HEMOGLOBIN

Detekcija hemoglobina: alkalna i kisela elektroforeza Hb

Dijagnostika hemoglobinopatija:

1. TESTOVI RASTVORLJIVOSTI
- dokazivanje HbS, NaSO3: oksi HB  deoksiHb (fosf. pufer)
- jednostavno, brzo, nedovoljno osjetljivo
- ne detektuje druge varijante Hb, nije koristan za screening
- vazan za diferencijaciju HbS, D, G  HbS< 15% lazno neg rez

2. SEKUNDARNI TESTOVI:

a) Testiranje rastvorljivosti sa ditionitom

b) Test alkalne denaturacije za kvantificiranje HbF

Alkalna denaturacija HbF

uzorak: EDTA antikoagulirana krv
princip: drugi HB su podlozniji od HbF na alkalnoj pH
denaturacija se zaustavlja dodavanjem amonijum sulfata
denaturisani Hb precipitiraju, a ostatak HbF  spektrofotometrijski

Kvantifikacija HbF
1. Jonoizmjenjivacka hromatografija + visoke konc
2. Imunoloske reakcije (RIA, ELISA)
3.Radijalna imunodifuzija
4. Alkalna denaturacija ( ne kod visokih konc)
5. Elektorforeza ( celulozo acetat) --- ne preporucuje se

c) Test elucije sa kiselinom za testiranje distribucije sa HbF

d) Testiranje na prisustvo Heniz tjelasaca

 ANALITIKA HEMOGLOBINA

1. Detekcija na osnovu spektralnih karakteristika

- OksiHb  540 nm, 578 nm
- deoksi Hb  555 nm
- met Hb  500 i 630 nm
- karboksi Hb  537 nm
Zahvaljujuci parafinskom prstenu, svi nastali derivati pokazuju sposobnost apsorpcije
između 400 i 440 nm ( soretova traka)

2. Određivanje Hb u krvi

CIJANOMETHEMOGLOBINSKA METODA

Fe 2+ (iz Hb) + fericijanid  Fe 3+ (Hb)

methemoglobin

methemoglobin + kalijcijanid  cijanomethemoglobin (crven, A= 540 nm)

- Koristi se Drapkinov reagens, EDTA antikoag.

-Za rad potrebno 20 mikrolitara pune krvi (venska ili kapilarna)

3. Određivanje Hb u plazmi
- normalno je nizak u plazmi
- visok: hemoliza, transfuzija, dijaliza

a) metoda sa benzidinom
b) mjerenje oksi Hb ( Soretova traka 415 nm)
- na 380 i 450 korekcija turbiditeta

4. Određivanje sulfHB i metHb

- zasniva se na njihovim spektralnim karakteristikama

a) metHB + CN  cijanomethemoglobin Amax= 630- 635 nm

b) sulfHB + CN  cijanosulfhemoglobin A max = 600- 620 nm