ANALITIKA ZUCNIH BOJA

 Odredjivanje bilirubina u serumu

 Odredjivanje bilirubina u urinu
 Odredjivanje urobilinogena u urinu i stolici

 BILIRUBIN (u serumu)

1) Diazo reakcija :

Nekonj.bilirubin + diazotizirana sulfanilna kis. (pH=1,2)  Azobilirubin (izomer 1)

Azobilirubin (izomer 2)

Crveno – ljubicast A= 560nm

2) Metoda po Mallay Evelinu

3) Metoda po Jandrassik – Grofu

- Direktnom metodom ne mozemo odrediti ukupni bilirubin, vec samo konjugovani.

Za odredjivanje nekonj.bilirubina potrebno je koristiti akceleratore (kafein, Na
benzoat).

 Uzorak + diazo reag. + aks.kis., dil.. HCl, alkalije  konj.bilirubin

 Uzorak + kofein- Na- benoat + diazo reag. + ask.kis.; dil. HCl, alkalije 
ukupni bilirubin

- Bilirubin je osetljiv na svetlost i promene temp. Svi uzorci se moraju cuvati na +4

(do 7 dana) ili zaledjeni (nekoliko meseci), takodje zasticeni od prirodne ili
fluorescentne svetlosti.
 4) Metoda sa tankim filmom ( reakcija po Van den Bergu) –uk.bilirubin iz tri sloja

 Rekcioni sloj (Triton X-100, surfaktant, diazonij so i difilin (akcelator)

 Kontrolni sloj sadrzi binder koji stabilizira bilirubin i puferuju u svrhu rasta
osetljivosti
 Suport sloj

 Slojevi u ovoj metodi

Nekonjugirani/ konjugirani bilirubin; 4 sloja

1) Spreding sloj – Triton X-100, kafein i Na-benzoat (separacija nekonj.

bilirubina od albumina)
2) Sloj demaskiranja – filtrira velike molekule poput Hb, delta bilirubina,
lipida i lipohroma
3) Sloj registriranja – sadrzi mordant koji vezuje bilirubine i pufere
4) Suport – zastitni sloj

 Ova metoda je zasnovana na cinjenici da konj. I nekonj. bilirubin imaju razlicite aps.
max. kad se vezu na kationske polimere.
- Nekonj. bilirubin A= 400nm
- Konj. Bilirubin A= 460nm

5) Enzimatska metoda sa bilirubin oksidazom

- Dodati anionski deterdzent da se oslobodi albuminski vezan bilirubin
- A= 425 nm

6) HPLC
- Cetiri forme bilirubina u serumu
 Alfa bilirubin (nekonj.oblik) 27% od ukupnog
 Beta bilirubin (mono konj. Sa glukuronskom kis.) 24%
 Gama bilirubin (dikonjugiran sa glukuronskom kis.) 13%
 Delta bilirubin je ireverzibilno vezan za protein 37%
- Samo beta, gama i delta frakcije su rastvrljive u vodi, i zato korespondiraju sa
direktnim bilirubinom.
- Alfa bilirubin biva solubiliziran putem alkohola i prisutan je sa svim drugim
podfrakcijama u frakciji indirektnog bilirubina.
- Delta b. – nekad se detektuje kod obstruktivnog oboljenja jetre. Njegov rast
objasnjava rast konc.konj. bilirubina kada nema rasta bilirubina u urinu.
 BILIRUBIN (u urinu)

- Samo konjugovani se izlucuje urinom, njegova prisutnost upucuje na konj.hiperb.

- Taman urin, sa zutom penom
- Ako mokraca dugo stoji na zraku, boja prelazi u zelenu (ox. Bilirubina u biliverdin)
- Test traka impregnirana diazo—reag. Lijekovi koji boje mokracu crveno ili su
crveno obojeni u kiselom mediju kao sto je fenazopiridin, mogu dati lazno pozitivnu
reakciju.
- Velike kol.askorbinske kis.smanjuju osetjivost reakcije.

 Elihova reakcija
- Bilirubin se u reakciji sa jodom oksidira smaragdno zeleni prsten.

 UROBILINOGEN (stolica/urin)

- Stolica boje gline ili bela poput krede (holestatska zutica)  mala kolicina bilirubina
u GIT-u.

 Urin

 Test traka impregnirana diazo reagensom.

 Konc nitrita veca od 50mg/ L ili prisutnost formaldehida dovode do smanjenja boje
testne trake.
DIAZO I (sulfenilna kis. + HCl)
DIAZO II (Na nitrit)