BÁO CÁO THỰC HÀNH PHÂN TÍCH SẮC KÝ

GVGD: ThS.
Trần Nguyễn An Sa Lớp Nhóm: 2

Học và tên SV Mã Tuyết Huê MSSV: 2004180112
Nguyễn Thị Trang 2004180029
BÁO CÁO THỰC HÀNH PHÂN TÍCH SẮC KÝ

BÀI 1: SẮC KÝ BẢN MỎNG
1. Cơ sở lý thuyết phương pháp SKBM (TLC) (2,5đ)

Pha tĩnh:
Trong kỹ thuật TLC, pha tĩnh thường được tráng thành một lớp mỏng lên mộ tấm
thủy tinh nhôm hoặc nhựa có kích thước tùy chọn. Các tấm thủy tinh trơ về mặt hóa
học, chịu nhiệt tốt, có thể rửa sạch dễ dàng, sử dụng lại được nhưng dễ vỡ và khó cắt.
Các tấm nhôm và nhựa có thể được cắt bằng kéo, nhưng nhôm có thể không chịu được
các vết axit hoặc oxy hóa mạnh, và nhựa không chịu được nhiệt độ cao.
Các tấm TLC trong kỹ thuật TLc có thể được chuẩn bị ngay trong phòng thí
nghiệm, tuy nhiên hiện nay chúng được mua nhiều hơn. Khi lựa chọn pha tĩnh cũng
nên lưu ý đến các tính chất của mẫu. Silicagel có thể được sử dụng riêng cho các axit
amin và hydrocacbon. Cũng cần lưu ý rằng silicagel có tính axit. Do đó, đối với các
chất phân tích mang tính bazơ hoặc không bền với axit thì phân tách bằng các tấm
TLC phủ silicagel sẽ cho kết quả khá kém. Điều này cũng đúng với các tấm TLC phủ
alumina trong các dung dịch axit. Lưu ý là có sự khác biệt giữa silicagel và alumina.
Alumina có tính bazơ và sẽ không phân tsch các mẫu cỡ lớn như silicagel và do đó,
khi sử dụng TLC phủ alumina sẽ cần lưu ý đến các tính chất các chất và các nhóm hợp
chất nhiều hơn. Việc lưu ý này sẽ tránh được sự phân hủy mẫu.
Bảng 1: Pha tĩnh và đối tượng mẫu phân tích
Pha tĩnh Cơ chế sắc ký Chất phân tích
Steroids, amino acid, alcohols, hydrocarbons,

Silica gel Hập phụ
lipids, aflaxtoxin, vitamins, alkaloids
Amines, alcohols, steroids, lipids, aflatoxins,

Alumium oxide Hập phụ
vitamins, alkaloids
Nucleic acids, nucleotides, steroids,
PEI cellulose Trao đổi ion
nucelosides, purones, pyrimidines
GVGD: ThS. Trần Nguyễn An Sa Lớp Nhóm: 2
Fatty acids, vitamins, steroids, hormones,

Silica gel RP Săc ký pha đảo
carotrnoids
Magnesium silicate Hập phụ Steroids, pesticides, lipids, alkaloids
Trong bài thí nghiệm pha tĩnh là: bản mỏng silicagel Merck 60 F254
Pha động:
Việc quan trọng nhất trong kỹ thuật TLC là lựa chọn dung môi rửa giải (pha động)
phù hợp để tách được các chất trong mẫu phân tích. Để chọn được dung môi phù hợp,
cần lưu ý đến các tính chất vật lý cũng như hóa học của chất phân tích.
Axit, Bazơ là các hợp chất phân cực mạnh thường tạo ra các vệt dài hơn là các
đốm tròn trong dung môi trung tính. Các vệt này gây khó khăn trong việc tính toán Rf
và có thể bao gồm các điểm khác (các chất chồng lên nhau). Thêm một vài phần trăm
axit axetic hoặc axit formic vào dung môi có thể điều chỉnh vệt cho các axit. Tương tự
như vậy đối với các bazơ, thêm một vài phần trăm triethylamine có thể cải thiện kết
quả. Đối với các hợp chất phân cực, thêm một vài phần trăm methanol cũng có thể cải
thiện kết quả.
Tính dễ bay hơi của dung môi cũng cần được lưu ý. Bất kỳ dung môi nào còn lưu
lại trên bản mỏng đều có thể phản ứng với các vết bẩn (nếu có). Và che giấu cấc điểm.
Dung môi dễ bay hơi chỉ nên sử dụng để rửa giải một lần. Nếu pha động được sử dụng
nhiều lần, kết quả sẽ không nhất quán hoặc không có độ lặp lại.
Chất phân tích – tính chất chất phân tích: thứ tự độ phân cực giảm dần
Diphenylmethanol  Benzophenone  Biphenyl.
Cơ chế tách:
Trong sắc ký, các chất phân tsich sẽ được phân bố giữa các pha tĩnh và pha động.
Trong hầu hết tất cả các ứng udjng của TLC, pha tĩnh là chất hấp phụ silica hoặc
alumina và pha động là dung môi hữu cơ hoặc hỗn hợp dung môi.
Sắc ký được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt các
chât cần tách. Giọt dung dịch mẫu được nhỏ trên đường xuất, còn rìa bản được nhúng
vào dung môi thích hợp. Dưới tác dụng của lực mao quản, dung môi sẽ chuyển động
dọc theo lớp hấp phụ và chuyển vận các cấu tử chứa hỗn hợp với các vận tosc khác
nhau đưa đến việc tách các cấu tử. Sự khuếch tán các cấu tử trong lớp hấp phụ vừa
theo chiều dọc vừa theo chiều ngang, vì vậy, có thể xem qua trình sắc ký thực hiện
theo 2 chiều
Dự đoán thứ tự tách:
do cả hai chất đều là dung môi phân cực và tỷ lệ bằng nhau nên ta có hỗn
hợp dung môi phân cực. Áp dụng nguyên tắc những chất giống nhau thì có ái
lực giống nhau và thứ tự độ phân cực giảm dần ở chất phân tích
Diphenylmethanol  Benzophenone  Biphenyl nên thứ tự tách và sự di
chuyển vết trên tấm TLC giảm dần.
Cách phát hiện các vết sắc ký:
những vết dễ thấy có thể nhìn thấy bằng mắt thường hoặc dùng đèn UV để
hiện vết sắc ký cho những chất khó thấy.
2. Qui trình thực nghiệm: (sơ đồ khối và hình chụp thực tế) (2,5đ)
 Quy trình chung của sắc ký bản mỏng
Chuẩn bị pha Chuẩn bị bản

tĩnh mỏng
Chấm mẫu lên

vạch xuất phát
Triển khai sắc Xử lý kết quả

ký
 Pha chế dung dịch chuẩn đơn, chuẩn hỗn hợp

Cân 5mg mỗi Hòa tan Lọ thủy tinh 10ml

chất chuẩn có nắp đậy
đơn
0,5ml dung
Môi
Dd chuẩn đơn dùng

để phân tích
Lấy 2-3 giọt
Vào lọ thủy tinh

10ml
Dung dịch chuẩn

hỗn hợp
 Pha chế dung dịch mẫu phân tích

0,5ml methanol Dán nhãn
5mg mẫu Lọ thủy tinh 10ml Dung dịch mẫu
phân tích
 Chuẩn bị bản mỏng và ống vi quản

Chuẩn bị bản mỏng như sau: Dùng kéo cắt tấm bản mỏng silicagel Merck 60 F254
thành các bản nhỏ theo kích thước dài x rộng = 8 x 6 cm. Mỗi nhóm cần 6 bản nhỏ cho
6 loại dung môi rửa giải. Sau đó, dùng bút chì vạch nhẹ nét xuất phát (cách mép dưới
1cm) và mức tiền tuyến dung môi (cách mép trên 0,5 cm).
Chuẩn bị ống vi quản như sau: Vi quản được hơ và xoay tròn trên ngọn lửa xanh
của đèn cồn để vi quản nóng chảy đều. Khi vi quảng nóng chảy, vừa đem vi quản ra
khỏi ngọn lửa đèn cồn, vừa kéo 2 đầu vi quản ra 2 hướng khác nhau, sau đó giữ yên
cho thủy tinh nguội.
 Quy trình triển khai

Chuẩn bị 6 cốc chứa 6 loại dung môi rửa giải khác nhau như acetone, CH2Cl2, ethyl
acetate, hexane, methanol và toluene như sau:
Cho 10ml dung môi rửa giải vào cốc thủy tinh 250ml. Chiều cao của dung môi
trong cốc thấp hơn hoặc bằng 5mm để mẫu sau khi được chấm lên bản mỏng không bị
chìm vào dung môi.
Đặt bên trong mỗi cốc một mảnh giấy lọc để hơi dung môi có thể bão bên trong
cốc. Đậy cốc bằng mặt kính dán nhãn hoặc đánh số cho từng cốc.
Chấm bản: Dùng ống vi quản vừa chuẩn bị ở trên để chấm các dung dịch chuẩn
đơn, chuẩn hỗn hợp và mẫu phân tích lên bản mỏng. Mỗi điểm có đường kính 1-2mm,
cách nhau khoảng 1 cm, lượng mẫu khoảng 10µL. Sau khi chấm, để khô trong không khí
Dùng kẹp đặt bản mỏng vào bình giải ly đã chuẩn bị. Chờ và theo dõi bản mỏng. Khi dung môi
chạm đến mức tiền tuyến của dung môi thì dùng kẹp gắp bản mỏng ra khỏi bình giải ly một cách cẩn
thận về để khô trong không khí.
Sau khi dung môi bay hơi, đặt bản mỏng dưới đèn UV để quan sát. Dùng bút chì đánh dấu lại các
vết quan sát.
3. Kết quả thực nghiệm (3đ)

(hình chụp bản mỏng chiếu UV của tất cả dung môi, có nhận xét sơ bộ về khả
năng tách của dung môi)
Dung môi 1 2 3 4
Hình kết
quả chiếu
UV
Nhận xét Chất phân tích Chất phân tích Chất phân tích Chất phân tích
không tách được tách được khá không tách ra tách được ít
nhiều khỏi dung môi
Dung môi 5 6 7 8
Hình kết quả

chiếu UV
Nhận xét Chất phân tích Chất phân tích Chất phân tích Chất phân tích
tách được ít tách nhiều khỏi không tách không tách
dung môi được được
Dung môi 9 10
Hình kết quả

chiếu UV
Nhận xét Chất phân tích Chất phân tích

tách ít tách được ít
4. Kết quả tính toán (2đ)

- Dung môi tối ưu là Toluen
Chất tách được tối ưu

A 2 4.6
9
R f1
2

S

6.7
 0.39
73
A 1.2
R f3

S

6.7
 0.18
Nhận xét: Chất 1 di chuyển
được 39% khoảng cách của dung môi vì có Rf1=0,39 chất 2 di chuyển được 73%
khoảng cách của dung môi vì cố Rf2=0,73 chất 3 di chuyển được 18% khoảng cách của
dung môi vì cố Rf2=0,18 do sự chênh lệch giữa 3 khoảng cách là có nên 3 chất này có
thể tách ra khỏi nhau và dung môi rủa giải này là phù hợp
Mẫu mà Gv đưa nằm ở vị trí thứ 5 trong bản mỏng hiển thị bao gồm 2 chất là chất thứ
1 và chất thứ 3
BÁO CÁO THỰC HÀNH PHÂN TÍCH SẮC KÝ

BÀI 2: SẮC KÝ CỘT
1. Cơ sở lý thuyết phương pháp sắc ký cột (2,5đ)

Pha tĩnh:
Có 3 loại là: Silica gel, Alumina, Gel
Silicagel
 Slicagel pha thường
Silica gel được chế tạo bằng cách thủy phân silicat natri để thành acid polysilisic,
tiếp theo là sự ngưng tụ và polyme hóa để đạt được các chỉ tiêu vật lý cần thiết như
kích cỡ hạt, thể tích lỗ rỗng trên bề mặt, diện tích bề mặt,...như yêu cầu. Silica gel sử
dụng trong sắc ký cột có đường kính hạt trung bình khoảng 40-200 µm, các lỗ rỗng có
đường kính trung bình khoảng 30-300 A o, diện tích bề mặt khoảng 100-800 m2/g.
Các vị trí hoạt động trên bề mặt silicagel là các nhóm silanol -OH. Khi silicagel hấp phụ nước, các
phân tử nước sẽ che khuất các tâm hoạt động này, do đó muốn điều chỉnh hoạt tính của silicagel chỉ
cần thêm hoặc loại bỏ bớt nước.
Các tâm hoạt động này có thể tạo nối hydrogen mạnh với những hợp chất được sắc ký, do đó những
hợp chất phân cực sẽ bị silicagel giữ chặt trong cột và giải ly ra muộn hơn so với các hợp chất ít phân
cực.
 Silica gel chế hóa
Có thể chế hóa silicagel bằng cách cho các nhóm silanol tác dụng với nhiều loại chloride silyl
khác nhau để tạo thành những chất hấp phụ mới với các đặc tính vật lý thay đổi được gọi là silicagel
tạo nối. Tùy thuộc vào loại chloride silyl mà loại silicagel này được dùng cho pha thường hay pha đảo.
Thường dùng silicagel pha thường trong hầu hết các quá trình phân lập hợp chất. Do đó trong
các mục sau chủ yếu đề cập đến silicagel pha thường.
Alumina
Alumina là oxit aluminium Al2O3 được điều chế với quy trình tương tự như silicagel với nguyên liệu
ban đầu là hydroxid aluminium. Hơn nữa có thể điều chỉnh pH của để tạo thành mạng không gian,
tính kiềm hay trung tính. Thường sử dụng alumina trung tính làm pha tĩnh
Gel
Gel là tên gọi chung cho các loại pha tĩnh được điều chế từ tinh bột, agar hoặc polyacrylamid,
trong đó các chuỗi dây dài được nối mạng ngang để tạo thành mạng không gian 3 chiều. Có nhiều
loại gel thương phẩm với đặc tính khác nhau tùy thuộc vào nhà sản xuất. Phổ biến là gel dextran có
tên thương mại là Sephadex G.
Pha động:
Lần lượt giải ly cột từ dung môi không phân cực đến dung môi phân cực. Có thể
sử dụng hệ dung môi đơn nồng độ hoặc dung môi có tính phân cực tăng dần để rửa
giải .
Dưới đây là các dung môi thường được dùng trong sắc ký cột với chỉ số phân cực tăng
dần.
Bảng 2: Các loại dung môi thường được sử dụng trong sắc ký cột
Dung môi đơn Hệ hai dung môi Hệ dung môi đặc biệt
Các hydrocacbon như: Ether với ether dầu
N-butanol với acid axetic và
1 pentane, ether dầu hỏa, hỏa/hexane/pentan
nước
hexane e
Hexane với ethyl
Ether hoặc 2-melthyl-1-propanol với acid
2 acetate/
dichloromethane acetic và nước
dichloromethane
Dichloromethane
3 Ethyl acetate 1-propanol với NH4OH và nước
với methanol
Chất phân tích – tính chất chất phân tích:

Cơ chế tách:
Hỗn hợp được đưa qua cột thẳng đứng có chứa vật liệu hấp phụ (pha tĩnh) rồi
dùng dung môi hay hệ dung môi (pha động) phù hợp để rửa giải, các chất đi ra được
thu lại thành từng phần nhỏ ở đầu dưới của cột. Tùy thuộc vào tương tác của chất
trong hỗn hợp với vật liệu hấp phụ và dung môi rửa giải, các chất đi ra được thu lại
thành từng phần nhỏ hay phân đoạn nhỏ ở đầu dưới của cột. Tùy thuộc vào tương tác
của chất trong hỗn hợp với vật liệu hấp phụ và dung môi rửa giải mà các thành phần
khác nhau trong mẫu được phân tách.
Dự đoán thứ tự tách:

Yêu cầu khi nạp pha tĩnh, nạp mẫu và giải ly
Bột silica và alumina là chất kích thích phổi. Và phải luôn được xử lý cẩn thận
trong tủ hút. Bụi bị đổ nên được xử lý bằng cách lau nó bằng khăn giấy ướt (Vì khi
ướt, các hạt mịn sẽ ít phân tán hơn).
Trong toàn bộ quá trình rửa giải. Cột phải luôn ướt và không được để mực dung
môi rửa giải quá sát bề mặt lớp pha tĩnh.
Phải đảm bảo có đủ thời gian để chạy cột trước khi đưa mẫu lên, không nên dừng
cột quá 5 phút. Không được ngừng cột quá 2 lần. Khi cột đang chạy rồi, việc dừng cột
trên 1 phút sẽ dẫn tới dải bị mở rộng.
Qui trình thực nghiệm: (sơ đồ khối và hình chụp thực tế) (2,5đ)
 Quy trình nhồi cột sắc ký

Bước 1: Tráng rửa cột bằng nước
cất, để khô, tráng lại bằng
chloroform. Kẹp cột lên giá, cho
vào đó miếng bông nhỏ để bịt đầu
dưới của cột. Để dưới cột một hũ
bi để hứng dung môi.
Bước 2:Cân khoảng 6g silica gel
vào cốc thủy tinh, cho tiếp vào đó
khoảng 30ml chloroform, khuấy
đều.
Dùng pipette pastuer chuyển hỗn hợp vào cột. Tiếp tục cho chloroform đến khi silaca trong cột
lắng và ổn định. Quá trình này cần khoảng 30ph
 Quy trình triển khai sắc ký

Bước 1: Xử lý mẫu lá cây, chuẩn bị hệ dung môi.
Cốc 10g mẫu Cối sứ
+ 10ml dm CHCl 3
Nghiền Cao
3-5 lần
Dung dịch Cô cách

thủy
Becher Lọc Dung dịch
Mẫu cây sau khi được rửa sạch, để khô, sau đó được giã nhuyễn, hòa với một ít chloroform.
Bước 2: Chuyển mẫu lên cột tiến hành sắc ký

- Dùng pipet pasteur chuyển mẫu lên cột sắc ký theo phương pháp ướt
- Pha hỗn hợp dung môi chạy cột (CHCl3). Chờ cho dung môi hòa tan mẫu chạm sát xuống bề mặt
pha rắn mới cho dung môi chạy vào cột sắc ký.
- Dùng hũ bi hứng dung dịch chảy ra khỏi cột theo các phân đoạn khác nhau.
2. Kết quả thực nghiệm (2đ) - cao CHCl3

a. Kết quả lựa chọn dung môi giải ly bằng TLC
Dung CH3Cl_MeOH CH3Cl_MeOH CH3Cl_MeOH MeOH
môi (2:3) DM1 (1:1) DM2 (3:2) DM3 DM5
Hình
kết quả
chiếu
UV
Nhận Vết rất đẹp, rõ Các vết tách Có một số vết tách Các vết kéo
xét ràng, tách nhau nhau ra tạm ổn ra được còn lại dính dài từ dưới đi
rất đều nhưng các vết với nhau thành một lên loan vào
vẫn loan vào vết, tách không tốt nhau hiệu
nhau quả tách kém
Kết luận dung môi tối ưu: nhìn vào hình ta thấy dung môi 1 tách được nhiều màu
nhất (5 màu). Nên dung môi 1 là dung môi tối ưu nhất.
b. Kết quả trên sắc ký cột
Hình chụp trên cột
Chai chứa các phân đoạn

3. Nhận xét kết quả trên sắc ký cột của 2 cao (1đ)
- Về kết quả trên ta thấy thì mẫu được pha trong MeOH tạo cao MeOH chỉ cho ra được
3 phân đoạn trên cùng 1 sản phẩm, nhưng trong khi đó cao CHCl 3 được pha từ mẫu với
CHCl3 thì lai cho ra được 4 phân đoạn cho thấy hiệu quả tách khi sử dụng cao CHCl 3
cao hơn cao MeOH.
- Khi thực hiện sắc ký cột chúng ta củng nên ưu tiên sử dụng cao mẫu với CHCl 3 sẽ dễ
cho kết quả tốt hơn, vì CHCl3 hòa tan được nhiều chất giúp kết quả thí nghiệm hay
nghiên cứu được chính xác hơn.

BÁO CÁO THỰC HÀNH PHÂN TÍCH SẮC KÝ - bai 1-2

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

BÁO CÁO THỰC HÀNH PHÂN TÍCH SẮC KÝ - bai 1-2

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

GVGD: ThS.

Trần Nguyễn An Sa Lớp Nhóm: 2

1. Cơ sở lý thuyết phương pháp SKBM (TLC) (2,5đ)

Pha tĩnh Cơ chế sắc ký Chất phân tích

Steroids, amino acid, alcohols, hydrocarbons,

Amines, alcohols, steroids, lipids, aflatoxins,

Fatty acids, vitamins, steroids, hormones,

Magnesium silicate Hập phụ Steroids, pesticides, lipids, alkaloids

Chuẩn bị pha Chuẩn bị bản

Chấm mẫu lên

Triển khai sắc Xử lý kết quả

 Pha chế dung dịch chuẩn đơn, chuẩn hỗn hợp

Cân 5mg mỗi Hòa tan Lọ thủy tinh 10ml

Dd chuẩn đơn dùng

Lấy 2-3 giọt

Vào lọ thủy tinh

Dung dịch chuẩn

 Pha chế dung dịch mẫu phân tích

 Chuẩn bị bản mỏng và ống vi quản

 Quy trình triển khai

3. Kết quả thực nghiệm (3đ)

Hình kết quả

Hình kết quả

Nhận xét Chất phân tích Chất phân tích

4. Kết quả tính toán (2đ)

Chất tách được tối ưu

BÁO CÁO THỰC HÀNH PHÂN TÍCH SẮC KÝ

1. Cơ sở lý thuyết phương pháp sắc ký cột (2,5đ)

Chất phân tích – tính chất chất phân tích:

Dự đoán thứ tự tách:

 Quy trình nhồi cột sắc ký

 Quy trình triển khai sắc ký

Cốc 10g mẫu Cối sứ

Dung dịch Cô cách

Becher Lọc Dung dịch

Bước 2: Chuyển mẫu lên cột tiến hành sắc ký

2. Kết quả thực nghiệm (2đ) - cao CHCl3

Hình chụp trên cột

Chai chứa các phân đoạn

You might also like