyanid hóa Cô chân không

Tinh chế Dịch cô

Cột oxyd nhôm cyanocobalamin thô
(300 oC/1h)
Aceton/ nước Cyanid hóa:
KCN; pH=8.5

Kết tinh Tinh chế

Aceton, 4oC Cột oxyd nhôm

Sấy khô 50-60oC (300oC/1h)
Aceton/nước
Kết tinh
Sản phẩm

Aceton, 4 độ C
Sấy khô 50-60

Sản phẩm

29
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
câu 1: định nghĩa công nghệ sinh học
❖ CNSH là công nghệ sử dụng các quá trình sinh học của tế bào (VSV, thực vật,
động vật) để sx sản phẩm ở quy mô CN phục vụ lợi ích của con người
❖ Nghĩa rộng: gồm nhiều dạng sử dụng VSV vào sx như lên men làm rượu, men
bánh mỳ, pho mát, tương,… và các kĩ thuật hiện đại của sinh học và di truyền
học phân tử ( như tái tổ hợp DNA, biến nạp gen, cố định enzyme,…
Câu 2: đặc điểm công nghệ sinh học

• có tính chất đa ngành

• kết hợp nhiều lĩnh vực, sản phẩm CNSH có thể phục vụ cho
1 nhiều ngành

• đòi hỏi mức độ đầu tư nghiên cứu cao

• đầu tư cao hơn ngành khác và lợi nhuận cao
2 • đầu tư cho nghiên cứu thường cao hơn cho sx; thường sx
quy mô vừa và nhỏ

• tính hợp tác cao

• cần có sự liên hệ và phối hợp chặt chẽ giữa nhiều ngành
như sinh học, hóa học , dược học để triển khai TNLS và các
3 liên quan đến an toàn và đạo đức y học => ms triển khai dc
sản phẩm CNSH

Câu 3: các lĩnh vực của CNSH và ứng dụng CNSH trong ngành dược?
3.1. các lĩnh vực:
a. CNSH truyền thống:
- các quy trình chế biến, bảo quản thực phẩm, xử lý đất đai, phân bón, giống
cây trồng và động vật phục vụ nông nghiệp chăn nuôi
- các quá trình lên men công nghiệp sx acid, acid amin, acid hữu cơ, dung môi,
kháng sinh, vitamin, enzyme,…
- ví dụ: + thực phẩm lên men truyền thống

30
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 + sx phân bón, thuốc trừ sâu vsv
+ sx sinh khối giàu vitamin
+nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô và tế bào thực vật
+ lên men vsv sx: acid amin, a hữu cơ, dung mội, ks, vitamin, enzyme..
+ thụ tinh nhân tạo
b. CNSH hiện đại
- công nghệ di truyền ( NC gen, thực vật và động vật chuyển gen, đột biến gen,)
- công nghệ tế bào ( động vật nhân bản, liệu pháp gen và tế bào,..)
- công nghệ enzyme và protein (protein trị liệu, tin sinh học, công nghệ sinh học
nano, hoạt chất sinh học,..)
- CN vi sinh vật , CN môi trường,..
- gắn với các đối tượng mang gen tái tổ hợp

3.2. ứng dụng

Tạo ra các sản phẩm phục vụ y dược, chủ yếu:
- thuốc:
kháng sinh, vitamin, acid amin, vaccine, hormone, probiotic,…
- Nguyên liệu sx thuốc:
Vsv , dược liệu và vật nuôi được biến đổi gen, sinh ra các loại protein trị liệu
như interferon, insulin, các hormone ( hormone sinh trưởng, erythropoietin,
thrombopoietin,…)
- các công cụ chẩn đoán dựa trên AND, enzyme,..
- các liệu pháp điều trị như liệu pháp gene, liệu pháp miễn dịch, liệu pháp tế
bào gốc

Câu 4: phân loại sản phẩm của ngành công nghệ vsv
Phân loại theo sinh lý trao đổi chất của VSV:
bao gồm:
- Vật chất tế bào: SP là bản thân các tế bào VSV; hay còn gọi là sinh khối
tế bào hay protein đơn bào SCP

31
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 - Các sản phẩm trao đổi chất : là sp tạo ra trong quá trình trao đổi chất
của VSV.
Cơ chất sản phẩm + tế bào
- Các sản phẩm chuyển hóa : sử dụng VSV thực hiện các chuyển hóa sinh
học đặc biệt
• 1. chế phẩm probiotic : sinh khối vk lactic và 1 số vsv
khác; bổ sung vào sữa cho trẻ em,..
1. vật • 2. sinh khối một số vsv gây bệnh để sản xuất vaccin (
chất vaccin tả uống, bại liệt,..)
tế bào • 3. protein đơn bào: sinh khối vi tảo or vsv giàu protein,
vitamin nhóm B, chất khoáng dùng làm thuốc, thực
phẩm, thức ăn chăn nuôi

• 1. sản phẩm cuối cùng

2. các • 2. sản phẩm bậc 1
SP trao
• 3. sản phẩm bậc 2
đổi chất
• 4. enzym

3. các • là quá trình sử dụng vsv hoặc enzym vsv để thực

hiện các pư hóa học đặc biệt mà hóa học hữu cơ ko
SP làm dc hoặc quá phức tạp, đắt tiền => gọi là chuyển
chuyển hóa sinh học
hóa • tiền sản phẩm tế bào or enzym vsv sản phẩm

các sp trao Đặc điểm Sản phẩm

đổi chất
SP cuối cùng - Được tế bào tổng hợp trong
và cả sau pha sinh trưởng
đầu của vsv
- Gắn liền với quá trình sinh
trưởng của vsv
- Bia rượu, ethanol, glycerol,
mannitol, butanol, aceton,
khí methan..
- Sản phẩm từ sữa (phomat,
sữa chua,..)
- Acid lactic, acetic,
propionic,..

32
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
SP bậc 1 Là những chất dc tạo thành
(hay sản trong pha sinh trưởng đầu tiên
phẩm sơ của vsv bao gồm:
cấp) - Các chất tham gia tạo
thành cấu trúc tê bào (acid
amin, nucleotid, vitamin,
đường,..)
- Các sản phẩm trung gian
tạo thành trong quá trình
trao đổi chất (acid hữu cơ)
- SP bậc 1 có cấu trúc rất đa
dạng, từ khí Hidro đến
vitamin B12
SP bậc 2 Là các chất được tạo thành gần
vào lúc kết thúc của pha sinh
trưởng , thường là vào gần
chính pha cân bằng
- Chỉ tồn tại trong 1 số loài, 1
số tế bào
- Phụ thuộc vào điều kiện
nuôi cấy
enzym - Tế bào vsv chứa khoảng
>1000 enzym
- Các enzyme dc sx CN phần
lớn là enzyme vsv, được sản
xuất nhờ VSV
- Hơn 60% enzyme sx là sp tái
tổ hợp
- Rất nhiều lĩnh vực cần sử
dụng enzym
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
- Các aid amin:
Glutamic acid, aspartic acid,
phenylalanine, lysine,…
- Các vitamin:
Có 7 vitamin và tiền vitamin
dc sx bằng công nghệ lên
men:
+beta-caroten
+ vit B12, B13, riboflavin
+ vit C
+ vit F (linoleic acid)
+ ergosterol
- Các aid hữu cơ: quan trọng
dc sx bằng CN lên men
Acid citric, acetic, lactic,
gluconic, itaconic. (có cả sp
cuối cùng)
- Kháng sinh
- Chất kích thích sinh trưởng
- Độc tố, thuốc trừ sâu,
- 1 số alkaloid….
- 1 số chất hạ lipid máu:
Compactin, lovastatin,
pravastatin tổng hợp từ
nấm
- 60% là các protease , ứng
dụng trong cn bột giặt,
phomai, thuộc da, thực
phẩm
33
Sản phẩm chuyển hóa
Chuyển hóa penicillin thành các nguyên Penicillin vi khuẩn 6-APA;
liệu bán tổng hợp các kháng sinh mới Cephalosporin enzyme 7-ADCA
nhóm b-lactam
chỉ được ứng dụng sx 1 số hormone, Ethanol acetobacter suboxydans
vitamin C, acid acetic acid acetic
d- sorbitol acetobacte suboxydans
L-sorbitol
Chuyển hóa acrylonitrile thành
acrylamide nhờ enzyme nitritle hydratase
từ chủng vk pseudomonas chlororaphis;
Acrylamide dc sd để sx nguyên liệu
polyacrylamide để sx hồ dán, giấy, mỹ
phẩm, xử lý nước

GIỐNG VI SINH VẬT TRONG SX THUỐC VÀ CHẾ PHẨM SINH

HỌC
Câu 1: tầm quan trọng của các tiêu chuẩn chung của giống vsv dùng trong sx
thuốc?

34
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 7. phải
ổn định
6. dễ
trog bảo
5. sản nuôi
quản và
4. ít tạo phẩm cấy, có
dễ bảo
3. cho sản dễ tách thể sd
quản
2. ko sản phẩm chiết nguyên
gây phẩm phụ liệu rẻ
1. tiền
nguồn bệnh, với hiệu
gốc rõ không suất cao
ràng, hoặc ít
thuần gây
chủng bệnh

Tiêu chuẩn Đặc điểm

1. nguồn gốc rõ - Thuần khiết, ko nhiễm vsv lạ, ổn định phenotype (kiểu
rang, thuần hình) và genotype ( khác biệt của vsv cùng loài)
chủng - Qua các thế hệ, nếu ko liên tục tuyển chọn thì giống sẽ bị
(quan trọng hồi biến tính hoang dại, thoái hóa -> hiệu suất thấp
nhất) - Giống thuần chủng dc lưu giữ tại các bảo tàng giống lớn
trên TG
- Giống trong lên men truyền thống thường dc tuyển chọn
sàng lọc từ các chủng tự nhiên -> ko ổn định, năng suất
thấp
- Trong CN, sử dụng giống đã biến đổi nguồn gốc di chuyền
➔ ổn định, năng suất cao
- giống có thể phân lập từ môi trường đang sx để chọn ra
chủng thích ứng vs đk sản xuất
2. ko gây bệnh, Lưu ý: sx vaccine, probiotic,…
ko or ít độc tính

35
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
3. cho SP với hiệu SP chính phải chiếm đa số cả về số lượng và chất lượng
suất cao
4. ít tạo SP phụ
5. SP dễ tách - SP ngoại bào- phải dễ tách khỏi MT nuôi cấy và sinh khối
chiết - SP nội bào- dễ phá vỡ tb
6. dễ nuôi cấy - Tốc độ trao đổi chất nhanh (nhanh tạo sp đích)
- Phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu dễ kiếm và rẻ
tiền
- Phát triển tốt ở đk không hoặc ít cần bổ sung các yếu tố
tăng trưởng, vitamin,..
- Sinh sản nhanh, phát triển mạnh trong MT sản xuất
(=>lấn át các vsv tạp nhiễm)
7. ổn định di
truyền trong BQ
8. 1 số đặc tính - Tính chịu nhiệt
khác dc quan - Tính chịu muối
tâm đối vs các - Khả năng chịu khuấy trộn
chủng riêng - Ko sinh quá nhiều bọt
- Ko bám vào các bề mặt
- Có thể biến đổi di truyền,…

Câu 2: nguyên tắc tìm kiếm vi sinh vật?

Nguyên tắc chung
1. Phân lập, tách riêng 1 chủng thuần nhất từ các nguồn khác nhau:
a. phương pháp săn lùng:
➢ Lấy mẫu từ 1 nguồn bất kỳ,
➢ Sau đó tách riêng, sàng lọc riêng 1 chủng thuần nhất
➢ Xác định các đặc tính sinh học
b. phương pháp định hướng
➢ Lấy mẫu có chủ đích ( vd sinh kháng sinh…)
➢ Sau đó tách riêng, sàng lọc riêng 1 chủng thuần nhất có khả năng sinh sản
phẩm đích với hiệu suất cao
2. sàng lọc, tuyển chọn cá thể khỏe nhất

36
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
3. tìm MT dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy thích hợp
4. đột biến tăng hiệu suất
5. tách chiết thu sản phẩm, tinh chế
6. bảo quản chủng giống

1 số chế phẩm riêng

tiêu chuẩn vsv Phân lập
Vsv sinh 1. nguồn gốc rõ ràng thuần- Phân lập vsv sinh kháng sinh chủ
kháng chủng (quan trọng nhất) yếu từ đất (nấm mốc, vi khuẩn, xạ
sinh 2. khuẩn -67%)
3. sinh KS với hiệu suất cao (ex- penicillin phân lập từ chủng
(quan trọng nhì) nấm mốc trên quả dưa hỏng ở mỹ)
4. - Các bước phân lập:
5. • Lấy mẫu đất, phân lập trên MT
6. dinh dưỡng, tách riêng khuẩn lạc
7. • Thử hoạt tính kháng khuẩn trên
các chủng vsv kiểm định
• Tìm MT nuôi cấy thích hợp
• Đột biến nâng cao hiệu suất
• Nghiên cứu đk tách chiết
• NC bảo quản
Vsv 1. nguồn gốc rõ ràng, thuần - Các nguồn phân lập vsv probiotic:
probiotic chủng (Ko tạo sp phụ độc hại, sống dc kỵ
(lợi - có định danh chính xác khí,…-> ko sd dc nấm mốc)
khuẩn) - có đặc điểm di truyền ổn ❖ Vi khuẩn
định • Vk lactic (LAB)
- những chủng sử dụng cho + lactobacillus (vd
người tốt nhất là có nguồn L.acidophilus- từ sữa)
gốc từ người (phân lập từ +bifidobacteria (vd
đường tiêu hóa của những B.longum- từ phân trẻ sơ
người khỏe mạnh) sinh)
2. ko gây bệnh, ko sinh độc +streptococcus
tính cho vật chủ, • Vk bacillus (sinh bào tử)
- chủng probiotic thường +B. subtilis
thuộc nhóm an toàn(GRAS)

37
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 - được phân lập từ những
nguồn an toàn : từ người là
tốt nhất
- ko mang các gen đề kháng
kháng sinh có thể truyền
được
- ko liên quan đến bệnh tật - Các bước phân lập:
3. sinh sp với hiệu suất cao:
có đặc tính probiotic
Có khả năng phát triển
trong ruột và có tác dụng
lợi cho vật chủ (những vsv
phát triển ở đk kỵ khí 37
o
C)
6. dễ nuôi cấy : tăng sinh
nhanh trong MT sx
thu sinh khối tb sống
7. phải ổn định trong bảo
quản và dễ bảo quản
có khả năng tồn tại độc lập
trong thời gian dài;
tỷ lệ sống sót cao trong
thời gian bảo quản
Vsv sản 1.
xuất sản 2.
phẩm 3.
bậc 1 4.
5. sp dễ tách chiết: ưu tiên
vsv sinh sản phẩm ngoại
bào
6.
7.
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
+ B. clausii: phân lập từ
đất
❖ Nấm men saccharomyces
• S. cerevisiae: phân lập từ
quả nho
• S. boulardii: quả vải
➢ Tìm nguồn thích hợp
➢ Pha loãng, cấy trên mt dinh
dưỡng
➢ Tách riêng khuẩn lạc thuần nhất
➢ MT nuôi cấy thích hợp thu sinh
khối
➢ Thử khả năng: chịu acid, muối
mật, khả năng đối kháng vk kiểm
định, khả năng bám dính ruột
non,…
➢ NC đk bảo quản
Các bước phân lập:
1. tìm nguồn thích hợp để phân lập
- Tìm theo cơ chất đối với enzyme,
acid hữu cơ
- Đột biến cơ chế điều hòa tổng
hợp các chất trao đổi của Vsv
=> tổng hợp thừa các sản phẩm
này
- Chủng sx acid amin, acid hc,
vitamin trong CN là chủng đột
biến
2. pha loãng, cấy mt dd
3. tách riêng kl thuần nhất
38
 4.NC MT nuôi cấy thích hợp, rẻ tiền
thu sản phẩm
Enzyme: bổ sung các chất cảm ứng
Vd: sinh amylase- tinh bột
Sinh cellulose- cellulose
5. cải tạo tìm ra các chủng có hiệu suất
cao: đột biến làm tăng tính thấm của
sp qua màng tb, tăng khả năng chịu
acid,..
Vsv sản 1. nguồn gốc rõ ràng,
xuất thuần chủng
protein 2.ko gây bệnh cho người và
đơn bào động thực vật, ko có chất
độc
3. giá trị dinh dưỡng cao
4. dễ nuôi cấy, giá thành sx
thấp
- Tốc độ sinh trưởng
- Hàm lượng protein
- Nhu cầu dinh dưỡng
- Dễ tách và làm khô

Vsv sản 1.nguồn gốc rõ ràng thuần

xuất chủng
vaccin 2.ít độc tính
3.dễ nuôi cấy
4.an toàn và có hiệu lực
5.giống ổn định trong bảo
quản

Câu 3: các phương pháp bảo quản, cải tạo, đột biến nâng cao hiệu
suất chủng giống vsv
1. các phương pháp bảo quản

39
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 ❖ Mục tiêu: giữ dc quần thể tb giống sống sót với tỷ lệ cao và giữ dc tình trạng
cần thiết
❖ Nguyên tắc: giảm thiểu những yếu tố đóng vai trò quan trọng trong quá trình
phát triển của vsv như nhiệt độ, độ ẩm, dinh dưỡng, ánh sáng,…
❖ Các phương pháp:

Phương Đặc điểm ưu Nhược

pháp
a. pp - Cấy giống trên môi Đơn + thủ công, dễ nhiễm
cấy trường thích hợp giản tạp, sai sót
truyền (lỏng/rắn) + dễ mất, nhầm lẫn nhãn
định kỳ - Nuôi cấy trong đk thích hiệu giữa các chủng
trên môi hợp trong quá trình bảo quản
trường - Bảo quản nhiệt độ thấp + chủng cấy truyền dễ bị
mới (4oC) thay đổi các đặc điểm
- Cần lặp lại trong 1 thời sinh học do đột biến
gian nhất định., đảm bảo xuất hiện sau mỗi lần cấy
giống luôn dc chuyển truyền
đến môi trg mới trước + thời gian bquan ngắn:
khi già chết ➢ MT lỏng 2-6 tháng
➢ MT đặc 2-3 năm
b. pp - Giữ giống vsv trong giá thể - chủ yếu
làm khô khô (đất, cát, hạt…) áp dụng
- cấy bào tử vào giá thể đã cho vsv
tiệt trùng và làm khô sinh bào
- dùng paraffin nóng chaỷ tử như
quét lên nút bông của ống nấm
nghiệm men,
- bảo quản ở nhiệt độ phòng nấm
hay 4-6oC mốc, xạ
- thời gian: 3-5 năm khuẩn,
vk sinh
bào tử

40
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 c. pp - Bảo quản vsv trong mt dịch - Hạn chế dc sự Đắt, tế
làm lạnh thể thay đổi các đặc bào có
sâu - Nước cần cho hoạt động tính của vsv và thể bị vỡ
sống của vsv bị bất hoạt ở bq trong thời trong quá
nhiệt độ lạnh sâu (-196 đến gian dài trình làm
-80oC) - Hiệu quả vs lạnh và
- Phổ biến hơn: bảo quản nhiều nhóm vsv làm tan
lạnh sâu trong nito lỏng -> khác nhau như mẫu
thích hợp vs nhiều vsv khác nấm sợi, nấm
nhau men, vk, xạ
(vk, nấm men, nấm sợi, khuẩn, virus
virus, tảo, dòng tế bào động
vật)
d. pp - Là quá trình lấy nước ra khỏi - Hàm ẩm thấp Đắt
đông tế bào khi các mẫu đang ở nên chuyển hóa
khô trạng thái lạnh sâu (-70, - ngừng lại, vsv
140, -196oC) -> bảo quản dc bảo toàn tình
toàn vẹn tế bào trạng
- Phổ biến, hiệu quả cao với - Bq thời gian dài
nấm sợi, nấm men, vk và 1 - Đơn giản, tiện
số virus - Có thể bq nhiệt
- Ít dc sd với tảo, động vật độ phòng
nguyên sinh và tb động vật
- Phổ biến trên TG

2. các phương pháp đột biến

❖ nguyên tắc
- vsv trong tự nhiên ko sx thừa các sp trao đổi chất bậc 1,2;
- chủng sàng lọc từ tự nhiên (chủng hoang dại): ko bền vững
- ko hoặc rất khó phân lập từ nguồn tự nhiên các chủng vsv có khả năng sinh
tổng hợp thừa sp bậc 1,2, để ứng dụng trong sx

41
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 - do đó: xử lý bằng các tác nhân gây đột biến định hướng (dc chọn lọc trong
đk phòng TN) thì ms có thể tạo ra các thể đột biến sai hỏng về cơ chế điều
hòa, có khả năng sth thừa các sp trao đổi chất dùng cho quy mô CN
❖ ưu
- nhanh chóng thu nhận chủng mới
- nhanh đánh giá kết quả thu sp
❖ nhược
khó lường trước được các biến đổi sinh lý, sinh hóa
❖ các phương pháp
pp Đặc điểm
Tác nhân vật lý UV; tia X; tia hồng ngoại
Thời gian chiếu xạ sao cho chỉ 1 số rất
nhỏ tế bào vsv sống sót (0.2-0.5%)
Tác nhân hóa học Các hợp chất chứa nito:
➢ nitrozomethylguanidin
➢ methyldicloroetylamin
➢ nitrit
➢ hydroxylamine
➢ etylenimin
Pp đột biến bậc thang kết hợp vs các ➢ tái tổ hợp định hướng các gen
kỹ thuật di truyền sinh học phân tử ➢ KT tách dòng gen
➢ KT tạo và dung hợp tế bào trần

42
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY VI SINH
1. Ưu điểm của VSV trong công nghệ lên men

- Vsv có kích thước nhỏ=> tỷ lệ bề mặt/thể tích lớn nên hấp thu dinh dưỡng
nhanh
- Tốc độ đồng hóa cao, sinh sản nhanh
- Tốn ít diện tích
- Phát triển ở nhiệt độ và áp suất thường
- Dễ thích nghi, sx ít phụ thuộc môi trường, thời tiết
- Tận dụng dc phế phẩm, phụ phẩm làm nguyên liệu nuôi cấy
- Dễ sd KT di truyền để tăng sản lượng, biến đổi sản phẩm cuối
- Có khả năng tạo các chất đối quang hay đối hình có hoạt tính => mà trong
hóa học rất khó thực hiện dc. VD L-glutamic acid, L-lactic acid
- Có thể thực hiện nhiều phản ứng sinh hóa khác nhau
- Các phân tử phức tạp như protein, kháng sinh thì tổng hợp bằng vi sinh dễ
hơn

❖ Nhược điểm:
- Dễ biến dị, có thể có độc tính
- Quá trình sx phức tạp, yêu cầu vô trùng cao (do dễ nhiễm trùng)
- Chi phí cao cho quá trình giữ giống và bảo quản giống
- Sản phẩm mong muốn thường lẫn trong phức hợp cần phải tách
riêng
- Thời gian lâu, cần xử lý thể tích môi trường lớn

2. Phương pháp lên men (ưu+nhược điểm)

Phương Phân loại Đặc điểm
pháp
Pp lên Lên men - Vsv kỵ khí, không cấp khí
men theo kỵ khí - Môi trường lỏng, bán rắn
- Vd lên men rượu

43
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
điều kiện Lên men - Vsv hiếu khí, cấp khí sạch
hô hấp hiếu khí - Mt lỏng, bán rắn; Vd : làm dấm, mốc tương,
penicillin
Lên men - Vsv vi hiếu khí, cấp khí nhẹ
vi hiếu khí - Mt lỏng
- Vd; SX vitamin B12
Pp lên Bề mặt - Vsv hiếu khí, cấp khí vô trùng, làm mát, môi trg lỏng
men theo dịch thể - Ưu điểm: đơn giản, dễ tiến hành
hình thức - Nhược điểm:
thiết bị +khó giữ vô trùng
+khó cơ giới hóa tự động
+tốn diện tích
+ tốn nhân công
Bề mặt - Môi trường: các loại hạt, mảnh, phế liệu hữu cơ, bã
bán rắn mía… => được xử lý bằng cách hồ hóa (60-75% ẩm),
bổ sung dinh dưỡng, khoáng, vi lượng,…
- Vsv hiếu khí; Quạt thổi khí vô trùng
- Ưu điểm: +đơn giản, lên men đồng thời nhiều vsv;
+ dễ xử lý cục bộ
- Nhược: +khó vô trùng
+khó cơ giới hóa, tự động hóa
+tốn diện tích, nhân công
Lên men - Vsv hiếu khí + kỵ khí
chìm - Ưu: + tốn ít diện tích, giữ vô trùng;
+dễ cơ giới hóa, tự động hóa;
+dễ kiểm soát toàn bộ; tốn ít nhân lực
- Nhược: +kinh phí lớn cho thiết bị;
+cán bộ chuyên môn cao;
+không thể xử lý cục bộ
Pp lên Lên men Tiến hành theo lô mẻ; thu sản phẩm ở cuối quá trình
men theo mẻ, gián Vsv được nuối cấy cố định trong bình lên men có V xác
cách tiến đoạn định ko đổi
hành ❖ Đặc điểm:
- Thể tích môi trường nuôi cấy không thay đổi trong
suốt quá trình, thu sp ở cuối quá trình

44
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 - Khi đảm bảo các đk thích hợp, VSV phát triển
theo đúng sinh lý gồm 5 giai đoạn: tiềm phát,
nhân lên chậm, logarit, cân bằng, suy vong
- Hầu hết các thông số của quá trình đều thay đổi
theo thời gian
- Thường sx sp chuyển hóa thứ cấp bậc 2 (a.amin;
kháng sinh)
❖ Ưu:
- Chi phí ban đầu thấp
- Có thể lập mô hình toán học chính xác để nâng
cấp quy mô sx
- Có thể sx quy mô lớn (nồi lên men>1000L)
❖ Nhược:
- Hiệu suất thấp hơn pp khác
- Không lý tưởng trong sx các sp bậc 1
- Sp không đồng nhất trong các mẻ khác nhau
- Khử trùng nhiều lần dẫn đến các bộ phận nhạy
cảm như cảm biến oxy, đo ph, nhiệt kế,…bị nhanh
lão hóa
Lên men Liên tục cung cấp chất dinh dưỡng và liên tục thu sản
liên tục phẩm; ứng dụng đối với sản phẩm ngoại bào , dùng để
sx các protein đơn bào (nấm men) để sx acid acetic,
etanol, xử lý nước thaỉ của 1 số nhà máy
❖ Đặc điểm:
- Liên tục cấp dd và thu sp => thể tích MT nuôi cấy
ko thay đổi do cân bằng động
- Thay đổi sinh lý của vsv
- Khi đảm bảo đk thích hợp => vsv có thể kéo dài
pha cân bằng
- Quy mô nhỏ ( nồi lên men<1000L)
❖ Ưu
- Kéo dài pha cân bằng=> tế bào lâu già hóa hơn
- Trạng thái sinh lý của tế bào đồng nhất hơn lên
men mẻ => sản lượng ổn đinh hơn

45
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 - Giảm chi phí nhân lực và các khâu nhân giống, tiệt
trùng, thu sp ( do sp thu dần dần nên giảm quy mô
xử lý dịch nuôi cấy hơn lên men mẻ)
- Tính đồng nhất sp cao hơn
- Cơ chất sử dụng nhiều hơn nên tổng sp thu dc cao
hơn
❖ Nhược điểm:
- Sp ko đạt nồng độ tối đa và bị pha loãng
- Duy trì điều kiện vô trùng khó hơn nên nguy cơ
nhiễm cao hơn, cần các thiết bị vô trùng dự
phòng=>tăng chi phí
- Làm thay đổi sinh lý tb do kéo dài pha cân bằng =>
cần tính toán lại nhiều thông số, chất lượng các
đợt lên men khác nhau khó đồng nhất
- Dễ xảy ra sự thất thoát giống và sinh khối trong
quá trình thu sp ( do vsv đi ra cùng sản phẩm)
- Khó nâng cấp quy mô sản xuất->chưa phổ biến
trong CN

Lên men Định kỳ bổ sung chất dinh dưỡng và thu sản phẩm
bán liên định kỳ ( ko chứa tế bào) hoặc thu sản phẩm cuối quá
tục trình
Nhằm làm tăng mật độ tế bào trong bình giúp tăng
hiệu quả sử dụng bình lên men
Hay còn gọi PP lên men mẻ có bổ sung
❖ Đặc điểm:
- Bổ sung MT dinh dưỡng định kỳ => thay đổi thể
tích MTnuôi cấy
- Thu sản phẩm….
- Thích hợp sx SP cuối cùng hay sơ cấp bậc 1
❖ Ưu
- Giảm độ nhớt dịch nuôi cấy khi bổ sung dinh
dưỡng
- Mt đc pha loãng => giảm ức chế tế bào do các SP
phụ hoặc bản thân sản phẩm chính
- Cơ chất dc chuyển hóa nhiều hơn

46
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 ❖ Nhược
- Không ổn định về thành phần MT và sản phẩm =>
cần lấy mẫu thường xuyên để kiểm tra nồng độ cơ
chất và sp
- Tăng rủi ro nhiễm khuẩn

3. Thiết bị nuôi cấy vi sinh vật (ưu+nhược điểm)?

THIẾT BỊ LÊN MEN CHÌM:
❖ Yêu cầu về cấu tạo
❖ Ưu
❖ Nhược
4. Trình tự qui trình và điều kiện lên men Vi sinh vật

4.1. Trước lên men

chuẩn bị giống: ko chuẩn bị môi khử
dùng dịch ở 1 nồi đã kết trường dd (phụ
thúc lên men để làm giống thuộc mục đích quá
trùng
cho một nồi khác; có thể trình, bản chất sp, nhu MT và
nhân giống từ những mẻ cầu vsv,đủ chất) thiết bị
lên men tốt từ trước đó
nguồn
hydratcacbon
giữ giống:
+ MT thạch nitơ
+ cát, đất, hạt ngũ cốc,
silicagel khoáng chất
+đông khô(ống giống đông
khô) vi lượng
hoạt hóa giống:
+ ktra độ thuần khiết các chất khác:
tiền chất, dầu
+ ktra khả năng hồi biến
tính hoang dại
phá bọt, vitamin,
chất kích thích
+ kích hoạt tế bào
sinh trưởng

47
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
Chuẩn bị Nguồn hydrat - Lượng lớn (20%), vi sinh vật tiêu thụ từ
môi trường cacbon 10-50%
nuôi cấy - Đường: glucose, saccarose
- Tinh bột: ngô, lúa mỳ, gạo, sắn,..
- Khác: +cellulose (rơm, rạ, bã mía,..)
+ paraffin( C8-C18) : khí methan
Nguồn nito - Vô cơ: NH4+; NO3-
- Hữu cơ:
+acid amin (bột đậu, bột ngô, cao nấm
men, pepton, cao thịt,…)
+cao ngô: bổ sung protein, a.amin,
peptid, vit nhóm B, biotin, chất kích
thích sinh trưởn, vi lượng,…

Nguồn khoáng chất - Phosphor:

+ phosphor hữu cơ: bột đậu, ngô,..
+ phosphor vô cơ : KH2PO4, K2HPO4,..
- Canxi: CaCO3 chỉnh ph đối với vsv tiết
acid
Vi lượng - Có trong nguồn nguyên liệu HC và nito
thô
- Muối sulfat Mg, Mn,.;muối vô cơ Zn,
Cu,.
Vitamin, chất kích - Vd: cobalt , có trong cao ngô, rỉ
thích sinh trưởng đường,..
Dầu phá bọt Dầu thực vật, dầu silicon. Quá nhiều gây
tạo nhũ tương. Dùng trong lên men hiếu
khí cần cấp khí
Tiền chất (mcg/l) quan trọng
Chất điều chỉnh pH, …..
và các chất khác
Khử trùng Mục đích: Phương pháp:
- Khử trùng MT dd - Dùng hơi nóng (121oC/ 30’)
- Hồ hóa thành - Áp suất (0.6-1 atm)
phần chứa tinh - Khử trùng không khí cần qua hệ
bột thống xử lý độ ẩm, tạp cơ học-bụi kk

48
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 - Tiệt trùng đường (vì nếu ko tách hơi ẩm trong kk thì
ống và thiết bị vật liệu lọc sẽ bị ẩm và không còn
- Đồng nhất hóa khả năng lọc sạch)
các thành phần
trong mt nuôi cấy

4.2. Trong lên men

- Nhân giống
- lên men là quá trình tạo ra sp đích, tăng sinh khối, và tạo hoạt chất chính
- lên men bao gồm:
+ cấp khí, cấp dinh dưỡng
+ truyền nhiệt (nóng/lạnh)
+ chuyển khối (khuấy trộn)
+ điều chỉnh phản ứng sinh học (ph,phá bọt, bổ sung dd,..)
- hiệu suất phụ thuộc:
+ độ vô trùng
+thành phần dinh dưỡng
+ pH, nhiệt độ, cung cấp oxy hòa tan
+ thời gian nuôi cấy
+ chất tiền thể

49
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 nhân giống lên men

quá trình khuấy trộn

mục đích:
1. tăng số lượng tb ở giai đoạn quá trình cấp khí
phát triển mạnh nhất
2. vsv làm quen vs MT dịch thể quá trình phá bọt
(nuôi cấy chìm)
quá trình chỉnh pH
chỉnh nhiệt độ
3. cấp độ nhân giống phụ
thuộc vào thể tích nồi lên men bổ sung dinh dưỡng
và tiền chất
4. tbị nhân giống cuối cùng cần
có cấu tạo tương tự TB lên
men lấy mẫu
5. tỷ lệ giống cấy: 5-10% (20%
cho vsv kỵ khí)

Quá trình Đặc điểm

trong Lên men
Khuấy trộn - Ngăn cản sự kết lắng của tế bào
- Giảm tập trung cục bộ SP chính và phụ
- Tăng tiếp xúc giữa tế bào và MT dinh dưỡng, oxy
- Cung cấp oxy
- Khuấy trộn mạnh quá: gây phá vỡ tb hoặc hệ sợi, tạo pellet
chắc, nhỏ, và nồng độ oxy hòa tan lớn
- Khuấy trộn nhẹ quá: tạo các pellet rỗng, giảm tiếp xúc với
oxy và MT dinh dưỡng
- Pp khuấy trộn:
+cơ học: cánh khuấy chuyển động, rung
+bằng khí động với các bọt khí có vận tốc tương đối
lớn=>tạo ra vòng tuần hoàn
+ bằng thủy lực với cách phun tạo ra dòng tuần hoàn
Cấp khí - Vsv hiếu khí

50
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 - Lượng oxy tan/nước rất thấp và phụ thuộc: nhiệt độ, độ
nhớt, lượng sinh khối, nồng độ các chất/MT,…
- Nhu cầu oxy khác nhau: giữa các loại vsv, các giai đoạn sinh
trưởng
- Nhu cầu oxy thường tăng dần theo lượng sinh khối
- Lưu lượng cấp oxy phụ thuộc vào dung tích thiết bị nuôi cấy
Phá bọt - Bọt xuất hiện do quá trình khuấy trộn và sục khí mạnh; gây
trào dịch nuôi cấy ra=>gây nhiễm; cản trở tb tiếp xúc với
môi trường
- Pp xử lý:
+ sd các chất hoạt động bề mặt
+ dầu thực vật, mỡ cá heo
 Yêu cầu nhanh chóng phân tán bọt, ko độc vs vsv, tác
động kéo dài, lượng dùng nhỏ
Chỉnh pH - Ph ảnh hg lớn đến phát triển và sinh tổng hợp SP của vsv do
ion H và OH tác động trực tiếp đến hoạt lực enzyme và tính
chất keo của tế bào
- Biện pháp ổn định:
+ CaCO3 (1-5%)
+ dd NaOH, NaCl, NH4OH, đệm photphat
Nhiệt độ - Vsv hô hấp => tỏa nhiệt
- Khuấy trộn+ sục khí => tỏa nhiệt
- Bphap: nồi 2 vỏ, ống xoắn
Lấy mẫu Kiểm tra: trạng thái tb, ph, độ vô trùng, sản phẩm
Tiêu hao năng lượng
Xđ thời gian thu sản phẩm

4.3. Quá trình sau lên men

51
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)
 Tách sinh khối
lọc hoặc ly tâm (lọc trống, khung bản); sd
hạ nhiệt độ (4oC) để giữ hoạt tính
chất trợ lọc

giải phóng chất nội bào

sp trong dịch lọc => loại sản phẩm trong sinh khối=>loại dịch lọc
sinh khối giải phóng hoạt chất ra khỏi tb => phá màng tb = acid hóa

chiết tách sản phẩm

chiết bằng dung môi nhựa trao đổi ion hoặc nhựa hấp phụ

tinh chế ( tẩy màu, loại tạp, kết tinh)

52
Học dược cùng Ds. Củ Cải (^.^)