Laboratorijska hematologija

Obezbeđenje kvaliteta rada u hematologiji

Violeta Dopsaj

Pojmovi u definisanju kontrole kvaliteta

Nepreciznost (reproducibilnost)

Netačnost

Delta Check

Pouzdanost (Reliability)

Referentni interval
2

1
 Nepreciznost

• Reproducibilnost
• Slaganje u rezultatima iz više uzastopnih merenja istog uzorka
• Slučajna komponenta greške
• Greške koje su nepredvidive i javljaju se bez pravilnosti
• Uzroci su nestabilnost instrumenta, promena temperature, promena
operatera
• Određuje se pre procenjivanja netačnosti

Netačnost
• Slaganja između srednje vrednosti i prave vrednosti
kontrolnog materijala
• Sistematsko odsupanje-bias
• Netačnost se određuje upotrebom kontrolnog materijala,
različitim metodama poznate preciznosti

Napomena

nema tačnosti bez preciznosti !!

postoji preciznost bez tačnosti !!

2
Netačnost

• Konstantna sistematska greška je greška u test sistemu

u kome veličina greške ostaje konstantna kroz ceo opseg
test merenja - konstantni bias
(sve konc Hgb su za 20 g/L više u odnosu na pravu
vrednost)
• Proporcionalna sistematska greška je greška u test
sistemu gde veličina greške raste sa koncentracijom
supstance koja se meri
(Hgb 80 g/L greška je 10 g; na 90 g/L greška je 15 g/L)

Netačnost i nepreciznost
Tačni i precizni rezultati

Netačni i neprecizni rezultati

3
 Statistički parametri nepreciznosti i netačnosti

• Srednja vrednost
x 
x 
x1  x 2    x N
N N
• Standardna devijacija (Sd)
– ± 1Sd
N
– ± 2Sd  (xi  x)2
– ±3Sd Sd  i1
N-1

• Koeficijent varijacije (%CV, %Kv)

Sd
Kv =  100
x

Pojmovi u definisanju kontrole kvaliteta

• Delta Check - način da se proveri sumnjiv rezultat

istog pacijenta koji je kontrolisao krvnu sliku na istom
aparatu 2-3 nedelje ranije
• Dozvoljeno odstupanje drugog rezultata u odnosu na
prvi uzima u obzir dozvoljen CV i fiziološku
intraindividualnu varijaciju
• Pouzdanost (Reliability) - metoda koja se koristi
treba da obezbedi stalnu tačnost i preciznost
• Test sistem: instrument, reagensi, kontrolni materijal
• Referentni interval - opseg u kome se nalazi vrednost
ispitivanog analita kod zdravih osoba (muškarci, žene,
deca)

4
 Obezbeđenje kliničke pouzdanosti rezultata
Koliko je dozvoljeno odstupanje od ciljnih vrednosti?
Uzeti u obzir nepreciznost metode i intraindividualnu varijaciju

Intraindividualna Ukupna greška (%)

varijacija (CV)
Hemoglobin 2.8 4.1
Hct 2.8 4.1
Eritrociti 3.2 4.4
MCV 1.3 2.3
MCHC 1.7 2.2
RDW 3.5 4.6
Leukociti 10.9 14.6
Neutrofili 15.1 22.4
Limfociti 10.4 16
Monociti 17.8 27.9
Eozinofili 21 37.1
Bazofili 28 38.5
9
Trombociti 9.1 13.4

Osiguranje kvaliteta rada u hematološkim laboratorijama

Quality assurance
Organizacija različitih aktivnosti u laboratoriji da bi se
obezbedio najbolji servis pacijentima i doktorima
Kontrola kvaliteta obuhvata procedure za monitoring i evaluaciju
karakteristika test sistemu
Program kontrole kvaliteta
Cilj: obezbediti pouzdane rezultate pacijentima i lekarima

Na koji način?
1. Detektovati potencijalne probleme u test sistemu
2. Primeniti korektivne mere u test sistemu pre nego
što rezultati pacijenata budu nepouzdani zbog nastalog problema

10

5
Obezbedenje kvaliteta sastoji se od 3 komponente:

1. Preanaliticka komponenta obuhvata sve uticaje u preanalitičkoj

fazi, a dešavaju se pre procedure testiranja, tj analitičke faze

2. Analiticka komponenta obuhvata sve uticaje na proceduru

testiranja, tj na analitičku fazu

3. Postanaliticka komponenta obuhvata sve uticaje u

postanalitičkoj fazi, nakon procedure testiranja

Sve tri komponente mogu uticati i konačno odrediti medicinski

ishod pacijenta

11

Program obezbeđenja kvaliteta obuhvata:

1. Internu kontrolu kvaliteta
2. Spoljašnju kontrolu kvaliteta
3. Standardizaciju
1. Interna kontrola kvaliteta u hematologiji obuhvata test
procedure koje se izvode u laboratoriji: testiranje preciznosti,
primena statističkih analiza, kontrola iz dana u dan
Sprovodi se kontinuirana evaluacija pouzdanosti rada laboratorije
primenom validacionih testova pre izdavanja rezultata
Koriste se komercijalne kontrole ili EDTA uzorci krvi pacijenata
2. Spoljašnja kontrola kvaliteta rada sprovodi se kontrolnim
uzorcima koje laboratorija dobija od institucije koja sprovodi
kontrolu (nacionalna, regionalna, međunarodna), najčešće više
puta godišnje
Nacionalne šeme NEQAS
12

6
3. Standardizacija obuhvata materijale i metode

Referentni materijali
Koriste se za kalibraciju analitičkih instrumenata i imaju tačno
određenu vrednost
Za referentne preparate u hematologiji zadužena je WHO i
Institute for Reference Materials and Measurements (EU)
Sertifikovani referentni materijali
Internacionalni standardi - nisu dostupni za rutinski rad već se
prema njima određuju komercijalni sekundarni standardi ili
kalibratori
Kao kalibrator se moge koristiti i sveži EDTA uzorci
Kontrole su preparati koji se koriste za unutrašnju kontrolu
kvaliteta ali se mogu koristiti i za spoljašnju kontrolu (kontrolne
krvi Beckman-Coulter)
13

Referentni preparati
Standard za hemoglobin
Cijanmethemoglobin kao standard za kalibraciju manuelnih i
automatskih metoda za određivanje hemoglobina
Standardni preparati za krvne ćelije
1. Krvne ćelije humanog porekla
Sakupljena krv se čuva nekoliko nedelja u ACD (acidum
citricum-dekstroza) ili CPD (citrat-fosfat-dekstroza) na 4ºC
MCV stajanjem raste, a dolazi i do lize eritrocita pa se ne može
koristiti kao referentni materijal, samo kao kontrolni preparat za
testiranje preciznosti aparata
2. Suspenzija od surogata krvnih ćelija
Koriste se fiksirani eritrociti i lateks partikule sferičnog oblika i
određene veličine u stabilnoj suspenziji
Koriste se kao primarni referentni materijal za veličinu eritrocita i
trombocita 14

7
 Za broj leukocita kao standardni referentni materijal koriste se:
- Fiksirani humani leukociti iz pune krvi
- Fiksirani eritrociti suspendovani u punoj krvi sisara bez leukocita
Hematološki brojači se podešavaju arbitralno: da bi se dobio pravi
rezultat instrument se kalibriše referentnim preparatom poznate
vrednosti još u fabrici

Komercijalni kalibrator za krvne ćelije i kontrolne krvi?

Kalibrator je konzervisana suspenzija humanih ćelija ili surogata
ćelija (na pr lateks partikule određene veličine) gde su hematološki
parametri određeni u više referentnih hematoloških laboratorija
Postoji veći broj komercijalnih kalibratora i kontrola za
hematološke brojače
Kontrolne krvi sadrže uglavnom 3 nivoa kontrole u oblasti
normalnih, niskih i visokih vrednosti hematoloških parametara
15

Kalibracija hematološkog brojača

Kalibracija je od suštinskog značaja za postizanje tačnosti rezultata
Kalibracija hematološkog brojača – proces elektronske korekcije
instrumenta za vrednost analitičkog biasa (tj numeričke razlike od
prave vrednosti)
Danas se koriste Komercijalni Kalibratori
Instrumenti su fabrički kalibrisani u proizvodnji

Kalibracija se mora uraditi na instalaciji i verifikovati na 6 meseci

Periodična kalibracija izvodi se posle velikih servisnih intervencija,
kada je potrebno optičko podešavanje
Whole blood calibration (koristi sveže uzorke krvi) ima istorijski
značaj i danas je zamenjena komercijalnim kalibratorima koji su
određeni referentnim metodama
Hb kao cijanmethemoglobin je jedini referentni standard
16

8
Kalibracija 5-part diff hematoloških brojača
Ne može se kalibrisati brojač za određivanje leukocitarne formule
Kalibracija 5-part diff definisana je podešavanjima:
a. Hidraulike
Pritisak se podešava da obezbedi protok ćelija, laminarni protok
ćelija i hidrodinamičko fokusiranje (osnov flow citometrije)
b. Optičkog sistema
Fokusiranje svetlosti lasera na Flowcell, tj na ćelije koje su u
protoku tečnosti
c. Hemijskom ravnotežom između krvi i lizirajućeg sredstva
Postizanje stabilizirajućeg volumena, odgovarajuće temperature,
podešavanje mešanja , tj kvalitet hemijske ravnoteže
Posebna komercijalna kontrola za kontrolu hidraulike i optike
(radi se obavezno jednom nedeljno)
Kontrola hidraulike i optike uvek se radi pre kontrolnih krvi
17

Provera instrumenta
Predstavlja rutinsku proceduru opisanu u Product Reference
Manual-u svakog proizvođača, koje treba strogo slediti

 Vizuelna provera instrumenta: on/off, provera stanja

reagenasa, start up
 Provera elektronike
 Beckground count (dozvoljen broj ćelija koji ne utiče na
rezultat pacijenta)
 Preventivno održavanje
 Test reproducibilnosti i Test carryover
 Vođenje dokumentacije o održavanju instrumenta

18

9
Kada i koliko često se rade kontrole?
Kontrolni uzorci se u automatizovanim hematološkim laboratorijama
obrađuju na početku rada i u svakoj analitičkoj seriji (period od 8 sati)

Obavezno posle intervencije na aparatu, promene reagensa,rekalibracije

Dozvoljena nepreciznost na hematološkim brojačima, CV (%)

WBC (4 - 15 x 109/L)  2.5
RBC (3 - 6 x 1012)  2.0
HGB (120 - 180 g/L)  3.0
MCV (80 - 100 fl)  2.0
PLT (200 - 500 x 109)  3.0

2 SD
LY % (20 - 40%)  3.0
MO % (3 - 9%)  3.0
GR % (45 - 75 %)  6.5

19

EDTA uzorci krvi pacijenata

• EDTA uzorci krvi pacijenata

– leukociti, eritrociti, hemoglobin, MCV, MCH,
MCHC
– stabilni 7 dana na 4C
– Prednost:
• jeftini
• dostupni
– Nedostaci:
• mala količina
• nestabilni

10
Vrste analitičkih grešaka
U preanalitičkoj, analitičkoj i postanalitičkoj fazi
Sistematske greške
Dešavaju se u test-sistemu ili u metodi
Najčešći uzrok je nekorektna kalibraciona procedura
Konstantna sistematska greška je greška u test sistemu u kome
veličina greške ostaje konstantna kroz ceo opseg test merenja -
konstantni bias (na pr sve konc Hgb su za 20 g/L više u odnosu
na pravu vrednost)
Proporcionalna sistematska greška je greška u test sistemu gde
veličina greške raste sa koncentracijom supstance koja se meri ( na
konc Hgb 80 g/L greška je 10 g; na 90 g/L greška je 15 g/L)
Slučajne greške
Greške koje su nepredvidive i javljaju se bez pravilnosti
Uzroci su nestabilnost instrumenta, promena temperature,
promena operatera
21

SD 0

-1

-2

-3
A B

Kontrolna karta i kontrolna pravila

A – slučajna greška
B – sistematska greška zbog neispravnosti reagensa
(zamena reagensa dovodi do normalizacija vrednosti)
22

11
 Tumačenje kontrolnih karata

• Koriste 3 različita kontrolna uzorka

– sa vrednostima u okviru referentnog opsega
– sa patološkim visokim vrednostima
– sa patološkim niskim vrednostima

• Dobijeni rezultati posmatraju se istovremeno

Za tumačenje se koriste Westgardova višestruka pravila

Određivanje uzoraka pacijenata u duplikatu

• Za testiranje nepreciznosti u jednom danu

• Testira se 10 EDTA uzoraka u duplikatu pod
kontrolisanim uslovima
• Izračunava se razlika između parova rezultata i prikazuje
kroz SD
• Razlika u parovima određivanja ne sme biti veća od 2 SD
• Metoda otkriva slučajnu grešku ali ne registruje pogrešnu
kalibraciju parata i progresivno pomeranje vrednosti
d 2 d- razlika parova
SD  N-broj parova
2N

12
 CUSUM metod
Izračunava se ukupni skor razlika između svakog merenja i srednje
vrednosti kontrolnog uzorka
Dani MCV (fL) Srednja Dnevne CUSUM*
N vrednost razlike
1 93 93 0 0
2 91 93 -2 -2
3 95 93 +2 0
4 92 93 -1 -1
5 94 93 +1 0
6 93 93 0 0
7 91 93 -2 -2
8 94 93 +1 -1

Izračunavanje kumulativnih skorova (CUSUM*) za MCV

CUSUM* na dan N = dnevna razlika + CUSUM na dan (N – 1)

Koristi se zajedno sa kontrolnom kartom, pogodan za otkrivanje

problema sa aparatom i sistematskog biasa

25

CUSUM

SD 0

-1

-2

-3
A Uzorci (N) B

Iz 5-10 određivanja izračunava se srednja vrednost i SD

Interval pouzdanosti (decision interval DI=2.6 SD), nacrta se CUSUM kriva
Ukoliko je CUSUM izvan DI određivanje više nije tačno i treba proveriti da li je
potrebno uraditi rekalibraciju aparata

26

13
 Izračunavanje dozvoljenog odsupanja po Brittin-u

• Analiziranje 5-10 uzoraka EDTA krvi sa hematološkim

parametrima u opsegu normalnih vrednosti u toku više dana (do
7 dana)
• Statistički značajna promena na nekom hematološkom
parametru može se utvrditi Student-t- testom za parove
određivanja

d n = broj parova određivanja

tn   n d= srednja vrednost razlika (iz dana u dan )
SD SD = standardna devijacija razlika

Izračunavanje dozvoljenog odsupanja po Brittin-u

• t - vrednost se određuje za svaki parametar i poredi sa

tabelarnim t
• ttab = 2,78 za n = 5, p <0,05

• t-vrednost za neki hematološki parametar veća od ttab

ukazuje na grešku tj. postoji statistički značajna razlika,
a stalan značajan t-skor u istom kanalu za brojanje ćelija
(iz dana u dan) ukazuje na potrebu rekalibracije aparata

14
Hematološki uzorci zdrave populacije u kontroli kvaliteta

Iz najmanje 5 EDTA uzoraka zdravih osoba odredi se MCV,

MCH i MCHC (imaju najmanje intraindividualne varijacije)

Izračunava se srednja vrednost i SD

Srednja vrednost ne varira više od 2SD, i SD su konstantne

Statistički značajna razlika u srednjoj vrednosti indikuje

konstantnu grešku, tj nekorektnu kalibraciju

Slučajna greška povećava SD a ne utiče na srednju vrednost

Pogodna za male laboratorije (manuelne metode)

29

XB analiza (Bull s algorithm)

Statistički program u softveru hematološkog brojača koji se koristi
za kontrolu preciznosti u laboratorijama sa velikim brojem
uzoraka
MCV, MCH, MCHC uzoraka obrađuju se kroz grupe podataka od
po 20 pacijenata, preko srednje vrednosti algoritma XB (tzv Bull-
ovi algoritmi)
Dozvoljeno odstupanje 3% od očekivane srednje vrednosti
populacije
Program obezbeđuje istu preciznost i tačnost kao i upotreba
komercijalnih kontrolnih krvi
Treba obraditi najmanje 500 uzoraka krvi pacijenata
Na grafikonima je moguće uočiti promene u funkcionisanju
aparata
Sprovodi se i statistička kontrola populacije
30

15
 31

Spoljašnja kontrola kvaliteta

Kontrola laboraatorije iz referentne ustanove spolja
Rezultati jedne laboratorije upoređuju se sa rezultatma drugih
laboratorija kao i sa prethodnim rezultatima
Grupe laboratorija definišu se prema vrsti hematološkog brojača
Određuje se tzv konsenzus vrednost za svaki tip hematološkog
brojača i konsenzus vrednost za sve brojače
Konsenzus vrednost predstavlja srednju vrednost rezultata koji
ostaju posle odbacivanja ekstremnih vrednosti
SDI index standardne devijacije predstavja razliku aktuelnog
rezultata i konsenzus vrednosti, podeljena sa SD za dati brojač
SDI između – 2.00 i 2.00 dobra tačnost
CVI index koeficijenta varijacije predstavlja indeks aktuelnog
CV i konsenzus CV za dati brojač
CVI manji od 2 dobra preciznost
32

16
IPI Instrument performace index (tačka na grafu)
Lokacija tačke na grafu pokazuje koliko se instrument slaže sa
pool-om (ako se tačka nađe u zelenom delu grafa (3)
dobra tačnost i preciznost
33

IPI izvan osenčene oblasti?

1 Tačnost u opsegu, preciznost ne

2 Preciznost u opsegu, tačnost ne
3 Preciznost i tačnost van opsega 34

17
Preciznost izvan opsega u LOW kontroli

Problem sa bočicom kontrole? Promeniti bočicu i ponoviti

Problem sa aparatom? 35

Tačnost izvan opsega u High kontroli

Potreba za rekalibracijom?

36

18
Tačnost izvan opsega u sve 3 kontrole
Instrument van kalibracije, uraditi rekalibraciju

37

Preciznost i tačnost izvan opsega u 3 nivoa kontrole

Uraditi Test reproducibilnosti i Test Carryover po opisanim

procedurama
Neprecizan instrument se ne kalibriše
Najpre otkriti i ukloniti uzrok loše reproducibilnosti, pa tek
onda raditi kalibraciju 38

19
U obezbeđenju kontrole kvaliteta na hematološkom brojaču
voditi računa o sledećem:

Nijedna pojedinačna QC metoda ne može dati sve informacije

za istinski efektivnu kontrolu kvaliteta, već predstavlja
kombinaciju metoda:

Kalibracije
Provere aparata
Komercijalne kontrole
EDTA kontrolni uzorci pacijenata
Uvid biohemičara u rezultate pre izdavanja

39

20